專利名稱：一種產(chǎn)生功能性免疫球蛋白超家族蛋白的方法
發(fā)明簡述人類免疫系統(tǒng)的特異性和反應(yīng)性受MHC(在人HLA中)分子控制。HLA的功能是對(duì)免疫T細(xì)胞選擇和呈遞抗原肽?？梢哉J(rèn)為免疫系統(tǒng)是通過MHC視孔觀察世界，任何一種合理的免疫操作途徑都必須考慮到MHC。這類合理的途徑應(yīng)該具有多種科研、實(shí)用或臨床的價(jià)值。為了開發(fā)這些可能性，我們設(shè)計(jì)了一種方法，以新穎并且簡便、可靠和價(jià)廉的方式產(chǎn)生高純度的重組MHC分子。這些重組分子作為肽結(jié)合劑和T細(xì)胞激活劑具有充分的功能活性?？梢允顾鼈儤?gòu)成二種不同的形式a)作為完全成熟的肽填充部分，它非常穩(wěn)定并具有極強(qiáng)的T細(xì)胞激活性，b)作為部分成熟的無肽部分(“空”MHC分子)，它具有合理的穩(wěn)定性和肽易接受性。應(yīng)該注意到，后一種結(jié)果修正了當(dāng)前關(guān)于“空”MHC分子就是不存在的，或者至少是極不穩(wěn)定的錯(cuò)誤概念。
我們已知的產(chǎn)生重組或非重組MHC的所有其它方法，都更加麻煩并且/或者只能得到具有局限功效和純度的產(chǎn)品。MHC分子的復(fù)雜性和不良穩(wěn)定性導(dǎo)致要產(chǎn)生肽易接受性純MHC分子將非常因難，因而要產(chǎn)生預(yù)定的純肽-MHC復(fù)合物也非常困難。作為出自天然來源的天然分子，MHC分子的產(chǎn)物是緩慢和低產(chǎn)率的。并且只能用很麻煩的方法純化它們，導(dǎo)致制備物中MHC被大量不同的肽預(yù)先占據(jù)了，并且有時(shí)還污染了其它MHC單倍型，最終結(jié)果是非常受污染的制備物。
產(chǎn)生MHC分子的難題綜合起來是MHC基因座的極端多態(tài)性。在人類群體中存在400個(gè)以上不同的HLA-A、HLA-B和HLA-C等位基因，并存在200個(gè)以上HLA-D等位基因。這種多樣性當(dāng)然具有免疫學(xué)目的，但是對(duì)于產(chǎn)生MHC是一種實(shí)際障礙，因?yàn)樾枰a(chǎn)生許多不同的MHC，并且需要對(duì)它們單獨(dú)地最優(yōu)化、確認(rèn)、鑒定和儲(chǔ)存等。
重組表達(dá)系統(tǒng)可能具有多種優(yōu)點(diǎn)?？赡塬@得較高的產(chǎn)率和設(shè)計(jì)簡便的純化方案，并且可能用一個(gè)特定的肽對(duì)其分子作同質(zhì)性標(biāo)記。但是這種方法的主要障礙是，正確折疊的MHC結(jié)構(gòu)是由三個(gè)成分(重鏈、輕鏈(β-2-微球蛋白β2m)和肽)組成的相當(dāng)復(fù)雜的結(jié)構(gòu)。只有三個(gè)成分都在一起時(shí)MHC方能獲得充分的穩(wěn)定性。特別是不存在其它兩個(gè)成分時(shí)重鏈極不穩(wěn)定。因此，很難制備、操作和貯存沒有β2m和肽的分離的重鏈，因而也很難產(chǎn)生MHC分子，它可容易地結(jié)合實(shí)驗(yàn)者選擇的任何一種肽。因?yàn)槠溆邢薜姆€(wěn)定性，分離的MHC分子會(huì)迅速聚集并被丟失，導(dǎo)致最終產(chǎn)率非常差。
本專利申請(qǐng)描述了大量產(chǎn)生具有所需任何等位基因特異性的重組MHC分子的一般方法。此方法還首次獲得了真正的空MHC分子，并具有相當(dāng)?shù)姆€(wěn)定性，結(jié)果表明這些空分子的結(jié)合特征不同于過去產(chǎn)生的MHC所具有的結(jié)合特征。合理的預(yù)期是，這些空分子與生理性MHC結(jié)合有更多的關(guān)系，因?yàn)樗鼈兎从吵鲋匦陆Y(jié)合狀態(tài)，而以前使用的MHC分子已反映出更多的人工交換反應(yīng)。除了改進(jìn)MHC質(zhì)量之外，這種新穎的制備方案還簡便可靠，容易適合于大部分(可能是全部)MHC分子，并且對(duì)于完整功能的純MHC分子具有高產(chǎn)率。這些重組分子是非常有效的，因?yàn)榭蓪?duì)它們檢測出小至2-4ng分離MHC重鏈的肽結(jié)合活性，并且可檢測出小至150ng肽/MHC的T細(xì)胞結(jié)合能力。它們具非常的親和活性，類似于對(duì)天然存在的分子所測定的親和性，具有更快的結(jié)合速率并可充分地結(jié)合(即沒有內(nèi)源性肽)。我們已能夠儲(chǔ)存這種分子并使它們保持?jǐn)?shù)個(gè)月活性。此含義既有分析證明又有治療證明。
最后，所描述的方法已成功地用于其它(非-MHC)分子如CD3復(fù)合體成分。實(shí)際上，所公開的方法可應(yīng)用于設(shè)計(jì)產(chǎn)生任何蛋白質(zhì)(重組的或非重組的，在原核生物內(nèi)或真核生物內(nèi))，其中在制備的某一階段蛋白質(zhì)通過變性或解析疊成為溶劑化物(其目的可能是解除蛋白質(zhì)的聚集，為了純化蛋白質(zhì)等)，以后必須實(shí)施恢復(fù)/再折疊步驟。因此，本方法可能具有非常大的應(yīng)用范圍。我們推測，特別是它可能用于免疫球蛋白超家族的所有成員，包括抗體、MHC和T細(xì)胞受體。它可能用于產(chǎn)生包含至少一個(gè)半胱氨酸的所有分子。
存在二種MHC亞型，MHC I類和MHC II類。這二種亞型對(duì)應(yīng)于二個(gè)T淋巴細(xì)胞亞群1)CD8＋細(xì)胞毒T細(xì)胞，它通常識(shí)別由MCH I類分子呈遞的肽，殺滅受感染的或突變的細(xì)胞，以及2)CD4＋輔助T細(xì)胞，它通常識(shí)別由MHC II類分子呈遞的肽，調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)其它細(xì)胞的應(yīng)答。MHC I類由非共價(jià)結(jié)合于12000 MW非糖基化蛋白(β鏈，也稱為β2-微球蛋白)的43000MW跨膜糖蛋白(α鏈)組成。MHC II類具有類似于MHC I類的整體結(jié)構(gòu)，雖然功能區(qū)的分布不同。MHC II類由二個(gè)非共價(jià)結(jié)合的大約34000和29000MW的跨膜糖蛋白組成。對(duì)MHC I類和II類分子的詳細(xì)結(jié)構(gòu)已在X-射線晶體學(xué)的水平進(jìn)行了分析(Bjrkman等，1987)。MHC結(jié)構(gòu)最引人注目的部分是其上部，它顯示出一個(gè)獨(dú)特的肽結(jié)合凹槽，由形成凹槽圍墻的二個(gè)α螺旋和形成凹槽底面的第八β-折褶的外套層組成。
MHC是非常多形性的，也就是說，人群中存在許多不同的版本(等位基因，同種異型)，但是每個(gè)個(gè)體只繼承了其中的一個(gè)或二個(gè)(一個(gè)來自父親，另一個(gè)來自母親)。MHC也是多基因的，即在基因組中存在幾個(gè)MHC編碼基因座，使之有可能同時(shí)表達(dá)幾個(gè)同種型。重要的是，大多數(shù)多形性殘基是指向?qū)ζ浯笮?、形狀和功能性起作用的肽結(jié)合凹槽(Mrtsumure等1992)。肽-MHC相互作用是特異性的，而雖然較寬，但可使許多無關(guān)的肽結(jié)合于每種MHC同種異型(Buus等1987)。這種多形性限定了肽結(jié)合的特異性，它的生物學(xué)結(jié)果是，群體中的每個(gè)個(gè)體培育和形成一套獨(dú)特的T細(xì)胞指令表。MHC特異性的產(chǎn)生從結(jié)構(gòu)上，MHC的肽結(jié)合部位形成一個(gè)凹槽，還可細(xì)分成從A至F的多個(gè)口袋。肽-MHC結(jié)合能的大多數(shù)包含在結(jié)合肽的主鏈原子(包括MHC I類的未端)；其特點(diǎn)對(duì)所有的肽都是共同的(Matsumura等1992)。只有少量結(jié)合能包含在肽側(cè)鏈原子，但是認(rèn)為這些相互作用可解釋MHC的特異性。這種機(jī)制可解釋MHC如何實(shí)現(xiàn)寬特異性及高親和性的肽結(jié)合。從功能上，MHC是通過“基元序列”的識(shí)別來實(shí)現(xiàn)其較寬的肽結(jié)合特異性(Sette等1987)。一個(gè)基元序列表示出肽結(jié)合所需要的重要結(jié)構(gòu)要求，例如在錨定位置中特定氨基酸的存在和適當(dāng)間隔。相當(dāng)多的興趣已集中在理解MHC特異性和基元序列是如何產(chǎn)生的，以及鑒定各種MHC分子的特異性。這種努力的根本目的之一是能夠預(yù)測肽結(jié)合。從MHC的多形性(同為這點(diǎn)在結(jié)構(gòu)和功能上已證明)可以推斷，每個(gè)MHC同種異型都具有其自己的特異性特征。迄今為止還只能夠經(jīng)過實(shí)驗(yàn)描述這些特異性。對(duì)MHC特異性的描述和預(yù)測目前有二種根本不同的，但互補(bǔ)的方法用于測定MHC的肽結(jié)合特異性。一種方法包括對(duì)已結(jié)合于給定同種異型MHC分子的肽進(jìn)行測序(Buus等1988；Falk等1991)，而另一種方法包括測定哪些肽將會(huì)結(jié)合于此MHC(Buus等1986；Olsen等1994)。二種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。測序的方法使用非人工處理的肽-MHC復(fù)合物，但是此方法人為地規(guī)定重要的殘基、比較不重要的殘基和不重要的殘基，并且不能夠鑒別負(fù)相互作用的殘基。因此它最適合于鑒別最優(yōu)勢的正相互作用殘基。后一種方法是直接結(jié)合法，是定量的方法，它可將結(jié)合的與不結(jié)合的進(jìn)行比較。此方法可以鑒別和定量正的以及負(fù)的相互作用殘基。因此如下結(jié)果可能不會(huì)令人意外與測序的方法(大約30％成功)相比較，直接結(jié)合法可獲得較好的可預(yù)測性(大約70％預(yù)測的肽確實(shí)結(jié)合了)(Kast等1994)。已經(jīng)證明，要準(zhǔn)確地預(yù)測肽結(jié)合需要詳細(xì)地了解所研究MHC的精細(xì)特異性(有時(shí)稱為擴(kuò)展的基元序列)(Paker等1994，Rupert等1993；Stryhn等1996)。但是，獲得如此詳細(xì)的基元序列需要非常多的人力和物力。目前，為了測定所需每種MHC分子的精細(xì)特異性，是對(duì)傾向于具有特殊序列或基元序列的大批肽進(jìn)行常規(guī)分析(Parker等1994，Rupert等1993)。我們最近建立了一種基于肽文庫的方法，此方法可對(duì)所有功能上重要的MHC結(jié)合殘基給予準(zhǔn)確、無偏見的和定量的描述(Stryhn等1996)。它是普遍運(yùn)用的，因?yàn)閷?duì)許多不同的MHC分子可以用相同的一套肽文庫進(jìn)行尋址，并且試驗(yàn)結(jié)合的測定法可被發(fā)展用于任何一種MHC分子。此方法簡便，可顯著地減少實(shí)驗(yàn)安排和隨后的數(shù)據(jù)處理，因此便于繪制全部MHC I類特異性的完整圖譜?；谶@種無偏向的肽文庫的方法也確實(shí)導(dǎo)致改進(jìn)了對(duì)肽結(jié)合的預(yù)料(Stryhn等1996)。這種預(yù)測規(guī)則系統(tǒng)的成功暗示，基本上可將MHC I類的結(jié)合看作是獨(dú)立起作用的亞特異性排列的結(jié)果。重組MHC分子的產(chǎn)生其它的研究者已可用細(xì)菌作載體用于產(chǎn)生重組MHC分子(Parker和Wiley 1989)。但是這些MHC分子被包裹在細(xì)菌內(nèi)的包涵體中而不能為肽結(jié)合利用。包括使這些包涵體完全變性和還原的方案已被用于提取和溶解此重組MHC分子(Parker等1992，Parker等1992，Parker和Wiley1990)。這又使之需要在有還原/氧化劑如谷胱甘肽(GSH/GSSG)存在時(shí)在體外應(yīng)用重折疊步驟。已加入了其它一些成分如L-精氨酸以便防止聚集和錯(cuò)誤折疊。但是，體外折疊將面對(duì)在產(chǎn)生正確形成的二硫橋中的主要問題。MHC I類的重鏈包含4個(gè)半胱氨酸(在某些分子中是5個(gè))。在這種重折疊過程中對(duì)于錯(cuò)誤配對(duì)的二硫橋存在幾種可能性。已有報(bào)導(dǎo)應(yīng)用這種方法功能性MHC I類的一般產(chǎn)率很低(大約10-20％)，并具有非常緩慢的功力學(xué)過程(Garboczi等1992)。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及一種我們發(fā)明的方法，是為了解決在聚集體如包涵體中表達(dá)的具有功能的免疫球蛋白超家族蛋白的問題。在本發(fā)明的方法中，功能性蛋白可能由在相同細(xì)胞中或在不同細(xì)胞中產(chǎn)生的幾個(gè)蛋白質(zhì)亞單位組成。在后一種情況下，此功能性蛋白質(zhì)可能正好是二種不同的蛋白質(zhì)，例如MHC I類蛋白的重鏈和β2微球蛋白，它可能是在折疊時(shí)或稍后被組合成。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種產(chǎn)生功能性免疫球蛋白超家族蛋白的方法，此蛋白在有功能時(shí)具有至少一個(gè)二硫鍵，此方法包括如下步驟(ⅰ)提供一種包含編碼此蛋白質(zhì)基因的細(xì)菌細(xì)胞，此基因在該細(xì)胞中可表達(dá)，(ⅱ)在使此基因表達(dá)的條件下培育此細(xì)胞，(ⅲ)在不會(huì)改變細(xì)胞產(chǎn)生的二硫鍵的條件下從細(xì)胞中分離出此蛋白質(zhì)，并且任選地純化此蛋白質(zhì)，(ⅳ)使分離出的蛋白質(zhì)經(jīng)受折疊處理。
在本詳細(xì)說明和權(quán)利要求中當(dāng)使用“a”或“an”時(shí)，這意指一個(gè)或幾個(gè)，即至少一個(gè)。
用名詞“功能性蛋白”意指能夠?qū)崿F(xiàn)某些功能中至少一種功能的免疫球蛋白超家族蛋白，這些功能至少在相當(dāng)程度上歸因于這種蛋白質(zhì)，例如通過體外檢測法所評(píng)估的。作為例子，“功能性MHC I類蛋白”被定義為包含重鏈、輕鏈(b2m)和肽的蛋白質(zhì)。為了使它在水溶液中能溶解可將重鏈截去。此肽是可結(jié)合于所述MHC蛋白的肽?？山柚诶缬葿uus等1986和Olsen等1994所描述的直接結(jié)合法發(fā)現(xiàn)這種肽。
“功能性MHC II類蛋白”意指包含二個(gè)重鏈(α和β鏈)和一個(gè)肽的復(fù)合體的蛋白質(zhì)。為了使此復(fù)合體可溶解于水溶液可將其重鏈截去。此肽是可以結(jié)合于所述MHC蛋白的肽。可借助于例如由Buus等1986和Olsen等1994所描述的直接結(jié)合法發(fā)現(xiàn)這種肽。
本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方案是一些方法，其中的MHC蛋白是一種MHC I類蛋白，選自重鏈、與β2m組合的重鏈和功能成熟的MHC I類蛋白質(zhì)；或者是一種MHC II類蛋白，選自α/β二聚體和帶有肽的α/β二聚體。本發(fā)明的一個(gè)重要方面是一種方法，其中所形成的MHC蛋白是作為一種無肽的MHC蛋白被獲得。
“無肽的MHC I類蛋白”意指包含與輕鏈(b2m)結(jié)合的重鏈但不含肽的蛋白質(zhì)。這種蛋白質(zhì)還可被稱為“空”MHC I類蛋白。
“無肽的MHC II類蛋白”意指包含重鏈復(fù)合體但不含肽的蛋白質(zhì)。這種蛋白質(zhì)還可被稱為“空”MHC II類蛋白。
將根據(jù)MHC I類蛋白對(duì)本發(fā)明作例證性說明，但是可設(shè)想按相似的方式有可能產(chǎn)生所有的免疫球蛋白超家族蛋白(由二硫鍵結(jié)合確定的蛋白)，即包括選自如下種類的蛋白質(zhì)抗體、免疫球蛋白可變(V)區(qū)、免疫球蛋白恒定(C)區(qū)、免疫球蛋白輕鏈、免疫球蛋白重鏈、CD1、CD2、CD3、I類和II類組織相容性分子、β2微球蛋白(β2m)，淋巴細(xì)胞功能相關(guān)的抗原-3(LFA-3)和FcγRIII、CD7、CD8、Thy-1和Tp44(CD 28)、T細(xì)胞受體、CD4、多免疫球蛋白受體，神經(jīng)細(xì)胞粘附分子(NCAM)、髓鞘相關(guān)糖蛋白(MAG)，髓鞘質(zhì)P蛋白、癌胚抗原(CEA)、血小板衍生生長因子受體(PDGFR)、集落到激因子-1受體、αβ-糖蛋白、ICAM(細(xì)胞間粘附分子)，血小板以及白介素。本發(fā)明者已提供了關(guān)于幾種MHC I類分子、β2-微球蛋白、MHC II類分子、以及T細(xì)胞受體CD3鏈γ和ε的資料。
按照例如“分子克隆”(Sambrook，F(xiàn)ritsch和Maniatis，冷泉港出版社，1989)中所述的標(biāo)準(zhǔn)程序克隆編碼所需不同蛋白質(zhì)的cDNA。概括地說，可使用商品cDNA合成試劑盒(碰巧購自Pharmacia)從適合的細(xì)胞系合成cDNA。為了用于人，此細(xì)胞可從一組表達(dá)HLA的EBV轉(zhuǎn)化的人B細(xì)胞系得到，此B細(xì)胞系是來自第12屆國際組織相容性專題討論會(huì)的細(xì)胞系各單數(shù)據(jù)庫(“HLAHLA的基因多樣性，功能和醫(yī)學(xué)意義”，Dominique Charron編輯EDK出版，1997，或者參見http//www.icnet.uk/axp/tia/marsh/ihw.html)。對(duì)于HLA-A*0201，適合的細(xì)胞系可以是IHW9012。與所需MHC/HLA分子相對(duì)應(yīng)的核苷酸序列可以在http//www.anthonynolam.com/HIG/index.html，或 者 在http//www.ncbi.nl m.nih.gov找到。應(yīng)用此序列信息可以設(shè)計(jì)霧核苷酸引物，以便近過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增包含來自此適當(dāng)cDNA的成熟MHC/HLA分子氨基酸1-274的編碼區(qū)。選定相關(guān)的正向和反向引物用于擴(kuò)增HLA-A*0201，并將它插入Pet28a表達(dá)載體(Novagen，見http//www.novagen.com/vectfram.html)的NcoI和HindIII限制性位點(diǎn)。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入細(xì)菌TOP10F’并對(duì)卡那霉素抗性選擇過夜。挑選出幾個(gè)克隆并借助于Wizard miniprep(Promega)制備它們的質(zhì)粒。在應(yīng)用此克隆引物的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中將該質(zhì)粒用作模板，并通過瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色分析此擴(kuò)增產(chǎn)物。對(duì)導(dǎo)致適當(dāng)大小擴(kuò)增產(chǎn)物的質(zhì)粒進(jìn)行測序(ABL310測序儀)，以便鑒別包含所需序列的克隆。將這些確定無疑的克隆用于隨后的制備過程。類似的方案可用于克隆任何所需的基因。
特別優(yōu)選的蛋白質(zhì)是脊推動(dòng)物蛋白質(zhì)，例如人的、鼠的、大鼠的、豬的、?；蝤B類的蛋白質(zhì)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種產(chǎn)生多種功能性蛋白質(zhì)的方法，在此至少其中一種蛋白質(zhì)是免疫球蛋白超家族，并且此多種蛋白質(zhì)當(dāng)有功能時(shí)包含至少一個(gè)分子內(nèi)或分子間二硫鍵，此方法包括如下步驟(ⅰ)提供一種細(xì)菌細(xì)胞，此細(xì)胞包含各編碼一種蛋白的多種基因，所有的基因都可在該細(xì)胞中表達(dá)，
(ⅱ)在使這些基因表達(dá)的條件下培養(yǎng)此細(xì)胞，(ⅲ)在不會(huì)改變細(xì)胞產(chǎn)生的二硫鍵的條件下從細(xì)胞中分離出這些蛋白質(zhì)，且任選地可純化它們，(ⅳ)使分離出的蛋白質(zhì)經(jīng)受折疊處理。
在此實(shí)施方案中，此蛋白質(zhì)可以是融合蛋白，或者可能是二個(gè)單獨(dú)的蛋白質(zhì)，即共表達(dá)蛋白質(zhì)。
另一個(gè)實(shí)施方案涉及一種產(chǎn)生功能性免疫球蛋白超家族蛋白的方法，此蛋白質(zhì)在有功能時(shí)具有至少一個(gè)二硫鍵，此方法包括如下步驟(ⅰ)提供一種包含編碼該蛋白質(zhì)基因的細(xì)胞，此基因在該細(xì)胞中可表達(dá)，此蛋白質(zhì)是作為一個(gè)聚集體被表達(dá)，(ⅱ)在使該基因表達(dá)的條件下培養(yǎng)這種細(xì)胞，(ⅲ)在不會(huì)改變細(xì)胞產(chǎn)生的二硫鍵的條件下從細(xì)胞中分離出此蛋白質(zhì)聚集體，并且任選地純化它，(ⅳ)使分離出的蛋白質(zhì)經(jīng)受折疊處理。
變性蛋白質(zhì)可能以許多不同的構(gòu)象存在—它沒有一個(gè)獨(dú)特的構(gòu)象-而在水溶液中折疊的蛋白質(zhì)是以一種或幾種截然不同的構(gòu)象存在。本發(fā)明的基本特征之一是，它避免對(duì)在還原條件下由復(fù)性作用引起的蛋白質(zhì)聚集體進(jìn)行常規(guī)的溶解，這將導(dǎo)致完全未折疊的蛋白質(zhì)。為了產(chǎn)生正確折疊的蛋白質(zhì)而需要再形成正確的二硫鍵，這使隨后的再折疊復(fù)雜化了。本發(fā)明方法的特點(diǎn)在于它意外地發(fā)現(xiàn)，存在于聚集體如包涵體中的蛋白質(zhì)似乎是以具有正確二硫鍵的功能性形式存在，因此其任務(wù)是使它們不破壞二硫鍵而被溶解。本發(fā)明者已發(fā)現(xiàn)，必須在不改變蛋白質(zhì)的氧化還原狀態(tài)的非-還原條件下使此蛋白質(zhì)變性溶解。應(yīng)用具有正確二硫鍵的變性蛋白質(zhì)可導(dǎo)致簡化重折疊過程，現(xiàn)在可能像稀釋例如尿素一樣簡單而不需加氧化還原偶合物。但是可借助于其它一些蛋白質(zhì)如伴侶蛋白幫助折疊，在MHC I類的情況下可借助于β2m和/或肽的幫助。進(jìn)而根據(jù)本發(fā)明，對(duì)于某些蛋白質(zhì)如MHC可以基本上在沒有氧化還原偶合物如GSSG/GSH的存在下進(jìn)行折疊處理。
可通過使細(xì)胞破裂來實(shí)現(xiàn)分離過程，分離出聚集體如包涵體(例如通過離心)，任選地可進(jìn)行洗滌，在導(dǎo)致提取可溶性蛋白質(zhì)的變性劑(例如尿素或鹽酸胍，或者借助于本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它方法)中提取此聚集體(如包涵體)。這是分離步驟(ⅲ)的簡要過程，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員顯然還可以對(duì)它進(jìn)行修改或者隨后加入例如純化步驟。這是一個(gè)特別方便的時(shí)機(jī)，對(duì)于MHC分子加入純化步驟確實(shí)是優(yōu)選的，因?yàn)榭梢猿グü央牡脑S多非共價(jià)結(jié)合的分子。可借助于如下多種方法進(jìn)行這種純化過程離子交換層析、大小排阻層析、親和層析、疏水相互作用，沉淀法，過濾法，離心法和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它方法。
通過將變性劑(如尿素)稀釋至導(dǎo)致蛋白質(zhì)折疊的濃度點(diǎn)可啟動(dòng)折疊。本發(fā)明方法中的折疊步驟優(yōu)選地是在含有至少一種緩沖劑化合物的水介質(zhì)中進(jìn)行。然后可使蛋白質(zhì)經(jīng)過如上所述的純化程序。
在本發(fā)明的方法中，含有編碼異源性或同源性蛋白質(zhì)基因的細(xì)胞，并且此基因可在其中表達(dá)的細(xì)胞可以是任何一種細(xì)胞。優(yōu)選地此細(xì)胞可選自細(xì)菌細(xì)胞，真菌細(xì)胞，酵母細(xì)胞，動(dòng)物細(xì)胞和植物細(xì)胞。更優(yōu)選地此細(xì)胞是選自革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的細(xì)菌細(xì)胞。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中此革蘭陰性菌是大腸桿菌，包括BL21株或它的衍生株或者XA90株或它的衍生株。
預(yù)期可用的另一種細(xì)胞是被遺傳修飾的細(xì)胞，與相同株的未修飾細(xì)胞相比較這種細(xì)胞較弱的細(xì)胞內(nèi)還原環(huán)境，例如此細(xì)胞已被修飾具有降低的或者缺乏硫氧還蛋白還原酶或?qū)?xì)胞質(zhì)硫氫基還原潛力具有相似作用酶的活性，如trxB-突變株。另一種可用的細(xì)胞株可以是能夠生物素化蛋白質(zhì)的細(xì)胞株，即此細(xì)胞株能夠生物素化具有生物素化序列的蛋白質(zhì)?？梢栽隗w內(nèi)或體外修飾這種蛋白質(zhì)，例如被磷酸化、糖基化、乙?；?、酰胺化或任何所適當(dāng)?shù)钠渌揎椃绞健?br> 被表達(dá)的蛋白質(zhì)可能定位在細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞周質(zhì)或細(xì)胞外。
借助于任何一種用于將核苷酸序列導(dǎo)入細(xì)胞的常規(guī)技術(shù)可實(shí)施插入編碼功能性蛋白的基因，例如通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)。一般可借助于轉(zhuǎn)座(transposome)或通過重組過程將基因插入宿主細(xì)胞的染色體，或者可以借助于適當(dāng)?shù)妮d體以游離體的形式將基因?qū)?。適合于此目的的載體包括pET載體如T7質(zhì)粒。
人們會(huì)總意識(shí)到，基因可被單獨(dú)地或者與另一些核苷酸序列組合在一起導(dǎo)入宿主細(xì)胞。包括調(diào)節(jié)基因表達(dá)的序列如啟動(dòng)子序列，調(diào)節(jié)啟動(dòng)子的序列，增強(qiáng)子序列，編碼包括反義RNA的阻抑物的序列，或者終止序列。為了增加所產(chǎn)生蛋白質(zhì)的量，可以將編碼此功能蛋白質(zhì)的多拷貝基因?qū)胨拗骷?xì)胞。也可能導(dǎo)入編碼伴侶蛋白的序列或者調(diào)節(jié)天然伴侶蛋白表達(dá)或功能的序列，或者編碼導(dǎo)致此功能性蛋白質(zhì)糖基化的基因產(chǎn)物的序列。此啟動(dòng)子可能是組成型或可誘導(dǎo)的。
本發(fā)明方法的優(yōu)越性表現(xiàn)在蛋白質(zhì)產(chǎn)物的一方面或幾方面。按照本發(fā)明方法產(chǎn)生的功能性蛋白質(zhì)的產(chǎn)率，相對(duì)于在基本類似的條件下，但其中是在確實(shí)改變細(xì)胞產(chǎn)生的二硫鍵的條件下實(shí)施步驟(ⅲ)所得到的功能性蛋白質(zhì)的產(chǎn)率可能增加至少10％，例如至少20％、至少40％、至少50％、至少70％、或至少100％。另一方面，按照本發(fā)明方法的速度，與在確實(shí)改變細(xì)胞產(chǎn)生的二硫鍵的條件下實(shí)施步驟(ⅲ)時(shí)的速度相比較可能至少快10％，例如至少20％，至少40％，至少50％，至少70％，或至少100％。預(yù)期其速度實(shí)際上可能是多達(dá)2倍、5倍、10倍、100倍或10000倍地增加。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，其速度至少增加50倍。最后，按照本發(fā)明的方法產(chǎn)生的功能性蛋白質(zhì)的純度，相對(duì)于在基本上相似的條件下，但其中是在確實(shí)改變細(xì)胞產(chǎn)生的二硫鍵的條件下實(shí)施步驟(ⅲ)所得到的功能性蛋白質(zhì)的純度可能增加至少10％，例如至少20％、至少40％、至少50％、至少70％或至少100％。
根據(jù)實(shí)施例特別是MHC蛋白A2，其折疊效率可能是至少40％，而MHC蛋白Db具有認(rèn)為還要更高的折疊效率，即至少50％。對(duì)于活性蛋白質(zhì)此百分率是在折疊后立即被測定，與在折疊過程中所研究蛋白質(zhì)的輸入量相比較。預(yù)期當(dāng)使本發(fā)明的方法對(duì)于所研究的蛋白質(zhì)最佳化時(shí)，那么在所產(chǎn)生的免疫球蛋白超家族蛋白中至少可獲得25％具有功能形式的蛋白。
優(yōu)選地此蛋白質(zhì)不含有未配對(duì)的半胱氨酸殘基。但是在本發(fā)明范圍內(nèi)的一個(gè)實(shí)施方案，其中該蛋白質(zhì)含有1個(gè)未配對(duì)的半胱氨酸殘基。此蛋白質(zhì)可能含有至少2個(gè)例如至少3個(gè)、至少4個(gè)、至少5個(gè)、至少6個(gè)、至少7個(gè)、至少8個(gè)、至少9個(gè)、至少10個(gè)、至少11個(gè)、至少12個(gè)、至少13個(gè)、至少14個(gè)、至少15個(gè)、至少16個(gè)、至少17個(gè)、至少18個(gè)、至少19個(gè)、或至少20個(gè)半胱氨酸殘基。優(yōu)選地此蛋白質(zhì)含有偶數(shù)的半胱氨酸殘基。非常可能此蛋白質(zhì)具有至多20個(gè)，例如至多14個(gè)、至多10個(gè)、至多8個(gè)、至多5個(gè)、至多4個(gè)、至多3個(gè)或至多2個(gè)半胱氨酸殘基。此蛋白質(zhì)優(yōu)選地能夠具有至少1個(gè)，例如至少2個(gè)、至少3個(gè)、至少4個(gè)、至少5個(gè)或至少6個(gè)二硫鍵。非?？赡艽说鞍踪|(zhì)能夠具有至多20個(gè)，例如至多15個(gè)、至多10個(gè)、至多8個(gè)、至多5個(gè)、至多4個(gè)、至多3個(gè)或至多2個(gè)二硫鍵。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，其基因是天然存在基因的衍生物。通過取代至少一個(gè)密碼子可獲這種衍生物，此密碼子與原來存在的編碼相同氨基酸的密碼子相比較更經(jīng)常地被宿主細(xì)胞利用。一般地說此基因是在天然狀態(tài)不與此基因結(jié)合的調(diào)節(jié)性DNA序列的控制之下。但是它還可能是在它自己的啟動(dòng)子控制之下。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，是以選自pET載體例如T7質(zhì)粒的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化細(xì)菌細(xì)胞。對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員顯然還有其它的載體。
本發(fā)明最重要的方面是可通過本發(fā)明方法獲得的一種穩(wěn)定的無肽MHC蛋白。在本領(lǐng)域以前還沒有通過任何方法產(chǎn)生穩(wěn)定的無肽MHC蛋白。雖然已聲稱(Matsumura等1992)從TAP缺乏的真核細(xì)胞如T2或昆蟲細(xì)胞可以獲得空分子，但是從這種制備物中已提取并鑒定出肽(Wei和Cresswell1992，Henderson等1992)，也就是說，這些制備物不是真正的空分子。穩(wěn)定的無肽MHC蛋白的用途之一是提供用于高效率地產(chǎn)生純的同源肽-MHC復(fù)合體。用名詞“穩(wěn)定的”意指在尿素中分離形式的重鏈在-20℃，50％甘油下可以保存至少3個(gè)月。此復(fù)合物的半壽期實(shí)際上大于6個(gè)月，正在研究功能性MHC復(fù)合體即11重鏈和β2m在水溶液中的穩(wěn)定性。但是已知在存在過量β2m時(shí)重鏈在水溶液中穩(wěn)定的半壽期在4℃是大約2天。
本發(fā)明的另一個(gè)重要方面是一種試劑盒，它包含有使其接受者能產(chǎn)生功能性MHC I類蛋白的MHC I類重鏈和β2m，對(duì)此蛋白可以加入能夠結(jié)合于該MHC I類蛋白而導(dǎo)致形成功能性MHC I類蛋白的肽。此MHC蛋白將通過本發(fā)明的方法被優(yōu)選地產(chǎn)生。在一個(gè)實(shí)施方案中，此試劑盒包含將允許最終使用者可測定對(duì)他/她所選擇的任何一種肽結(jié)合的試劑，可應(yīng)用如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、放射免疫測定法(RIA)或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它檢測系統(tǒng)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，此試劑盒包含低聚合的MHC蛋白，例如2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)或更多MHC蛋白的低聚合物。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，此試劑盒包含被加入作為標(biāo)記物的另一種試劑，使此試劑盒適合于診斷的目的。標(biāo)記物優(yōu)選地可選自熒光染料、酶、化學(xué)發(fā)光和放射活性的標(biāo)記物。
本發(fā)明方法的優(yōu)選用途是用于生產(chǎn)MHC，特別是無肽的MHC分子。穩(wěn)定的無肽MHC蛋白的優(yōu)選用途是用于分析MHC中改變一個(gè)氨基酸對(duì)該MHC結(jié)合特異性的影響，如通過應(yīng)用肽文庫法分析所測定的，不論是合成的或者是重組的文庫。這樣一種MHC點(diǎn)突變的組合，隨后通過肽文庫進(jìn)行特異性分析，可構(gòu)成一種測定結(jié)構(gòu)-功能相互關(guān)系的新型方法。本發(fā)明的另一些用途如下面所述。重組MHC I類分子的用途a)分析和診斷(特別是借助于ELISA和/或FACS)a.1)對(duì)肽-MHC相互作用的定量測定測定肽和MHC之間的相互作用是相當(dāng)有價(jià)值的。對(duì)任何推定存在的T細(xì)胞抗原表位都應(yīng)該檢驗(yàn)其對(duì)MHC的結(jié)合，優(yōu)選地是進(jìn)行定量測定。目前不良控制的檢測系統(tǒng)、缺乏空MHC分子和/或需要標(biāo)記至少一種成分都阻礙了用于測定這種相互作用的方法?？辗肿邮歉呋钚缘模走\(yùn)用于高度受控制的RIA類型的生物檢測系統(tǒng)(BuuS等1995)。空分子還適合于通過ELISA法檢測。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，這種ELISA包括泛-特異性的抗-MHC抗體的捕捉和泛-特異性的抗-MHC抗體的檢測，隨后是高靈敏度、定量的非放射活性檢測。其它的ELISA檢測方案(例如包括親和性標(biāo)記的)也是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
a.2)對(duì)用于定量和定性鑒定T細(xì)胞群的特異性T細(xì)胞的詳述1996年Mark Davis和其同事(Altman等1996)證明，用加入的附著于重鏈C-端的生物素化信號(hào)可產(chǎn)生重組體純肽-MHC I類復(fù)合物。在酶促生物素化過程之后，可用藻紅素標(biāo)記的鏈親和素使這些復(fù)合物四聚體化。然后可按肽特異性的、MHC I限定的方式將這些多聚體化的標(biāo)記的肽-MHC I類復(fù)合物用于標(biāo)記T細(xì)胞。一般認(rèn)為對(duì)于肽-MHC I復(fù)合物T細(xì)胞受體的穩(wěn)定性太低，不能引起穩(wěn)定的生物化學(xué)結(jié)合。但是四聚體化之后，多聚體化復(fù)合物的親合性足夠引起生物化學(xué)結(jié)合。因此，借助于熒光激活的細(xì)胞分選儀(FACS)的分析，可將這種四聚體用于對(duì)任何給定的細(xì)胞懸液中T細(xì)胞的數(shù)目進(jìn)行計(jì)數(shù)。此后表明，用于計(jì)數(shù)特異性T細(xì)胞的老方法，有限稀釋分析法非常不準(zhǔn)確，并會(huì)過低估計(jì)特異性T細(xì)胞的數(shù)目。因此不論從科學(xué)的觀點(diǎn)而且從公布文獻(xiàn)的觀點(diǎn)進(jìn)行“四聚體”分析都已成必需的。Davis的方法具有二個(gè)主要的問題難以產(chǎn)生大量的純MHC I分子，以及生物素化過程是昂貴、麻煩的，特別是需要在37℃持續(xù)地溫育。許多肽在此溫育的后期確實(shí)仍然結(jié)合于MHC I，這可能解釋即使在相同的實(shí)驗(yàn)中結(jié)果易變的原因。本專利申請(qǐng)公開了一種方法，按照此方法可以快速有效地產(chǎn)生肽-MHC復(fù)合物，致使復(fù)合物形成后只要作最小的修正。預(yù)期按照本發(fā)明方法產(chǎn)生的MHC I分子經(jīng)得起作為商品試劑盒的運(yùn)輸和貯存的考檢，它還進(jìn)一步允許在任何非專門的實(shí)驗(yàn)室，用最后使用者選擇的任何相關(guān)肽生產(chǎn)最終的肽-MHC I復(fù)合物。相比之下，以前生產(chǎn)MHC I的方法可能要求有相當(dāng)多的蛋白質(zhì)和分子生物學(xué)知識(shí)以及經(jīng)驗(yàn)。最后可以預(yù)期有許多比酶促生物素化法更好的方法能用于標(biāo)記MHC I(Gallimore等1998，Walter等1998)。
a.3)對(duì)使免疫處理可受到精確監(jiān)控的特異性T細(xì)胞的詳述任何免疫處理(例如免疫接種)都需要精確和特異性的監(jiān)控。上述的“四聚體”技術(shù)是目前對(duì)免疫處理過程進(jìn)行科學(xué)、臨床和商業(yè)評(píng)價(jià)的極好標(biāo)準(zhǔn)。
b)科學(xué)價(jià)值b.1)對(duì)MHC I分子特異性的功能和結(jié)構(gòu)測定在產(chǎn)生T細(xì)胞介導(dǎo)的所有應(yīng)答時(shí)MHC I分子是主要的角色。相當(dāng)多的努力都是針對(duì)理解MHC I分子的功能和特異性。在所有這些場合都需要獲得有功能活性的MHC I分子。從天然來源產(chǎn)生MHC I分子有幾個(gè)嚴(yán)重的缺點(diǎn)(麻煩、昂貴的生產(chǎn)過程，還會(huì)產(chǎn)生少量不純的MHC I)。在此公開的方法使有可能簡便、快速和高效率地產(chǎn)生肽-MHC I復(fù)合的。以前用于產(chǎn)生肽-MHC I復(fù)合物的方法包括對(duì)處于重折疊過程中的MHC I提供過量肽的步驟(Garboczi等1992)。因此所形成的復(fù)合物被肽預(yù)先占據(jù)了，不能很快地重新進(jìn)行肽結(jié)合。按照在此公開的方法可以將所產(chǎn)物的MHC I分子立即用于結(jié)合肽，并因此可用于對(duì)肽結(jié)合進(jìn)行任何一種分析，包括將異性分析。重組MHC I分子與最近公布的肽文庫法相結(jié)合(Stryhn等1996)，研究者可仔細(xì)地測定包括突變MHC I分子在內(nèi)的任何MHC I子的特異性。應(yīng)該著重指出的是，這種詳細(xì)的分析還導(dǎo)致提高了對(duì)肽結(jié)合的預(yù)測(Styrhn等1996)。
b.2)對(duì)T細(xì)胞特異性的功能和結(jié)構(gòu)測定通過在此公開的方法可快速有效地產(chǎn)生純肽-MHC I復(fù)合物。這種復(fù)合物可在T細(xì)胞受體與該肽-MHC I復(fù)合物相互作用時(shí)用于分析此T細(xì)胞受體的結(jié)構(gòu)，并且應(yīng)用肽變異體或MHC I變異體還可能對(duì)T細(xì)胞變體的特異性進(jìn)行功能分析。
b.3)對(duì)特異性T細(xì)胞的處理(誘導(dǎo)或阻斷)在此公開的肽-MHCI復(fù)合體能夠與給定靶細(xì)胞的T細(xì)胞受體相互作用。為了刺激此細(xì)胞，它的T細(xì)胞受體必須被交聯(lián)。因此可以預(yù)料，多聚體化的肽-MHCI復(fù)合物(如“四聚體”)可能刺激適合的肽特異性的MHC I-限制性T細(xì)胞，而可溶性肽-MHC I復(fù)合物可能阻斷這種細(xì)胞。
b.4)對(duì)免疫處理(如免疫接種)特異性作用的監(jiān)測在技術(shù)得到進(jìn)一步改善之前，任何關(guān)于如何操縱T細(xì)胞免疫系統(tǒng)的研究都依賴于現(xiàn)存的“四聚體”(或類四聚體)技術(shù)。可以精確、簡便地測定其誘導(dǎo)預(yù)測的特異性應(yīng)答的能力，并且借助于現(xiàn)代的FACS分析技術(shù)可更進(jìn)一步分析哪些亞群受到影響和程度如何。因此四聚體技術(shù)對(duì)于免疫處理的未來發(fā)展將是必不可少的。
b.5)純化特異性T細(xì)胞四聚體將使對(duì)肽特異性的MHC I限制性T細(xì)胞的有效純化成為可能。作為例子，如果此四聚體通過它們的生物素被偶聯(lián)于順磁性微珠，那末使用一個(gè)磁體就可比較直接了當(dāng)?shù)丶兓湎鄳?yīng)的特異性T細(xì)胞。然后此特異性T細(xì)胞可被洗脫出，用于分析或被擴(kuò)展并被用于進(jìn)一步的免疫處理(例如適應(yīng)性T細(xì)胞轉(zhuǎn)移)。與目前極端麻煩和緩慢的克隆技術(shù)相比較這可能成為一個(gè)巨大的改進(jìn)。
c)治療用途c.1)疫苗的開發(fā)對(duì)疫苗開發(fā)的作用可被粗略地細(xì)分為直接的和間接的作用。所公開技術(shù)的直接作用可能是將b3中所述的原理用于治療，在此，基于按刺激性方式(交聯(lián)成“四聚體”或在微珠上等)所給予的被分離的富有肽的MHC I分子，預(yù)期將高度特異性并非常有效地激活特異性T細(xì)胞(隨后是激活免疫系統(tǒng))。間接的作用是由改進(jìn)對(duì)候選疫苗的鑒別引起的，這種改進(jìn)將是本公開技術(shù)的結(jié)果。通過使其能夠?qū)θ巳縈HC I分子進(jìn)行大批量詳細(xì)地分析，將改善對(duì)能夠結(jié)合于MHC的病原體來源肽的預(yù)測，并且有可能容易地證實(shí)這種預(yù)測(MHC特異性抗原表位分析)。
c.2)對(duì)自身免疫性疾病的治療對(duì)治療自身免疫疾病的作用可被粗略地細(xì)分為直接的和間接的作用。所公開技術(shù)的直接作用可能是將b3中所述的原理用于治療，在此，基于按非刺激性方式(即作為可溶性的非交聯(lián)復(fù)合物)所給予的被分離的富有肽的MHC I分子，預(yù)期將導(dǎo)致高度特異性地阻斷特異性T細(xì)胞(隨后是阻斷免疫系統(tǒng)的重要部分)。間接的作用是由改進(jìn)對(duì)誘發(fā)自身免疫性疾病的候選物的鑒別引起的，這種改進(jìn)將是本公開技術(shù)的結(jié)果。通過使之能夠?qū)θ巳縈HC I分子進(jìn)行大批量詳細(xì)地分析，將改善對(duì)能夠結(jié)合于MHC的自身蛋白來源肽的預(yù)測，并且有可能容易地證實(shí)這種預(yù)測。
c.3)純化T細(xì)胞用于適應(yīng)性轉(zhuǎn)移可以用“四聚體”特異性地標(biāo)記T細(xì)胞，因此也可以對(duì)它進(jìn)行挑選(即通過磁性微珠)，獲得具有預(yù)定特異性的純T細(xì)胞群制備物。然后可以使這種T細(xì)胞群擴(kuò)展用于例如針對(duì)感染性疾病或致癌性疾病的適應(yīng)性轉(zhuǎn)移(adoptivetransfer)。
c.4)治療癌癥許多癌癥與突變的致癌基因/腫瘤抑制基因有關(guān)，或者與不良調(diào)控的致癌基因/抑制基因有關(guān)。形成的細(xì)胞代謝改變可被免疫系統(tǒng)發(fā)覺?，F(xiàn)在有例子表明，不良調(diào)控可導(dǎo)致完全正常的自身蛋白水平發(fā)生改變。但是在這種情況下已證明自身蛋白水平的改變使它變得具有致免疫性和腫瘤排斥作用(Vierboom等1997)。作為例證但不局限于這些例證，借助于基因分析(例如“單鏈構(gòu)象多態(tài)性”，“選擇性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”或“差異展示”)或者蛋白質(zhì)分析(質(zhì)譜驅(qū)動(dòng)的蛋白質(zhì)分析)可發(fā)現(xiàn)這種突變和不良調(diào)控?？梢詫?duì)任何這樣鑒定的蛋白質(zhì)進(jìn)行上述的MHC特異性抗原表位分析，并可如c1和c3所詳述的嘗試對(duì)癌癥進(jìn)行特異性治療。
泳道1如所指示的標(biāo)準(zhǔn)參照物。泳道2誘導(dǎo)前的細(xì)胞蛋白質(zhì)。泳道3誘導(dǎo)后3小時(shí)的細(xì)胞蛋白質(zhì)。泳道4用陰離子交換層析純化后的重組HLA-A*0201。圖2非還原條件下在15％SES-PAGE中分析的重組HLA-A*0201重鏈的陰離子交換組分，此重鏈?zhǔn)莵碜阅蛩厝芙獾陌w蛋白。分析了與純化肽結(jié)合單體相應(yīng)的組分(在上端標(biāo)明了組分號(hào)，與圖中相對(duì)照)。顯示重組HLA-A*0201象二種大約31-32kD的不同蛋白質(zhì)一樣遷移；蛋白帶2a和3都具有完整的二硫鍵。圖3存在或不存在DTT時(shí)對(duì)純化的重組HLA-A*0201分子的SDS-PAGE分析。泳道1通過稀釋法折疊(非還原的方法)得到的高度純化的和功能性HLA-A*0201重鏈。泳道2和3在非還原條件下陰離子交換的HLA-A*0201重鏈(蛋白帶2a和3)。在泳道3顯示二條蛋白質(zhì)帶通過存在于泳道4中的還原劑被部分地還原成蛋白帶1。泳道4在還原條件下陰離子交換的HLA-A*0201重鏈，顯示出蛋白質(zhì)帶1，它比蛋白帶2a和3遷移更緩慢。圖4對(duì)洗脫量蛋白質(zhì)分析的陰離子交換組分和相對(duì)應(yīng)的肽結(jié)合能力。由BCA確定濃度并在OD562下(實(shí)線)測定。還對(duì)相同的組分測定了肽結(jié)合。對(duì)柱加樣的大約30％蛋白質(zhì)總量沒有結(jié)合(堿性的或中性帶電的蛋白質(zhì))。這些蛋白質(zhì)與同包函體共純化的細(xì)菌本底蛋白質(zhì)相對(duì)應(yīng)。用大約200mM的NaCl洗脫重組HLA-A*0201分子，并通過肽結(jié)合分析(虛線)和SDS-PAGE分析(圖3)進(jìn)行鑒定。圖5用特異性抗體免疫沉淀重組HLA-A*0201分子。
在4℃將重組HLA-A*0201重鏈、b2m和放射性標(biāo)記肽的復(fù)合物與抗HLA-A*0201，H-2Kk或H-2Dh分子的單克隆抗體共同孵育。然后加入蛋白A沉淀免疫復(fù)合物。反復(fù)洗此沉淀并作放射性記數(shù)。只有HLA-A*0201特異性的抗體BB7.2和W6/32能沉淀結(jié)合了放射性標(biāo)記肽的重組HLA-A*0201。在重組HLA-A*0201與具有無關(guān)特異的抗體之間不存在可測定出的相互作用。圖6與重組HLA-A*0201重鏈結(jié)合的肽。
將逐漸增加劑量的重組HLA-A*0201重鏈與b2m(1μM)的微量放射性標(biāo)記的肽(2nM)在18℃共溫育4小時(shí)。借助于G25旋轉(zhuǎn)柱層析測定復(fù)合物形成的程度。圖7肽與重組HLA-A*0201相互作用的親和性。
將5nM重組HLA-A*0201與微量放射性標(biāo)記的肽和b2m(1μM)以及分別具有對(duì)HLA-A*0201和H2-Kk特異性的逐漸增加濃度的未標(biāo)記肽共同溫育。在18℃共溫育這些反應(yīng)物4小時(shí)，并借助于G25旋轉(zhuǎn)柱層析測定復(fù)合物形成的程度。將結(jié)合的配體濃度對(duì)結(jié)合與游離配體之比作圖得到Scatchard直線圖(插入圖)。圖8對(duì)重組HLA-A*0201的b2m依賴性肽結(jié)合。
將重組HLA-A*0201重鏈與微量肽和如所示的逐漸增加濃度的人和小鼠b2m共溫育。在18℃溫育此反應(yīng)物4小時(shí)，并借助于G25旋轉(zhuǎn)柱層析測定復(fù)合物形成的程度。圖9逐漸增加劑量的重組HLA-A*0201重鏈與放射標(biāo)記的人b2m在有或沒有特異性肽(10μM)存在時(shí)，在18℃共溫育4小時(shí)。將此反應(yīng)物在18℃溫育4小時(shí)之后，借助于G50旋轉(zhuǎn)柱層析測定復(fù)合物形成的程度。

圖10b2m從重組HLA-A*0201復(fù)合物中的離解。將旋轉(zhuǎn)柱層析純化的重鏈和帶有或不帶有肽的放射標(biāo)記b2m的復(fù)合物與3μM未標(biāo)記的b2m混合，并在4℃溫育所指定的時(shí)間。借助于葡聚糖凝膠G50旋轉(zhuǎn)柱層析測定離解的程度。圖11通過FACS分析評(píng)估的四聚體染色。被分析的細(xì)胞是CD8陽性的T細(xì)胞，此T細(xì)胞是來自攜帶有對(duì)與H-2Db結(jié)合的KAVYNFATM肽特異性的T細(xì)胞受體轉(zhuǎn)基因的小鼠，或者是來自非轉(zhuǎn)基因?qū)φ誋-2Db小鼠。以藻紅素-鏈親合素形成的四聚體進(jìn)行分析，此四聚體包含與重組H-2Db和生物素化b2m復(fù)合的相關(guān)的KAVYNFATM肽，或者帶有與重組H-2Db和生物素化b2m復(fù)合的無關(guān)的FAPGNYPAL肽。以在x-軸上的四聚體染色和y-軸上的CD8染色進(jìn)行FACS分析。在右上四邊形中可見陽性四聚體和CD8陽性細(xì)胞的數(shù)量。對(duì)方框右邊計(jì)算四聚體和CD8都為陽性的細(xì)胞總百分?jǐn)?shù)，并在右上四邊形中直接給出。
T細(xì)胞復(fù)合物 ％四聚體+和CD8+圖11A 相關(guān)的 相關(guān)的53％圖11B 相關(guān)的 無關(guān)的2％圖11C 無關(guān)的 相關(guān)的1％圖11D 無關(guān)的 無關(guān)的3％
在pGMT7載體(pET衍生載體)中的重組H-2Db來自Dr Gallimore的友好贈(zèng)送。將含有H-2Db的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌BL21菌株(DE3)(Novagen)，在含有100μg/ml氨芐青霉素的200ml Luria-Bertani培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)。為了制備在含有100μg/ml氨芐青霉素的200mlLuria-Bertani培養(yǎng)基中接種來自過夜培養(yǎng)物的這種細(xì)胞，并在37℃培養(yǎng)。
用0.4mM異丙基-b-D-硫代半乳糖苷(IPTG)在對(duì)數(shù)生長中期(A600-0.6)誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)。3小時(shí)后通過離心收細(xì)胞。將此細(xì)胞懸浮于含有1mM EDTA的10ml20mM，pH8.0的tris緩沖液中，-20℃保存。分離包涵體和純化重組HLA-A2*01 I類重鏈在含有溶菌酶(100μg/ml)，EDTA(1 mM)，PMSF(50μg/ml)的10ml20mM pH8.0的tris緩沖液中借助于超聲處理破裂冷凍的細(xì)胞制備物(來自200ml培養(yǎng)物的)，并在室溫下溫育20分鐘。隨后加入DNA酶(10μg/ml)和MgCl(10mM)。放置一段時(shí)間之后通過以10000g離心15分鐘部分地純化包涵體。在tris緩沖液內(nèi)洗含有包涵體的沉淀3次。最后通過在含有PMSF和EDTA的3ml8M尿素、20mM tris pH8.0的溶液中4℃溫育2小時(shí)使沉淀溶解。通過離心除去不溶解的物質(zhì)。收集此上清液，使之通過孔徑0.22μm的濾器然后保存在-80℃。這些制備物含有HLA-A*0201I類重鏈，根據(jù)SDS-PAGE測定此重鏈具有大約60-80％的純度。用陽離子交換(速流、Pharmacia)柱(1×25 cm)純化了此HLA-A*0201I類重鏈。用8M尿素、pH8.0的20mM tris緩沖液將含有部分純化重鏈的制備物稀釋5倍，并對(duì)此離子交換基質(zhì)加樣。用20ml8M尿素、pH8.0的20mM tris緩沖液洗柱，然后以在8M尿素、pH8.0的20mM tris緩沖液配制的0-500mM NaCl梯度液洗脫蛋白質(zhì)。通過BCA蛋白測定，SDS-PAGE分析和肽結(jié)合能力監(jiān)測被洗脫的蛋白質(zhì)。將含有高度純化的重鏈蛋白質(zhì)單體的組分和具有高度肽結(jié)合能力的組分合并在一起，保持于-80℃。111.4b2m和單克隆抗體的純化按以前所述方法(Pedersen等1995)制備并純化了重組人和小鼠b2m。以腹水的形式制備了單克隆抗體W6/32(α-HLA I類)、BB7.2(α-HLA-HLA-A*0201)、11-4.1(α-Kk)、S13-29(α-Kk)、28-14-8S(α-H-2Db)，和B22-249(α-H-2Db)，并通過蛋白A層析進(jìn)行了純化(這些雜交瘤大多數(shù)來自ATCC)。放射性碘化標(biāo)記b2m和肽通過反相HPLC層析純化HLA-A*0201和H-2Db特異性肽，并被冷凍干燥。按以前所述的方法(Olsen等1994)放射標(biāo)記此肽(1-2μg)，達(dá)到60mCi/μg的比活性?？山Y(jié)合于重組的或天然MHC I類的被標(biāo)記肽的百分率通常是80％。電泳用均質(zhì)的聚丙烯酰胺凝膠(15％)進(jìn)行一維的小型SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)。在SDS-PAGE分析之前先在加入或不加入50mM DTT的Laemmli樣品緩沖液中將樣品煮沸。用Coomassie蘭R-250對(duì)蛋白質(zhì)染色。肽對(duì)重組HLA-A*0201 I類分子的結(jié)合(示蹤結(jié)合)對(duì)來自陰離子交換純化的變性重組HLA-A*0201重鏈測定其在b2m存在時(shí)結(jié)合肽的能力?；旧先缤ㄟ^稀釋測定(Garboczi等1992)實(shí)施肽對(duì)重組重鏈的結(jié)合-不同的是放射標(biāo)記肽的量是示蹤量即大約2nM。通常是在下述的折疊緩沖液中將取自離子交換純化組分的1μl變性的重鏈液稀釋100倍。溫育此反應(yīng)物至少4小時(shí)。借助于葡聚糖凝膠G25旋轉(zhuǎn)柱層析(Buus等1995)檢測肽的結(jié)合。所有的實(shí)驗(yàn)都進(jìn)行了二次或二次以上。揭示出由20mM tris pH7、150mM NaCl、1mM EDTA、50μg/ml PMSF、1μM b2m和1-2nM示蹤肽組成的最佳折疊緩沖液可優(yōu)化肽對(duì)重組H-2Db和HLA-A*0201的結(jié)合。值得注意的是，經(jīng)典的折疊劑如L-精氨酸和細(xì)菌伴侶蛋白如GRO-EL/ES對(duì)此肽結(jié)合沒有負(fù)面影響(資料未顯示)。正常濃度范圍的GSH/GSSG例如1.8mM/0.2mM對(duì)此肽相互作用沒有影響。在4℃-37℃溫度范圍內(nèi)的肽結(jié)合分析表明18℃有最佳的結(jié)合。在pH5.5-9的范圍內(nèi)肽結(jié)合分析表明在pH6.5-7.5有最佳的結(jié)合。動(dòng)力學(xué)研究顯示在18℃4小時(shí)溫育之后達(dá)到示蹤肽結(jié)合平衡。功能性HLA-A*201 I類分子的產(chǎn)生(遞增性折疊)通過在折疊緩沖液(如上面)中100倍稀釋使變性的和純化的HLA-A*201重鏈制備物(300-600μg/ml)折疊，對(duì)它加入肽達(dá)到大約10μM的濃度。應(yīng)用具有大約10kD阻隔孔徑的Amicon濾器在4℃將此反應(yīng)物濃縮10-20倍。在4℃保溫此濃縮物1小時(shí)，然后在15000g離心15分鐘。進(jìn)一步使用具有大約3kD阻隔孔徑的Centricon裝置在4℃濃縮其上清液。反復(fù)離心后將上清液對(duì)大小排阻層析柱(葡聚糖凝膠G50)加樣，除去游離的b2m和肽。合并含有功能性HLA-A*201I類的組分，并濃縮至大約1mg/ml的濃度。結(jié)果對(duì)變性的重組HLA-A*201重鏈的表達(dá)和純化用基本上如Garboczi等(Garboczi等1992)所述的方法表達(dá)并部分地純化重組HLA-A*0201和H-2Db。在大約0.6的細(xì)胞濃度用0.4mM IPTG誘導(dǎo)細(xì)胞并在37℃溫育3小時(shí)。以15％SDS-PAGE凝膠分析在加入和未加入IPTG時(shí)煮沸和還原樣品的遷移率。估計(jì)重組HLA-A*0201的產(chǎn)率是大約50-50ml/L培養(yǎng)物，相當(dāng)于圖1中泳道3大約33kD的主要蛋白帶。
為了分離包涵體通過超聲波處理使此細(xì)胞破裂。離心此表達(dá)重組重鏈的細(xì)胞(來自200ml培養(yǎng)物)，并使沉淀在含有20mM tris、pH8、溶酶體、PMSF和EDTA的緩沖液中再溶解。隨后加入DNA酶和MgCl2。待此溶液放置一段時(shí)間之后(20-30分鐘，22℃)離心沉淀出包涵體。在tris緩沖液pH8中洗沉淀3次，最后在8M尿素中再溶解并保存在-80℃。
應(yīng)用陽離子交換層析將來自包涵體的部分純化的蛋白質(zhì)進(jìn)一步分級(jí)分離。進(jìn)行這一純化步驟的原因是為了使制備物有效地富集高度折疊的重組HLA-A*0201分子，并避免異質(zhì)性(少量污染物，在細(xì)菌中對(duì)重鏈的少量酶促改變等)。
以梯度(0-500mM)NaCl洗脫單體重組HLA-A*0201。分別在大約200mM和350mM NaCl洗脫出了重組HLA-A*0201和H-2Db重鏈單體。以SDS-PAGE分析了此純化重鏈的純度、濃度和功能性(圖1泳道4和圖2)，并進(jìn)行了BCA-蛋白質(zhì)測定試驗(yàn)和示蹤蛋白質(zhì)結(jié)合分析(圖4)。
陰離子-交換純化和非還原性SDS-PAGE分析表明，從分離的包涵體中溶解的大多數(shù)，如果不是全部，重組HLA-A*0201蛋白被氧化了，即含有二硫橋。如圖2中顯示的，在非還原性SDS-PAGE分析中洗脫出的重組HLA-A*0201重鏈遷移成二個(gè)不同的帶(此后分別被分稱為2a和3)。應(yīng)用大小排阻層析、離子-交換層析或疏水性層析我們都未能使蛋白質(zhì)2a與蛋白質(zhì)3分開。在還原性條件下，此二種HLA-A*0201重鏈像一個(gè)單獨(dú)的蛋白帶——被稱為帶1，緩慢地共-遷移(圖3，將電泳道2和3與電泳道4相比較)。此蛋白帶相當(dāng)于圖1中占優(yōu)勢的HLA-A*0201蛋白帶(電泳道3)?？傊说鞍踪|(zhì)仿佛是帶有完整的二硫橋包裹在包涵體內(nèi)，導(dǎo)致成為至少二個(gè)不同的單體。如下面所述的折疊實(shí)驗(yàn)清楚地表明，只有蛋白帶2a折疊成為功能性重組HLA-A*0201復(fù)合物(圖3，比較泳道1和2)。在通過稀釋法的折疊過程中蛋白帶3錯(cuò)誤折疊并聚集。推測蛋白帶2a包含正確的二硫橋，而蛋白帶3是不正確的。使放射標(biāo)記的肽化學(xué)交聯(lián)于重組HLA-A*0201重鏈還發(fā)現(xiàn)此蛋白帶2a為肽受體(資料未被顯示出)。
包裹在包涵體內(nèi)的蛋白質(zhì)快速遷移似乎是普遍現(xiàn)象。在非還原性SDS-PAGE分析中我們已觀察到多種不同蛋白質(zhì)的較快速的遷移，如人b2m、CD3復(fù)合物蛋白質(zhì)γ-和ε-鏈的功能區(qū)、H2-Kk、MHC II類的α-和β-鏈。在非還原性條件下重組H-2Db分子以比較高的速度遷移(資料未被顯示出)。與HLA-A*0201重鏈相比較，非還原的H-2Db重鏈像在還原性SDS-PAGE分析中較緩慢遷移的一條單獨(dú)的快速遷移帶一樣遷移(資料未被顯示出)。放射標(biāo)記的肽對(duì)部分純化的變性重組HLA-A*201重鏈的結(jié)合對(duì)通過陽離子交換層析分級(jí)分離的重組重鏈測定了它們結(jié)合在通過稀釋法(見材料和方法)折疊過程中加入的放射標(biāo)記特異性肽的能力。如圖4中顯示的，在重組HLA-A*0201重鏈單體的單體存在(帶2a和帶3)與肽結(jié)合能力之間存在良好的相關(guān)性。在即使存在GSH/GSSG時(shí)進(jìn)行生物化學(xué)純化之后，從具有還原劑(大于0.1mM DTT)的尿素制備物中得到的純化重鏈不與肽結(jié)合。因此，肽結(jié)合的能力與具有預(yù)先形成的二硫橋的重鏈有關(guān)。
重組HLA-A*0201和重組H-2Db重鏈都可結(jié)合特異性放射配體，這種放射配體可被特異性肽抑制，但不能被非-結(jié)合性肽抑制。復(fù)合物中具有放射標(biāo)記肽的重組HLA-A*0201可用抗HLA-A*0201的特異性抗體使之沉淀，但是用抗H2-Kk和H-2Db分子的抗體不能使之沉淀，表明產(chǎn)生了正確的HLA-A*0201(圖5)。放射標(biāo)記的肽對(duì)高度純化的變性重組HLA-A2*201重鏈的結(jié)合使用放射標(biāo)記的肽和放射標(biāo)記的b2m評(píng)價(jià)了從具有預(yù)先形成的二硫橋的變性狀態(tài)重鏈功能性MHC I類的產(chǎn)生。通過用8M尿素變性功能性重組HLA-A*0201獲得了與蛋白帶2a相對(duì)應(yīng)的完全純化的HLA-A*0201重鏈。在含有8M尿素的20mM tris pH8緩沖液中通過大小排阻層析(葡聚糖凝膠G50)對(duì)此變性的蛋白質(zhì)作分級(jí)分離，重鏈被收集在空隙體積中。
通過在上面所述的折疊緩沖液中稀釋進(jìn)行放射標(biāo)記配體(肽或b2m)的結(jié)合。劑量響應(yīng)曲線(圖6)顯示在折疊過程中放射標(biāo)記的肽對(duì)變性重鏈非常有效和靈敏的結(jié)合。相比之下常規(guī)親和性純化的MHC I類分子為了結(jié)合相似量的肽需要10-50倍的較高濃度。
以抑制試驗(yàn)和Scatchard分析對(duì)肽結(jié)合的高效率進(jìn)行了分析。如圖7所示，重組HLA-A*0201只與特異性肽相互作用。Scatchard分析(圖7插入框)顯示出完全直線的Scatchard作圖，親和平衡常數(shù)是大約30nM。重要的是，活性受體的百分率大約是輸入蛋白質(zhì)的80-90％。因此，此HLA-A*201重鏈?zhǔn)峭耆钚缘?，沒有被來自細(xì)菌或由任何后續(xù)操作步驟產(chǎn)生的肽預(yù)先占據(jù)。相比之下，常規(guī)親和性純化的MHC I類制備物被具有通常是2％的有限數(shù)量活性受體的肽預(yù)先占據(jù)了。
肽結(jié)合是非常地取決于b2m。如圖8所示，對(duì)結(jié)合反應(yīng)加入逐漸增加劑量的b2m可促進(jìn)放射標(biāo)記肽的結(jié)合。不存在b2m時(shí)完全阻止了肽對(duì)重鏈的結(jié)合。也有相反的反應(yīng)，即b2m對(duì)重鏈的結(jié)合也顯示出對(duì)特異性肽存在的某些依賴性(圖9)。因?yàn)閎2m在沒有肽時(shí)確實(shí)與重鏈結(jié)合了，雖然是以較低的親和性，所以肽不是絕對(duì)的需要。
在動(dòng)力學(xué)研究中進(jìn)一步分析了肽對(duì)b2m相互作用的影響。在有或沒有特異性肽存在時(shí)分析了由放射標(biāo)記b2m和重鏈組成的HLA-A*201復(fù)合物的離解速度。異二聚體復(fù)合物即在沒有特異性肽存在時(shí)形成和保持的復(fù)合物37℃以大約4小時(shí)的半壽期迅速地離解。三聚體肽-b2m-重鏈復(fù)合物即在有肽存在時(shí)形成或保持的復(fù)合物比較穩(wěn)定，半壽期大約是14小時(shí)。因此肽可穩(wěn)定b2m的結(jié)合。我們的結(jié)論是，通過變性重鏈和b2m之間的初級(jí)相互作用可形成HLA-A*201復(fù)合物。此相互作用可產(chǎn)生異二聚體，它表現(xiàn)出高親合性的肽結(jié)合位點(diǎn)。肽本身又可增加被結(jié)合b2m分子的親和性，導(dǎo)致形成穩(wěn)定的功能性HLA-A*201復(fù)合物。功能性HLA-A*0201的產(chǎn)生收集具有高度肽結(jié)合能力的組分(大約15ml相當(dāng)于含有單體重鏈組分的60-70％)并合并在一起用于產(chǎn)生(折疊)功能性HLA-A*0201分子。在上述的折疊緩沖液中稀釋重組HLLA-A*0201重鏈。將1ml500μg部分純化的重鏈(相當(dāng)于大約13ml細(xì)菌培養(yǎng)物)加到99ml緩沖液中，并立即用具有大約10kD阻隔孔徑的Amicon濾器濃縮。將5-10ml濃縮液(在1小時(shí)內(nèi)獲得的)在4℃保溫1小時(shí)，然后以15000g離心除去聚集物。收集上清液并用具有大約3kD阻隔孔徑的Centricon裝置進(jìn)一步濃縮至大約150-200μl。再一次離心之后應(yīng)用滯留游離b2m和肽的大小排阻層析(G50)純化此折疊的HLA-A*0201。將含有所集中的HLA-A*0201的組分合并在一起并用Centricon裝置濃縮至最后的濃度大約1mg/ml。從加入的變性蛋白質(zhì)的量計(jì)算，折疊效率大約是40-50％。通過整個(gè)過程功能性HLA-A*0201的產(chǎn)率相當(dāng)于大約10mg功能性HLA-A*0201/L細(xì)菌培養(yǎng)物。整個(gè)折疊和純化過程可在24小時(shí)內(nèi)完成。注意折疊過程中未加入常規(guī)的作用劑如L-精氨酸和GSH/GSSG。前者抑制具有預(yù)先形成二硫橋的變性HLA-A*0201重鏈的折疊。后者不影響此結(jié)果。已在SDS-PAGE中常規(guī)地測定了此折疊的重組HLA-A*0201分子(圖3)，并用特異性抗體測定了其反應(yīng)性(圖5)。最近將使用生物素化的b2m通過此程序產(chǎn)生的重線H-2Db復(fù)合物用鏈親合素進(jìn)一步裝配成了寡聚體復(fù)合物。此寡聚體化的(“四聚體”)H-2Db復(fù)合物已被用于特異性T細(xì)胞的FACS染色(圖11)，以及用于當(dāng)通過共焦顯微鏡檢測時(shí)染色T細(xì)胞。后者證明了其特異性的結(jié)合和內(nèi)在化作用。
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權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)生功能性免疫球蛋白超家族蛋白的方法，此蛋白質(zhì)在有功能時(shí)具有至少一個(gè)二硫鍵，此方法包括如下步驟(ⅰ)提供一種包含編碼此蛋白質(zhì)基因的細(xì)菌細(xì)胞，此基因在該細(xì)胞中可表達(dá)，(ⅱ)在使此基因表達(dá)的條件下培養(yǎng)此細(xì)胞，(ⅲ)從該細(xì)胞中分離出此蛋白質(zhì)而不還原它，(ⅳ)使分離出的蛋白質(zhì)經(jīng)受折疊處理。
2.一種產(chǎn)生多種功能性蛋白質(zhì)的方法，其中包括至少一種是來自免疫球蛋白超家族的蛋白，并且此多種功能性蛋白質(zhì)在有功能時(shí)具有至少一個(gè)分子間和/或一個(gè)分子內(nèi)的二硫鍵，此方法包括如下步驟(ⅰ)提供一種細(xì)菌細(xì)胞，此細(xì)胞包含各編碼一種蛋白的多種基因，所有的基因都可在該細(xì)胞中表達(dá)，(ⅱ)在使這些基因表達(dá)的條件下培養(yǎng)此細(xì)胞，(ⅲ)從該細(xì)胞中分離出這些蛋白質(zhì)而不還原它們，(ⅳ)使分離出的蛋白質(zhì)經(jīng)受折疊處理。
3.一種產(chǎn)生功能性免疫球蛋白超家族蛋白的方法，此蛋白質(zhì)在有功能時(shí)具有至少一個(gè)二硫鍵，此方法包括如下步驟(ⅰ)提供一種包含編碼該蛋白質(zhì)基因的細(xì)胞，此基因在該細(xì)胞中可表達(dá)，此蛋白質(zhì)是作為一個(gè)聚集體被表達(dá)，(ⅱ)在使該基因表達(dá)的條件下培養(yǎng)這種細(xì)胞，(ⅲ)從細(xì)胞中分離出此蛋白質(zhì)聚集體而不還原它，(ⅳ)使分離出的蛋白質(zhì)經(jīng)受折疊處理。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任何之一的方法，其中按照本方法產(chǎn)生的功能性蛋白質(zhì)的產(chǎn)率，相對(duì)于在基本類似的條件下但其中是在還原條件下實(shí)施步驟(ⅲ)所得到的功能性蛋白質(zhì)的產(chǎn)率增加至少10％，例如至少20％、至少40％、至少50％、至少70％、或至少100％。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任何之一的方法，其中當(dāng)在非還原條件下實(shí)施步驟(ⅲ)時(shí)，本方法的速度與在還原條件下實(shí)施步驟(ⅲ)時(shí)相比較至少快10％。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任何之一的方法，其中按照本方法產(chǎn)生的功能性蛋白質(zhì)的純度，相對(duì)于在基本上類似的條件下但其中是在還原條件下實(shí)施步驟(ⅲ)所得到的功能性蛋白質(zhì)的純度增加至少10％。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任何之一的方法，其中的蛋白質(zhì)是選自如下種類的免疫球蛋白超家庭蛋白抗體、免疫球蛋白可變(V)區(qū)、免疫球蛋白恒定(C)區(qū)、免疫球蛋白輕鏈、免疫球蛋白重鏈、CD1、CD2、CD3、I類和II類組織相容性分子、β2微球蛋白(β2m)、淋巴細(xì)胞功能相關(guān)的抗原-3(LFA-3)和FcγRIII、CD7、CD8、Thy-1和Tp44(CD28)，T細(xì)胞受體、CD4、多免疫球蛋白受體、神經(jīng)細(xì)胞粘附分子(NCAM)、髓鞘相關(guān)糖蛋白(MAG)、髓鞘P蛋白、癌胚抗原(CEA)、血小板衍生生長因子受體(PDGFR)、集落刺激因子-1受體、αβ-糖蛋白、ICAM(細(xì)胞間粘附分子)、血小板以及白介素。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任何之一的方法，其中的免疫球蛋白超家庭蛋白是例如脊椎動(dòng)物蛋白質(zhì)，如人、鼠、大鼠、豬、牛或鳥類的蛋白質(zhì)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任何之一的方法，其中的免疫球蛋白超家庭蛋白是MHC。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中的HHC蛋白是人MHC。
11.根據(jù)權(quán)利要求9或10的方法，其中的MHC蛋白是選自重鏈、與β2m結(jié)合的重鏈、和功能性成熟MHCI類蛋白的MHCI類蛋白；或者是選自α/β二聚體和帶有肽的α/β二聚體的MHCII類蛋白。
12.根據(jù)權(quán)利要求9-11中任何之一的方法，其中是作為無肽的MHC蛋白得到所產(chǎn)生的MHC蛋白。
13.根據(jù)權(quán)利要求7-12中任何之一的方法，其中當(dāng)折疊過程結(jié)束時(shí)可得到至少25％所產(chǎn)生的免疫球蛋白超家庭蛋白是有功能形式的。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-13中任何之一的方法，其中步驟(ⅱ)的蛋白質(zhì)是作為包涵體產(chǎn)生。
15.根據(jù)權(quán)利要求1-14中任何之一的方法，其中是在不改變氧化還原狀態(tài)的非還原條件下實(shí)施步驟(ⅲ)。
16.根據(jù)權(quán)利要求1-15中任何之一的方法，其中該方法進(jìn)一步包括在步驟(ⅳ)之前使從步驟(ⅲ)分離的蛋白質(zhì)經(jīng)受純化的步驟。
17.根據(jù)權(quán)利要求1-16中任何之一的方法，其中是在水基質(zhì)和至少一種緩沖化合物中實(shí)施折疊處理(ⅳ)。
18.根據(jù)權(quán)利要求1-17中任何之一的方法，其中是在基本上不存在還原劑如DTT的情況下實(shí)施折疊處理。
19.根據(jù)權(quán)利要求1-18中任何之一的方法，其中所表達(dá)的蛋白質(zhì)是處于細(xì)胞內(nèi)。
20.根據(jù)權(quán)利要求1-19中任何之一的方法，其中所表達(dá)的蛋白質(zhì)是處于細(xì)胞周質(zhì)中。
21.根據(jù)權(quán)利要求1-20中任何之一的方法，其中所表達(dá)的蛋白質(zhì)被轉(zhuǎn)移至細(xì)胞外。
22.根據(jù)權(quán)利要求1-21中任何之一的方法，其中是以糖基化的形式表達(dá)該蛋白質(zhì)。
23.根據(jù)權(quán)利要求1-22中任何之一的方法，其中是以磷酸化的形式表達(dá)該蛋白質(zhì)。
24.根據(jù)權(quán)利要求1-23中任何之一的方法，其中是在體外使該蛋白質(zhì)糖基化或磷酸化。
25.根據(jù)權(quán)利要求1-24中任何之一的方法，其中該蛋白質(zhì)不包含未配對(duì)的半胱氨酸殘基。
26.根據(jù)權(quán)利要求1-25中任何之一的方法，其中該蛋白質(zhì)包含1個(gè)未配的半胱氨酸殘基。
27.根據(jù)權(quán)利要求1-26中任何之一的方法，其中該蛋白質(zhì)包含至少2個(gè)、例如至少3個(gè)、至少4個(gè)、至少5個(gè)、至少6個(gè)、至少7個(gè)、至少8個(gè)、至少9個(gè)、至少10個(gè)、至少11個(gè)、至少12個(gè)、至少13個(gè)、至少14個(gè)、至少15個(gè)、至少16個(gè)、至少17個(gè)、至少18個(gè)、至少19個(gè)、或至少20個(gè)半胱氨酸殘基。
28.根據(jù)權(quán)利要求1-27中任何之一的方法，其中該蛋白質(zhì)包含偶數(shù)的半胱氨酸殘基。
29.根據(jù)權(quán)利要求1-28中任何之一的方法，其中該蛋白質(zhì)具有至多20個(gè)、例如至多14個(gè)、至多10個(gè)、至多8個(gè)、至多5個(gè)、至多4個(gè)、至多3個(gè)或至多2個(gè)半胱氨酸殘基。
30.根據(jù)權(quán)利要求1-29中任何之一的方法，其中該蛋白質(zhì)能夠具有至少1個(gè)、例如至少2個(gè)、至少3個(gè)、至少4個(gè)、至少5個(gè)或至少6個(gè)二硫鍵。
31.根據(jù)權(quán)利要求1-30中任何之一的方法，其中該蛋白質(zhì)能夠具有至多20個(gè)、例如至多15個(gè)、至多10個(gè)、至多8個(gè)、至多5個(gè)、至多4個(gè)、至多3個(gè)或至多2個(gè)二硫鍵。
32.根據(jù)權(quán)利要求3-31中任何之一的方法，其中的細(xì)胞是選自細(xì)菌細(xì)胞、真菌細(xì)胞、酵母菌細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞和植物細(xì)胞。
33.根據(jù)權(quán)利要求1-32中任何之一的方法，其中的細(xì)胞是選自革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的細(xì)菌細(xì)胞。
34.根據(jù)權(quán)利要求33的方法，其中的革蘭氏陰性菌是大腸桿菌，包括BL21侏或它的衍生株或者XA90株或它的衍生株。
35.根據(jù)權(quán)利要求1-34中任何之一的方法，其中的細(xì)胞經(jīng)遺傳修飾，與未經(jīng)修飾和同株細(xì)胞相比它具有較弱的細(xì)胞內(nèi)還原環(huán)境。
36.根據(jù)權(quán)利要求1-35中任何之一的方法，其中的細(xì)胞已被修飾具有降低的或者缺乏硫氧還蛋白還原酶或?qū)?xì)胞質(zhì)硫氫基還原潛力具有相似作用酶的活性。
37.根據(jù)權(quán)利要求1-36中任何之一的方法，其中該修飾的細(xì)胞是trxB突變株。
38.根據(jù)權(quán)利要求1-37中任何之一的方法，其中的基因是天然存在基因的衍生物。
39.根據(jù)權(quán)利要求38的方法，其中通過取代至少一個(gè)密碼子可獲得該衍生物，此密碼子與原來存在的編碼相同氨基酸的密碼子相比較更經(jīng)常地被宿主細(xì)胞利用。
40.根據(jù)權(quán)利要求1-39中任何之一的方法，其中該基因是在天然狀態(tài)不與此基因結(jié)合的調(diào)節(jié)性DNA序列的控制之下。
41.根據(jù)權(quán)利要求1-40中任何之一的方法，其中是以選自pET載體例如T7啟動(dòng)子的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化該細(xì)胞細(xì)胞。
42.一種穩(wěn)定的無肽MHC蛋白，可通過權(quán)利要求1-41中任何之一的方法獲得。
43.一種包含MHCI類重鏈和β2m的試劑盒，它能夠使其接受者產(chǎn)生和測定或檢測出功能性MHCI類蛋白，對(duì)此蛋白可以加入能夠結(jié)合于該MHC I類蛋白而導(dǎo)致形成此功能性MHC I類蛋白的肽。
44.根據(jù)權(quán)利要求43的試劑盒，它包括對(duì)一種或幾種MHC I類亞單位(重鏈、b2m和/或肽)的標(biāo)記，以便測定或檢測MHC I類蛋白的產(chǎn)生。
45.根據(jù)權(quán)利要求43和44的試劑盒，其中對(duì)所產(chǎn)生MHC I類蛋白的測定或檢測系統(tǒng)可選自如下技術(shù)放射-配體、免疫沉淀、ELLSA、胞質(zhì)團(tuán)共振、熒光極化、分析超離心、生物化學(xué)沉淀、超過濾、層析和平衡透析技術(shù)。
46.根據(jù)權(quán)利要求43-45的試劑盒，它包含低聚合的MHC蛋白，例如2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)或更多MHC蛋白的低聚合物。
47.根據(jù)權(quán)利要求43-46的試劑盒，其中加入了作為標(biāo)記物的一種試劑，使此試劑盒適合于診斷的目的。
48.根據(jù)權(quán)利要求44-47的試劑盒，其中的標(biāo)記物可選自生物素、熒光染料、酶、化學(xué)發(fā)光和放射活性的標(biāo)記物。
49.根據(jù)權(quán)利要求1-41中任何之一的方法用于生產(chǎn)MHC的用途。
50.根據(jù)權(quán)利要求42的穩(wěn)定空MHC蛋白用于分析MHC中改變一個(gè)氨基酸對(duì)該MHC結(jié)合特異性的影響的用途，這種影響通過應(yīng)用肽文庫法分析測定，合成的文庫或者是重組的文庫均可。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種產(chǎn)生功能性免疫球蛋白超家族蛋白的方法,此蛋白質(zhì)在有功能時(shí)具有至少一個(gè)二硫鍵,此方法包括如下步驟:提供一種包含編碼此蛋白質(zhì)的基因且此基因可在其中表達(dá)的細(xì)菌細(xì)胞;在使此基因表達(dá)的條件下培養(yǎng)此細(xì)胞;從該細(xì)胞中分離出此蛋白質(zhì)而不還原它;以及使分離出的蛋白質(zhì)經(jīng)受折疊處理。優(yōu)選地,此免疫球蛋白超家族蛋白是選自如下種類的蛋白質(zhì):抗體、免疫球蛋白可變(Ⅴ)區(qū)、免疫球蛋白恒定(C)區(qū)、免疫球蛋白輕鏈、免疫球蛋白重鏈、CD1、CD2、CD3、Ⅰ類和Ⅱ類組織相容性分子、β
文檔編號(hào)A61P37/02GK1326466SQ99813211
公開日2001年12月12日 申請(qǐng)日期1999年9月14日 優(yōu)先權(quán)日1998年9月14日
發(fā)明者拉斯·奧斯特加德·佩德森, 索仁·布斯 申請(qǐng)人:拉斯·奧斯特加德·佩德森, 索仁·布斯