自血漿純化免疫球蛋白的制作方法
【專利說明】自血漿純化免疫球蛋白
[0001] 本發(fā)明設(shè)及自血漿純化祀分子像免疫球蛋白?；谟H水性的化學(xué)上穩(wěn)定的聚乙締 酸樹脂的某些類型的離子交換劑的使用導(dǎo)致祀分子的特別高的收率。
[0002]發(fā)巧背景 人和動(dòng)物血包含許多蛋白和酶，其具有例如治療性質(zhì)。運(yùn)些蛋白的一些可在紅細(xì)胞中 發(fā)現(xiàn)，而其它的在血漿或血清的溶液中發(fā)現(xiàn)。運(yùn)樣的蛋白是用于大規(guī)模和特異性分離的目 標(biāo)，目的是純化和標(biāo)準(zhǔn)化所述蛋白用作人治療劑。分離W供治療應(yīng)用的重要血蛋白的實(shí)例 有：白蛋白、免疫球蛋白G、因子IX、因子VIII和α-1-蛋白酶抑制劑。運(yùn)些蛋白的一些W 每年數(shù)千kg的規(guī)模生產(chǎn)（白蛋白和IgG)，而其它的僅W每年克至千克的規(guī)模生產(chǎn)。然而， 為了分離運(yùn)些蛋白，在全世界范圍內(nèi)，每年有數(shù)百萬升的血液被處理。
[0003] 血、血漿和血清是極其復(fù)雜的含蛋白質(zhì)的溶液，其包含許多并非目的蛋白或酶的 其它類型的化合物。從運(yùn)種類型的樣品分離特異性祀分子需要復(fù)雜的且往往是多步的純化 程序。
[0004] 特別是免疫球蛋白G的當(dāng)前生產(chǎn)方法的一個(gè)常見問題是純化過程中免疫球蛋白G 的大量流失，估計(jì)為起始原料的總IgG含量的至少30%-35%。一個(gè)挑戰(zhàn)是保持病毒失活和缺 乏可引起不良反應(yīng)的雜質(zhì)的品質(zhì)，同時(shí)擴(kuò)大IgG的收率。在可被考慮的目前的IgG生產(chǎn)水 平下，收率的小幅度增加實(shí)際上是非常重要的。即使效率的2%增加也將在收率和生產(chǎn)力方 面產(chǎn)生顯著的增加。
[0005] 因此，存在對(duì)改進(jìn)的和更有效的生產(chǎn)IgG產(chǎn)品的方法的需求。
[0006] 發(fā)巧簡(jiǎn)沐 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，某種類型的色譜材料或基質(zhì)可W非常有效地用于來自血漿樣品的祀分子的 陰離子交換純化。所述基質(zhì)是攜帶600和1200帕ol/g之間的陰離子基團(tuán)的親水性聚乙締 酸。祀分子可W非常高的收率和極好的純度獲得。
[0007] 本發(fā)明因此設(shè)及一種自血漿樣品純化祀分子的方法，其通過W下方面進(jìn)行： a) 提供包含祀分子的血漿樣品， b) 使所述血漿樣品經(jīng)受在攜帶600和1200帕ol/g之間的陰離子基團(tuán)的聚乙締酸基 質(zhì)上的離子交換色譜，藉此自基質(zhì)中洗脫純化的祀分子。
[0008] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述基質(zhì)是一種由至少一種來自組a)和b)的化合物的共 聚而形成的共聚物，其中 a)至少一種式I的親水取代的烷基乙締基酸
其中R1、R2、R3彼此獨(dú)立地可W是Η或C1-C6烷基，優(yōu)選地Η或CH3， 和R4是攜帶至少一個(gè)徑基的基團(tuán) 和 b)至少一種符合式II和/或III和/或IV的交聯(lián)劑，
其中X是具有2-5個(gè)C原子、優(yōu)選2或3個(gè)C原子的二價(jià)烷基，其中不鄰近的和不位 于N的直接附近的一個(gè)或多個(gè)亞甲基可W被0、C=0、S、S=0、S02、NH、NOH或N替代和所述亞 甲基的一個(gè)或多個(gè)Η原子可W彼此獨(dú)立地被徑基、C1-C6-烷基、面素、Ν&、C5-C10-芳基、 ΝΗ- (C1-C8)-烷基、N(C1-C8)-烷基2、C1-C6-烷氧基或C1-C6-烷基-0Η取代，和
其中在式III和IV中的Y1和Y2彼此獨(dú)立地是C1-C10烷基或環(huán)烷基，其中一個(gè)或多 個(gè)非-鄰近的亞甲基或不位于N的直接附近的亞甲基可W被0、C=0、S、S=0、S〇2、畑、N0H 或N替代和所述亞甲基的一個(gè)或多個(gè)Η可W彼此獨(dú)立地被徑基、C1-C6-烷基、面素、NHz、 C5-C10-芳基、NH(C1-C8)烷基、N(C1-C8)烷基 2、C1-C6-烷氧基或C1-C6-烷基-OH取代， 或C6-C18芳基，其中芳基系統(tǒng)中的一個(gè)或多個(gè)Η可W彼此獨(dú)立地被徑基、C1-C6-烷基、 面素、畑2、NH(C1-C8)烷基、N(C1-C8)烷基2、C1-C6-烷氧基或C1-C6-烷基-0Η取代訊 A是具有2-5個(gè)C原子、優(yōu)選2或3個(gè)C原子的二價(jià)烷基，其中一個(gè)或多個(gè)非-鄰近的 亞甲基或不位于N的直接附近的亞甲基可W被0、C=0、S、S=0、S〇2、畑、N0H或N替代和所 述亞甲基的一個(gè)或多個(gè)Η可W彼此獨(dú)立地被徑基、C1-C6-烷基、面素、Ν&、C5-C10-芳基、 NH(C1-C8)烷基、N(C1-C8)烷基2、C1-C6-烷氧基或C1-C6-烷基-0Η取代。
[0009] 式I中的R4通常為攜帶至少一個(gè)徑基的烷基、環(huán)脂族基團(tuán)或芳基。
[0010] 在非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述基質(zhì)通過所用的親水取代的烷基乙締基酸和作為 交聯(lián)劑的二乙締基乙締脈（1,3-二乙締基咪挫嘟-2-酬）的共聚而形成，所述烷基乙締基 酸選自1,4-下二醇單乙締基酸、1,5-戊二醇單乙締基酸、二乙二醇單乙締基酸或環(huán)己燒二 甲醇單乙締基酸。
[0011] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，離子基團(tuán)已通過使聚乙締酸基質(zhì)經(jīng)受姉催化的接枝聚合而 附接于基質(zhì)。運(yùn)優(yōu)選地依據(jù)US5453186第9頁實(shí)施例8進(jìn)行，其中荷電基團(tuán)優(yōu)選地是帶正 電荷的Ξ甲基錠烷基。
[0012] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，離子交換基團(tuán)是帶正電荷的Ξ甲基錠烷基。
[0013] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，離子交換色譜W流通模式進(jìn)行。
[0014] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，祀分子是免疫球蛋白，優(yōu)選人免疫球蛋白，最優(yōu)選人免疫球 蛋白G。
[0015] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述勒1分子從IgA、IgM、白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白和因子XIa分離。
[0016] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，步驟b)中的基質(zhì)用具有4和7. 4之間的pH的緩沖液洗脫。
[0017] 在一個(gè)實(shí)施方案中，將樣品W樣品中25-150g蛋白/每升基質(zhì)的量施加于所述基 質(zhì)。
[0018] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟b)中的基質(zhì)的負(fù)載和洗脫用包含0. 005和1Μ之間乙 酸鹽的乙酸鹽緩沖液進(jìn)行。
[0019] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述基質(zhì)由具有20和250化之間的平均粒徑的顆粒制得。
[0020] 所述基質(zhì)的孔徑（例如孔半徑）指顆粒在表面改性反應(yīng)前的孔徑并通過逆尺寸排 阻色譜測(cè)定。用于測(cè)定的程序描述于文獻(xiàn)（JournalofC虹omatogra地yA, 1037卷，1-2 期，273-282 頁）。
[0021] 在一個(gè)實(shí)施方案中，孔半徑在30-150nm之間。
[0022] 在一個(gè)實(shí)施方案中，在從步驟b)中的基質(zhì)洗脫祀分子后，在隨后的步驟C)中，基 質(zhì)用具有低于步驟b)所用的緩沖液抑的抑的緩沖液洗脫，從而自基質(zhì)中洗脫含IgM的產(chǎn) 物。
[0023] 在一個(gè)實(shí)施方案中，在從步驟b)中的基質(zhì)洗脫祀分子后，在隨后的步驟C)中，基 質(zhì)用具有低于步驟b)所用的緩沖液抑的抑的緩沖液處理，由此從所述基質(zhì)洗脫IgA、IgM 和因子XI曰。
[0024] 定女 在詳細(xì)描述本發(fā)明之前，將要理解的是，本發(fā)明并不限于特定組成或過程步驟，因?yàn)樗?述組成或步驟可能會(huì)有所不同。必須注意到，如用于本說明書和所附權(quán)利要求書中的，單數(shù) 形式"a"、"an"和"the"包括復(fù)數(shù)指代，除非上下文中另外清楚地指明。因此，例如，提及" 配體"包括多種配體和提及"抗體"包括多種抗體等。
[00巧]除非另外限定，否則本文所用的全部技術(shù)和科學(xué)術(shù)語，具有本發(fā)明所設(shè)及領(lǐng)域的 普通技術(shù)人員通常理解的相同意義。為了如本文所述的本發(fā)明的目的，定義W下術(shù)語。 [00%] 本文所用的術(shù)語"祀分子"指應(yīng)從樣品的一個(gè)或多個(gè)其它成分，例如雜質(zhì)中分離、 分開或純化的任何分子、物質(zhì)或化合物。祀分子的實(shí)例有抗體、抗原結(jié)合片段（Fab)、恒定 區(qū)片段（Fc)、蛋白質(zhì)、膚、重組蛋白、其它天然化合物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，祀分子是蛋白 質(zhì)。在一個(gè)非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，祀分子是抗體。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述祀 分子是免疫球蛋白。在生產(chǎn)和/或純化過程中，祀分子通常存在于液體中。液體可W是水、 緩沖液、非-水性溶劑像乙醇或其任何混合物。除了祀分子，所述液體還可包含一或多種雜 質(zhì)。液體的組成可在生產(chǎn)和/或純化期間根據(jù)進(jìn)行的過程步驟而改變。在色譜步驟后，由 于色譜步驟所用的洗脫劑，液體通常包含比之前更多的其它溶劑。典型地只有經(jīng)過最后的 純化步驟后，祀分子才可被干燥，供制備最終的劑型。
[0027] 術(shù)語"抗體"指具有特異性地結(jié)合于抗原的能力的蛋白質(zhì)。"抗體"或"IgG"還 指基本上由一種或多種免疫球蛋白基因或其片段編碼的多膚，其特異性地結(jié)合和識(shí)別分析 物（抗原）。識(shí)別的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、丫、5、ε和μ恒定區(qū)基因，W及無 數(shù)免疫球蛋白可變區(qū)基因。輕鏈被分類為或者Κ或者λ。重鏈被分類為丫、μ、α、δ或 ε，其依次分別定義免疫球蛋白種類IgG、IgM、IgA、I曲和I姐。
[0028] 一種示例性免疫球蛋白（抗體）結(jié)構(gòu)單元由兩對(duì)多膚鏈組成，每一對(duì)具有一條" 輕鏈（約25kD)和一條"重"鏈（約50-70kD)，所述鏈，例如，通過鏈間二硫鍵穩(wěn)定。每 條鏈的N-末端限定一個(gè)主要負(fù)責(zé)抗原識(shí)別的約100-110或更多氨基酸的可變區(qū)。術(shù)語可 變輕鏈（VL)和可變重鏈（VH)分別指運(yùn)些輕鏈和重鏈。
[0029] 抗體可W是單克隆