專利名稱：β－淀粉樣前體蛋白和泛素－B的移碼突變體和它們的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及治療和/或預(yù)防早老性癡呆和唐氏綜合癥的肽。早老性癡呆和唐氏綜合癥的治療都與β淀粉樣前體蛋白(βAPP)和泛素-B(Ubi-B)的編碼過(guò)程中轉(zhuǎn)錄水平上或RNA的轉(zhuǎn)錄后編輯中發(fā)生的移碼突變相關(guān)。這樣的移碼突變產(chǎn)生了特征為在羧基末端處的異常蛋白質(zhì)序列的突變?chǔ)翧PP和Ubi-B蛋白質(zhì)產(chǎn)物。包含突變?chǔ)翧PP或Ubi-B蛋白質(zhì)產(chǎn)物的異常部分的全部或部分的肽引發(fā)了T細(xì)胞免疫性，所以可以用于治療早老性癡呆和唐氏綜合癥的組合物中。另外，本發(fā)明的肽可以用作預(yù)防性的抗早老性癡呆疫苗。
本發(fā)明還涉及編碼對(duì)應(yīng)于早老性癡呆和唐氏綜合癥患者中發(fā)現(xiàn)的異常βAPP和Ubi-B蛋白質(zhì)序列的肽的DNA序列，并涉及含有至少一個(gè)插入位點(diǎn)的載體，所述插入位點(diǎn)含有編碼至少一個(gè)這樣的肽的DNA序列。
另外，本發(fā)明涉及治療和/或預(yù)防早老性癡呆的方法，該方法是通過(guò)施用至少一個(gè)突變?chǔ)翧PP和/或Ubi-B肽或者含有至少一個(gè)插入位點(diǎn)的重組病毒載體，所述插入位點(diǎn)含有編碼至少一個(gè)突變?chǔ)翧PP和/或一個(gè)突變Ubi-B肽的DNA序列。
本發(fā)明體現(xiàn)了治療和/或預(yù)防早老性癡呆的方法的發(fā)展，它基于利用肽來(lái)激活身體自己的免疫系統(tǒng)的T細(xì)胞臂(T cellular arm)抵抗產(chǎn)生與早老性癡呆相關(guān)的突變?chǔ)翧PP和Ubi-B蛋白產(chǎn)物的細(xì)胞。
早老性癡呆的治療方法的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用也可以直接用于患有唐氏綜合癥的患者的治療。
背景技術(shù)：
對(duì)應(yīng)于從癌細(xì)胞的基因中的移碼突變產(chǎn)生的異常蛋白質(zhì)序列的肽引發(fā)了特異性T細(xì)胞免疫性，并且可以用作抗癌疫苗(參見(jiàn)NorskHydro ASA在與本發(fā)明相同的日期遞交的挪威專利申請(qǐng))。以同樣的方式，可以將對(duì)應(yīng)于從與其它疾病相關(guān)的移碼突變產(chǎn)生的異常蛋白質(zhì)序列的肽用于基于產(chǎn)生特定性T細(xì)胞免疫性而開(kāi)發(fā)這些疾病的治療方法。
移碼突變?cè)诘鞍踪|(zhì)的C末端部分產(chǎn)生了全新的氨基酸序列，在成熟之前終止在新的終止密碼子出現(xiàn)的地方。這產(chǎn)生了兩個(gè)重要的后果1)從移碼產(chǎn)生的截短的蛋白質(zhì)通常是沒(méi)有功能的，在大多數(shù)情況下，導(dǎo)致重要的細(xì)胞功能的“剔除”。異常的蛋白質(zhì)也可以獲得新的功能如聚集和形成斑塊的能力。在這兩種情況中，移碼導(dǎo)致了疾病。
2)對(duì)于身體而言，從移碼產(chǎn)生的異常的新的C末端氨基酸序列是外來(lái)的。它在突變之前是不存在的，它只存在于具有突變的細(xì)胞中。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的突變部分完全是新的，所以對(duì)載體的免疫系統(tǒng)是外來(lái)的，它們可以被載體的所有組成成分中的T細(xì)胞識(shí)別。迄今，還沒(méi)有人著重研究移碼突變的這一方面，并且還沒(méi)有報(bào)道把蛋白質(zhì)的編碼區(qū)產(chǎn)生的移碼肽鑒定為抗原。所以，這一構(gòu)思是新的，并且形成了開(kāi)發(fā)基于這些序列的疫苗的基礎(chǔ)。由此可見(jiàn)，這些疫苗也可以在遺傳了缺陷性基因，或以其它方式傾向于移碼突變的人中預(yù)防性地使用。所以，這樣的疫苗將填充抵抗遺傳形式的疾病的治療裝備中的空缺。
已經(jīng)顯示，在細(xì)胞內(nèi)的“自身”蛋白質(zhì)中的單個(gè)氨基酸的取代可以產(chǎn)生腫瘤排斥抗原，其中包括與正常肽在氨基酸序列上有區(qū)別的肽。識(shí)別在腫瘤細(xì)胞表面上的主要組織相容性(MHC)分子中的這些肽的T細(xì)胞能夠殺死腫瘤細(xì)胞，所以從宿主排斥腫瘤。
與B細(xì)胞產(chǎn)生的抗體相反，T細(xì)胞只有抗原被結(jié)合并且由MHC分子呈遞時(shí)才識(shí)別抗原，而B(niǎo)細(xì)胞通常識(shí)別呈天然構(gòu)象的游離抗原并且進(jìn)一步可能識(shí)別抗原表面上暴露的差不多所有位點(diǎn)。通常這一結(jié)合只發(fā)生在適當(dāng)?shù)目乖庸ず?，該過(guò)程包括蛋白質(zhì)的蛋白酶裂解，所以產(chǎn)生的肽片段與MHC分子的溝相適合。因此，T細(xì)胞還能夠識(shí)別起源于細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)的肽。所以，T細(xì)胞能識(shí)別細(xì)胞表面的MHC分子中起源于細(xì)胞任何地方的異常肽，并且隨后能夠被激活而消除含有異常蛋白質(zhì)的細(xì)胞。
M.Barinaga，科學(xué)(Science),257,880-881,1992提供了一篇MHC如何結(jié)合肽的短綜述。在D.Male等人1987年的《高等免疫學(xué)》(Advanced Immunology)J.B.lippincott Company,Philadelaphia中可以發(fā)現(xiàn)對(duì)這一發(fā)明的技術(shù)背景的更綜合性的解釋。這兩篇文獻(xiàn)都全文在此并入本文。
人的MHC分子通常被稱為HLA(人白細(xì)胞抗原)分子。它們是由人6號(hào)染色體上的HLA區(qū)編碼的。
根據(jù)編碼它們的染色體的區(qū)和與它們相互作用從而最初地激活的T細(xì)胞亞群，HLA分子表現(xiàn)為兩個(gè)不同的類別。Ⅰ類分子是由HLA A,B和C亞基因座(subloci)編碼的，它們最初激活CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞。HLAⅡ類分子是由DR,DP和DQ亞基因座編碼的，最初激活CD4+T細(xì)胞，既有輔助細(xì)胞又有細(xì)胞毒性細(xì)胞。
通常，每個(gè)個(gè)體具有6個(gè)HLAⅠ類分子，通常兩個(gè)來(lái)自A,B和C三個(gè)組的各組。相應(yīng)地，所有個(gè)體也選擇自己的HLAⅡ類分子，同樣其中兩個(gè)來(lái)自DP,DQ和DR三個(gè)組的各組。組A,B,C和DP,DQ和DR的每一個(gè)再分為幾個(gè)亞組。在一些情況下，由于兩個(gè)HLA亞組的交疊，不同的HLAⅠ類或Ⅱ類分子的數(shù)目減少了。
所有的基因產(chǎn)物是高度多態(tài)性的。所以，不同的個(gè)體表達(dá)區(qū)別于其它個(gè)體的不同HLA分子。這是尋找移植時(shí)HLA匹配器官供體中的困難的根源。HLA分子作為免疫應(yīng)答基因的作用反映了它們的遺傳變異在免疫生物學(xué)中的意義。通過(guò)它們的肽結(jié)合能力，某些HLA分子的有無(wú)控制了個(gè)體應(yīng)答肽表位的能力。結(jié)果，HLA分子決定了對(duì)疾病的抗性或敏感性。
T細(xì)胞可以通過(guò)各種機(jī)制控制產(chǎn)生異常蛋白質(zhì)的細(xì)胞的發(fā)育和生長(zhǎng)。細(xì)胞毒性T細(xì)胞，既有限制在HLAⅠ類的CD8+又有限制在HLAⅡ類的CD4+，可以直接殺死攜帶適當(dāng)抗原的細(xì)胞。CD4+輔助T細(xì)胞是細(xì)胞毒性CD8+T細(xì)胞應(yīng)答以及抗體應(yīng)答，和誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞和LAK細(xì)胞殺傷所需要的。
HLAⅠ類和Ⅱ類結(jié)合兩者都需要肽必須含有通常在不同的HLA組和亞組中不同的結(jié)合基序。結(jié)合基序的特征在于，需要某些類型的氨基酸，例如在肽的確定位置攜帶大的和疏水性或帶正電的側(cè)基從而獲得與HLA結(jié)合溝的口袋的嚴(yán)格配合的那些氨基酸。這以及在結(jié)合溝中的肽長(zhǎng)度限制在8-10個(gè)氨基酸的結(jié)果是，結(jié)合一個(gè)類型的HLAⅠ類分子的肽同樣結(jié)合另一類型是不太可能的。所以，例如，HLA-A1和HLA-A2亞組(二者都屬于Ⅰ類)的肽結(jié)合基序與HLA-Al和HLA-B1分子的基序同樣不同是非?？赡艿?。
因?yàn)橥瑯拥脑?，完全相同的氨基酸序列定位于不同的Ⅱ類分子的結(jié)合溝中是不可能的。在HLAⅡ類分子的情況中，肽的結(jié)合序列可能更長(zhǎng)，并且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)它們通常含有10到16個(gè)氨基酸，其中在一個(gè)或兩個(gè)末端的一些氨基酸不是HLA溝的結(jié)合基序的一部分。
但是，可能發(fā)生幾個(gè)HLAⅠ類和Ⅱ類分子的不同肽結(jié)合基序的交疊。據(jù)說(shuō)在至少兩個(gè)不同的HLA分子的結(jié)合序列中存在交疊的肽含有“嵌套的T細(xì)胞表位”。在“嵌套表位肽”中含有的各種表位可以通過(guò)抗原呈遞細(xì)胞對(duì)肽的加工而形成，然后被呈遞給結(jié)合到不同HLA分子上的T細(xì)胞。在人的HLA分子的個(gè)別種類使含有嵌套表位的肽比只能夠結(jié)合一個(gè)類型的HLA分子的肽更加可用作通用的疫苗。
只有在患者中至少一個(gè)類型的HLAⅠ類和/或Ⅱ類分子可以結(jié)合全長(zhǎng)的或被患者自身的抗原呈遞細(xì)胞加工和修整后的疫苗肽時(shí)，才能獲得個(gè)體的有效接種。
肽作為大多數(shù)群體的通用疫苗的效用隨著它以其全長(zhǎng)或在被抗原呈遞細(xì)胞加工后可以結(jié)合的不同的HLA分子的數(shù)目而增強(qiáng)。
為了將起源于細(xì)胞中的突變事件產(chǎn)生的異常蛋白質(zhì)的肽用作產(chǎn)生CD4+和/或CD8+T細(xì)胞的疫苗或治療劑，有必要研究討論中的突變蛋白質(zhì)，并且鑒定最終被抗原呈遞細(xì)胞加工成更短的肽后能夠刺激T細(xì)胞的肽。
定義本發(fā)明解決的問(wèn)題到目前為止，還沒(méi)有藥物或其它治療方法能夠消除在患有早老性癡呆的患者的腦中產(chǎn)生引起變性過(guò)程的異常蛋白質(zhì)的細(xì)胞。治療和預(yù)防早老性癡呆始終是需要的。本發(fā)明將提供新的能夠用作早老性癡呆的治療和預(yù)防的肽。我們的方法的目的是直接消除引起變性過(guò)程的細(xì)胞。
該肽也可以用于患有唐氏綜合癥的患者的治療。
本發(fā)明的定義本發(fā)明的主要目的是獲得可以用于刺激T細(xì)胞的對(duì)應(yīng)于早老性癡呆和/或唐氏綜合癥患者中發(fā)現(xiàn)的異常βAPP和Ubi-B蛋白質(zhì)的肽片段的肽。
本發(fā)明的另一個(gè)主要目的是開(kāi)發(fā)一種治療早老性癡呆的方法，該方法基于可以在患者中利用本發(fā)明的肽體內(nèi)或從體內(nèi)刺激T細(xì)胞來(lái)誘導(dǎo)的T細(xì)胞免疫性。
本發(fā)明的第三個(gè)目的是開(kāi)發(fā)一種唯一地或部分地基于對(duì)應(yīng)于本發(fā)明的肽的肽的、預(yù)防早老性癡呆的產(chǎn)生的疫苗，這些肽可以用于產(chǎn)生和激活T細(xì)胞，該T細(xì)胞產(chǎn)生對(duì)抗產(chǎn)生突變?chǔ)翧PP和突變Ubi-B蛋白質(zhì)的細(xì)胞的細(xì)胞毒性T細(xì)胞免疫性。
本發(fā)明的第四個(gè)主要目的是設(shè)計(jì)一種特異地適用于需要治療或預(yù)防早老性癡呆的人個(gè)體的治療或預(yù)防早老性癡呆的方法，包括施用至少一種本發(fā)明的肽。
本發(fā)明的第五個(gè)目的是獲得一種利用與治療早老性癡呆相同的方法治療患有唐氏綜合癥的患者的方法。
本發(fā)明的這些和其它目的由所附權(quán)利要求書(shū)實(shí)現(xiàn)了。
移碼突變可以在基因水平，轉(zhuǎn)錄水平或RNA的轉(zhuǎn)錄后編輯中發(fā)生，并且產(chǎn)生了成熟前的終止密碼子，所以往往缺失了蛋白質(zhì)的一些大的部分。從移碼突變產(chǎn)生的異常蛋白質(zhì)通常沒(méi)有被認(rèn)為是免疫原性的，因而也沒(méi)有被視為免疫治療的靶。于是，現(xiàn)在已經(jīng)驚人地發(fā)現(xiàn)，對(duì)應(yīng)于與早老性癡呆和唐氏綜合癥相關(guān)的移碼突變產(chǎn)生的異常蛋白質(zhì)的一組新肽可用于引發(fā)抵抗產(chǎn)生這些異常蛋白質(zhì)的細(xì)胞的T細(xì)胞應(yīng)答。
含有單核苷堿基重復(fù)序列(如脫氧腺苷堿基的)或二核苷堿基重復(fù)序列(如脫氧胞嘧啶-脫氧胸苷單位的)的基因?qū)σ拼a突變是敏感的。分別通過(guò)在重復(fù)序列中插入一個(gè)或兩個(gè)單核苷堿基殘基或者一個(gè)或兩個(gè)二核苷堿基單位，或通過(guò)在重復(fù)序列中缺失一個(gè)或兩個(gè)單核苷堿基殘基或者一個(gè)或兩個(gè)二核苷堿基單位，產(chǎn)生移碼突變。移碼突變將從突變點(diǎn)開(kāi)始編碼含有新的和完全不同的氨基酸序列的蛋白質(zhì)(與正常的蛋白質(zhì)相比)。在羧基末端含有新氨基酸序列的這一突變蛋白質(zhì)將是特異于已經(jīng)發(fā)生這樣的移碼突變的所有細(xì)胞的。
在這一說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)的其余部分，移碼突變肽的定義將包括這些蛋白質(zhì)和其肽片段。
這些肽至少是8個(gè)氨基酸長(zhǎng)并且對(duì)應(yīng)于與早老性癡呆和/或唐氏綜合癥相關(guān)的移碼突變?chǔ)翧PP和/或Ubi-B蛋白質(zhì)序列。
本發(fā)明的肽的其特征在于，它a)至少長(zhǎng)為8個(gè)氨基酸，并且是從與早老性癡呆或唐氏綜合癥相關(guān)的移碼突變產(chǎn)生的突變?chǔ)翧PP和/或Ubi-B的片段；和b)含有突變?chǔ)翧PP和/或Ubi-B蛋白質(zhì)的突變部分的至少一個(gè)氨基酸；和c)含有對(duì)應(yīng)于在突變序列的氨基末端前面的蛋白質(zhì)序列的正常部分的羧基末端的0-10個(gè)氨基酸，并且可以進(jìn)一步延伸到如相關(guān)的移碼突變產(chǎn)生的新的終止密碼子所確定的蛋白質(zhì)的突變部分的羧基末端；和d)以它的全長(zhǎng)或在被抗原呈遞細(xì)胞加工后，誘導(dǎo)T細(xì)胞應(yīng)答。
本發(fā)明的肽優(yōu)選地含有8-25,9-20,9-16,8-12或20-25個(gè)氨基酸。它們例如可以含有9,12,13,16或21個(gè)氨基酸。
本發(fā)明的肽最優(yōu)選地至少是9個(gè)氨基酸長(zhǎng)，例如9-18個(gè)氨基酸長(zhǎng)，但由于抗原呈遞細(xì)胞的加工可能性，更長(zhǎng)的肽也是非常適合本發(fā)明的。所以，如果整個(gè)突變氨基酸序列含有8個(gè)氨基酸或更多，它可用作本發(fā)明的移碼突變肽。本發(fā)明進(jìn)一步涉及傾向于患早老性癡呆的人的接種方法，包括以足夠誘導(dǎo)對(duì)突變?chǔ)翧PP和/或Ubi-B蛋白質(zhì)的T細(xì)胞免疫性的量，一次或多次施用本發(fā)明的至少一個(gè)肽。
本發(fā)明也涉及治療患有早老性癡呆的患者的方法，包括以足以誘導(dǎo)對(duì)突變?chǔ)翧PP和/或Ubi-B蛋白質(zhì)的T細(xì)胞免疫性的量，一次或多次施用本發(fā)明的至少一個(gè)肽。
本發(fā)明也涉及治療患有唐氏綜合癥的患者的方法，包括以足以誘導(dǎo)對(duì)突變?chǔ)翧PP和/或Ubi-B蛋白質(zhì)的T細(xì)胞免疫性的量，一次或多次施用本發(fā)明的至少一個(gè)肽。
本發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明在本發(fā)明的說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中，如本領(lǐng)域已知，氨基酸是用單字母縮寫(xiě)表示的。
本發(fā)明的肽是由與早老性癡呆和唐氏綜合癥相關(guān)的βAPP和Ubi-B移碼突變舉例說(shuō)明的
在早老性癡呆和唐氏綜合癥患者中，在纏結(jié)，神經(jīng)纖維網(wǎng)線和神經(jīng)炎斑中蛋白質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的沉積是與導(dǎo)致癡呆的神經(jīng)元功能障礙相關(guān)的(R.D.Terry等人在《早老性癡呆癥》(Alzheimer Disease)中，R.D.Terry,R.Katzman,K.L.Bick編輯(Raven，紐約，1994)pp.179-196)。已經(jīng)顯示這些蛋白質(zhì)沉積物含有在羧基末端處異常的β淀粉樣前體蛋白質(zhì)(βAPP)和泛素-B(Ubi-B)的形式，并且進(jìn)一步顯示這些異常的蛋白質(zhì)序列是可能在轉(zhuǎn)錄水平上或RNA的轉(zhuǎn)錄后編輯中發(fā)生的移碼突變的結(jié)果(F.W.van Leeuwen等人，科學(xué)，279卷，242-247頁(yè))。
在βAPP的情況中，已經(jīng)觀察到兩個(gè)移碼突變，一個(gè)是從外顯子9中的(ACC)GAGAGAGA(ATG)序列中缺失二核苷脫氧鳥(niǎo)苷-脫氧腺苷(GA)單位而產(chǎn)生的，一個(gè)是從外顯子10中的(CAT)GAGAGA(ATG)序列中缺失GA單位而產(chǎn)生的。表1中表示了從這些移碼突變產(chǎn)生的突變?chǔ)翧PP肽。含有seq id nos 1和4的肽是βAPP蛋白質(zhì)序列的突變部分，含有seq idnos 2,3和5的肽代表了延伸到氨基末端的正常βAPP序列的突變肽。
表1正常βAPP；RLEAKHRERMSQVMREWEEAERQAKNLPKseq id no 1，NVPGHERMGRGRTSSKELAseq id no 2；RLEAKHRENVPGHERMGRGRTSSKELAseq id no 3；RLEAKHRENVPGHERMGseq id no 4；MGRGRTSSKELAseq id no 5；ERMSQVMRMGRGRTS同樣，在Ubi-B的情況中，已經(jīng)觀察到兩個(gè)移碼突變，一個(gè)是從外顯子中的(TCT)GAGAGGT(GGT)序列中缺失二核苷脫氧鳥(niǎo)苷-脫氧胸苷(GT)單位而產(chǎn)生的，一個(gè)是從外顯子3中的(TCA)CTCT(GGA)序列中缺失二核苷脫氧胞嘧啶-脫氧胸苷(CT)單位而產(chǎn)生的。表2中顯示了從這些移碼突變產(chǎn)生的突變Ubi-B肽。含有seq id nos 6和9的肽是Ubi-B蛋白質(zhì)序列的突變部分，含有seq id nos 7,8和10的肽代表了延伸到氨基末端的正常Ubi-B序列的突變肽。
表2．正常Ubi-B；HLVLRLRGGMQIFVKTLTGKTITLEVEPSDseq id no 6；YADLREDPDRQDHHPGSGAQseq id no 7；HLVLRLRGYADLREDPDRQDHHPGSGAQseq id no 8； HLVLRLRGYADLREDPDseq id no 9；GGGAQseq id no10；TLTGKTITGGGAQ突變?chǔ)翧PP和Ubi-B蛋白質(zhì)只是相應(yīng)的移碼突變已經(jīng)發(fā)生的細(xì)胞編碼的，并且所以是早老性癡呆和唐氏綜合癥的特異免疫治療的靶。
根據(jù)本發(fā)明，對(duì)應(yīng)于突變?chǔ)翧PP和突變Ubi-B蛋白質(zhì)的肽可以用于引發(fā)T細(xì)胞免疫性和特異地殺死產(chǎn)生突變?chǔ)翧PP和突變Ubi-B蛋白質(zhì)的細(xì)胞，這些蛋白質(zhì)在早老性癡呆和唐氏綜合癥患者中是與導(dǎo)致呆癡的神經(jīng)元功能障礙相關(guān)的。本發(fā)明的其它肽可以是上面的表1和表2中列出的肽的片段。這樣的片段最優(yōu)選地是9-16個(gè)氨基酸長(zhǎng)，并且包括來(lái)自蛋白質(zhì)的突變部分的至少一個(gè)氨基酸。
如本說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中所用，術(shù)語(yǔ)“片段”是指更長(zhǎng)的肽或蛋白質(zhì)的較短部分。
合成利用連續(xù)流動(dòng)固相肽合成法合成這些肽。利用具有適當(dāng)側(cè)鏈保護(hù)的N-a-Fmoc-氨基酸。激活Fmoc-氨基酸，作為五氟苯基酯偶聯(lián)，或在偶聯(lián)之前利用TBTU或二異丙基碳二亞胺活化。在DMF中的20％吡啶被用于在每次偶聯(lián)之后選擇性地除去Fmoc。用95％的含有適當(dāng)清除劑的TFA將側(cè)鏈保護(hù)從樹(shù)脂裂解和最后除去。純化肽并且利用反相(C18)HPLC分析。利用電噴霧質(zhì)譜法證實(shí)了這些肽的同一性(Finniganmat SSQ 710)。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以應(yīng)用幾個(gè)其它的公知方法合成肽。
本發(fā)明的肽可以用于具有產(chǎn)生移碼突變?chǔ)翧PP和Ubi-B蛋白質(zhì)的細(xì)胞的早老性癡呆和唐氏綜合癥患者的治療方法中，該治療方法包括對(duì)需要這樣的治療的患者體內(nèi)或從體內(nèi)施用本發(fā)明的至少一個(gè)肽。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽可以用于接種傾向于患早老性癡呆的人，方法是對(duì)所述的人施用本發(fā)明的至少一個(gè)肽。
另外，人們認(rèn)為對(duì)人施用本發(fā)明的肽的混合物是有利的，這樣本發(fā)明的每個(gè)肽就可以結(jié)合個(gè)體的不同類型的HLAⅠ類和/或Ⅱ類分子。
為了加強(qiáng)如本領(lǐng)域已知的免疫應(yīng)答，認(rèn)為可以將這些肽同時(shí)或分別地與化合物(如細(xì)胞因子和/或生長(zhǎng)因子，即，白介素-2(IL-2)，白介素-12(IL-12)，粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)，或諸如此類)一起施用。
可以將本發(fā)明的這些肽單獨(dú)地或與其它物質(zhì)(例如標(biāo)準(zhǔn)佐劑)組合地或以如本領(lǐng)域已知的可以誘導(dǎo)高親和力的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的脂肽共軛物的形式用于疫苗或治療組合物中(K.Deres，自然(Nature)，342卷(nov,1989))。
本發(fā)明的肽包括在基于肽或重組片段的疫苗中可能是有用的。
本發(fā)明的肽可以與常用的添加劑、稀釋劑、穩(wěn)定劑或如本領(lǐng)域已知的那些組分一起包括在藥物組合物或疫苗中。
根據(jù)本發(fā)明，藥物組合物或疫苗可以含有單獨(dú)的肽或與至少一種藥物可接受載體或稀釋劑組合的肽。
另外，疫苗或治療組合物可以含有選擇的肽，它們是與早老性癡呆和唐氏綜合癥相關(guān)的突變?chǔ)翧PP和Ubi-B蛋白質(zhì)的片段。
本發(fā)明的疫苗還可以作為產(chǎn)生T細(xì)胞免疫性的肽混合物對(duì)普通群體給藥，所述T細(xì)胞免疫性是抵抗可能發(fā)生與早老性癡呆和唐氏綜合癥相關(guān)的βAPP和Ubi-B移碼突變的細(xì)胞的。
本發(fā)明的肽可以作為單個(gè)肽或作為肽的混合物給藥?；蛘?，肽可以共價(jià)地相互連接，形成更大的多肽或甚至環(huán)多肽。
作為主要的目的，為了引發(fā)抵抗與早老性癡呆和唐氏綜合癥相關(guān)的突變?chǔ)翧PP和Ubi-B基因產(chǎn)物的特異性T細(xì)胞免疫性，可以體內(nèi)或從體內(nèi)采用本發(fā)明的早老性癡呆和唐氏綜合癥的治療方案。
另外，可以通過(guò)各種途徑，包括但不限于皮下、肌內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)或諸如此類，對(duì)患者施用本發(fā)明的移碼突變肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)皮內(nèi)施用本發(fā)明的肽。可以以治療或預(yù)防有效量在單個(gè)或多個(gè)注射位點(diǎn)對(duì)患者施用本發(fā)明的肽。
根據(jù)被治療的患者的需要，可以只一次或幾次，例如重復(fù)在1-2個(gè)月的時(shí)期內(nèi)每周一次施用本發(fā)明的肽。
對(duì)待接種的一般病人或個(gè)體可以施用1微克(1μg)到1克(1g)范圍內(nèi)的本發(fā)明的肽。每次給藥利用范圍在1微克(1μg)到1毫克(1mg)范圍內(nèi)的更小劑量是優(yōu)選的。
本發(fā)明另外也包括編碼移碼突變肽的DNA序列。
對(duì)個(gè)體可以施用DNA疫苗形式的本發(fā)明的肽。編碼這些肽的DNA可以呈克隆化質(zhì)粒DNA或合成寡核苷酸的形式。DNA可以與細(xì)胞因子(如IL-2)和/或其它共同刺激分子一起遞送。細(xì)胞因子和/或共同刺激分子本身可以質(zhì)?；蚬押塑账酓NA的形式遞送。已經(jīng)顯示，對(duì)DNA疫苗的應(yīng)答將因免疫刺激DNA序列(ISS)的存在而加強(qiáng)。這些可以采取含有甲基化CpG的六聚體基序的形式，通式5’-嘌呤-嘌呤-CG-嘧啶-嘧啶-3’。所以，我們的DNA疫苗可以在編碼肽的DNA中，在編碼細(xì)胞因子或其它共同刺激分子中或在兩者中摻入這些或其它ISS。Tighe等人提供了DNA接種的優(yōu)點(diǎn)的綜述(1998，今日免疫學(xué)(Immunologytoday),19(2),89-97)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，編碼突變?chǔ)翧PP和突變Ubi-B肽的DNA序列含有正常的βAPP基因序列(外顯子9和10)。
重復(fù)1GAG AGG CTT GAG GCC AAG CAC CGA GAG AGA ATG TCC CAG GTC ATG重復(fù)2AGA GAA TGG GAA GAG GCA GAA CGT CAA GCA AAG AAC TTG CCT AAA突變?chǔ)翧PP基因序列，其中從重復(fù)1中缺失了GA。GAG AGG CTT GAG GCC AAG CAC CGA GAG AAT GTC CCA GGT CAT GAGAGA ATG GGA AGA GGC AGA ACG TCA AGC AAA GAA CTT GCC TAA突變?chǔ)翧PP基因序列，其中從重復(fù)2中缺失了GA。GAG AGG CTT GAG GCC AAG CAC CGA GAG AGA ATG TCC CAG GTC ATGAGA ATG GGA AGA GGC AGA ACG TCA AGC AAA GAA CTT GCC TAA正常的Ubi-B基因(外顯子)序列。
缺失基序CAC CTG GTC CTG CGT CTG AGA GGT GGT ATG CAG ATC TTC GTG AAGACC CTG ACC GGC AAG ACC ATC ACC CTG GAA GTG GAG CCC AGT GAC突變Ubi-B基因序列，其中從缺失基序中缺失了GT。CAC CTG GTC CTG CGT CTG AGA GGG TAT GCA GAT CTT CGT GAA GACCCT GAC CGG CAA GAC CAT CAC CCT GGA AGT GGA GCC CAG TGA正常的Ubi-B基因(外顯子2)序列。CAC CTG GTC CTG CGT CTG AGA GGT GGT ATG CAG ATC TTC GTG AAGCT重復(fù)ACC CTG ACC GGC AAG ACC ATC ACT CTG GAG GTG GAG CCC AGT GAC突變Ubi-B基因序列，其中從CT重復(fù)中缺失了CT。CAC CTG GTC CTG CGT CTG AGA GGT GGT ATG CAG ATC TTC GTG AAGACC CTG ACC GGC AAG ACC ATC ACT GGA GGT GGA GCC CAG TGA本發(fā)明進(jìn)一步包括載體和質(zhì)粒，它們含有編碼至少一個(gè)移碼突變?chǔ)翧PP和/或Ubi-B肽的DNA序列。這些載體包括但不限于大腸桿菌質(zhì)粒，李斯特菌屬載體和重組病毒載體。重組病毒載體包括但不限于含有編碼突變?chǔ)翧PP和/或Ubi-B肽的DNA序列的正痘病毒，金絲雀病毒，山羊痘病毒，豬痘病毒，牛痘，桿狀病毒，人腺病毒，SV40，牛乳頭瘤病毒。
通過(guò)對(duì)患者施用有效量的重組病毒載體或質(zhì)粒也可以達(dá)到對(duì)早老性癡呆和唐氏綜合癥的治療或早老性癡呆的預(yù)防，所述載體或質(zhì)粒包含至少一個(gè)含有編碼移碼突變肽的DNA序列的插入位點(diǎn)，從而將患者的抗原呈遞細(xì)胞轉(zhuǎn)移到載體/質(zhì)粒的宿主細(xì)胞，并且實(shí)現(xiàn)HLA/移碼突變肽復(fù)合物的呈遞。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員將發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明的肽相關(guān)的其它可能的用途，這些用途包括在權(quán)利要求書(shū)的范圍內(nèi)。
通過(guò)本領(lǐng)域的常規(guī)方法，如化學(xué)肽合成，重組DNA技術(shù)或由移碼突變?chǔ)翧PP基因和Ubi-B基因編碼的蛋白質(zhì)或肽的蛋白酶裂解可以生產(chǎn)本發(fā)明的肽。在下面的敘述中闡述了一個(gè)化學(xué)合成法。
通過(guò)本發(fā)明可以獲得下面的優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明提供了治療患有與移碼突變?chǔ)翧PP和Ubi-B基因產(chǎn)物相關(guān)的早老性癡呆和唐氏綜合癥的患者的可能性，目前知道這些患者還沒(méi)有任何好的治療替代方法。
另外，本發(fā)明提供了為抵抗早老性癡呆的發(fā)作而對(duì)人進(jìn)行預(yù)防性接種的可能性。
序列表所有序列的共同點(diǎn)序列類型肽序列單位氨基酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性SEQ ID NO: 1序列長(zhǎng)度19個(gè)氨基酸N V P G H E R M G R G R T S S K E L A1 5 1015SEQ ID NO: 2序列長(zhǎng)度27個(gè)氨基酸R L E A K H R E N V P G H E R M G R G R T S S K E L A1 510 152025SEQ ID NO: 3序列長(zhǎng)度17個(gè)氨基酸R L E A K H R E N V P G H E R M G1 5 1015SEQ ID NO: 4序列長(zhǎng)度12個(gè)氨基酸M G R G R T S S K E L A1 5 10SEQ ID NO: 5序列長(zhǎng)度15個(gè)氨基酸E R M S Q V M R M G R G R T S1 5 1015SEQ ID NO: 6序列長(zhǎng)度20個(gè)氨基酸Y A D L R E D P D R Q D H H P G S G A Q1 5 101520SEQ ID NO: 7序列長(zhǎng)度28個(gè)氨基酸H L V L R L R G Y A D L R E D P D R Q D H H P G S G A Q1 5 10152025SEQ ID NO: 8序列長(zhǎng)度17個(gè)氨基酸H L V L R L R G Y A D L R E D P D1 5 1015SEQ ID NO: 9序列長(zhǎng)度5個(gè)氨基酸G G G A Q1 5SEQ ID NO: 10序列長(zhǎng)度13個(gè)氨基酸T L T G K T I T G G G A Q1 5 10
權(quán)利要求
1．一種肽，其特征在于，它a)至少長(zhǎng)為8個(gè)氨基酸，并且是從與早老性癡呆和/或唐氏綜合癥相關(guān)的移碼突變產(chǎn)生的突變?chǔ)翧PP和/或Ubi-B蛋白質(zhì)的片段；和b)含有突變?chǔ)翧PP和/或Ubi-B蛋白質(zhì)的突變部分的至少一個(gè)氨基酸；和c)含有對(duì)應(yīng)于在突變序列的氨基末端前面的蛋白質(zhì)序列的正常部分的羧基末端的0-10個(gè)氨基酸并且可以進(jìn)一步延伸到如相關(guān)移碼突變產(chǎn)生的新的終止密碼子所確定的蛋白質(zhì)的突變部分的羧基末端；和d)以它的全長(zhǎng)或在被抗原呈遞細(xì)胞加工后，誘導(dǎo)T細(xì)胞應(yīng)答。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽，其特征在于，它含有8-25個(gè)氨基酸。
3．根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽，其特征在于，它含有9-20個(gè)氨基酸。
4．根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽，其特征在于，它含有9-16個(gè)氨基酸。
5．根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽，其特征在于，它含有8-12個(gè)氨基酸。
6．根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽，其特征在于，它含有20-25個(gè)氨基酸。
7．根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽，其特征在于，它含有9個(gè)氨基酸。
8．根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽，其特征在于，它含有12個(gè)氨基酸。
9．根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽，其特征在于，它含有13個(gè)氨基酸。
10．根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽，其特征在于，它選自具有下面序列號(hào)的一組肽seq id no.1-seq id no.10或其中任何一個(gè)的片段。
11．含有上面的權(quán)利要求中任何一個(gè)所述的肽和藥物可接受載體或稀釋劑的藥物組合物。
12．含有權(quán)利要求1-10中任何一個(gè)所述的肽和藥物可接受載體或稀釋劑的用于早老性癡呆的疫苗。
13．根據(jù)權(quán)利要求1-10中任何一個(gè)所述的肽在制備用于治療或預(yù)防早老性癡呆或者治療唐氏綜合癥的藥物組合物中的用途。
14．接種患有或傾向于患早老性癡呆的患者的方法，包括以足以誘導(dǎo)對(duì)與早老性癡呆和/或唐氏綜合癥相關(guān)的突變?chǔ)翧PP和/或突變Ubi-B肽的特異性T細(xì)胞免疫性的量一次或多次施用權(quán)利要求1-10中至少一種肽。
15．根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中肽的每次施用量范圍是1微克(1μg)到1克(1g)，優(yōu)選范圍是1微克(1μg)到1毫克(1mg)。
16．治療患有早老性癡呆或唐氏綜合癥的患者的方法，該方法是通過(guò)用權(quán)利要求1-10所述的肽體內(nèi)或從體內(nèi)刺激進(jìn)行的。
17．根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中肽的每次施用量范圍是1微克(1μg)到1克(1g)，優(yōu)選范圍是1微克(1μg)到1毫克(1mg)。
18．含有編碼權(quán)利要求1所述的移碼突變肽的DNA序列或其變異體的分離的DNA序列。
19．編碼含有seq.id.no:1-10或其變異體的肽的權(quán)利要求18所述的分離的DNA序列。
20．根據(jù)權(quán)利要求18-19中任何一個(gè)所述的DNA序列在制備用于治療或預(yù)防早老性癡呆或者治療唐氏綜合癥的藥物組合物中的用途。
21．治療患有或傾向于患早老性癡呆或者患有唐氏綜合癥的患者的方法，該方法通過(guò)用權(quán)利要求18-19所述的DNA序列體內(nèi)或從體內(nèi)刺激進(jìn)行的。
22．一種質(zhì)?；虿《据d體，它含有編碼與早老性癡呆或唐氏綜合癥相關(guān)的移碼突變?chǔ)翧PP肽和/或Ubi-B肽的權(quán)利要求18所述的DNA序列。
23．根據(jù)權(quán)利要求22所述的載體，其中載體是大腸桿菌質(zhì)粒，李斯特菌屬載體和重組病毒載體。重組病毒載體包括但不限于正痘病毒，金絲雀病毒，山羊痘病毒，豬痘病毒，牛痘，桿狀病毒，人腺病毒，SV40或牛乳頭瘤病毒。
24．權(quán)利要求22所述的質(zhì)粒或病毒載體在制備用于治療或預(yù)防早老性癡呆或者治療唐氏綜合癥的藥物組合物中的用途。
25．治療患有或傾向于患早老性癡呆或者患有唐氏綜合癥的患者的方法，該方法是通過(guò)用權(quán)利要求22所述的質(zhì)?；虿《据d體體內(nèi)或從體內(nèi)刺激進(jìn)行的。
全文摘要
用于治療和/或預(yù)防早老性癡呆和/或唐氏綜合癥的組合物中的、引發(fā)T細(xì)胞免疫性的、與早老性癡呆和唐氏綜合癥相關(guān)的移碼突變體β－淀粉樣前體肽和突變體泛素－B。
文檔編號(hào)A61K35/66GK1300294SQ99805976
公開(kāi)日2001年6月20日 申請(qǐng)日期1999年4月30日 優(yōu)先權(quán)日1998年5月8日
發(fā)明者G·高德納克, J·A·艾里克森, M·莫勒 申請(qǐng)人:諾爾斯海德公司