專利名稱：監(jiān)測蛋白酶體抑制劑藥物作用的方法
背景技術(shù)：
構(gòu)成26S蛋白酶體催化核心的是20S蛋白酶體，一個(gè)分子量大約為700 kDa的多亞基復(fù)合物。Coux等(生物化學(xué)年評(Ann.Rev.Biochem.)65801-847(1995))教導(dǎo)20S蛋白酶體并不獨(dú)自降解被泛素化的蛋白質(zhì)，但是的確具有多種肽酶活性?；诘孜锲眯?，Coux等將這些活性鑒定為糜蛋白酶樣、胰蛋白酶樣、后-谷氨酰水解酶，偏好支鏈氨基酸，偏好中性小氨基酸。Coux等還教導(dǎo)可以通過各種體外處理誘導(dǎo)20S蛋白酶體活性的引人注目的活化，例如加熱到55℃，與堿性多肽、十二烷基硫酸鈉(SDS)、鹽酸胍或脂肪酸孵育，對水透析，或者通過生理調(diào)節(jié)劑例如PA28或PA700。McCormack等(生物化學(xué)(Biochemistry)377792-7800(1980))教導(dǎo)有許多肽底物，包括Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC，Z-Leu-Leu-Arg-AMC和Z-Leu-Leu-Glu-2NA，被20S蛋白酶體剪切，其中Suc是N-琥珀?；?，AMC是7-氨基-4-甲基香豆素，2NA是2-萘胺。
泛素-蛋白酶體途徑在許多生理過程發(fā)揮重要作用。Deshaies(細(xì)胞生物學(xué)趨勢(Trends in Cell BioL.)5428-434(1995)和Hoyt(細(xì)胞(CeLL)91149-151(1997))教導(dǎo)細(xì)胞周期蛋白質(zhì)，包括細(xì)胞周期蛋白、細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶抑制劑、腫瘤抑制蛋白，的受調(diào)控的蛋白水解是控制的細(xì)胞循環(huán)進(jìn)展所必須的，這些蛋白質(zhì)的水解通過泛素-蛋白酶體途徑發(fā)生。Palombella等在WO95/25533中教導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活化依賴于蛋白酶體所介導(dǎo)的一種抑制性蛋白IκB-α的降解，NF-κB自身在調(diào)控參與免疫和炎癥應(yīng)答的基因中發(fā)揮關(guān)鍵作用。Goldberg和Rock在WO94/17816公開了通過泛素-蛋白酶體途徑對細(xì)胞蛋白進(jìn)行連續(xù)轉(zhuǎn)變在抗原呈遞中發(fā)揮重要的作用。
在發(fā)揮重要生理功能的同時(shí)，泛素-蛋白酶體途徑還介導(dǎo)蛋白質(zhì)的不當(dāng)降解或加速蛋白質(zhì)降解，這表現(xiàn)為病態(tài)例如腫瘤、炎癥性疾病或自身免疫病的結(jié)果或原因，在這些疾病中正常的細(xì)胞過程變得失去調(diào)控。另外，Goldberg(美國專利5,340,736號(1994))教導(dǎo)與諸如癌癥、慢性傳染病、發(fā)熱、肌肉廢用(萎縮)、神經(jīng)損傷、腎衰竭以及肝衰竭相關(guān)的惡病質(zhì)和肌肉消耗起因于泛素-蛋白酶體途徑蛋白質(zhì)降解增加。Gonzales等(實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志(J.Exp.Med.)1841909(1996))教導(dǎo)在原生動物門寄生蟲成熟期間發(fā)生的細(xì)胞骨架再組織是蛋白酶體依賴性的。
因此，對蛋白酶體活性的抑制提供了一種在這些或其它由蛋白酶體蛋白質(zhì)水解功能所直接或間接介導(dǎo)的病況中用于治療性介入的很有希望的新方法。Goldberg等(化學(xué)與生物學(xué)(Chemistry&Biology)2503-508(1995))教導(dǎo)在人類疾病的動物模型中蛋白酶體抑制劑能阻斷體內(nèi)炎癥應(yīng)答。
發(fā)明人正在開發(fā)治療炎癥和自身免疫病以及癌癥的蛋白酶體抑制劑。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，如果給哺乳動物給藥一種蛋白酶體抑制劑，仔細(xì)選擇給藥方案以避免過度的蛋白酶體抑制是必要的。典型地，新候選藥物的給藥方案可通過測量生物樣品中藥物濃度以及設(shè)定劑量和給藥頻率來確定，從而獲得所期望的藥物水平(參見，例如，基礎(chǔ)藥物動力學(xué)手冊，Ritschel著，第4版，藥物情報(bào)公開公司，伊利諾州漢密爾頓，(1992)[Handbook of Basic Pharmacokinetics，F(xiàn)ourth Edition，Drug Intelligence Publications，Inc.，Hamilton，IL，1992])。發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)這些標(biāo)準(zhǔn)程序并不適用于蛋白酶體抑制。因此，本領(lǐng)域需要監(jiān)測蛋白酶體抑制劑藥物作用的靈敏方法。
本發(fā)明簡要概述本發(fā)明提供監(jiān)測蛋白酶體抑制劑藥物作用的靈敏方法。發(fā)明人驚訝地發(fā)現(xiàn)，是生物樣品中的蛋白酶體活性的離體分析而不是藥物濃度，提供了一種監(jiān)測蛋白酶體抑制劑藥效學(xué)的藥物作用的有用方法，而且這些數(shù)據(jù)為選擇今后將要給藥的蛋白酶體抑制劑的給藥量和給藥頻率提供了指導(dǎo)。
在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種監(jiān)測哺乳動物中蛋白酶體抑制劑藥效學(xué)的藥物作用的方法，包括給哺乳動物給藥蛋白酶體抑制劑；在給藥蛋白酶體抑制劑以后一個(gè)或多個(gè)指定的時(shí)間從該哺乳動物采集一個(gè)或多個(gè)試驗(yàn)生物樣品；測量試驗(yàn)生物樣品中蛋白酶體活性；確定試驗(yàn)生物樣品中蛋白酶體活性的量；用從沒有給藥過蛋白酶體抑制劑哺乳動物中所采集的生物樣品作為參照，比較試驗(yàn)生物樣品和參照生物樣品中蛋白酶體活性的量。
在第二個(gè)方面，本發(fā)明提供一種確定蛋白酶體抑制劑給藥方案的方法，包括給哺乳動給藥蛋白酶體抑制劑；在給藥蛋白酶體抑制劑以后一個(gè)或多個(gè)指定時(shí)間從該哺乳動物采集一個(gè)或多個(gè)試驗(yàn)生物樣品；測量試驗(yàn)生物樣品中蛋白酶體活性；確定試驗(yàn)生物樣品中蛋白酶體活性的量；用從沒有給藥過蛋白酶體抑制劑的哺乳動物所采集的生物樣品作為參照，比較試驗(yàn)生物樣品和參照生物樣品中蛋白酶體活性的量；選擇今后要給藥的蛋白酶體抑制劑的給藥量和給藥頻率。
在第三個(gè)方面，本發(fā)明提供一種確定哺乳動物，包括人，基線蛋白酶體活性的方法，包括從哺乳動物采集一個(gè)或多個(gè)生物樣品；測量該生物樣品中蛋白酶體活性；以及確定該生物樣品中蛋白酶體活性的量。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，哺乳動物患有疾病或病理狀態(tài)。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，已給哺乳動物給藥一種藥物。在特定的實(shí)施方案中，本方法進(jìn)一步包括確定要給哺乳動物給藥的蛋白酶體抑制劑的給藥量和給藥頻率。
在第四個(gè)方面，本發(fā)明提供一種測量來自哺乳動物的生物樣品中蛋白酶體活性的試劑盒，本試劑盒包括制備生物樣品的工具和測量蛋白酶體活性的工具。在特定的優(yōu)選實(shí)施方案中，哺乳動物是人。在其它的特定實(shí)施方案中，生物樣品是血液、尿或者活組織檢查樣品。
附圖簡述

圖1是7例人類志愿者白細(xì)胞中20S蛋白酶體活性的圖解表示。
圖2是7例人類志愿者白細(xì)胞中每日20S蛋白酶體活性的圖解表示。
圖3是靜脈給藥N-(吡嗪)羰基-L-苯丙氨酸-L-亮氨酸硼酸(boronic acid)(1)后1.0小時(shí)后鼠白細(xì)胞中20S蛋白酶體活性的圖解表示。
圖4是靜脈給藥1后24小時(shí)鼠白細(xì)胞中20S蛋白酶體活性的圖解表示。
圖5是靜脈給藥1后1.0小時(shí)大鼠白細(xì)胞中20S蛋白酶體活性的圖解表示。
圖6是靜脈給藥1后24小時(shí)大鼠白細(xì)胞中20S蛋白酶體活性的圖解表示。
圖7是靜脈給藥1后48小時(shí)后大鼠白細(xì)胞中20S蛋白酶體活性的圖解表示。
圖8是每周兩次靜脈注射給藥1連續(xù)兩周后1.0小時(shí)后大鼠白細(xì)胞中20S蛋白酶體活性的圖解表示。
圖9是靜脈給藥1后1.0小時(shí)靈長類動物白細(xì)胞中20S蛋白酶體活性的圖解表示。
圖10是靜脈給藥1后72小時(shí)靈長類動物白細(xì)胞中20S蛋白酶體活性的圖解表示。
圖11是糜蛋白酶(□)和胰蛋白酶(◇)活性對1濃度的函數(shù)的圖解表示，其中顯示1完全抑制糜蛋白酶活性但引起胰蛋白酶活性活化。
圖12是比較從兔網(wǎng)狀細(xì)胞所純化的20S蛋白酶體的蛋白酶體抑制百分?jǐn)?shù)與糜蛋白酶活性對胰蛋白酶活性比值的曲線圖。
圖13是比較大鼠白細(xì)胞裂解物的蛋白酶體抑制百分?jǐn)?shù)與糜蛋白酶活性對胰蛋白酶活性比值的曲線圖。
優(yōu)選實(shí)施方案詳述本發(fā)明涉及監(jiān)測生物樣品中蛋白酶體活性的方法。更特別的，本發(fā)明涉及在體內(nèi)給藥蛋白酶體抑制劑之后藥物作用的監(jiān)測方法。這里所引用的專利申請、專利和參考文獻(xiàn)表示本領(lǐng)域的知識，因此將其作為參考文獻(xiàn)完整地并入本發(fā)明。在不一致時(shí)，本公開內(nèi)容優(yōu)先。
本發(fā)明人驚訝地發(fā)現(xiàn)，是生物樣品中蛋白酶體活性的離體分析而不是藥物濃度提供了監(jiān)測蛋白酶體抑制劑藥效學(xué)藥物作用的方法，而且這個(gè)數(shù)據(jù)為選擇今后將要給藥的蛋白酶體抑制劑的給藥量和給藥頻率提供了指導(dǎo)。
本發(fā)明提供監(jiān)測蛋白酶體抑制劑藥物作用的靈敏方法。蛋白酶體抑制劑是有希望的用于治療直接由蛋白酶體蛋白水解功能所介導(dǎo)病癥例如肌肉消耗，或者間接通過蛋白酶體所加工或降解的蛋白質(zhì)例如轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白所介導(dǎo)病癥的新治療性藥物。本發(fā)明人已經(jīng)證明蛋白酶體抑制劑在許多動物腫瘤模型和炎癥模型上的體內(nèi)效能。然而，本發(fā)明人也發(fā)現(xiàn)過度的蛋白酶體抑制劑引起毒性效應(yīng)，包括致死性。盡管不愿意局限于任何理論，本發(fā)明人相信這些毒性效應(yīng)主要是基于蛋白酶體功能的多效性的性質(zhì)的機(jī)制且由該性質(zhì)產(chǎn)生。
因此蛋白酶體抑制劑的安全給藥要求密切監(jiān)測藥物水平以及仔細(xì)選擇給藥方案以避免給藥過量。在本領(lǐng)域中典型的是通過測量血漿中母體藥和/或其代謝產(chǎn)物的量來監(jiān)測藥物水平(例如，參見，基礎(chǔ)藥物動力學(xué)手冊，Ritschel著，第4版，藥物情報(bào)公開公司，漢密爾頓，伊利諾州，1992年[Handbook of Basic Pharmacokinetics，F(xiàn)ourthEdition，Drug Intelligence Publications，Inc.，Hamilton，IL，1992])。藥物水平測量值對于時(shí)間的函數(shù)提供了藥物動力學(xué)曲線，其中參數(shù)例如藥峰濃度(Cmax)、半壽期(t1/2)、藥時(shí)曲線下面積(AUC)、分布容積(Vd)。然而，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這些標(biāo)準(zhǔn)方法不適用于蛋白酶體抑制劑。在動物中靜脈給藥治療量蛋白酶體抑制劑后數(shù)分鐘內(nèi)，在血漿房室中實(shí)際上檢測不到藥物。盡管不愿意局限于理論，本發(fā)明人仍然相信蛋白酶體抑制劑在血管系統(tǒng)和組織被細(xì)胞內(nèi)蛋白酶體快速螯合。因此，血漿中循環(huán)藥物測量值在總體上低估了現(xiàn)存生物活性藥物的量。因此迫切需要能更準(zhǔn)確地反映蛋白酶體的真實(shí)藥效曲線的替代方法。
就本發(fā)明而言，將會使用下列定義“蛋白酶體抑制劑”指任何能直接或間接地抑制20S或26S蛋白酶體或其活性的物質(zhì)。這種抑制優(yōu)先是特異性的，也就是說，蛋白酶體抑制劑在低于產(chǎn)生另外一個(gè)無關(guān)生物學(xué)效應(yīng)必需的濃度抑制蛋白酶體活性。優(yōu)選地，抑制蛋白酶體所必需蛋白酶體抑制劑濃度至少比產(chǎn)生無關(guān)生物學(xué)活性所必需濃度低2倍，更優(yōu)選地是至少低5倍，甚至更優(yōu)選地是至少低10倍，最優(yōu)選地是至少低20倍。本發(fā)明中所使用蛋白酶體抑制劑的非限制性的實(shí)例包括肽醛類(參見，例如Stein等1995年9月21日公開的WO95/24914；Siman等1991年9月19日公開的WO91/13904；Iqbal等，醫(yī)藥化學(xué)雜志(J.Med.Chem.)382276-2277(1995))、乙烯砜類(參見，例如，Bogyo等，美國國家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)946629(1995))、α’，β’-環(huán)氧酮類(參見，例如，Spaltenstein等，四面體快報(bào)(TetrahedronLett.)371343(1996))、肽硼酸(參見，例如，Adams等，1996年5月9日公開WO96/13266；Siman等1991年9月19日公開的WO91/13904)和lactacystin及l(fā)actacystin類似物(參見，例如，F(xiàn)enteany等，美國科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)943358(1994)；Fenteany等1996年10月19日公開的WO96/32105)，其中每一個(gè)都作為參考文獻(xiàn)完整地并入本發(fā)明。
“生物樣品”指任何取自動物的體液、器官或組織樣品。在采集樣品時(shí)動物可以是死亡或者存活的。動物優(yōu)選哺乳動物，這個(gè)術(shù)語包括人。
“試驗(yàn)生物樣品”指取自已經(jīng)給藥過蛋白酶體抑制劑的動物的生物樣品。
“參考生物樣品”指取自沒有給藥過蛋白酶體抑制劑的動物的生物樣品，包括已經(jīng)以書寫、可讀或電子形式制定或保存的統(tǒng)計(jì)學(xué)或過去的參考樣品?！翱勺x形式”包括可以能為機(jī)器或技師所理解具有特定意義的任何形式。
“標(biāo)準(zhǔn)樣品”指一種包括已知量或恒定量20S或26S蛋白酶體活性的樣品。這樣品可以包括純化或部分純化的蛋白酶體，或者它可以包括一種含有蛋白酶體的生物樣品。
“蛋白酶體活性”指任何與20S或26S蛋白酶體相關(guān)的蛋白水解活性或肽酶活性。
“肽”指一種由彼此通過肽鍵在線性排列中相互連結(jié)的氨基酸殘基的線性排列所組成的分子。在本發(fā)明中，這些肽可以包括從大約3到大約500個(gè)氨基酸殘基，可以進(jìn)一步包括二級、三級或四級結(jié)構(gòu)，此外，分子間連結(jié)可以通過，但是并不限于，共價(jià)鍵(例如通過二硫鍵連結(jié))或者通過螯合作用、靜電相互作用、疏水相互作用、氫鍵、離子-偶級子相互作用，偶級子-偶級子相互作用或上述方式的任意組合。
在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種監(jiān)測蛋白酶體抑制劑在哺乳動物中的藥效學(xué)藥物作用的方法，包括哺乳動物給藥蛋白酶體抑制劑；給藥蛋白酶體抑制劑后在指定的一個(gè)或多個(gè)時(shí)間從動物采集一個(gè)或多個(gè)試驗(yàn)生物樣品；測量生物樣品或各生物樣品蛋白酶體活性；確定生物樣品或各生物樣品蛋白酶體活性的量；比較試驗(yàn)生物樣品和取自沒有給藥過蛋白酶體抑制劑哺乳動物參考生物樣品中蛋白酶體活性的量。
從哺乳動物采集的生物樣品包括，但是不限制于，血液、尿、器官和組織樣品。根據(jù)發(fā)明的這一個(gè)方面，優(yōu)選生物樣品是血液、更優(yōu)選的是血細(xì)胞裂解物。細(xì)胞裂解可以通過標(biāo)準(zhǔn)程序完成。在特定的優(yōu)選實(shí)施方案中，生物樣品是全血細(xì)胞裂解物。Kahn等(生物化學(xué)生物物理通訊(Biochem.Biophys.Res.Commun.)214957-962(1995)和Tsubuki等(歐洲生化學(xué)會聯(lián)合會快報(bào)(FEBES Lett.)，344229-233(1994))公開了紅細(xì)胞含有內(nèi)源性蛋白質(zhì)性的蛋白酶體抑制劑。因此即使小量紅細(xì)胞對生物樣品的污染就可能干擾分析。然而，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)當(dāng)存在大約0.05％濃度的SDS時(shí)，內(nèi)源性蛋白酶體抑制劑被滅活，從而允許對紅細(xì)胞裂解物和全血細(xì)胞裂解物進(jìn)行可靠地分析。在這個(gè)SDS濃度下，全部蛋白酶體活性都?xì)w因于20S蛋白酶體。盡管純化的20S蛋白酶體在0.05％SDS下表現(xiàn)出不良的穩(wěn)定性，但是細(xì)胞裂解物中20S蛋白酶體活性在這些條件卻是穩(wěn)定的。就經(jīng)濟(jì)和樣品制備的難易而言，用全血細(xì)胞裂解物中進(jìn)行分析的能力提供了顯著優(yōu)勢。
在其它特定的優(yōu)選實(shí)施方案中，生物樣品是白細(xì)胞裂解物。血細(xì)胞分離的方法在本領(lǐng)域中是公知的(Rickwood等，分析生物化學(xué)(Anal.Biochem.)12323-31(1982))；Fotino等，臨床實(shí)驗(yàn)室科學(xué)年刊(Ann.Clin.Lab.Sci.)1131(1971))，并且在實(shí)施例中有進(jìn)一步的描述。對細(xì)胞分離有用的商業(yè)化產(chǎn)品包括，但不限于，F(xiàn)icol-Paque_(Pharmacia Biotech)和NycoPrepTM(Nycomed)。在一些情況下，白細(xì)胞裂解物比全血細(xì)胞裂解物提供更好的數(shù)據(jù)重現(xiàn)性，因此在那些情況下它可能是優(yōu)選的生物樣品。
在樣品制備方面的差異能夠通過向數(shù)據(jù)處理過程引進(jìn)一個(gè)歸一化步驟來校正。在特定的優(yōu)選實(shí)施方案，樣品中的蛋白酶體活性可以相對于樣品中蛋白質(zhì)含量進(jìn)行歸一化處理(比活方法)?？衫脴?biāo)準(zhǔn)程序，包括但不限于，Bradford分析和Lorry方法確定樣品中全部蛋白質(zhì)含量。在其它特定的優(yōu)選實(shí)施方案中，樣品中蛋白酶體活性可以相對于細(xì)胞計(jì)數(shù)進(jìn)行歸一化處理。這個(gè)實(shí)施方案在某些環(huán)境中可能是優(yōu)選的實(shí)施方案，例如臨床環(huán)境，在此環(huán)境中很容易使用自動化細(xì)胞計(jì)數(shù)儀。
蛋白酶體抑制劑經(jīng)常表現(xiàn)出對蛋白酶體中的一種肽酶活性具有優(yōu)先抑制，超過對其它蛋白酶體肽酶活性的抑制。本發(fā)明人已經(jīng)認(rèn)識到這種差異抑制提供了一種以蛋白質(zhì)含量或細(xì)胞計(jì)數(shù)為基礎(chǔ)的歸一化程序的可替換的方法。因此，在特定的特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，蛋白酶抑制用蛋白酶體中一種肽酶活性與另一種肽酶活性的比值來確定。在實(shí)施例中，提供了用本發(fā)明的這個(gè)實(shí)施方案確定蛋白酶體抑制的理論方程的推導(dǎo)過程。為了使本發(fā)明的這個(gè)實(shí)施例可以操作，研究所用的蛋白酶體抑制劑必須能優(yōu)先抑制一種肽酶活性，(此種抑制)超過對其它至少一種肽酶活性的抑制。所要研究的肽酶活性，以及因此的所要使用的合適的肽底物的選擇取決于所研究的抑制劑。例如，對于抑制劑N-(吡嗪)羰基-L-苯丙氨酸-L-亮氨酸硼酸(1)，蛋白酶體抑制優(yōu)先確定為糜蛋白酶活性與胰蛋白酶活性的比值。糜蛋白酶活性被1完全抑制，然而胰蛋白酶活性在相同的濃度范圍內(nèi)卻被1活化。
用于采集生物樣品的哺乳動物優(yōu)選大鼠、小鼠、狗、豬、兔、除人以外的靈長類動物，或人。除人以外的靈長類動物包括，但是不限于，食蟹猴、狨猴、黑猩猩和狒狒。哺乳動物更優(yōu)選地是人，最優(yōu)選地是正使用蛋白酶體抑制劑進(jìn)行治療的人。治療可以發(fā)生在醫(yī)院背景或者門診的基礎(chǔ)上。人優(yōu)選是正在經(jīng)受由泛素-蛋白酶體途徑所介導(dǎo)蛋白質(zhì)不當(dāng)降解或者蛋白降解加速所引起病癥的患者。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該病癥選自HIV感染；惡病質(zhì)；原生動物門寄生蟲病例如瘧疾；細(xì)胞增殖性疾病例如腫瘤、牛皮癬和再狹窄；和炎性疾病。炎性疾病包括但是不限于，骨-和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；炎性腸炎，包括潰瘍性結(jié)腸炎和局限性回腸炎；膿毒癥；移植排斥；哮喘；以及局部缺血或再灌注損傷，包括中風(fēng)和心肌梗塞。在特定的優(yōu)選實(shí)施方案中，人是指癌癥病人或者正患有或具有發(fā)展成局部缺血或再灌注損傷風(fēng)險(xiǎn)的病人。
本發(fā)明的肽醛蛋白酶體抑制劑優(yōu)選地包括Stein等在1995年9月21日所公開的WO95/24914中或Siman等在1991年9月19日所公開的WO91/13904中公開的那些，將兩者作為參考文獻(xiàn)完整地并入本發(fā)明。
在本發(fā)明中使用的硼酸或酯類化合物優(yōu)選地包括Adams等在1996年5月9日所公開的WO96/13266或Siman等在1991年9月19日所公開的WO91/13904中公開的那些，以參考文獻(xiàn)形式將兩者完整地并入本發(fā)明。
在本發(fā)明中使用的硼酸(boronic acid)化合物，更加優(yōu)選地選自N-乙?；?L-亮氨酸-β-(1-萘基)-L-丙氨酸-L-亮氨酸硼酸；N-(8-喹啉)磺?；?β-(1-萘基)-L-丙氨酸-L-亮氨酸硼酸；N-(吡嗪)羰基-L-苯丙氨酸-L-亮氨酸硼酸；β-(1-萘基)-L-丙氨酸-L-亮氨酸硼酸；和N-(4-嗎啉)羰基-[O-(2-吡啶基甲基)]-L-酪氨酸-L-亮氨酸硼酸。
在本發(fā)明中使用的lactacystin和lactacystin類似物化合物優(yōu)選地包括在Fenteany等1996年10月17日公開的WO96/32105中公開的那些化合物，以參考文獻(xiàn)的形式將其完整地并入本發(fā)明。lactacystin類似物更優(yōu)選地從lactacystin，clasto-lactacystinβ-內(nèi)酯，7-乙基-clasto-lactacystinβ-內(nèi)酯和7-正-丙基-clasto-lactacystinβ內(nèi)酯中選擇。最優(yōu)選地，該lactacystin類似物是7-正丙基-clasto-lactacystinβ-內(nèi)酯。
蛋白酶體抑制劑可以用任何途徑給哺乳動物用藥，包括皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、關(guān)節(jié)腔內(nèi)、口服、鞘內(nèi)、鼻內(nèi)、動脈內(nèi)、靜脈內(nèi)、局部、或直腸(給藥)。在特定的優(yōu)選實(shí)施方案中，蛋白酶體抑制劑可以通過瘤內(nèi)注射給藥。腸胃外用藥可以用大丸劑(bolus)或輸注提供。目前優(yōu)選靜脈或腹膜內(nèi)途徑給藥。蛋白酶體抑制劑可以單次給藥或重復(fù)給藥。重復(fù)給藥可以按照每月一次到每日數(shù)次的頻率給藥。如下所討論，本發(fā)明的方法對確定適合于一種特定蛋白酶體抑制劑的給藥量和給藥頻率是有用的。
生物樣品中蛋白酶體活性可用任何適于確定20S或26S蛋白酶體活性的分析方法測量。(參見，例如，McCormack等，生物化學(xué)(Biochemistry)377792-7800(1998)；Driscoll和Goldberg，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)2654789(1990)；Orlowski等，生物化學(xué)(Biochemistry)321563(1993))。優(yōu)選地，向反應(yīng)混合物提供一種具有可檢測的標(biāo)記的底物，隨后通過底物的消失或一種切割產(chǎn)物的出現(xiàn)來監(jiān)測底物的蛋白水解性切割。標(biāo)記物檢測可以用，例如，熒光測量、比色法或放射性測量分析實(shí)現(xiàn)。
用于確定26S蛋白酶體活性優(yōu)選的底物，包括但是不限于，溶菌酶、α-乳清蛋白、β-乳球蛋白、胰島素b-鏈和鳥氨酸脫羧酶。如果要測量26S蛋白酶體活性，底物優(yōu)選是泛素化的或者反應(yīng)混合物應(yīng)該優(yōu)選進(jìn)一步包括泛素和泛素化酶。
更優(yōu)選的底物是長度小于10個(gè)氨基酸的肽。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，肽底物含有一個(gè)可以切割的熒光標(biāo)記并可通過熒光測量監(jiān)測此標(biāo)記的釋放。根據(jù)本發(fā)明的這個(gè)實(shí)施方案，優(yōu)選底物的非限制性的實(shí)例包括N-(N-羰基芐氧羰基亮氨酰亮氨酰精氨酰)-7-氨基-4-甲基香豆素(Z-Leu-Leu-Arg-AMC)，N-(N-苯甲酰基纈氨酰甘氨酰精氨酰)-7-氨基-4-甲基香豆素(Bz-Val-Gly-Arg-AMC)，N-(N-羰基芐氧羰基亮氨酰亮氨酰精氨酰)-2-萘胺(Z-Leu-Leu-Glu-2NA)，或N-(N-琥珀酰亮氨酰亮氨酰纈氨酰酪氨酰)-7-氨基-4-甲基香豆素(Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC)。在特定的優(yōu)選實(shí)施方案中，反應(yīng)混合物進(jìn)一步包括一種20S蛋白酶體活化劑。優(yōu)選的活化劑包括Coux等(生物化學(xué)年評(Ann.Rev.Biochem.)65801-847(1995))所教導(dǎo)的那些活化劑，優(yōu)選PA28或十二烷基硫酸鈉(SDS)。
分析當(dāng)中每日之間的差異可能起因于如下因素，例如緩沖溶液的差異、操作者差異、設(shè)備性能差異和溫度差異?？上鄬τ谝环N包括已知量或恒定量蛋白酶體活性的標(biāo)準(zhǔn)蛋白酶體樣品對生物樣品和參考樣品中蛋白酶體活性進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，使這些差異達(dá)到最小。在特定的優(yōu)選實(shí)施方案中，標(biāo)準(zhǔn)蛋白酶體樣品包括純化的20S蛋白酶體，更優(yōu)選從真核生物純化的20S蛋白酶體。20S蛋白酶體的來源并不是至關(guān)重要的，它包括但是不限于，哺乳動物，后者包括但不限于兔。在特定的優(yōu)選實(shí)施方案中，20S蛋白酶體是從兔網(wǎng)狀細(xì)胞純化的。在其它的特定實(shí)施方案中，標(biāo)準(zhǔn)樣品是一種生物樣品，包括但不限于血液樣品。生物樣品優(yōu)選是全血細(xì)胞裂解物，更加優(yōu)選從人采集的全血細(xì)胞裂解物，又優(yōu)選沒有接受過蛋白酶體抑制劑給藥的人。
將試驗(yàn)生物樣品中所測量的蛋白酶體活性與從沒有給藥過蛋白酶體抑制劑哺乳動物所采集參考生物樣品的測量數(shù)值作比較。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，試驗(yàn)生物樣品和參考生物樣品各自獨(dú)立地包括從一組正在接受治療的哺乳動物，優(yōu)選小鼠，所匯集的許多樣品。在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，試驗(yàn)生物樣品和參考生物樣品每一個(gè)都包括從哺乳動物個(gè)體采集的單個(gè)樣品。目前，檢測個(gè)體樣品是優(yōu)選的，除了由于哺乳動物的小體積所致的不可行外。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，通過匯集來自個(gè)體試驗(yàn)生物樣品或個(gè)體參考生物樣品的數(shù)據(jù)獲得一個(gè)統(tǒng)計(jì)學(xué)樣本。
在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，在開始蛋白酶體抑制劑治療前從治療的哺乳動物采集參考樣品。為使哺乳動物間差異的影響最小，目前優(yōu)選對高等哺乳動物進(jìn)行這個(gè)實(shí)施方案。目前，對蛋白酶體抑制劑藥物作用的臨床監(jiān)測優(yōu)選包括本發(fā)明的這個(gè)實(shí)施方案，每個(gè)病人作為自己的基線對照。
與參考樣品比較，生物樣品中蛋白酶體活性的下降指示采集生物樣品時(shí)蛋白酶體抑制劑的體內(nèi)效應(yīng)。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，在給藥蛋白酶體抑制劑之后多個(gè)時(shí)間點(diǎn)采集生物樣品。在這些實(shí)施方案中，生物樣品中蛋白酶體活性的測量值為蛋白酶體抑制劑活在體內(nèi)的效應(yīng)程度和持續(xù)時(shí)間提供了指示。在其它特定的優(yōu)選實(shí)施方案中，在一個(gè)或多個(gè)時(shí)間點(diǎn)從一種哺乳動物采集多個(gè)生物樣品。在這個(gè)實(shí)施方案中，生物樣品中蛋白酶體活性的測量值為蛋白酶體抑制劑在哺乳動物體內(nèi)的分布提供了指示。
蛋白酶體活性測量值差異的潛在來源包括個(gè)體間差異，單一個(gè)體中蛋白酶體活性隨時(shí)間波動，以及白細(xì)胞和紅細(xì)胞中蛋白酶體活性的差異。所有這些差異的來源都可能影響基于比活的對蛋白酶體抑制測定。相反地，基于蛋白酶體中一種肽酶活性對另一種(肽酶活性)的比值蛋白酶體抑制測定，可能顯示更好的一致性。
在第二個(gè)方面，本發(fā)明提供一種確定蛋白酶體抑制劑給藥方案的方法，包括給哺乳動物給藥蛋白酶體抑制劑；在給藥蛋白酶體抑制劑之后一個(gè)或多個(gè)指定時(shí)刻從哺乳動物采集一個(gè)或多個(gè)試驗(yàn)生物樣品；測量試驗(yàn)樣品或各試驗(yàn)樣品中蛋白酶體活性；確定試驗(yàn)樣品或各試驗(yàn)樣品中蛋白酶體活性的量；將試驗(yàn)樣品中蛋白酶體活性的量與從沒有給藥過蛋白酶體抑制劑哺乳動物所采集參考樣品的活性量做比較；以及選擇今后將要給藥的蛋白酶體抑制劑的給藥量和給藥頻率。
根據(jù)發(fā)明的這個(gè)方面，優(yōu)選實(shí)施方案正如第一個(gè)方面所述。
給藥量優(yōu)選地以mg/kg或mg/m2為基礎(chǔ)確定。今后將要給藥的哺乳動物可能與采集生物樣品或樣品的哺乳動物相同，或者也可能是不同的哺乳動物。在某些實(shí)施方案中，可以重復(fù)前面所述及的步驟。例如，在臨床場合，由于對從患者所采集的生物樣品中蛋白酶體活性的反復(fù)監(jiān)測，所以可以反復(fù)或連續(xù)地調(diào)節(jié)給藥量和給藥頻率。
在特定的優(yōu)選實(shí)施方案中，為避免蛋白酶體的過度抑制而選擇蛋白酶體抑制劑的給藥量和給藥頻率。在某些實(shí)施方案中，蛋白酶體過度抑制引起毒性效應(yīng)，毒性效應(yīng)包括但不限于，嘔吐、腹瀉、血容量減少、低血壓和死亡。優(yōu)選地，選擇蛋白酶體抑制劑給藥量和給藥頻率，從而使此后任何生物樣品中蛋白酶體的抑制不會超過大約95％。
在其它特定的優(yōu)選實(shí)施方案中，選擇蛋白酶體抑制劑的給藥量和給藥頻率，從而獲得對治療有用的蛋白酶體抑制。優(yōu)選的對治療有用的蛋白酶體抑制引起一種對治療有利的抗腫瘤、抗炎癥、抗病毒或抗寄生蟲效應(yīng)。優(yōu)選地，選擇蛋白酶體抑制劑的給藥量和給藥頻率，從而使此后生物樣品中蛋白酶體抑制達(dá)到至少大約15％，優(yōu)選大約20％，更優(yōu)選地大約30％，甚至更優(yōu)選地是大約40％，還更優(yōu)選地是50％，最優(yōu)選地是大約50-大約80％，盡管在某些情況下優(yōu)選高達(dá)95％的蛋白酶體抑制。
在特定的優(yōu)選實(shí)施方案中，從疾病局灶采集生物樣品。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，生物樣品包括腫瘤或腫瘤細(xì)胞，優(yōu)選地從一個(gè)癌癥患者采集。在這個(gè)實(shí)施方案中，優(yōu)選地通過在患者中所出現(xiàn)腫瘤的活組織檢查采集生物樣品。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，生物樣品包括來自患有血細(xì)胞增殖病的患者的血細(xì)胞或血細(xì)胞前體。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，通過牛皮癬患者的皮膚活組織檢查采集生物樣品。在還一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過炎性腸炎患者結(jié)腸活組織檢查采集生物樣品。在又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，生物樣品包括滑液，優(yōu)選來自關(guān)節(jié)炎患者的(滑液)。在再一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，生物樣品包括肌肉細(xì)胞，優(yōu)選來自惡病患者的(肌肉細(xì)胞)。在又一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，生物樣品包括支氣管液，優(yōu)選來自哮喘患者的(支氣管液)。
在第三個(gè)方面，本發(fā)明提供一種確定哺乳動物基線蛋白酶體活性的方法，包括從哺乳動物采集一個(gè)或多個(gè)生物樣品；測量該生物樣品或各生物樣品中蛋白酶體活性；確定生物樣品或各生物樣品中蛋白酶體活性的量。在特定的實(shí)施方案中，本方法進(jìn)一步包括確定要給哺乳動物給藥的蛋白酶體抑制劑的給藥量和給藥頻率。
根據(jù)本發(fā)明這一方面中，優(yōu)選的實(shí)施方案如以上在第一個(gè)方面和第二個(gè)方面所描述的。
在根據(jù)本發(fā)明這一方面的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，哺乳動物患有疾病或疾病狀態(tài)。本發(fā)明人考慮在特定疾病狀態(tài)下，活體內(nèi)蛋白酶體活性會變化。重要的是在開始給藥蛋白酶體抑制劑治療之前鑒定與蛋白酶體活性正常值的偏差。在基線蛋白酶體活性高于正常值的地方，可能必需一個(gè)高于正常給藥量的蛋白酶體抑制劑給藥量。相反的，在蛋白酶體活性低于正常數(shù)值的地方，可能必需一個(gè)低于正常給藥量的蛋白酶體抑制劑給藥量。
在特定的優(yōu)選實(shí)施方案中，將從患有疾病或疾病狀態(tài)哺乳動物所采集生物樣品的蛋白酶體活性數(shù)據(jù)與從患有相同疾病或病況的其它哺乳動物所采集生物樣品的蛋白酶體活性數(shù)據(jù)合并。然后將合并后的蛋白酶體活性數(shù)據(jù)與從沒有患過疾病或病況哺乳動物或各哺乳動物所采集參考生物樣品的蛋白酶體活性數(shù)據(jù)做比較。在本發(fā)明這個(gè)方面中，本方法允許用統(tǒng)計(jì)學(xué)確定疾病或病況對體內(nèi)蛋白酶體活性所具有的效應(yīng)，如果有的話。在特定的優(yōu)選實(shí)施方案中，本方法進(jìn)一步包括確定給患有疾病或病態(tài)狀況的哺乳動物給藥蛋白酶體抑制劑的給藥量和給藥頻率。將要給藥蛋白酶體抑制劑的患病哺乳動物可能與用來確定基線蛋白酶體活性的哺乳動物相同，或者也可能是患有相同疾病或病況的其它不同哺乳動物。
在其它的特定的優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明這一方面的方法進(jìn)一步包括為哺乳動物確定診斷和預(yù)后。發(fā)明人考慮蛋白酶體活性在導(dǎo)致相似癥狀的不同疾病狀態(tài)之間可以區(qū)分。相似的，依據(jù)基線蛋白酶體活性水平可以將患有特定疾病的哺乳動物分成亞群。本發(fā)明人考慮本發(fā)明的方法對于將基線蛋白酶體活性和疾病后果關(guān)聯(lián)起來將會有用，對于以相關(guān)數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)確定哺乳動物個(gè)體的預(yù)后將會有用。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，哺乳動物已經(jīng)給藥過一種藥物。出于各種目的而給藥的藥物可能會影響蛋白酶體活性水平，或者是直接地影響，例如通過抑制蛋白酶體，或者是間接影響，例如通過影響代謝途徑或影響底物利用度。本發(fā)明提供監(jiān)測這些效應(yīng)和預(yù)測藥物-藥物相互作用的方法。在特定的優(yōu)選實(shí)施方案中，蛋白酶體活性是在從開始給藥蛋白酶體抑制劑給哺乳動物治療之前就已經(jīng)接受過藥物治療的哺乳動物所采集的生物樣品中測量的。本方法進(jìn)一步包括確定將要給藥蛋白酶體抑制劑的給藥量和給藥頻率。
在其它特定實(shí)施方案中，合并從藥物治療過哺乳動物所采集生物樣品獲得的蛋白酶體活性數(shù)據(jù)和從給藥相同藥物治療過的其它哺乳動物所采集生物樣品獲得的蛋白酶體活性數(shù)據(jù)。然后將合并后數(shù)據(jù)與從沒有給藥過該藥物的哺乳動物或各哺乳動物所采集的參考生物樣品的蛋白酶體活性數(shù)據(jù)做比較。本發(fā)明的這個(gè)方面中的方法允許用統(tǒng)計(jì)學(xué)確定藥物在活體內(nèi)對蛋白酶體活性所具有的影響，如果有的話。在特定的優(yōu)選實(shí)施方案中，本方法進(jìn)一步包括確定將給已經(jīng)用該藥物治療過的哺乳動物給藥蛋白酶體抑制劑的給藥量和給藥頻率。將要給其給藥蛋白酶體抑制劑的已經(jīng)用該藥物治療過的哺乳動物可以與用來測量基線蛋白酶體活性的哺乳動物相同，也可以是已經(jīng)用相同藥物治療過的不同哺乳動物。
在第四個(gè)方面，本發(fā)明提供一種測量從哺乳動物采集的生物樣品中蛋白酶體活性的試劑盒，本試劑盒包括制備生物樣品的工具和測量蛋白酶體活性的工具。在特定的優(yōu)選實(shí)施方案中，哺乳動物是人。在其它特定的優(yōu)選實(shí)施方案中，生物樣品是血液、尿、或活組織檢查樣品。
以下實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明特定優(yōu)選實(shí)施方案，且在本質(zhì)上是非限制性的。
實(shí)施例在給藥前和給藥后第一天大約10分鐘、30分鐘、1小時(shí)、3小時(shí)、和24小時(shí)從動物頸靜脈收集血液樣品(約1.0ml)。用色譜/質(zhì)譜(LC/MS/MS)法分析樣品中1。在大鼠血漿和全血中1分析定量的下限確定在2.5ng/mL。
單次靜脈給藥之后，只有當(dāng)血漿或全血中1的水平在0.3mg/kg給藥水平上時(shí)才可以測量。觀察到的Cmax在第一個(gè)時(shí)間點(diǎn)出現(xiàn)；因此，估計(jì)到達(dá)藥峰濃度的時(shí)間在雄性和雌性大鼠中都≤10分鐘。雄性一般具有稍高于雌性的藥峰濃度(Cmax)和藥物濃度-時(shí)間曲線下面積(AUC0-t)值。雄性血漿和全血的Cmax值分別是51.8和22.7ng/mL，在雌性中分別是36.9和19.1ng/mL。雄性血漿和全血AUC0-t值分別是14.0和18.6ng·h/mL，雌性分別是12.9和17.7ng.h/mL。因?yàn)樵诮K末期內(nèi)1的水平發(fā)生波動，所以不可能估計(jì)消除半壽期(t1/2)。觀察結(jié)果提示1被快速地從血液中清除。靈長類動物在靈長類動物上所進(jìn)行尋找范圍的研究中，給藥后2小時(shí)測定血液和血漿中1的水平。單次靜脈給藥給兩食蟹猴給藥1(1雄性，3.3kg；1雌性，2.3kg)。每只猴子接受兩次單給藥(第1天0.1mg/kg和第8天)，給藥體積為1.0mL/kg。載體是0.1％抗壞血酸/2％乙醇/98％鹽水(0.9％)。本工作由Conance Laboratories Inc.，Madison，WI完成。
第1天和第8天給動物靜脈用藥后大約2小時(shí)，從每只動物收集血液。血液和血漿樣品貯存在冰箱中維持于-20±10℃，直至用于分析試驗(yàn)物質(zhì)含量。
用色譜/質(zhì)譜(LC/MS/MS)方法分析樣品中的1。在猴血漿和全血中1分析定量的下限確定在2.5ng/mL處。給藥0.1mg/kg的1之后2小時(shí)，血漿中1的濃度不到2.5ng/mL(雄性和雌性)；全血中1的濃度在雄性中是3.72ng/mL，在雌性中是3.86ng/mL。給藥0.3mg/kg的1之后2小時(shí)，血漿中1的濃度是4.64ng/mL(雌性)和6.44ng/mL(雄性)；全血中1的濃度是10.6ng/mL(雌性)和9.01ng/mL(雌性)。實(shí)施例2制備外周血白細(xì)胞裂解物用于體外測量20S蛋白酶體活性本制備程序適用于從哺乳動物，特別是大鼠、小鼠、狗、豬、兔、除人之外的靈長類動物或人所采集的血液樣品。從收集血液樣品分離外周血白血胞，貯存在-70℃直至用于測試。為避免因?yàn)榇嬖趦?nèi)源蛋白酶體抑制劑對分析造成的干擾，嚴(yán)格排除血紅細(xì)胞是很重要的。程序?qū)⒈匦枇康难菏占胶锌鼓齽┑脑嚬堋＞腿耸茉囌吆挽`長類動物而言，需要約5mL血液；就大鼠而言，約需要4mL血液；就小鼠而言，需要從5只小鼠中每一只都采集約1mL血液，將5個(gè)血液樣品匯集在一起以提供大約5mL血液；血液樣品用無菌鹽水1∶1稀釋，在14×75mm聚苯乙烯試管中將血液-鹽水混合物按2∶1血液NycoprpTM置于NycoprpTM分離介質(zhì)上層(GIBCO BRL Products)。樣品在室溫下500×g離心約30分鐘。去除頂層，保留位于頂層和底層之間2-3mm的細(xì)胞帶。用移液管將剩余的細(xì)胞帶轉(zhuǎn)移到清潔離心管中。用3mL冷磷酸鹽緩沖鹽溶液洗滌細(xì)胞帶，4℃下400×g離心5分鐘。傾棄上清，用～1mL冷磷酸鹽緩沖鹽溶液重新懸浮。將懸液轉(zhuǎn)移到1.5mL Eppendorf小量離心管，4℃下6600×g小量離心約10分鐘。吸除上清，將細(xì)胞小團(tuán)貯存在-70℃±10℃。實(shí)施例3測量外周血白細(xì)胞中20S蛋白酶體活性的分析方法比活方法本分析方法以游離20S顆粒的SDS-誘導(dǎo)性糜蛋白酶樣活性為基礎(chǔ)。使用熒光分析測量20S蛋白酶體水解小肽底物中一個(gè)酰胺鍵的速率。缺乏和存在抑制劑時(shí)這個(gè)速率的測量值能夠確定抑制劑結(jié)合該酶的程度。本分析方法用來測量哺乳動物外周血白細(xì)胞中20S蛋白酶體的活性，特別是大鼠、小鼠、狗、豬、兔、除人以外的靈長類動物，或人受試者。縮寫和定義
程序?qū)s底物在DMSO中溶解成6mM。在玻璃瓶中制備2％(2g/100mL)SDS的MilliQ水溶液。制備Ys底物緩沖液，含有20mM HEPES，0.5mMEDTA，0.035％SDS，1％DMSO和60μM Ys底物。Ys緩沖液的最終pH為8.0。
依據(jù)文獻(xiàn)(McCormack等，生物化學(xué)(Biochemistry)377792-7800(1998))的程序從兔網(wǎng)狀細(xì)胞制備純化的20S蛋白酶體標(biāo)準(zhǔn)品，用20mMHEPES/0.5mM EDTA(pH7.8)按9∶1(v/v)稀釋。
向5μL 20mM AMC的DMF貯存液中加入2mL DMF。將所產(chǎn)生溶液按1∶25用DMSO稀釋從而制備2μM AMC溶液。在熒光分光光度計(jì)上記錄Ys底物緩沖溶液的零值(λem＝440nm；λex＝380nm)。用總共5次，每隔30秒鐘向2mL Ys底物緩沖液中加入5μL AMC，產(chǎn)生一條AMC為0-50pmol的校準(zhǔn)曲線。每次加入之后進(jìn)行一次熒光分光光度讀數(shù)，激發(fā)光帶寬為10nm，發(fā)射光帶寬為20nm。該斜率是熒光分光光度計(jì)校正值。
20S蛋白酶體標(biāo)準(zhǔn)品用20mM HEPES/0.5 mM EDTA(pH7.8)中按1∶10稀釋，形成12μg/mL的貯存液，置于冰上。向含有2mL Ys底物緩沖液的杯中加入10μL標(biāo)準(zhǔn)的20S蛋白酶體溶液，允許反應(yīng)進(jìn)行10分鐘。在熒光分光光度計(jì)上測量最大線性斜率，提供Ys底物緩沖液和分析條件校正值(Ys校正)。本數(shù)值除以熒光分光光度計(jì)校正值，從而提供標(biāo)準(zhǔn)20S蛋白酶體的標(biāo)準(zhǔn)化活性。
如同實(shí)施例1中所述制備白細(xì)胞，向每一樣品加入200μL 5mMEDTA裂解白細(xì)胞。允許這些樣品在冰上放置至少15分鐘。
使用商品化試劑盒按照標(biāo)準(zhǔn)的程序?qū)υ囼?yàn)樣品進(jìn)行Bradford蛋白質(zhì)分析(測量總蛋白質(zhì)含量)和血紅蛋白分析。如果血紅蛋白的含量大于總蛋白的10％，就不能確定白細(xì)胞20S蛋白酶體活性的準(zhǔn)確測量值。在這種情形下，樣品應(yīng)該按全血細(xì)胞裂解物處理。
在37℃下向含有2mL Ys底物緩沖液的透明小杯中加入10μL試驗(yàn)樣品，允許反應(yīng)進(jìn)行10分鐘。在10分鐘內(nèi)實(shí)現(xiàn)20S蛋白酶體的完全活化。4分鐘之后直到10分鐘，讀數(shù)得到的結(jié)果一致。測量數(shù)據(jù)的最大線性斜率至少1分鐘。如果速率不到1pmol AMC/sec，使用20μL試驗(yàn)樣品重復(fù)測量。
試驗(yàn)樣品中蛋白酶體活性數(shù)值依據(jù)如下公式計(jì)算 為使分析可以被認(rèn)為是有效的，在樣品中存在的血紅蛋白必須小于總蛋白質(zhì)的10％，一式三份的20S蛋白酶體活性數(shù)值的標(biāo)準(zhǔn)偏差必須不大于3％。實(shí)施例4將糜蛋白酶活性與胰蛋白酶活性比值和蛋白酶體抑制劑產(chǎn)生的抑制百分?jǐn)?shù)聯(lián)系起來的方程的推導(dǎo)假定kc和kt分別為標(biāo)準(zhǔn)分析條件下(沒有抑制劑)糜蛋白酶和胰蛋白酶位點(diǎn)的表觀速率常數(shù)vc＝kc[20S]t(1)vt＝kt[20S]t(2)這里的[20S]＝總蛋白酶體濃度如果存在可引起E·I復(fù)合物形成的蛋白酶體調(diào)節(jié)劑時(shí)，糜蛋白酶和胰蛋白酶位點(diǎn)的速率常數(shù)可以被結(jié)合到一個(gè)還沒有被鑒定位點(diǎn)的單個(gè)調(diào)節(jié)劑分子改變。這種效應(yīng)可以用βckc和βtkt代表。
在這里β＝0表示由調(diào)節(jié)劑引起的總抑制(也就是說E·I復(fù)合物無活性)β＜1表示部分抑制(也就是說E·I復(fù)合物活性小于E)β＝1表示無抑制(也就是說E·I復(fù)合物具有與E相同的活性)且β＞1表示活化(也就是說E·I復(fù)合物活性大于E)在受調(diào)節(jié)的蛋白酶體的一個(gè)給定分?jǐn)?shù)(f)下vc＝kc[20S]t(1－f)＋βckc[20S]t(f) (3)vt＝kt[20S]t(1－f)＋βtkt[20S]t(f) (4) f=(kckt-vcvt)kckt-vcvt+βtvcvt-βckckt-----(6)]]>
參數(shù)kc/kt是一個(gè)可通過實(shí)驗(yàn)確定的常數(shù)，至少在一種個(gè)體內(nèi)是這樣的，還可能在跨物種間(也是這樣的)。kc/kt依賴于糜蛋白酶和胰蛋白酶活性的分析條件，但不倚賴于抑制劑的本性。參數(shù)βc和βt是特定抑制劑的常數(shù)。因?yàn)橐种苿?酶復(fù)合物活性一定發(fā)生與游離酶活性差異的變化，所以預(yù)期它們對分析條件的依賴性遠(yuǎn)低于kc/kt。如果β＝0或1，預(yù)期β對分析條件沒有依賴性。一旦知道特定的一套分析條件和抑制劑下的kc/kt，βc和βt，就能夠用一個(gè)粗樣品中糜蛋白酶和胰蛋白酶活性來計(jì)算受調(diào)節(jié)的蛋白酶體的分?jǐn)?shù)。
在N-(吡嗪)羰基-L-苯丙氨酸-L-亮氨酸硼酸的特定例子中，βc＝0，所以vcvt=kckt(1-f1-f+βtf)----(8)]]>可以推導(dǎo)類似的方程來表示蛋白酶體抑制對于蛋白酶體的任意兩個(gè)肽酶活性比值的函數(shù)。實(shí)施例5測量外周白細(xì)胞中20S蛋白酶體活性的分析糜蛋白酶對胰蛋白酶活性的比值本分析建立在游離20S蛋白酶體顆粒的SDS-誘導(dǎo)性糜蛋白酶樣活性和胰蛋白酶樣活性的基礎(chǔ)上。它使用熒光分光光度計(jì)分析來測量20S蛋白酶體水解一種小肽底物中酰胺鍵的速率。因?yàn)?0S蛋白酶體的某些抑制劑完全抑制糜蛋白酶樣活性而活化胰蛋白酶樣活性，結(jié)合了這種抑制劑的20S蛋白酶體的百分?jǐn)?shù)可以直接用糜蛋白酶樣活性和胰蛋白酶樣活性的比值來確定?？s寫和定義除了在實(shí)施例3中所提出的定義之外，還給藥到如下定義Rs底物N-(N-苯甲?；i氨酰甘氨酰精氨酰)-7-氨基-4-甲基香豆素(Bz-Val-Gly-Arg-AMC)(Bachem)程序如實(shí)施例3中所述制備Ys底物緩沖液。
Rs底物緩沖液在DMSO中溶解成10mM。制備Rs底物緩沖液，它含有20mM HEPES，0.5mM EDTA，0.6％DMSO和60μM Rs底物。
根據(jù)文獻(xiàn)(McCormack等，生物化學(xué)(Biochemistry)377792-7800(1998))程序所制備的來自兔網(wǎng)狀細(xì)胞的純化的20S蛋白酶體標(biāo)準(zhǔn)用20mM HEPES/0.5mM EDTA(pH7.8)按1∶9(v/v)稀釋。
如實(shí)施例3中所述，進(jìn)行熒光分光光度計(jì)校正。
如施例3中所述，進(jìn)行Ys底物緩沖液校正。
用Rs底物緩沖液替換Ys底物緩沖液，以類似的方式進(jìn)行Rs底物緩沖液的校正。
在37℃下向含有2mL Ys底物緩沖液的透明小杯中加入10μL試驗(yàn)樣品，允許反應(yīng)進(jìn)行10分鐘。在10分鐘內(nèi)完成20S蛋白酶體的完全活化。4分鐘之后直到10分鐘，讀數(shù)獲得一致的結(jié)果。測量數(shù)據(jù)的最大線性斜率至少1分鐘。如果速率小于1pmol AMC/sec，就用20μL試驗(yàn)樣品重復(fù)測量。
在37℃下向含有2mL Rs底物緩沖液的透明小杯中加入20μL試驗(yàn)樣品，并允許反應(yīng)進(jìn)行10分鐘。在10分鐘內(nèi)完成20S蛋白酶體的完全活化。4分鐘之后直至10分鐘，讀數(shù)獲得一致的結(jié)果。測量最大線性斜率至少1分鐘。如果速率小于1pmol AMC/sec，就用20μL試驗(yàn)樣品在800μL Rs緩沖液中重復(fù)測量。
然后按照如下方程計(jì)算抑制百分?jǐn)?shù)(％I)%I=100*(kckt-vcvt)(kckt-vcvt+βtvcvt)----(9)]]>在這里，vc＝(糜蛋白酶解的速率(FU/s)/所分析樣品的體積)；vt＝(胰蛋白酶解的速率(FU/s)/所分析樣品的體積)；kc/kt＝在給藥蛋白酶體抑制之前從受試者所采集的1-3個(gè)基線樣品的vc/vt平均值。
βt＝?jīng)Q定于蛋白酶體抑制劑的滴定的活化因數(shù)。就蛋白酶體抑制劑1而言，在人樣品中βt＝1.28。實(shí)施例6制備外周全血細(xì)胞裂解物用于體外測定20S蛋白酶體活性將所需量的血液收集到一支含有抗凝劑的試管中。典型地，需要1mL血液。將血液轉(zhuǎn)移到1.5mL Eppendorf小量離心管中，在4℃下6000×g小量離心約10分鐘。吸去血漿，用一定體積(～0.5mL)的冷磷酸鹽緩沖液按1∶1重新懸浮細(xì)胞團(tuán)。細(xì)胞懸液再在4℃下6600×g小量離心約10分鐘。吸去上清，將10μL細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)移到一支1.5mLEppendorf小量離心管中，加入0.5mL 5mM EDTA。剩余細(xì)胞團(tuán)在-70℃保存。
在本分析中使用這種樣品10-20μL(典型的蛋白質(zhì)濃度是5mg/mL)。實(shí)施例7測量外周全血細(xì)胞中20S蛋白酶體活性的分析試驗(yàn)糜蛋白酶樣活性對胰蛋白酶樣活性的比值縮寫和定義使用在實(shí)施例3和5中所提出的縮寫和定義。程序在DMSO中將Ys底物溶解成6mM。在玻璃瓶中制備2％SDS(2g/100mL)的MilliQ水溶液。制備Ys底物緩沖液，含有20mM HEPES，0.5mMEDTA，0.05％SDS，1％DMSO和60μM Ys底物。Ys緩沖液的最終pH是8.0。
在DMSO中將Rs底物溶解成10mM。制備Rs底物緩沖液，含有20mM HEPES，0.5mM EDTA，0.6％SDS，0.6％DMSO和60μM Rs底物。Rs緩沖液的最終pH是8.0。
如實(shí)施例6中所述制備標(biāo)準(zhǔn)全血細(xì)胞裂解物，并用20mMHEPES/0.5mM EDTA(pH7.8)按1∶9稀釋。
用標(biāo)準(zhǔn)的全血細(xì)胞裂解物代替20S蛋白酶體標(biāo)準(zhǔn)，如實(shí)施例3中所述進(jìn)行熒光分光光度計(jì)校正。
用標(biāo)準(zhǔn)的全血細(xì)胞裂解物代替20S蛋白酶體標(biāo)準(zhǔn)，如實(shí)施例3中所述進(jìn)行Ys底物緩沖液的校正。
用Rs底物緩沖液代替Ys底物緩沖液，以類似的方式進(jìn)行Rs底物緩沖液的校正。
在37℃下向含有2mL Ys底物緩沖液的透明小杯中加入含有60μg蛋白質(zhì)的試驗(yàn)樣品，允許反應(yīng)進(jìn)行10分鐘。在10分鐘內(nèi)完成20S蛋白酶體的完全活化。4分鐘之后直到10分鐘，讀數(shù)獲得一致的結(jié)果。測量數(shù)據(jù)的最大線性斜率至少1分鐘。如果速率小于1pmol AMC/sec，就將試驗(yàn)樣品的量提高到含有120μg蛋白質(zhì)重復(fù)測量。
在37℃下向含有2mL Rs底物緩沖液的透明小杯中加入含有60μg蛋白質(zhì)的試驗(yàn)樣品，并允許反應(yīng)進(jìn)行10分鐘。在10分鐘內(nèi)完成20S蛋白酶體的完全活化。4分鐘之后直至10分鐘，讀數(shù)獲得一致的結(jié)果。測量數(shù)據(jù)的最大斜率至少1分鐘。如果速率小于1pmol AMC/sec，就用120μg試驗(yàn)樣品重復(fù)測量。
然后按照如下方程計(jì)算抑制百分?jǐn)?shù)(％I)%I=100*(kckt-vcvt)(kckt-vcvt+βtvcvt)----(9)]]>在這里，vc＝(糜蛋白酶解的速率(FU/s)/所分析樣品的體積)；vt＝(胰蛋白酶解的速率(FU/s)/所分析樣品的體積)；kc/kt＝在給藥蛋白酶體抑制之前從受試者所采集的1-3個(gè)基線樣品的vc/vt平均值。
βt＝?jīng)Q定于蛋白酶體抑制劑滴定的活化系數(shù)。就蛋白酶體抑制劑1而言，在人樣品中βt＝1.28。實(shí)施例8人類志愿者外周血白細(xì)胞中的蛋白酶體活性水平方法在10周時(shí)間內(nèi)在從數(shù)個(gè)人類志愿者采集血液樣品(每次大約2mL)5次。收集以后，用NycoprepTM從各血液樣品中分離白細(xì)胞。產(chǎn)生的小團(tuán)在設(shè)定好維持于-60℃-80℃的冰箱中貯存，直至試驗(yàn)?zāi)翘臁Ｔ诿看嗡占臉悠芬黄疬M(jìn)行試驗(yàn)，每個(gè)樣品做兩個(gè)重復(fù)進(jìn)行試驗(yàn)。
20S蛋白酶體活性通過測量樣品蛋白酶水解一種熒光素(AMC)標(biāo)記的肽底物的速率來確定，并用裂解物中蛋白質(zhì)的量對活性進(jìn)行歸一化處理。向含有2mL分析反應(yīng)緩沖液(溶于1.0％DMSO中的20mMHEPES，0.5mM EDTA，0.035％SDS，60μM Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC)和磁性攪拌棒的透明小杯中加入5μL樣品。將這個(gè)小杯置于熒光分光光度計(jì)上并維持在37℃，同時(shí)通過監(jiān)測可檢測熒光的增加來測量水解AMC的量5分鐘(λem＝440nm；λex＝380nm)。對開始反應(yīng)后3-5分鐘之間收集的數(shù)據(jù)的反應(yīng)進(jìn)程曲線進(jìn)行線性回歸，給出以熒光單位/秒(FU/sec)表示的水解速率。分別用改良的Bradford分析(Pierce)和血球蛋白特異性酶解為基礎(chǔ)的分析(Sigma)方法確定蛋白質(zhì)和血球蛋白的濃度。通過扣除紅細(xì)胞所貢獻(xiàn)蛋白質(zhì)的量(從血紅蛋白濃度估計(jì))來校正樣品中所測量蛋白質(zhì)的總量。用如下方程確定樣品中20S蛋白酶體的活性 在這里，C＝使熒光量等于與游離AMC濃度(FU/pmol AMC)的轉(zhuǎn)換系數(shù)。結(jié)果和討論所測出的各人類志愿者20S蛋白酶體活性的平均值是15.33-40.04pmol AMC/sec/mg蛋白質(zhì)(表1和圖1)。貫穿各試驗(yàn)日所發(fā)現(xiàn)的活性列于圖2。在該群體中所發(fā)現(xiàn)的20S蛋白酶體活性的平均值是29.97±0.80pmol AMC/sec/mg蛋白質(zhì)。
表1人類志愿者中的20S蛋白酶體活性水平
實(shí)施例9給藥N-(吡嗪)羰基-L-苯丙氨酸-L-亮氨酸硼酸(1)后所分離的白細(xì)胞和組織中暫時(shí)的20S蛋白酶體活性一般程序研究期間每日制備1的給藥劑型。從貯存液制備稀釋(溶液)。1的貯存液用98％的鹽水(0.9％)，2％乙醇和0.1％抗壞血酸制備。用相同賦形劑制備稀釋(溶液)。
從Taconic Farm(Gernmantown，NY)獲取雌性CD2-F1小鼠(18-20克)，雌性BALB/c小鼠(18-20克)，雌性Wistar大鼠(150-200克)和雄性Sprague-Dawley大鼠(250-450克)。開始研究之前觀察動物至少一周，進(jìn)行一般健康檢查。這些研究中所用動物都無癥狀的。在聚碳酸酯籠子飼養(yǎng)，小鼠每籠5只，大鼠每籠3只。在觀察和研究期間使用Corn Cob褥草(AND-1005；Farmers Exchange，F(xiàn)ramingham，MA)?？刂茻晒獍l(fā)光從而自動提供各大約12小時(shí)的光和暗交替的周期。每日主要控制和記錄溫度和濕度，讀數(shù)分別在21±2℃和45±5％之間。在全部觀察和研究期間，標(biāo)準(zhǔn)嚙齒動物食物的小團(tuán)(#5001，Purina，St.Louis，MO)隨意可得。水瓶隨意提供劍橋市自來水。沒有發(fā)現(xiàn)預(yù)期會干擾研究的食物和水污染。
用載體靜脈(IV)注射藥物，所用給藥體積為小鼠每只100μL或大鼠1.0mg/kg。給對照組給藥載體(98％的鹽水(0.9％)，2％乙醇和0.1％抗壞血酸)。用單個(gè)IV快注一次或數(shù)次給藥給動物1。表現(xiàn)出半死活性的動物用CO2吸入法將其安樂地處死。
IV給藥1之后，在各時(shí)間點(diǎn)抽取血液并分離外周血白細(xì)胞。單給藥1之后，在小鼠外周血白細(xì)胞中所測定的離體20S蛋白酶體活性在兩個(gè)合并的研究中，給雌性CD2-F1小鼠(18-20克)和雌性BALB/c小鼠(18-20克)單靜脈給藥1(0.1-0.3mg/kg，給藥體積為100μL)。載體是98％的鹽水
，2％乙醇，0.1％抗壞血酸。用藥后1.0和24小時(shí)收集血液樣品。因?yàn)?0S蛋白酶體活性試驗(yàn)所必需的血液體積，同時(shí)處死各組中5只小鼠，將血液合并以產(chǎn)生各單一數(shù)據(jù)點(diǎn)。
對所有劑量組在靜脈給藥1之后1小時(shí)，20S蛋白酶體活性有一個(gè)顯著的劑量-相關(guān)的下降(p＜0.05)，在24小時(shí)開始恢復(fù)(圖4)。這些研究表明，單次靜脈注射給藥1之后，小鼠外周血白細(xì)胞中20S蛋白酶體活性有劑量-依賴性的可逆轉(zhuǎn)的抑制。單次靜脈給藥1之后，在大鼠外周血白細(xì)胞中所確定的離體20S蛋白酶體活性在4個(gè)合并的研究中，給雌性Wistar大鼠(150-200克)單次靜脈給藥1(0.03-0.0mg/kg，給藥體積為1.0mg/kg)。載體是0.1％抗壞血酸/2％乙醇/98％鹽水(0.9％)。在給藥1后1.0，24和48小時(shí)收集血液樣品。
在靜脈給藥1后1小時(shí)，20S蛋白酶體活性有一個(gè)顯著(p＜0.05)的劑量-相關(guān)的下降(圖5)。給藥后24小時(shí)，20S蛋白酶體活性的劑量-相關(guān)下降較小，但在較高劑量組(0.2m/kg)中仍然顯著(p＜0.05)(圖6)。在給藥后48小時(shí)的時(shí)候，20S蛋白酶體抑制劑不再有顯著的下降(圖7)。
這些研究表明，在單次靜脈注射1之后大鼠外周血白細(xì)胞中20S蛋白酶體活性有一種劑量-依賴性的且可以逆轉(zhuǎn)的抑制。在大鼠上觀察到20S蛋白酶體活性水平有較慢的回歸基線速率，可能表示在小鼠上代謝更快。重復(fù)靜脈給藥1之后，在大鼠外周血白細(xì)胞中所確定的離體的20S蛋白酶體活性如果每日靜脈給藥1連續(xù)用7天，最后一次給藥之后24小時(shí)觀察到20S蛋白酶體活性有一種劑量相關(guān)的下降。對于≥0.05mg/kg的劑量觀察到顯著的抑制。7個(gè)每日靜脈給藥之后24小時(shí)所觀察到20S蛋白酶體抑制的程度大于單次靜脈給藥之后24之后所觀察到抑制的程度，這可能反映了每日給藥1對其生物學(xué)靶位-蛋白酶體的累積效應(yīng)。
對于隔日靜脈給藥1連續(xù)給藥14天(的給藥方案)，在最后一次給藥之后24小時(shí)觀察到20S蛋白酶體抑制劑有一種顯著的劑量相關(guān)性下降。在劑量≥0.2mg/kg的組中，20S蛋白酶體活性的劑量相關(guān)性下降是顯著的(p＜0.05)。對每周1次靜脈給藥1連續(xù)給藥8周(的給藥方案)，在最后一次給藥后24小時(shí)觀察到20S蛋白酶體活性有一種顯著的劑量相關(guān)的下降(p＜0.05)。在劑量≥0.1mg/kg的劑量組中，20S蛋白酶體活性的降低是顯著的(p＜0.05)。
在附加的重復(fù)給藥研究中，用每周兩次靜脈給藥(0.01-0.35mg/kg/day，給藥體積為1.0mL/kg)連續(xù)兩周給藥1(這樣的方式)來處理雄性Sprague-Dawley大鼠(250-450克；n＝6/組)。載體是0.1％抗壞血酸/2％乙醇/98％鹽水(0.9％)。為了評價(jià)20S蛋白酶體活性，在最后一次給藥之后1.0小時(shí)收集血液樣品。
當(dāng)每周給藥1共兩周時(shí)，在最后給藥后1.0小時(shí)觀察到20S蛋白酶體活性的劑量相關(guān)性下降(圖8)。對于所有劑量≥0.03mg/kg的給藥組，20S蛋白酶體活性的降低是顯著的(p＜0.05)。
結(jié)果表示重復(fù)劑量給藥1在大鼠白細(xì)胞中誘發(fā)20S蛋白酶體活性發(fā)生劑量相關(guān)性的下降。在每日1次或隔日1次給藥1時(shí)，20S蛋白酶體活性抑制的程度大于單次給藥之后所見到的程度。如果增加1的給藥間隔從而允許(蛋白酶體活性)恢復(fù)的話(例如，每周一次的給藥方案)，那么抑制的程度就等于單次給藥1(的給藥方案)。這種藥效曲線支持1每周兩次給藥(的給藥方案)，其中觀察到暫時(shí)性抑制。重復(fù)靜脈給藥1之后，在大鼠組織中所測定的離體的20S蛋白酶體活性在兩項(xiàng)研究中，給雌性Wistar大鼠(150-200克)單次靜脈給藥1(0.03，0.1和0.3mg/kg，給藥體積為1.0mL/kg)。載體是0.1％抗壞血酸/2％乙醇/98％鹽水(0.9％)。為了評價(jià)20S蛋白酶體活性，在給藥之后1.0，24和48小時(shí)從肝和腦收集組織樣品。
靜脈給藥1之后1.0小時(shí)在大鼠肝中20S蛋白酶體活性有一種顯著的劑量相關(guān)性下降(p＜0.05)。給藥后24小時(shí)，20S蛋白酶體活性的劑量相關(guān)性下降較小，但在高劑量組0.3mg/kg中仍然是顯著(p＜0.05)。在給藥后48小時(shí)，大鼠肝中的20S蛋白酶體活性已經(jīng)回到基線。肝中20S蛋白酶體活性抑制程度回到基線水平(的速度)比外周血白細(xì)胞所觀察到的快。在腦組織中沒有觀察到20S蛋白酶體抑制，反映出沒有1穿透進(jìn)入該組織。
在第3項(xiàng)研究中，給雄性Sprague-Dawley大鼠(250-450克)單次靜脈給藥1(0.1和0.3mg/kg，給藥體積為1.0mL)。載體是0.1％抗壞血酸/2％乙醇/98％鹽水(0.9％)。為了評價(jià)20S蛋白酶體活性，在給藥之后1.0小時(shí)收集血液和組織樣品。從腦、結(jié)腸、肝、肌肉(腓腸肌)、前列腺和睪丸中收集組織。
靜脈給藥1之后1小時(shí)，在外周血白細(xì)胞、結(jié)腸、肌肉(腓腸肌)、前列腺中觀察到20S蛋白酶體活性有一個(gè)顯著的劑量依賴性下降(p＜0.05)。在腦和睪丸中沒有觀察到20S蛋白酶體抑制，反映出沒有1穿透進(jìn)入這些組織。
靜脈給藥之后1小時(shí)，各組織中20S蛋白酶體抑制，除腦和睪丸外，都相似于外周血白細(xì)胞所觀察到的。單次靜脈給藥1之后，在靈長類動物中所測定的離體的20S蛋白酶體活性將雄性和雌性食蟹猴(2.2-3.5kg)分為四組(5/性別/組)。每組接受0(載體對照)，0.045，0.067，或0.100mg/kg/次單次靜脈注射1，給藥體積為0.3mL/kg，每周兩次連續(xù)4周(第1，5，8，12，15，19，22和26天)。載體是0.1％抗壞血酸/2％乙醇/98％鹽水(0.9％)。在第27天處理結(jié)束時(shí)，處死來自對照組、低劑量組和中劑量組的三只雄性，高劑量組兩只雄性和各組的三只雌性，兩只動物/性別/組被指定為恢復(fù)動物，接受處理4周，隨后兩周恢復(fù)；在第41天將它們處死。
在處理之前、在第1，8，15和22天給藥后1.0小時(shí)和第5，12，19和26天給藥前1.0小時(shí)、以及在第31，34，38和41天(恢復(fù)處死的動物)，收集血液用于20S蛋白酶體活性的確定。還在第26天接受8次給藥之后處于垂死狀態(tài)下被處死之前從高劑量雄性收集血液用于20S蛋白酶體活性確定。
給藥后1.0小時(shí)白細(xì)胞20S蛋白酶體活性的確定揭示在接受隨后給藥之前，已經(jīng)恢復(fù)72小時(shí)的酶活性有一個(gè)顯著的劑量依賴性的下降(圖9和10)。發(fā)現(xiàn)在第26天處死的垂死動物在其白細(xì)胞中有低的殘余20S蛋白酶體活性。
這些數(shù)據(jù)支持每周兩次給藥1的治療計(jì)劃，因?yàn)?0S蛋白酶體水平在給藥之間恢復(fù)。實(shí)施例10(N-(吡嗪)羰基-L-苯丙氨酸-L-亮氨酸硼酸)(1)對于來自兔網(wǎng)織細(xì)胞的純化的20S蛋白酶體的糜蛋白酶和胰蛋白酶活性的效應(yīng)根據(jù)已發(fā)表的程序從兔網(wǎng)織細(xì)胞純化20S蛋白酶體(McCormack等，生物化學(xué)(Biochemistry)377792-7800(1998))。如實(shí)施例3和5中所述，使用濃度遞增的蛋白酶體抑制劑1進(jìn)行糜蛋白酶和胰蛋白酶分析。數(shù)據(jù)列于圖11。實(shí)施例11來自兔網(wǎng)織細(xì)胞的純化的20S蛋白酶體中糜蛋白酶活性對胰蛋白酶活性比值與抑制百分?jǐn)?shù)之間的關(guān)聯(lián)性根據(jù)已發(fā)表的程序制備來自兔網(wǎng)狀細(xì)胞的純化20S蛋白酶體(McCormack等，生物化學(xué)(Biochemistry)377792-7800(1998))。如實(shí)施例3和5中所述，使用濃度遞增的蛋白酶體抑制劑1進(jìn)行糜蛋白酶和胰蛋白酶分析。數(shù)據(jù)擬合到vc/vt＝kc/kt*(1－f)/(1－f＋βt*f)，在這里kc/kt＝2.88±0.03，βt＝1.38±0.05，而％I＝f*100(圖12)。實(shí)施例12大鼠白細(xì)胞裂解物中抑制百分?jǐn)?shù)與糜蛋白酶活性對胰蛋白酶活性比值之間的關(guān)聯(lián)性如實(shí)施例3和5中所述，使用濃度遞增的蛋白酶體抑制劑1進(jìn)行糜蛋白酶和胰蛋白酶分析。如實(shí)施例10進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合，得kc/kt＝1.76±和βt＝1.1±0.2(圖13)。
權(quán)利要求
1.一種監(jiān)測蛋白酶體抑制劑在哺乳動物中的藥效學(xué)的藥物作用的方法，包括給該哺乳動物給藥蛋白酶體抑制劑；在給藥該蛋白酶體抑制劑之后的一個(gè)或更多指定的時(shí)刻從此哺乳動物采集一個(gè)或多個(gè)試驗(yàn)生物樣品；測量該一個(gè)或多個(gè)試驗(yàn)生物樣品中蛋白酶體的活性；確定該一個(gè)或多個(gè)試驗(yàn)生物樣品蛋白酶體活性數(shù)量；比較試驗(yàn)生物樣品中蛋白酶體活性數(shù)量與從未給藥過蛋白酶體抑制劑的哺乳動物中所采集的參考生物樣品中蛋白酶體活性數(shù)量。
2.權(quán)利要求1的方法，其中生物樣品選自血液、尿、器官和組織樣品。
3.權(quán)利要求1的方法，其中生物樣品選自腫瘤活組織檢查、皮膚活組織檢查、結(jié)腸活組織檢查、滑液、支氣管液、肌肉細(xì)胞、血細(xì)胞和血細(xì)胞前體。
4.權(quán)利要求2的方法，其中的生物樣品是血液樣品。
5.權(quán)利要求4的方法，其中的血液樣品是白細(xì)胞裂解物。
6.權(quán)利要求4的方法，其中的生物樣品是全血細(xì)胞裂解物。
7.權(quán)利要求1的方法，其中的哺乳動物選自大鼠、小鼠、非人靈長類動物和人。
8.權(quán)利要求7的方法，其中的哺乳動物是人。
9.權(quán)利要求1的方法，其中的蛋白酶體活性是通過分析存在一種20S蛋白酶體活化劑時(shí)蛋白水解的速率來測量的。
10.權(quán)利要求9的方法，其中的活化劑是SDS。
11.權(quán)利要求10的方法，其中的生物樣品是白細(xì)胞裂解物而SDS存在的濃度是大約0.035％。
12.權(quán)利要求10的方法，其中的生物樣品是全血細(xì)胞裂解物而SDS存在的濃度是大約0.05％。
13.權(quán)利要求1的方法，其中分析糜蛋白酶活性。
14.權(quán)利要求1的方法，其中分析胰蛋白酶活性。
15.權(quán)利要求1的方法，在其中相對于蛋白質(zhì)濃度獨(dú)立地對生物樣品中蛋白酶體活性和參考樣品中蛋白酶體活性進(jìn)行歸一化處理。
16.權(quán)利要求1的方法，在其中相對于細(xì)胞計(jì)數(shù)獨(dú)立地對生物樣品中蛋白酶體活性和參考樣品中蛋白酶體活性進(jìn)行歸一化處理。
17.權(quán)利要求1的方法，在其中用蛋白酶體的第1種肽酶活性對蛋白酶體的第2種肽酶活性的比值獨(dú)立地確定生物樣品中蛋白酶體活性和參考樣品中蛋白酶體活性。
18.權(quán)利要求17的方法，其中第1種肽酶活性是糜蛋白酶活性，第2種肽酶活性是胰蛋白酶活性。
19.權(quán)利要求1的方法，其中的蛋白酶體抑制劑選自肽基醛類、乙烯基砜類、環(huán)氧酮類、肽基硼酸類和lactacystin類似物類。
20.權(quán)利要求19的方法，其中的蛋白酶體抑制劑是一種肽基硼酸。
21.權(quán)利要求20的方法，其中的蛋白酶體抑制劑選自N-乙?；?L-亮氨酸-β-(1-萘基)-L-丙氨酸-L-亮氨酸硼酸；N-(8-喹啉)磺酰基-β-(1-萘基)-L-丙氨酸-L-亮氨酸硼酸；N-(吡嗪)羰基-L-苯丙氨酸-L-亮氨酸硼酸；β-(1-萘基)-L-丙氨酸-L-亮氨酸硼酸；和N-(4-嗎啉)羰基-
-L-酪氨酸-L-亮氨酸硼酸。
22.權(quán)利要求21的方法，其中的肽基硼酸是N-(吡嗪)羰基-L-苯丙氨酸-L-亮氨酸硼酸。
23.權(quán)利要求19的方法，其中的蛋白酶體抑制劑是一種lactacysin類似物。
24.權(quán)利要求23的方法，其中的lactacystin類似物選自lactacystin，clasto-Lactacystinβ-內(nèi)酯和7-乙基-clasto-lactacystinβ-內(nèi)酯和7-正-丙基-clasto-lactacystinβ-內(nèi)酯。
25.權(quán)利要求24的方法，其中的lactacystin類似物是7-正-丙基-clasto-lactacystinβ-內(nèi)酯。
26.一種給蛋白酶體抑制劑確定給藥方案的方法，包括給此哺乳動物給藥蛋白酶體抑制劑；給藥蛋白酶體抑制劑以后的在一個(gè)或多個(gè)指定的時(shí)間從哺乳動物采集一個(gè)或多個(gè)試驗(yàn)生物樣品；測量該一個(gè)或多個(gè)試驗(yàn)樣品中蛋白酶體活性；確定一個(gè)或多個(gè)試驗(yàn)生物樣品中蛋白酶體活性的量；將試驗(yàn)生物樣品中蛋白酶體活性的量與從沒有給藥過蛋白酶體抑制劑哺乳動物所采集的參考生物樣品中蛋白酶體活性的量做比較，并選擇今后要給藥蛋白酶體抑制劑的給藥量和給藥頻率。
27.權(quán)利要求26的方法，其中的生物樣品選自血液、尿、器官和組織樣品。
28.權(quán)利要求26的方法，其中生物樣品選自腫瘤活組織檢查、皮膚活組織檢查、結(jié)腸活組織檢查、滑液、支氣管液、肌肉細(xì)胞、血細(xì)胞和血細(xì)胞前體。
29.權(quán)利要求27的方法，其中的生物樣品是血液樣品。
30.權(quán)利要求29的方法，其中的血液樣品是白細(xì)胞裂解物。
31.權(quán)利要求29的方法，其中的血液樣品是全血細(xì)胞裂解物。
32.權(quán)利要求26的方法，其中的哺乳動物選自大鼠、小鼠、非人靈長類動物和人。
33.權(quán)利要求32的方法，其中的哺乳動物是人。
34.權(quán)利要求26的方法，其中的蛋白酶體活性是通過分析存在20S蛋白酶體活化劑時(shí)蛋白質(zhì)水解的速率來測量的。
35.權(quán)利要求34的方法，其中的活化劑是SDS。
36.權(quán)利要求35的方法，其中的生物樣品是白細(xì)胞裂解物并且SDS的存在濃度大約為0.035％。
37.權(quán)利要求35的方法，其中的生物樣品是全血細(xì)胞裂解物并且SDS的存在濃度大約為0.05％。
38.權(quán)利要求26的方法，其中的蛋白酶體活性是糜蛋白酶活性。
39.權(quán)利要求26的方法，其中的蛋白酶體活性是胰蛋白酶活性。
40.權(quán)利要求26的方法，其中生物樣品中蛋白酶體活性和參考樣品中蛋白酶體活性相對于蛋白質(zhì)濃度單獨(dú)進(jìn)行歸一化處理。
41.權(quán)利要求26的方法，其中生物樣品中蛋白酶體活性和參考樣品中蛋白酶體活性地相對于細(xì)胞計(jì)數(shù)單獨(dú)進(jìn)行歸一化處理。
42.權(quán)利要求26的方法，其中生物樣品中蛋白酶體活性和參考樣品蛋白酶體活性單獨(dú)用蛋白酶體中第1種肽酶活性對蛋白酶體中第2種肽酶活性的比值來確定。
43.權(quán)利要求42的方法，其中第1種肽酶活性是糜蛋白酶活性而第2種肽酶活性是胰蛋白酶活性。
44.權(quán)利要求26的方法，在其中選擇蛋白酶體抑制劑的給藥劑量和給藥頻率以避免過度的蛋白酶體抑制。
45.權(quán)利要求44的方法，其中過度的蛋白酶體抑制引起毒性效應(yīng)。
46.權(quán)利要求26的方法，在其中選擇蛋白酶體抑制劑的給藥劑量和給藥頻率以使生物樣品中蛋白酶體抑制不超過大約95％。
47.權(quán)利要求26的方法，在其中選擇蛋白酶體抑制劑的給藥劑量和給藥頻率從而獲得治療上有用的蛋白酶體抑制。
48.權(quán)利要求47的方法，在其中選擇蛋白酶體抑制劑的給藥劑量和給藥頻率從而在生物樣品中獲得至少15％的蛋白酶體抑制。
49.權(quán)利要求47的方法，在其中選擇蛋白酶體抑制劑的給藥劑量和給藥頻率從而在生物樣品中獲得至少20％的蛋白酶體抑制。
50.權(quán)利要求47的方法，在其中選擇蛋白酶體抑制劑的給藥劑量和給藥頻率從而在生物樣品中獲得至少30％的蛋白酶體抑制。
51.權(quán)利要求47的方法，在其中選擇蛋白酶體抑制劑的給藥劑量和給藥頻率從而在生物樣品中獲得至少40％的蛋白酶體抑制。
52.權(quán)利要求47的方法，在其中選擇蛋白酶體抑制劑的給藥劑量和給藥頻率從而在生物樣品中獲得至少50％的蛋白酶體抑制。
53.權(quán)利要求47的方法，在其中選擇蛋白酶體抑制劑的給藥劑量和給藥頻率從而在生物樣品中獲得大約50％-大約80％的蛋白酶體抑制。
54.權(quán)利要求26的方法，其中的蛋白酶體抑制劑選自肽基醛類、肽基硼酸類和lactacystin類似物類。
55.權(quán)利要求54的方法，其中的蛋白酶體抑制劑是一種肽基硼酸。
56.權(quán)利要求55的方法，其中的肽基硼酸選自N-乙?；?L-亮氨酸-β-(1-萘基)-L-丙氨酸-L-亮氨酸硼酸；N-(8-喹啉)磺?；?β-(1-萘基)-L-丙氨酸-L-亮氨酸硼酸；N-(吡嗪)羰基-L-苯丙氨酸-L-亮氨酸硼酸；β-(1-萘基)-L-丙氨酸-L-亮氨酸硼酸；和N-(4-嗎啉)羰基-
-L-酪氨酸-L-亮氨酸硼酸。
57.權(quán)利要求56的方法，其中的肽基硼酸是N-(吡嗪)羰基-L-苯丙氨酸-L-亮氨酸硼酸。
58.權(quán)利要求54的方法，其中的蛋白酶體抑制劑是一種lactacystin類似物。
59.權(quán)利要求58的方法，其中l(wèi)actacystin類似物選自lactacystin，clasto-lactacystinβ-內(nèi)酯，7-乙基-clasto-lactacystinβ-內(nèi)酯和7-正-丙基-clasto-lactacystinβ-內(nèi)酯。
60.權(quán)利要求59的方法，其中的lactacystin類似物是7-正-丙基-clasto-lactacystinβ-內(nèi)酯。
61.一種監(jiān)測哺乳動物中基線蛋白酶體活性的方法，包括從哺乳動物采集一個(gè)或多個(gè)生物樣品；測量一個(gè)或多個(gè)生物樣品中蛋白酶體的活性；和確定一個(gè)或多個(gè)生物樣品中蛋白酶體活性的數(shù)量。
62.權(quán)利要求61的方法，其中的哺乳動物被鑒定為患有疾病或病理狀態(tài)。
63.權(quán)利要求61的方法，進(jìn)一步包括比較從該哺乳動物采集的生物樣品中的蛋白酶體活性數(shù)量與從未患有該疾病或病理狀態(tài)的哺乳動物采集的參考生物樣品中的蛋白酶體活性數(shù)量。
64.權(quán)利要求63的方法，其中從患有疾病或病理狀態(tài)的哺乳動物采集的生物樣品的蛋白酶體活性數(shù)據(jù)，在與參考生物樣品的蛋白酶體活性數(shù)據(jù)比較之前，與患有相同疾病或病態(tài)的其它哺乳動物采集的生物樣品的蛋白酶體活性數(shù)據(jù)組合。
65.權(quán)利要求64的方法，進(jìn)一步包括選擇將要給患有該疾病或病況的哺乳動物給藥的蛋白酶體抑制劑的給藥劑量和給藥頻率。
66.權(quán)利要求64的方法，進(jìn)一步包括確定患有該疾病或病態(tài)的哺乳動物的診斷和預(yù)后。
67.權(quán)利要求61-66的任何一項(xiàng)的方法，其中的哺乳動物是人。
68.權(quán)利要求61的方法，其中的哺乳動物已經(jīng)給藥過一種藥物。
69.權(quán)利要求68的方法，其中的藥物不是蛋白酶體抑制劑。
70.權(quán)利要求68的方法，其中從已經(jīng)給藥過一種藥物的哺乳動物所采集生物樣品的蛋白酶體活性數(shù)據(jù)，在與參考生物樣品的數(shù)據(jù)比較之前，與從已給藥過該藥物的其它哺乳動物所采集生物樣品的數(shù)據(jù)組合。
71.權(quán)利要求68的方法，進(jìn)一步包括確定將要給已經(jīng)給藥過該藥物的哺乳動物給藥蛋白酶體抑制劑的給藥劑量和給藥頻率。
72.權(quán)利要求68-71中任何一項(xiàng)的方法，其中的哺乳動物是人。
73.一種用于測量生物樣品中蛋白酶體活性的試劑盒，包括制備生物樣品的工具和測量蛋白酶體活性的工具。
74.權(quán)利要求73的試劑盒，其中的哺乳動物是人。
75.權(quán)利要求73的試劑盒，其中的生物樣品是血液、尿或組織活組織檢查樣品。
全文摘要
本發(fā)明涉及測量生物樣品中的蛋白酶體活性的方法。更特別地,本發(fā)明涉及監(jiān)測體內(nèi)給藥蛋白酶體抑制劑后的藥物作用的方法。本發(fā)明提供了監(jiān)測藥效學(xué)的藥物作用和確定蛋白酶體抑制劑的給藥方案的方法和試劑盒。本發(fā)明還提供了確定哺乳動物中基線蛋白酶體活性的方法。
文檔編號C12Q1/37GK1331752SQ99813797
公開日2002年1月16日 申請日期1999年10月19日 優(yōu)先權(quán)日1998年10月20日
發(fā)明者G·R·瓦迪, R·L·斯泰因, L·R·迪克, V·J·帕羅姆貝拉, E·S·萊特凱普, P·J·艾利奧特, J·亞當(dāng)斯, T·A·麥克馬克, S·J·布蘭德, D·R·伯恩斯 申請人:千年藥物公司