專利名稱：治療含有雙微體dna的細胞的組合物及方法
技術領域：
一般而言，本發(fā)明涉及用于治療癌癥等腫瘤病的新型治療藥物的篩選方法以及該藥物在癌癥治療中的應用。
背景技術：
引用出版物貫穿該申請的整個范圍，其文獻目錄中的全部引文均可在該申請的正文或緊接權利要求書前的說明書結尾處找到。為了能更充分地描述與本發(fā)明相關的技術發(fā)展水平，這些出版物的公開內容和發(fā)表的專利說明書、著作以及發(fā)行的專利均在文中作為參考引入該公開內容中。
眾所周知，在一種先導組分被發(fā)現(xiàn)之前和被發(fā)現(xiàn)之后，導致新藥鑒定的藥物研究通常涉及對極大量的待選物質進行篩選。這是導致藥物研究投資大、周期長的因素之一，因此一種可輔助篩選的方法將會具有相當大的商業(yè)價值和實用性。
許多藥物通過與細胞內DNA相互作用而發(fā)揮其療效。一些藥物則以矯正遺傳異常為目標，遺傳異常的積累可導致某種患病狀態(tài)。例如，在癌癥發(fā)展期間通常會產生基因突變，它會大大提高堿基替換或大規(guī)模染色體重排的頻率。舉例來說，涉及p53腫瘤抑制基因的細胞周期調控途徑出現(xiàn)缺陷會形成一種允許環(huán)境，處在該環(huán)境中的細胞將對抗代謝物或癌基因過表達所造成的壓力產生應答，從而高頻率地出現(xiàn)非整倍性、染色體易位和基因擴增(Livingstone，et al.(1992)；Yin，et al.(1992)and Denko，et al.(1994))。
修復及細胞周期調控功能有缺陷的細胞內所產生的異常染色體結構類型可能受核結構的限制。例如，具有很長的臂的染色體會傾向于產生核突起物，該突起物在不同情況下被稱為“泡”或“芽”(Ruddle(1962)；Lo and Fraccaro(1974)；Toledo，et al.(1992)andPedeutour，et al.(1994))。最近在豌豆中進行的一項實驗表明，單染色體臂內的過量DNA產生了一種核突起物，該突起物在末期后細胞分裂板形成時被切除(Schubert and Oud(1997))。在微核內經常會檢測到該突起物所包含的序列，提示突起物可能是微核的前體(Toledo，et al.(1992)and Pedeutour，et al.(1994))，并且其包含的染色體序列可能從核中丟失。這些數據表明，特定細胞類型的核內的每個染色體臂存在一個最大容許長度。
癌細胞中還經常產生如雙微染色體(DMs)等自主復制的環(huán)狀DNA片段(Barder(1982)；Cowell(1982)and Benner，et al.(1991))。由這些結構編碼的蛋白可在體內提供生存優(yōu)勢，或在體外抵抗多種化學治療藥物(見Wahl(1989)；Brison(1993)；Von Hoff，et al.(1992)；Shimizu，et al.(1994)and Eckhardt，et al.(1994))。DMs采用細胞起源的復制起點進行復制(Carroll，et al.(1993))，但它們缺乏著絲粒，不能利用與染色體相同的機制進行分離。因此，DMs在缺乏選擇的情況下自然丟失。諸如羥基脲等藥物可顯著提高人類和嚙齒類細胞系內DMs的丟失率(Snapka and Varshavsky(1983)；Von Hoff，et al.(1991)；Von Hoff，et al.(1992)；Eckhardt，et al.(1994)and Canute，et al.(1996))。DMs的丟失可導致藥物敏感性增加、致腫瘤性降低、或導致分化，這取決于DM編碼基因所表達的蛋白(Snapka and Varshavsky(1983)；Snapka(1992)；Von Hoff，et al.(1992)；Eckhardt，et al.(1994)and Shimizu，et al.(1994))。為此，確定DMs丟失的機制將能夠發(fā)展出嶄新的或更具選擇性的化學治療策略，因為DMs僅能夠在癌細胞中發(fā)現(xiàn)，這種治療將不會導致染色體丟失。
另有報導，DMs與異常長染色體臂一樣，可被優(yōu)先摻入到將從胞內去除的微核內(VonHoff，et al.(1992)and Shimizu，et al.(1996))。很明顯，僅靠尺寸小是不能保證DNA片段被選擇性封裝在微核內的，因為具有典型DM大小的著絲點微染色體被選擇性排斥在微核之外(Shimizu，et al.(1996))。這一觀察結果與小核形成的經典機制相符，該過程涉及在有絲分裂末期核膜重組時封裝滯后的無著絲點染色體片段(Heddle and Carrano(1977)and Heddle，et al.(1983))。由此，可認為DMs是在有絲分裂后被封裝在微核內的，因為它們通常不具有功能性著絲粒(Levan，et al.(1976))。但DMs似乎能夠與染色體或核仁結合，使它們大多能夠逃避這種有絲分裂后機制。DMs這種通過與有絲分裂染色體或核仁結合而“搭便車”的能力可提供一種解釋，來說明為何在含有大量DMs的細胞系內幾乎檢測不到中間體中有微核(Levan and Levan(1978))，而且它們在某些細胞系中能夠以驚人的效率分配到子細胞中(Levan and Levan(1978)and Hamkalo，et al.(1985))。但正常染色體與DMs的間期行為可能不同，因為DMs缺乏著絲粒和/或端粒，而著絲粒和端粒能夠使染色體定位于限定區(qū)域并產生一套設計好的S期染色體移動線路(De and Mintz(1986)and Cremer et al.(1993))。目前還未能確定間期時無著絲點DM DNA所占據的位置是否與染色體有所不同，以及這是否能使它們通過與異常長染色體的觀測結果相類似的出芽過程而從核中去除(Ruddle(1962)；Jackson and Clement(1974)；Lo and Fraccaro(1974)；Miele，et al.(1989)andToledo，et al.(1992))。

發(fā)明內容
本發(fā)明涉及從待選物質中篩選潛在的藥學制劑。更詳細而言，本發(fā)明提供一種方法，通過該方法可就測試物通過微核形式而抑制、增強或消除細胞內雙微體DM或額外染色體DNA的能力而對其進行篩選。
本發(fā)明還提供一種方法，用于誘導具有DM DNA或額外染色體DNA的細胞的成熟或死亡。將適當細胞與文中定義的一種藥劑相接觸，從而利用微核形成的方法將DM DNA或額外染色體DNA從細胞內消除。
本發(fā)明進而提供一種治療方法，通過將文中定義的一種藥劑以有效劑量向受試者給藥來治療受試者所患的疾病。
本發(fā)明還進一步提供一種檢測細胞內染色體DNA及額外染色體DNA的方法。本方法需要將一種經可檢測標記的蛋白插入細胞，其中該蛋白能夠與細胞內染色體DNA特異結合，然后檢測標記，從而檢測細胞內的染色體DNA和額外染色體DNA。
附圖簡述

圖1A-D”顯示選擇性包載DMs的核出芽過程。經甲醇/醋酸固定的COLO 320DM細胞用RNAse處理，用來自純化微核的生物素標記DNA雜交，再用偶聯(lián)FITC的抗生蛋白鏈菌素檢測雜交探針。細胞核用碘化丙錠(PI)復染。圖1A為前中期圖，說明DM著色探針的特異性并證明前中期染色體周圍的DMs周邊定位。箭頭指明一個與染色體整合的HSR區(qū)域。這些DMs被選擇性摻入間期核形成的核芽內(圖1B至1D，箭頭所示)。核芽似乎以很高的選擇性俘獲DM，因為核芽內明顯有三個強烈的PI陽性信號(圖1D)，它們均被FITC FISH探針強烈標記(圖1D’)，以及合并圖像(圖1D”)。
圖2A-2F顯示COLO 320DM細胞同步培養(yǎng)物中微核及核芽的形成。利用下文所述的兩步法將COLO 320DM細胞同步于G1/S交界。將培養(yǎng)物分為兩部分，并在不加入任何藥物(圖2A、2C和2E)，或加入0.4mg/ml諾考達唑(圖2B、2D和2F)的情況下釋放。分別測定[3H]胸腺嘧啶摻入(實心圓)和有絲分裂細胞指數(空心圓)以分別監(jiān)控同步穿越S期和M期的進程(圖2A和2B)。在經DAPI染色的玻片上測定總微核數(實心圓)和總核芽數(空心圓)(圖2C和2D)。在經純化微核探針雜交的玻片上測定DM+微核數(實心圓)或DM+核芽數(空心圓)(圖2E和2F)。這些值均以相對于間期核計數的出現(xiàn)頻率形式表示(每個點的采樣數均大于1000)。
圖3A和3B顯示各種藥物對微核誘導及細胞周期分布的影響。COLO 320DM細胞用所示濃度的DNA復制抑制劑(阿非迪霉素(“APH”)；去鐵胺(“Def”)；胍唑(“Gua”)；羥基脲(“HU”)；及PALA)、DNA修復抑制劑(香豆素(“Cou”)；煙酰胺(“NA”))或膜活化劑DMSO處理3天。在圖3A中，經處理的細胞用甲醇/醋酸固定并用c-myc粘粒探針雜交。計算被c-myc探針明亮染色的微核數并以相對于間期核計數的“c-myc+微核出現(xiàn)頻率(％)”形式表示(每個點的采樣數均大于1000)。在圖3B中，細胞在藥物處理末期用BrdU進行脈沖標記(30分鐘)，并通過下述的流式細胞光度計方法進行分析，以確定G1、S和G2/M期的細胞數。
圖4A-4F顯示DMs在COLO 320DM間期核內的定位。由COLO 320DM細胞培養(yǎng)物分離的核用PFA固定，并用DM-染色探針進行雜交，然后用PI復染。每個核中心附近的光截面是利用共焦激光掃描顯微鏡獲得。圖中顯示來自快速生長培養(yǎng)物的三個代表性細胞核圖像(見圖4A至4C)和來自100μM羥基脲處理3天的培養(yǎng)物的三個代表性圖像(見圖4D至4F)。如箭頭所示，未處理培養(yǎng)物中的DMs只優(yōu)先定位于核膜下。而HU處理培養(yǎng)物的核內則極少觀察到周邊DMs，并且圖中顯示大多數信號都很好地位于細胞核內部。
圖5A-5C顯示DMs和隨染色體擴增的序列的核定位定量分析。由COLO 320DM細胞(見圖5A)、100μM HU處理3天的COLO 320DM細胞(見圖5B)和具有隨染色體擴增c-myc序列的快速生長COLO 320細胞(COLO 320HSR)(見圖5C)的快速生長培養(yǎng)物分離出的核用識別c-myc擴增子的探針進行雜交。圖4顯示所獲得的每類細胞核的中心截面。測定每個截面中各雜交信號的位置和強度。各分析結果代表對100個隨機選定的核的測量結果。橫坐標表示距核中心的距離數(0為中心，1為周邊)，縱座標表示在100個核中觀測到的各位置的信號數。曲線圖顯示每核體積內各位置信號的理論隨機分布曲線，圖下方為更詳細的說明。
圖6A-6C顯示DM DNA復制與COLO-320DM細胞凋亡的分析。在圖6A和6B中，快速生長COLO-320DM細胞培養(yǎng)物用10μM BrdU脈沖標記1小時。分離出細胞核，并用PFA固定，再用生物素標記的DM染色探針雜交，按圖4中的方法用結合FITC的抗生蛋白鏈菌素檢測。結合BrdU的位點先用小鼠抗-BrdU單克隆抗體再用結合羅丹明的抗小鼠免疫球蛋白進行檢測。用共焦激光掃描顯微鏡檢測雙標記的核。圖中顯示兩個典型視野的BrdU圖像、FISH圖像以及合并圖像(紅偽色代表BrdU，綠偽色代表FISH)。箭頭指明選擇性包載DMs的核芽，三角箭頭指明脈沖標記(BrdU-)時不處于S期的細胞。圖6C概括了利用下文所述TUNEL法進行的COLO 320DM細胞凋亡分析的結果。在獲得該典型照片的實驗中，COLO 320DM細胞用100μM HU處理3天。箭頭指明一個非凋亡細胞內的核芽，三角箭頭指明同一視野內的一個凋亡細胞。
圖7A-7D說明p53缺乏可使正常人二倍體成纖維細胞的S期出芽及微核形成增加。通過逆轉錄病毒轉導產生野生型(wt)WS1人二倍體成纖維細胞、或表達新霉素抗性基因(neo)的轉化體或既表達neo又表達人乳頭狀瘤病毒E6蛋白(E6)的轉化體。在不加入或以所示濃度加入HU或PALA的情況下將這些細胞培養(yǎng)3天。圖7A顯示在蓋片上生長的經上述方法處理并固定和DAPI染色的細胞。計算微核數，并以相對于間期核計數的微核出現(xiàn)頻率(％)形式表示(每個點的采樣數均大于1000)。圖7B顯示按圖2B方法檢查的這些藥物對細胞周期的影響。在圖7C和7D中，利用下文所述方法將WS1 neo(三角形)或WS1 E6(圓形)培養(yǎng)物同步于G1/S交界，并在生長培養(yǎng)基中釋放。在圖7C中，通過加入[3H]胸腺嘧啶來監(jiān)控穿越S期或M期的進程(實心符號)，或通過中期細胞數的顯微檢測方法確定有絲分裂細胞數(空心符號)。圖7D中，將蓋片上的細胞固定，DAPI染色，并計算相對于間期核數的微核出現(xiàn)頻率。每個點計算的核數均大于500，并且結果表示為WS1 neo及WS1-E6細胞的平均±S.D形式(每種細胞株獨立測定3次；WS1 neo數據點的誤差范圍小于符號的大小)。測定同一玻片上的核出芽頻率，以確定微核形成系數(每個點的核采樣數均大于1000)。
圖8顯示H2B-GFP嵌合肽的示意圖。H2B肽(239個氨基酸殘基)結合在GFP肽(126個氨基酸殘基)的C-端(H2B-G)或N-端(G-H2B)。圖中給出H2B肽和GFP肽連接處的額外氨基酸數。N-端的組蛋白尾加陰影框顯示。
圖9顯示表達H2B-GFP的細胞。圖為組成型表達H2B-GFP的HeLa活細胞的共焦顯微圖像。H2B-GFP熒光顯示為反射模式圖像。
圖10A-10D說明，H2B-GFP結合到單核小體內部。圖10A顯示HeLa細胞核及表達H2B-GFP的HeLa細胞核的細球菌核酸酶消化結果。將分離的核消化0、1、5、10、15、30和60分鐘。純化通過結合核小體核心蛋白而免受消化的DNA，并按照材料與方法中的詳細描述進行分析。圖10B顯示單核小體群體的蔗糖梯度分析。由細球菌核酸酶消化制得的單核小體蛋白-DNA復合物用5-30％平行蔗糖梯度進行純化。提取各部分的蛋白并通過15％ SDS-PAGE及考馬斯染色加以分析。圖中顯示H2B-GFP蛋白(約45kDa)及天然核心組蛋白。圖10C中，相同的蛋白等分試樣經電泳并利用抗人H2B抗體進行蛋白免疫印跡分析。圖中顯示H2B-GFP蛋白及天然H2B蛋白。圖10D中，提取各組分內的DNA并用1.5％瓊脂糖凝膠加以分析。
圖11A和11B說明H2B-GFP的表達不影響細胞周期的進程。圖11A為HeLa細胞和表達H2B-GFP的細胞的GFP直方圖。圖11B為圖11A的相同細胞經PI染色確定的DNA直方圖。
圖12A-12E顯示H2B-GFP蛋白的定位。圖為表達H2B-GFP的HeLa活細胞不同時期的共焦顯微圖像。分別顯示間期(圖12A)、前期(圖12B)、中期(圖12C)和后期(圖12D)的細胞。各圖板的左側顯示綠色GFP信號，右側為反射模式圖。圖12E顯示表達H2B-GFP的HeLa細胞的固定鋪展染色體。圖中顯示GFP定位(左)和DAPI染色(右)。
發(fā)明實施方式本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，稱為雙微染色體(DMs)的自主復制的無著絲點額外染色體結構常介導人腫瘤內的癌基因擴增。據本發(fā)明人顯示，通過S期核膜出芽啟動的微核形成作用將DMs由核中去除可促進細胞的成熟、分化和死亡。
因此，本發(fā)明提供一種用于鑒定潛在治療制劑的篩選方法和一種用于誘導適當細胞成熟或死亡的方法。實施本發(fā)明時所采用的適當測試細胞或細胞包括那些具有DM或額外染色體DNA并且能夠通過微核形成過程消除該DNA的細胞。這些細胞包括，但并不限定于，諸如細菌細胞或酵母細胞等原核細胞。另外還包括真核細胞，如大鼠、鳥類、鼠科、猿、哺乳動物，包括寵物和家畜、或人類的細胞。
就本發(fā)明而言，“藥劑”將包括，但并不限定于，有機小分子、復合物、組合物、DNA分子、RNA分子、蛋白、多肽、或融合蛋白。盡管沒有始終明確聲明，但應了解的是，該藥劑可單獨使用，或與其它在生物活性方面與本發(fā)明所述篩選方法確定的藥劑相同或不同的藥劑一同使用。這些藥劑及方法也可與其它療法相結合。
文中所用術語“誘導細胞的成熟或死亡”將包括凋亡、壞死或防止細胞分裂、致腫瘤性降低、抗藥性喪失、成熟、分化或細胞的腫瘤表型回復的其它任何方法。如上文所述，該方法適當于處理具有DM或額外染色體DNA的細胞。這些細胞的識別可采用該領域熟知的任何用于鑒定擴增的染色體DNA或額外染色體DNA的方法。這些方法包括，但并不限定于，DNA雜交(見下文實施例IID以及Sambrook etal.(1988))、FISH(見下文實施例IIB，U.S.Patent Nos.5,665,549；5,633,365；及5,545,524)、熒光激活細胞分類技術(FACS)(見下文實施例IIC)、離心分部分離以及組蛋白-GFP標記(見下文實施例I)。已知某些類型的細胞中含有微核，如腫瘤抑制蛋白缺失或缺陷的細胞以及腫瘤或瘤細胞。腫瘤抑制蛋白缺陷的存在與否可由腫瘤抑制基因缺陷來決定。由于腫瘤抑制基因的突變可導致功能喪失，因此這些基因被稱為“隱性”基因。在腫瘤形成之前，兩個等位基因必需均喪失或失效，但單個等位基因的突變可導致人類群體形成可遺傳的癌癥易感體質。
該方法可在體外、來自體內或在體內實施。當在體外實施時，該方法可提供一種強有力的測定和篩選手段，來確定一種藥劑或組合藥劑是否能調節(jié)以及如何調節(jié)胞內DM或額外染色體DNA的減少或消除。在某些情況下，它有望使DM或額外染色體DNA的消除得到加強，而在另一些情況下，如希望抑制細胞凋亡時，它可通過微核形成的方法減少或抑制DM或額外染色體DNA的消除。因此，通過首先提供一種適當細胞的實例，本發(fā)明還提供一種篩選潛在藥物的方法。該細胞在能夠促進藥劑插入細胞的適當條件下與潛在藥物相接觸。在經過適當時間后，對細胞或細胞培養(yǎng)物或上清液中的DM和/或額外染色體DNA的存在狀況加以測定。在一項實施方案中，DM或額外染色體DNA的減少或消除肯定地表明該藥劑可作為一種潛在的治療方法。在另一項實施方案中，則有望減少或抑制微核的消除。
因此，為在體外實施該方法而首先提供一種適當的細胞培養(yǎng)物或組織培養(yǎng)物。所用細胞為培養(yǎng)的細胞或經遺傳修飾的細胞。作為選擇，也可使用取自活檢組織的細胞。將細胞在一定條件(溫度、培養(yǎng)基及氣體(CO2))下培養(yǎng)適當時間，獲得不存在密度依賴性抑制的指數增長期。另外還需單獨保留一份額外的細胞培養(yǎng)物；作為不接受藥劑的對照加以測試。
正如對該領域的技術人員顯頁易見的，適當細胞可在微量滴定板中培養(yǎng)，并通過記錄表型變化或細胞死亡來對不同的藥劑進行同時測定。
當確定一種潛在藥劑具有所需生物活性時，可將該藥劑加入細胞，以誘導細胞的成熟或死亡。因此，本發(fā)明還提供一種誘導細胞成熟或死亡的方法，其中該細胞含有DM或額外染色體DNA，并能夠經歷微核形成。該方法包括將細胞與一種可通過微核形成來誘導或增強胞內DM或額外染色體DNA消除的藥劑相接觸。該藥劑在能夠促進細胞成熟或死亡的條件下與細胞相接觸。若該藥劑是除DNA或RNA核酸分子外的一種組合物，則可將適當條件直接加到細胞培養(yǎng)物或培養(yǎng)基內。正如該領域的專家所了解的，必須加入“有效的”劑量，該有效劑量可根據經驗加以確定。
當藥劑為核酸時，可利用該領域熟知的方法將其加入細胞培養(yǎng)物，這些方法包括，但并不限定于，磷酸鈣沉淀法、顯微注射法或電穿孔法。作為可選的或附加的方法，也可將核酸結合到一種用于摻入細胞的表達載體或插入載體內。包含一個啟動子和一個經操作可接入多核苷酸的克隆位點的載體已為該領域的專家所熟知。這些載體能夠在體外或體內轉錄RNA，并且能夠以商品形式從諸如Stratagene(LaJolla，CA)和Promega Biotech(Madison，WI)等供應商那里購得。為使表達和/或體外轉錄盡可能完善，或許有必要去除、加入或改變克隆的5’和/或3’非翻譯區(qū)，以消除那些可能導致錯誤翻譯的額外起始密碼子或那些可在轉錄或翻譯水平阻礙或降低表達的其它序列。作為選擇，也可在緊接起始密碼子的5’端插入共有核糖體結合位點以增加表達。載體的實例有病毒，如桿狀病毒和逆轉錄病毒，和噬菌體、粘粒、質粒、真菌載體，以及其它已證明可在多種真核及原核宿主內表達，并可用于基因治療和單純蛋白表達的該領域常用的重組載體。
其中有一些非病毒性載體，如DNA/脂質體復合物，和特定病毒蛋白DNA復合物。為加強向細胞的輸送，可將本發(fā)明的核酸或蛋白與結合TCR、CD3或CD4等細胞表面抗原的抗體或結合片段相結合。含有導向抗體或其片段的脂質體也可在本發(fā)明所述方法中使用。本發(fā)明還規(guī)定在本文公開的方法中使用的導向復合物。
利用該領域所熟知的方法將多核苷酸插入載體基因組。例如，可在適當條件下使插入DNA和載體DNA接觸，利用限制性內切酶在各分子上產生可相互配對的互補末端，并由連接酶連接。作為選擇，也可將合成的核酸連接子連接在限制性多核苷酸的末端。這些合成連接子中可含有與載體DNA的特定限制酶切位點相對應的核酸序列。此外，還可連接含有終止密碼子和適當限制酶切位點的寡核苷酸，以用于插入載體，所述的載體可含有，例如，如下所列的部分或全部成分一種可篩選標記基因，如用于篩選哺乳動物細胞中穩(wěn)定型或短暫型轉染子的新霉素基因；人類CMV的立早基因中用于高水平轉錄的增強子/啟動子；來自SV40中用于穩(wěn)定mRNA的轉錄終止信號和RNA加工信號；用于游離基因正確復制的SV40多瘤復制起始點和Col E1；通用多克隆位點；以及用于體外轉錄有義和反義RNA的T7和SP6 RNA啟動子。該領域中還有許多眾所周知的其它方法可以采用。
文中使用的“表達”是指多核苷酸轉錄成mRNA并翻譯成肽、多肽或蛋白的過程。若多核苷酸起源于基因組DNA，并已選定一種適當的真核宿主，則表達可能還包括mRNA剪切。表達所需的調控元件包括結合RNA聚合酶的啟動子序列和結合核糖體的轉錄起始序列。例如，細菌表達載體就包含有一個啟動子，如lac啟動子，和Shine-Dalgarno轉錄起始序列以及起始密碼子AUG(Sambrook et al.，見上文)。同樣，真核表達載體含有可被RNA聚合酶II識別的異源或同源啟動子，以及下游多腺苷酸化信號、起始密碼子AUG和用于核糖體脫離的終止密碼子。這些載體能夠以商品形式購得，或利用該領域熟知的方法中所描述的序列組裝而成，如上文描述的構建載體的一般方法。表達載體可用于產生表達本發(fā)明所述受體的細胞。
通過減少細胞壽命、細胞分化或凋亡測定可確定是否已實現(xiàn)該方法的目標，即通過微核形成來減少或消除細胞中的DM或額外染色體DNA。細胞分化的監(jiān)控可利用組織學方法或通過監(jiān)控與未分化表型相關的細胞表面特定標記，如初級造血干細胞上的CD34，的出現(xiàn)或消失來加以實現(xiàn)。
為監(jiān)控細胞凋亡，可將細胞以2.5×105細胞/孔的濃度平鋪在玻璃蓋片上。約兩天后，當細胞鋪展并粘連時將其固定，再用碘化丙錠染色并封固。利用熒光顯微技術根據核的形態(tài)測定凋亡細胞和非凋亡細胞的數量，并計算非凋亡細胞的損失百分率。每個樣品至少計算100個細胞，每次實驗應至少重復一次。由于在任何正常生長的細胞培養(yǎng)物中均有一小部分細胞產生凋亡，因此還需確定未處理樣品或處理樣品中自發(fā)性凋亡的數量。然后用未處理樣品中自發(fā)性凋亡的頻率進行校正，使非凋亡細胞的百分率標準化。電鏡觀測則按照電鏡技術的每個標準步驟來固定和處理細胞。還可使用該領域所熟知的細胞死亡第二種測定方法，如MTT轉化測定和結晶紫染色等。
利用U.S.Patent No.5,399,346中描述的修正方法，還可來自體內實施本發(fā)明所述方法。
含有實施文中所述篩選方法和體外方法所必需的藥劑和說明的試劑盒亦被要求專利保護。
本發(fā)明還提供一種治療疾病的方法，其中該疾病的特征在于受試者中存在含有DM或額外染色體DNA的細胞，并能夠通過微核形成消除這些DNA。該方法是給受試者施用有效劑量的藥劑，該藥劑可通過微核形成誘導或加強這些DNA的消除。
當受試者為大鼠或小鼠等動物時，該方法提供一種便利的動物模型系統(tǒng)，可在臨床測試該藥劑前使用。如果與具有此種病理細胞的未處理動物相比，通過細胞測試被確定可在該系統(tǒng)中減少或消除DM或額外染色體DNA，或可改善與含有DM或額外染色體DNA的細胞的出現(xiàn)相聯(lián)系或相關的癥狀，則該候選藥劑為一種潛在藥物。健康并且未經處理的細胞或動物的獨立陰性對照組還可用于提供一種對比依據。施用一種選自羥基脲或胍唑的藥劑，可用作體內和體外的陽性對照。
在一項實施方案中，文中所述方法中采用的藥劑選自一個集合，其中包括羥基脲、胍唑或其衍生物。例如，該藥劑具有結構
其中R1為H、烷基、芳基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基、?；?(CH2)n-X，其中n為1-4的整數，X為取代的烷基、烯基或炔基，并且取代基的選自下列一組，它們是鹵素、-OH、-NR2、-OR、-C(O)OR、-OC(O)R、酰胺和?；?，其中R為H、烷基或芳基；R2為H、烷基、芳基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基、-C(O)R’或-(CH2)n-X，其中n為1-4的整數，X為取代的烷基、烯基或炔基，并且其中的R’為烷基或芳基，取代基則如上文定義；R3為H、烷基、芳基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基、OR”、NR”2或-(CH2)n-X，其中n為1-4的整數，X為取代的烷基、烯基或炔基，并且取代基的選自下列一組，它們是-OH、-NR”2、-OR”、-C(O)OR”、-OC(O)R”、酰胺和?；?，其中R”為H、烷基或芳基；并且R4為H、烷基、芳基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基或-(CH2)n-X，其中n為1-4的整數，X為取代的烷基、烯基或炔基，并且取代基的選擇集合包括-OH、-NR”’2、-OR”’、-C(O)OR”’、-OC(O)R”’、酰胺和?；?，其中R”’為H、烷基或芳基。
在一種替代方法中，該藥劑具有結構 其中R1為H、烷基、芳基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基、酰基或-(CH2)n-X，其中n為1-4的整數，X為取代的烷基、烯基或炔基，并且取代基選自下列一組，它們是鹵素、-OH、-NR2、-OR、-C(O)OR、-OC(O)R、酰胺和?；渲蠷為H、烷基或芳基；R2和R4分別為H、烷基、芳基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基、OR’、NR’2或-(CH2)n-X，其中n為1-4的整數，X為取代的烷基、烯基或炔基，并且取代基選自下列一組，它們是-OH、-NR’2、-OR’、-C(O)OR’、-OC(O)R’、酰胺和酰基，其中R’為H、烷基或芳基；并且R3和R5分別為H、烷基、芳基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基或-(CH2)n-X，其中n為1-4的整數，X為取代的烷基、烯基或炔基，并且取代基選自下列一組，它們是-OH、-NR”2、-OR”、-C(O)OR”、-OC(O)R”、酰胺和?；渲蠷”為H、烷基或芳基。
羥基脲或胍唑能夠以商品形式購得，并用作衍生物的原材料。利用U.S.Patent Nos.5,549,974；5,639,603和5,679,773中描述的修正方案，可通過本發(fā)明所述方法合成并測定這些有機小化合物的衍生物的生物活性。
本發(fā)明的這些藥劑以及上文指出的化合物及其衍生物均可用于制備文中所述方法中使用的藥劑。
文中確定可有效用于其預定用途的藥劑均可向易于產生或可能產生某種與細胞中出現(xiàn)DM和/或額外染色體DNA相關的疾病，如癌癥，的受試者或個體給藥。當該藥劑向小鼠、大鼠或人類患者等受試者給藥時，可在藥劑中加入藥學上容許的載體，并對受試者進行全身或局部給藥。為確定能夠從治療中受益的患者，可從患者中采集腫瘤樣本，并測定細胞內DM、額外染色體DNA或微核的存在情況。治療劑量主要通過經驗確定，并隨所處理的病狀、受試者以及藥劑療效和毒性的不同而改變。當向動物給藥時，該方法可用于進一步確定藥劑的療效。作為動物模型的一個實例，對多組裸鼠(Bal b/c NCR nu/nu雌性，Simonsen，Gilroy，CA)各皮下注射約105-109個文中定義的過增殖癌細胞或靶細胞。當腫瘤形成時，將該藥劑給藥，例如可利用在腫瘤周圍的皮下注射方式。用游標卡尺對腫瘤進行二維測量，以確定腫瘤減小的尺寸，每周測量兩次。也可采用其它適當的動物模型。
體內給藥可通過整個療程內的單次、連續(xù)或間歇給藥方式加以實現(xiàn)。確定給藥的最有效方式和劑量的方法對該領域的專家而言是眾所周知的，該方法隨治療所用組合物、治療目的、處理的靶細胞、以及處理的受試者的不同而不同。由治療醫(yī)師選定的劑量和方式可進行單次或多次給藥。適當劑量的制劑以及藥劑的給藥方法將在下文給出。
本發(fā)明所述藥劑和組合物可用于藥物的生產，并可通過常規(guī)的給藥方法，如作為藥用組合物中的活性成分，而用于人類和其它動物的治療。
藥用組合物可通過口服、鼻內、胃腸外或吸入療法方式給藥，并且可采取片劑、錠劑、顆粒、膠囊、丸劑、針劑、栓劑或噴霧劑形式。另外也可采取將活性成分溶于水性或非水性稀釋劑而制成的懸浮液、溶液和乳劑形式，或采取糖漿、顆?；蚍勰┬问健Ｋ幱媒M合物中除可以含有本發(fā)明的一種藥劑外，還可含有其它具有藥學活性的復合物或多種本發(fā)明的復合物。
更詳細而言，本發(fā)明所述藥劑，也就是此處提到的活性成分，可通過任何適當的途徑進行治療性給藥，如通過口、直腸、鼻、局部(包括透皮、噴霧劑、口腔及舌下方式)、陰道、胃腸外(包括皮下、肌內、靜脈內及皮內方式)以及肺等途徑。還應該了解的是，優(yōu)選的途徑將隨接受者的狀況和年齡以及治療疾病的不同而不同。
理想的藥劑給藥方式應能夠使活性復合物在疾病部位達到最高濃度值。其實現(xiàn)方式有，例如，將該藥劑，或溶于生理鹽水的該藥劑，進行靜脈內注射，或將，例如，包含活性成分的片劑、膠囊或糖漿通過口服給藥。該藥劑的所需血液水平可通過連續(xù)注入加以維持，以在患病組織部位提供治療劑量的活性成分。有效組合物的使用可使治療性組合物所需的各抗病毒藥劑成分的總劑量低于單獨使用各治療性復合物或藥物時所需的劑量，從而可減少副作用。
盡管可以將該藥劑單獨給藥，但優(yōu)選的是將其以藥學制劑形式給藥，該藥學制劑中包含至少一種上文定義的活性成分和為此加入的一種或多種藥學上容許的載體以及任選的其它藥學制劑。各種載體必須是“容許的”，其含義是能夠與制劑中的其它成分相容并且對患者無害。
制劑中可含有那些適合于通過口、直腸、鼻、局部(包括透皮、口腔及舌下方式)、陰道、胃腸外(包括皮下、肌內、靜脈內及皮內方式)以及肺途徑給藥的成分。制劑能夠以單位劑量形式方便地提供，并可通過制藥領域中熟知的任何方法進行制備。這些方法包括將活性成分與構成一種或多種副組分的載體相結合的步驟。制劑的制備一般是將活性成分與液態(tài)載體或細碎的固態(tài)載體或二者均包括在內進行均勻而又密切地結合，如果需要可再將產品整形。
本發(fā)明中適合口服給藥的制劑的提供方式可以是各含有預定劑量活性成分的膠囊劑、扁囊劑或片劑等不連續(xù)單元形式；粉末或顆粒形式；溶于水性或非水性流體的溶液或懸浮液形式；或水包油或油包水乳劑形式?；钚猿煞值奶峁┻€可采用大丸劑、藥糖劑或藥膏劑形式。
片劑的制造可采用壓縮法或模塑法，其中可選擇加入一種或多種副組分。壓縮片劑的制備是在適當機器中將粉末狀或顆粒狀等易流動形式的活性成分進行壓縮，并與粘結劑(如聚烯吡酮、明膠、羥丙基甲基纖維素)、潤滑劑、惰性稀釋劑、防腐劑、崩解劑(如淀粉羥乙酸鈉、交聯(lián)的聚烯吡酮、交聯(lián)的羧甲基纖維素鈉)、表面活性劑或分散劑進行任意混合。模塑片劑的制備是在適當機器中將粉狀復合物與一種惰性稀釋液浸濕后所得的混合物模制成型。片劑可被任意包被或修整，并可配方化以使其活性成分緩慢釋放或受控釋放，例如，可利用不同比例的羥丙基甲基纖維素以獲得所需的釋放曲線。也可選擇在片劑外加一層腸衣，使其在腸道部分釋放，而不是在胃內釋放。
適合于口內局部給藥的配方包括，在調味基質，通常為蔗糖和阿拉伯膠或黃蓍膠，中含有活性成分的藥糖塊；在惰性基質，如明膠和甘油、或蔗糖和阿拉伯膠，中含有活性成分的錠劑；以及在適當液態(tài)載體中含有活性成分的漱口劑。
本發(fā)明所述用于局部給藥的藥用組合物可配制成軟膏、乳膏、懸浮液、洗劑、粉末、溶液、糊劑、凝膠、噴劑、氣霧劑或油劑。作為選擇，配方中還可包含浸有活性成分的繃帶或橡皮膠等帖劑或敷料，并可任意包含一種或多種賦形劑或稀釋劑。
如果需要，乳膏基質的水相中還可含有，例如，至少約30％ w/w的一種多元醇，即具有兩個或多個羥基的醇，如丙二醇、1，3-二醇丁烷、甘露醇、山梨醇、丙三醇和聚乙二醇，以及其混合物。局部制劑中還可包含能促進皮膚或其它受影響區(qū)域對藥劑的吸收或穿透的復合物。這些皮膚穿透增強劑的實例有二甲砜及相關類似物。
本發(fā)明所述乳劑的油相可由已知方式的已知成分構成。盡管油相可以只包含一種乳化劑(或在其它地方稱為成乳劑)，但理想的油相為混合物，其中含含有至少一種乳化劑和一種脂或一種油或既有脂又有油。優(yōu)選而言，可將一種親水性乳化劑與一種作為穩(wěn)定劑的親脂性乳化劑一同包含在內。既包含一種油又包含一種脂的方案為優(yōu)選方案。總之，包含或不包含穩(wěn)定劑的乳化劑構成通常所說的乳化蠟，而乳化蠟加上油和/或脂構成通常所說的乳化軟膏基質，乳化軟膏基質則形成乳膏制劑的分散油相。
適合于在本發(fā)明所述制劑中使用的乳化劑和乳化穩(wěn)定劑包括Tween 60、Span 80、十八醇十六醇混合物、肉豆寇醇、單硬脂酸甘油酯和十二烷基硫酸鈉。
由于活性復合物在大多數可用于藥用乳劑的油中的溶解性非常低，因此適用于該制劑的油或脂的選擇依據是要能夠實現(xiàn)所需的裝飾特性。因此，優(yōu)選的乳膏劑產品應該是無油膩性、非污染性以及可清洗的，并且應具有適當的粘稠度以避免從軟管或其它容器中泄露。可使用的有直鏈或支鏈烷基的單價或二價酸酯，如二異己二酸酯、異十六基硬脂酸酯、椰子脂肪酸的丙二醇二酯類、豆蔻酸異丙酯、油酸癸酯、棕櫚酸異丙酯、硬脂酸丁酯、2-乙基己基棕櫚酸酯，或稱為Crodamol CAP的支鏈酯混合物，最后三種則為優(yōu)選的酯。它們按所需特性的不同可單獨或結合使用。作為選擇，也可使用高融點液體，如白色軟石蠟和/或液體石蠟或其它礦物油。
適合于對眼進行局部給藥的制劑還包括眼藥水，其中活性成分溶解或懸浮在適合于該藥劑的載體，尤其是水性溶劑中。
用于直腸給藥的制劑可作為含有可可脂或水楊酸酯等適當基質的栓劑形式提供。
適合于陰道給藥的制劑可作為陰道栓劑、衛(wèi)生棉條、乳膏劑、凝膠、糊劑、泡沫劑或噴霧劑形式提供，其中除藥劑外還含有該領域所熟知的適當載體。
載體為固體的適合于鼻部給藥的制劑包括顆粒大小范圍約為，例如，20-500微米的粗粉，其給藥方式需用鼻子使勁地吸，即把含有粉末的容器置于鼻子附近并通過鼻孔快速吸入。載體為流體的適合于以，例如，鼻內噴霧、滴鼻液、或用噴霧器噴霧給藥等方式進行給藥的制劑包括藥劑的水性或油性溶液。
適合于胃腸外給藥的制劑包括水性和非水性等滲無菌注射液，其中可含有抗氧化劑、緩沖液、抑菌劑以及使制劑與預定接受者的血液等滲的溶質；以及水性和非水性無菌懸浮液，其中可含有懸浮劑和增稠劑以及可使復合物定向于血液成分或一種或多種器官的脂質體或其它微粒系統(tǒng)。該制劑可置于安瓿和小藥水瓶等單劑量或多劑量密封容器中提供，并可在冷凍干燥(凍干)狀態(tài)下儲存，在使用前只需加入無菌液態(tài)載體，例如加入水即可用于注射。臨時注射液和懸浮液可由上述種類的無菌粉末、顆粒和片劑制得。
所含藥劑的量為一日劑量或一日單位、或如上文所述的日亞劑量、或其適當部分的制劑為優(yōu)選的單位劑量制劑。
應當了解的是，就所述制劑的類型而言，除上文特別提到的成分外，本發(fā)明的制劑還可含有該領域的其它傳統(tǒng)藥劑，如適合于口服給藥的制劑中可進一步含有甜味劑、增稠劑和調味劑等藥劑。此外還將把其它適當的組合物和療法結合到本發(fā)明的藥劑、組合物和方法中。
本發(fā)明還進一步提供一種檢測細胞內染色體DNA和額外染色體DNA的方法。該方法步驟是首先在細胞內插入一種可檢測的標記蛋白，其中該蛋白能夠與細胞內的染色體DNA和額外染色體DNA特異結合，然后檢測標記，從而檢測胞內的染色體DNA和額外染色體DNA。在一項實施方案中，該蛋白為組蛋白或具有保守氨基酸取代的類似物，以及融合蛋白。在一項實施方案中，可檢測標記為熒光標記，如多管水母屬綠色熒光蛋白，它可經修飾產生紅色或黃色熒光。作為選擇，也可使用抗生物素蛋白、抗生蛋白鏈菌素或生物素。在一項可選實施方案中，插入步驟包括將細胞與一種載體接觸，其中該載體中含有經可檢測標記的組蛋白融合蛋白的編碼DNA。
上述方法還可用于分析體內染色體行為、監(jiān)控染色體運動，即細胞內染色體片段的丟失或易位、檢測以胞內含有DM或額外染色體DNA為特征的病理細胞，以及監(jiān)控患者體內該病理的進展狀況。所有這些方法均包括在細胞內插入一種可檢測的標記蛋白，其中該蛋白能夠與細胞內的染色體DNA和額外染色體DNA特異結合，然后檢測標記，從而檢測胞內的染色體DNA和額外染色體DNA。然后可將所測染色體區(qū)域的存在、缺失或定位情況與以前的樣品分析結果或正常細胞進行對比，從而完成染色體畸變和/或變化的分析和監(jiān)控。也可通過該方法對病理細胞進行檢測，其中該病理細胞含有擴增DNA或額外染色體DNA。諸如前列腺癌等癌細胞和/或腫瘤細胞均可檢測。
以下實例用來對本發(fā)明進行說明，但不是限制本發(fā)明。
實驗實例I.DM和額外染色體DNA與表型喪失的關系細胞培養(yǎng)人類COLO 320DM(ATCC Accension No.CCL 220)和COLO 320HSR(ATCC Accension No.CCL 220，1)神經內分泌腫瘤細胞來自美國典型培養(yǎng)保藏中心，12301 Parklawn Drive，Rockvillem Maryland，20853，美國并通過有限稀釋法獲得單細胞亞克隆(Von Hoff，et al.(1988))。利用c-myc粘粒DNA經FISH確定c-myc擴增基因對DMs或HSRs的定位。細胞在補加有10％胎牛血清(FBS)的RPMI1640培養(yǎng)基中增殖。由美國模式培養(yǎng)收集所(CRL 1502)獲得的WS1人胚胎皮膚成纖維細胞培養(yǎng)于Dulbecco’s改進型Eagle’s培養(yǎng)基(DMEM)中，該培養(yǎng)基補加有10％經熱滅活并透析的FBS以及1×MEM非必需氨基酸。WS1neo和WS1E6來自S.Linke博士的惠贈，并分別由表達新霉素抗性蛋白編碼基因或新霉素抗性蛋白和E6蛋白編碼基因的逆轉錄病毒載體感染WS1而產生(E6蛋白來自人乳頭瘤病毒16)(Linke，et al.(1996))。RPE-h(正常的人視網膜色素上皮細胞)及其neo和E6衍生物同樣由S.Linke博士惠贈，其親代細胞來自CellGenesys，Inc.(Foster City，CA)。上皮細胞的培養(yǎng)方法與WS1相同。
B.化學制劑阿非迪霉素、5-溴-2’-脫氧尿苷(BrdU)、香豆素(1，2-苯并吡喃酮)、去鐵胺甲磺酸(甲磺酸去鐵胺)、DMSO、羥基脲(HU)、煙酰胺、胸腺嘧啶以及諾考達唑(5-(2-噻吩基羰基)-1H-苯異咪唑-2-YL-基甲酚)均由Sigma(St.Louis，MO)購得。胍唑(3，5-二氨基-1，2，4-三唑)來自Aldrich(Milwaukee，WI)，PALA(N-膦乙酰-L-天冬氨酸)則由藥物生物合成和化學分部，治療開發(fā)項目，癌癥治療部，國立癌癥研究院(Bethesda，MD)提供。
C.細胞周期分析按前人所述(Yin，et al.(1992)and Di Leonardo，et al.(1994))，用流式細胞術對細胞周期的分布進行分析。經特定濃度的藥物處理了特定時間的細胞用10μM BrdU標記30分鐘。收集細胞，用70％乙醇固定，含有0.5％ Triton X-100的0.1N HCl，然后煮沸10分鐘，再迅速制冷使DNA變性。然后將核與結合FITC的抗BrdU抗體(Boehringer Mannheim)共保溫，并用含有RNAse(200μg/ml)的2μg/ml碘化丙錠(PI)復染。利用Becton Dickinson FACScan對樣品進行分析。每份樣品收集1萬個數據。按前人所述(Yin，et al.(1992)and Di Leonardo，et al.(1994))用Sun Display對數據進行分析。
D.微核定量利用在標準低滲膨脹條件下(Lawce and Brown(1991))制備的鋪展染色體，來檢測COLO 320DM細胞中含有DM序列的微核，然后按前人所述(Shimizu，et al.(1996))的方法用生物素標記的c-myc粘粒探針進行雜交。用DAPI(Sigma；1μg/ml in VectaShield，VectorInc.)對鋪展染色體進行染色，并由此確定總微核數(圖3)。將貼壁細胞(WS1、RPE-h及其衍生物)培養(yǎng)于蓋片上，用冷丙酮固定(-20℃，5分鐘)，再用冷甲醇固定(-20℃，5分鐘)，PBS重新水化，并用DAPI(1μg/ml in VectaShield)染色。用60×或100×的物鏡和配有適當表熒光濾片的Zeiss熒光顯微鏡計算總微核或富含DM的微核的數量。結果以相對于間期核計數的“微核出現(xiàn)頻率(％)”形式表示(每個點的最小采樣數為1000)。
E.細胞同步化按前人所述(Stein，et al.(1994))進行同步化。首先用過量胸腺嘧啶(2mM)處理17小時，使快速生長的COLO 320DM細胞抑制于早S期。然后用培養(yǎng)基清洗細胞，并在含有25μM 2’-脫氧胞苷的生長培養(yǎng)基中置12小時(以逆轉胸腺嘧啶的毒性)，然后在2.5μg/ml阿非迪霉素中培養(yǎng)17小時，使細胞在進入S期時被抑制。用培養(yǎng)基清洗被抑制的細胞，然后置于不含藥物，或含有諾考達唑(0.4μg/ml)的培養(yǎng)基中。通過加入[3H]胸腺嘧啶來監(jiān)控細胞周期的進展(Stein，et al.(1994))。為檢測有絲分裂過程的進展，用多聚甲醛(PFA；2％)固定一部分培養(yǎng)物(1ml)并用DAPI染色。利用熒光顯微鏡計算有絲分裂期細胞的出現(xiàn)率。WS1 E6細胞的同步化是通過將其接種于具有或不具有蓋片(18×18mm)的15cm培養(yǎng)皿中而實現(xiàn)。在傳代后第二天，去除原培養(yǎng)基并替換為含有0.1％FCS的培養(yǎng)基，再培養(yǎng)48小時。將通過血清缺失而被抑制在G0期的細胞置入含有5μg/ml阿非迪霉素的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)15小時，使其抑制于S期起始階段。把培養(yǎng)基替換為不含藥物的新鮮培養(yǎng)基，使細胞釋放并進入S期。通過加入[3H]胸腺嘧啶來監(jiān)控進入S期的進展情況(Stein，et al.(1994))。同時，移取蓋片，用丙酮和甲醇染色，DAPI固定，并按照上文所述計算微核、核出芽以及有絲分裂細胞的出現(xiàn)率。
F.TUNEL測定TUNEL測定是根據前人發(fā)表的一套步驟(Gavrieli，et al.(1992))按下列所述的修改方法。簡單地說，即用2％的PFA固定COLO 320DM細胞(室溫10分鐘)，并利用細胞甩片機離心到玻片上。細胞用冷甲醇進一步固定(-20℃，5分鐘)，再用冷丙酮固定(-20℃，5分鐘)。玻片用PBS重新水化，然后在室溫下用反應緩沖液(200mM二甲胂酸鈉，1mM MgCl2，1mM β-巰基乙醇，pH7.2)平衡15分鐘。末端標記反應采用將玻片在37℃下與含有10μM生物素-dUTP(Boehringer Mannheim GmbH，德國)和0.3單位/μl末端脫氧核苷酸轉移酶(Toyobo Co.，Osaka，日本)的反應緩沖液保溫60分鐘。將玻片廣泛清洗，用20％FCS封閉，并利用結合FITC的抗生蛋白鏈菌素按照FISH規(guī)程中的描述(見下文)檢測結合的生物素。玻片用RNAse A處理(100μg/ml，37℃，20分鐘)，PI復染，并在用于觀測FISH的條件下觀察。
G.探針制備及FISH除利用BioPrime DNA標記系統(tǒng)(Life Technologies Inc.Gaithersburg，MD)直接將純化微核中的DNA用于生物素標記之外，其余均按照文獻所述(Shimizu，et al.(1996))從純化微核中制備探針。按照前人所述(Shimizu，et al.(1996))利用經甲醇/醋酸標準化固定的核進行FISH。用共焦顯微鏡評測DM的定位時需采用以下方法來保持核的球形。該規(guī)程以用于人淋巴細胞而開發(fā)的規(guī)程(Ferguson and Ward(1992)and Vourc’h，et al.(1993))為基礎，但由于核的嚴重聚集而不能將其直接使用于COLO 320DM。改進方法包括在260×g下離心5分鐘使10ml COLO 320DM細胞沉淀，再完全去除上清液。將細胞溫和懸浮于50μl生長培養(yǎng)基，并緩慢加入10ml預熱(37℃)的75mM KCl，2mM CaCl2。利用上述條件立即將懸浮液離心，并完全去除上清。溫和地使細胞沉淀松散，并懸浮于1ml 4℃的75mM KCl和2mM CaCl2中，再加入1ml 4℃的75mM KCl、2mM CaCl2、0.5％Triton X-100。懸浮液在冰上置10分鐘，然后進行Dounce勻漿(松配杵，5分鐘，4℃)。懸浮液中加入1.5倍體積溶于PBS的5％PFA，并在室溫下保溫10分鐘，并偶爾溫和搖動。保溫后，再加入1/10體積含有1％BSA的1M Tris-HCl(pH7.4)，并于室溫下再保溫10分鐘并溫和搖動。固定的核用含有1％ FCS的PBS洗兩次，并在4℃下保存一周。在進行FISH雜交前，通過細胞甩片將固定的核沉淀于涂有多聚L-賴氨酸的玻片上(Matsunami Glass Ind.，Ltd.，日本)。玻片用RNAse A處理(Sigma，100μg/ml溶于2×SSC，37℃，60分鐘)，再用2×SSC清洗兩次，每次3分鐘，然后用溶于PBS的3％ BSA封閉并在37℃下放置30分鐘。玻片于室溫下在溶于2×SSC的50％甲酰胺中保溫30分鐘，以使緩沖液達到平衡，再加入含有標記探針的雜交液(按FISH的標準方法制備(Shimizu，et al.(1996)))。用蓋片覆蓋樣品，并用橡膠泥完全密封，在85℃下變性，并通過37℃保溫過夜完成雜交。雜交探針的清洗與檢測均按照前人所述(Shimizu，et al.(1996))進行。圖像是利用BioRad MRC600共焦系統(tǒng)在Zeiss Axiovert 135顯微鏡上獲得(圖6的方法可參考下文)。多數圖像是利用×63物鏡(Zeiss，復消色差物鏡，1.40，油鏡)獲得，并且放大比為2。所得數字圖像用偽彩色表示，圖像的合并采用Adobe Photoshop(Adobe systems Inc.，Mountain View，CA)。
H.間期核內的DMs定位以相應核的直徑為單位長度測量各雜交信號與核中心的距離，由此確定共焦核切面中DMs的定位。PI(DNA)和FITC(雜交信號)的核中心共截面圖像來自隨機選定的核。數字圖像的合并采用COMOS軟件(BioRad，Hercules，CA)。為能夠精確地測量距離，而將各FITC信號的閾值降低，直至每個代表了一個或多個DMs區(qū)域的信號成為單一的點。確定該點到核中心的距離以及核的直徑。用前一數字除以后一數字來表示各信號在核中的位置。按照這種表示方法，核的中心為0，核膜的外邊界為1。同時，利用任意單位標度測定各信號的密度。確定每個核切面中各信號的該密度值時，每個樣品至少隨機選定100個核。由這一過程得出各二維焦平面中的DM信號分布。每個核的高度和寬度近似相等，提示文中所述的固定方法確實保持了核的球狀形態(tài)。假定每個核體積內的信號分布與我們在2D空間的相應半徑內檢測的信號數量相符。將信號數量對各徑向位置加以修正，使其代表在相應半徑的球形體積內所應出現(xiàn)的數量。
I.通過加入FISH和BrdU摻入來同時確定DM位置和DNA復制快速生長的COLO 320DM培養(yǎng)物用10μM BrdU(Sigma)脈沖標記1小時，然后立即收集細胞。按上文所述將核分離，用PFA固定，并利用純化的微核探針進行FISH。在FISH后確定BrdU的摻入情況，方法是將玻片與溶于含有0.1％ BSA的PBS中的終濃度為10μg/ml的小鼠抗BrdU單克隆抗體(Pharmingen，San Diego，CA)共保溫。玻片于37℃保溫60分鐘后，用PBS清洗3次，每次5分鐘。然后用終濃度為10μg/ml、溶于含有0.1％BSA的PBS中的羅丹明標記的抗小鼠Ig(Boeringer-Mannheim)處理玻片。玻片于37℃保溫60分鐘，再用PBS清洗3次，每次5分鐘。利用Axiovert 135M顯微鏡(Zeiss)上配備的MRC 1024(BioRad)共焦系統(tǒng)觀察未經復染的細胞核，所得數字圖像按上文所述進行處理。
J.間期時的核出芽可選擇性包載DMsDMs等無著絲點染色體片段從細胞中丟失的傳統(tǒng)機制涉及末期后將其封裝在重新形成核膜內(綜述可參考Heddle，et al.(1991))。但有報告稱，經γ射線照射后可在間期產生類似微核的核異?，F(xiàn)象(Duncan，et al.(1985))。這里采用一種具有c-myc擴增基因的細胞系來評定有絲分裂期后結構及間期結構對DM微核形成的相對影響。
圖1顯示COLO 320DM，一種神經內分泌起源的結腸癌細胞系，的熒光原位雜交(FISH)分析。特異識別COLO 320細胞中c-myc擴增子的生物素標記FISH探針，來自COLO 320DM細胞的純化微核(Shimizu，et al.(1996))。利用該探針所得的FISH分析結果表明，群體中95％以上的細胞只含有DMs，其余細胞則含有DMs以及一種染色體內擴增區(qū)域(圖1A箭頭所示)。前中期鋪展染色體中的DMs(圖1A)似乎并非隨機分布，因為其中有很多是位于前中期環(huán)的邊緣，這與前人的報導(Levan and Levan(1978))相一致。另外還利用共焦顯微技術觀測了間期核中的周邊核定位(見下文)。
由COLO 320DM細胞的指數增長培養(yǎng)物所得的分析結果均顯示出具有突起或“芽”的間期核。約40-80％的核芽含有高度濃縮的DM序列(圖1，B-D圖板顯示典型的含有DMs的芽；C圖板顯示兩個微核和一個核芽)。圖1D顯示的核芽高度富含擴增序列，因為它含有三個可被PI染色的簇區(qū)(紅色信號表示DNA染色，因為這些樣品首先用RNAse進行廣泛處理)，而每個PI陽性簇區(qū)均能夠與微核DNA FISH-探針強烈雜交(圖1D’；合并顯示于圖1D”)。偶爾會觀測到不與DM探針雜交的PI-陽性芽，這表明與DM序列不相關的DNA也能夠摻入核芽內。但含有DM序列的核芽相對而言似乎含有極少的不與FISH探針雜交的PI反應物質，這表明核芽的DNA俘獲對DMs有高度選擇性。采用由包含c-myc的粘粒所獲得的FISH探針、或不同的固定方法(如多聚甲醛，見圖6)或采用核分離所使用的等滲方法，均同樣很容易地表明核芽對DMs的選擇性包載(數據未顯示)。
K.核芽與微核均在S期時形成產生核芽的核顯示出間期細胞所具有的典型形態(tài)，而不是有絲分裂期時的形態(tài)。因此測定微核與核芽的形成動力學，以確定這些結構是否可產生于S期。利用兩步法將COLO 320DM細胞同步于G1/S交界，該方法包括用高濃度的胸腺嘧啶處理細胞，使其阻滯于S期，再將抑制解除12小時，使細胞周期的進程能夠穿過并脫離S期，然后與DNA聚合酶抑制劑阿非迪霉素保溫，使細胞阻滯于下一S期的起始點(Stein，et al.(1994))。去除阿非迪霉素，使細胞快速進入S期，并在4小時后達到DNA合成的高峰，在10小時后達到有絲分裂的高峰(圖2A)。細胞在抑制解除19小時后進入同步性較差的第二個周期。
利用DNA特異性染料4’，6-二脒-2-苯吲哚(DAPI)確定微核與核芽的發(fā)生率(圖2C和2D)。所有樣品用來自微核的DM著色探針雜交，以確定這些結構是否包含擴增序列。具有核芽的核的發(fā)生率在G1/S交界處(即t＝0)幾乎為零，并在細胞步入早S期時(t＝0-5小時)顯著增加，在S期后期時又減小，然后當細胞進入并穿過第二個S期時又逐漸增加(圖2C)。FISH分析說明核芽內含有DMs(圖2E)。重要的是，總微核或含有DMs的微核的數量的增加和減少與核芽數量的增加和減少非常吻合(圖2C)。
在S期發(fā)展過程中，核芽與微核可再次出現(xiàn)，并且對其形成而言并非必須經歷M期。
出芽與微核形成的動力學分析及核形態(tài)分析結果表明，這兩個事件均可發(fā)生于S期。由于減慢復制叉進程可導致DNA斷裂(Eki，et al.(1987)and Linke，et al.(1996))，并且微核可優(yōu)先俘獲無著絲點的片段(Von Hoff，et al.(1992)and Shimizu，et al.(1996))，因此對這些抑制因素是否能增加S期的微核形成效率進行了測定。測試的藥物包括核糖核苷酸還原酶抑制劑(HU、去鐵胺、胍唑)、可催化嘧啶再次生物合成前三個步驟的CAD酶復合物的抑制劑(PALA)、以及阿非迪霉素。DNA合成抑制劑導致微核形成的顯著增加，它通常與處S期細胞的增加相關(圖3A和3B)。在能夠嚴重抑制S期的濃度下使用去鐵胺和PALA時發(fā)現(xiàn)，這些藥物導致了微核形成效率的急劇下降(圖3B)。這些數據表明，能夠阻滯復制叉進程并使S期延長的抑制劑可導致微核形成。
對不影響DNA合成的抑制劑的效應進行分析，以確定阻礙諸如DNA修復等其它DNA事務或擾亂膜結構是否會導致微核形成。由于DNA修復過程包括ADP的核糖基化(Satoh and Lindahl(1992))，并且抑制修復可使無著絲點染色體片段產生的概率增加，因此測試采用了多聚(ADP-核糖)聚合酶的兩種抑制劑(煙堿和香豆素)。據前人報導，膜活化極性復合物DMSO可減少某些腫瘤細胞系內DM拷貝數(Shima，et al.(1989)and Eckhardt，et al.(1994))，在此對DMSO的效應也進行了測試。DMSO使微核形成增加，但不使S期延長(圖3A和3B)。香豆素對微核形成沒有影響，而煙堿在胞內損傷量明顯增加的條件下使微核形成稍有增加，因為處于G2期的細胞顯著增加(圖3A和3B)。這些數據與至少有兩種機制可提高微核形成效率的觀點相符合，一個可能涉及到復制叉進程的干擾，另一個可能涉及到S期外所發(fā)生的事件。
L.DMs的核周邊定位與其通過出芽而被消除相關利用共焦顯微技術了解DMs被選擇性包含在核芽內的機制以及這些結構的形成機制。為能夠最好地保持核的形態(tài)而用PFA對核進行固定(Manuelidis and Borden(1988))。
圖4A-C顯示分離自未處理的快速生長COLO 320DM細胞的三個代表性核的共焦面。FISH結果顯示，顯著的雜交強度表明大多數DM序列優(yōu)先定位于核周邊，并且顯示出DM信號在細胞核最邊緣的群集及數量。注意DM序列在核周邊隨機分布的基本偏差(圖5A顯示測量的100個間期核內相對于每個核中心的DM位置的定量結果)。相反，近親細胞系COLO 320HSR內隨染色體擴增的序列幾乎在整個核內隨機分布(圖5C)。用HU處理優(yōu)先減少核周邊的DMs(圖4D-F，定量結果顯示于圖5B)，競爭性PCR擴增的測定結果表明HU處理使每個細胞內的DM含量減少了約三倍(方法見Shimizu，et al.(1996)，數據未給出)。綜合以上數據，這些結果表明，定位于核周邊的DM序列可優(yōu)先摻入核芽，然后通過微核形成從核內去除。
M.將復制的DM序列摻入核芽上文所述的S期進程、核出芽和微核形成之間的相關性，致使本發(fā)明人去研究是否進行復制的DM序列可被定向包含在核芽內。用BrdU脈沖標記COLO 320DM細胞，然后用DM FISH探針對分離的核進行雜交。隨后用抗BrdU抗體和熒光素標記的二級抗體進行反應，使核、核芽以及含有在短暫標記間隙進行DNA復制的DMs的微核可被同時檢測。兩個代表性共焦面的FI SH分析結果(圖6A-A”，B-B”)顯示，這些細胞內的核芽(箭頭所示)內含有高度濃縮的DM序列。核、核芽以及每個核的外周區(qū)域均與BrdU結合，表明形成這些核芽的核在核芽形成時正在進行DNA合成。表1顯示，BrdU+，DM+核芽(1，1’型)占整個含DM核芽群體的48％。也有一些核與BrdU結合，但其產生的核芽卻不被標記(2，2’型；35％)。這些核芽中也有一些產生于S期(與前一周期相反)，并且它們未顯示出可與BrdU結合，因為其DNA在短暫的BrdU溫育期間不進行復制。
從表面上看，此處描述的S期微核形成過程類似于γ射線照射(Duncan，et al.(1985))或秋水仙素處理(Duncan and Heddle(1984))后由凋亡機制誘導的“核異?！薄５怯珊水a生的核芽中不含有高度濃縮的DNA，表明它們在形成核芽時并沒有發(fā)生凋亡。為確定是否能把出芽和微核形成與凋亡分開，而對核芽中是否含有凋亡細胞特征性DNA濃縮片段進行測定。DNA片段的檢測采用TUNEL測定法，在該方法中利用末端轉移酶將BrdU加到凋亡DNA片段產生的3’-OH基團上(Gavrieli，et al.(1992))。為觀測所有的核及核芽，細胞同樣用PI染色。圖6C-C”顯示由該COLO 320DM細胞分析所獲得的數據實例。TUNEL測定結果顯示一個具有葉狀細胞核的細胞，細胞核具有強烈的TUNEL反應，并且特征性含有在凋亡細胞中觀測到的DNA濃縮片段(Cohen(1993))。中間圖板的PI染色結果顯示一個細胞，該細胞產生的核芽不被TUNEL測定染色，并且不具有凋亡核的固縮結構。同步化實驗顯示，在S期高峰期時約有5％的細胞產生核芽(例如，見圖2C)，但只有0.5-1％為TUNEL陽性。
N.微核形成在正常細胞內很少發(fā)生，而一旦p53失活則發(fā)生率上升正常細胞內出現(xiàn)微核形成的幾率明顯低于腫瘤細胞系(Roser，etal.(1989)and Bondy，et al.(1993))。由于染色體斷裂可誘導微核形成(Heddle and Carrano(1977))，因此在腫瘤細胞內觀測到的微核形成的增加可能是由可增加DNA斷裂概率的突變所導致。腫瘤抑制因子p53控制著G1檢驗點，該檢驗點可被經PALA處理而導致的DNA斷裂和rNTP損耗所激活，而在PALA處理時進入S期的p53-缺陷細胞系中可發(fā)生DNA斷裂(Livingstone，et al.(1992)；Yin，et al.(1992)and Linke，et al.(1996))。如上所述，PALA也能夠誘導COLO 320細胞內的S期微核形成。這些數據致使我們去研究是否正常二倍體成纖維細胞內的p53失活可導致S期出芽及微核形成的增加。
所使用的有人WS1正常二倍體成纖維細胞和兩種通過新霉素磷酸轉移酶基因的逆轉錄病毒轉導而產生的幾乎同源的衍生物(WS1-neo)或一種含有人乳頭狀瘤病毒E6基因的致瘤衍生物(WS1-E6)。E6基因產物可通過泛素依賴性途徑促進p53的降解(Scheffner，etal.(1990)and Crook，et al.(1991))。細胞周期檢驗點調節(jié)裝置可在存在DNA損傷或rNTP濃度有限的情況下控制細胞進入S期，它在表達突變p53和E6致瘤蛋白的人類細胞以及敲除p53的純合小鼠胚胎成纖維細胞內似乎被同等程度地滅活(Kastan，et al.(1992)；Kuerbitz，et al.(1992)；Livingstone，et al.(1992)；Yin，et al.(1992)；White，et al.(1994)；Linke，et al.(1996)and Linke，et al.(1997))。此前的文獻顯示，在p53-/-MEFs內由γ射線照射誘導的微核發(fā)生率要高于野生型MEFs的頻率(Huang，et al.(1996))。因此，在E6致瘤蛋白表達時觀測到的對微核形成的影響很可能與p53的滅活相關，而不是與其它可被E6影響的蛋白相關。
圖7顯示的數據表明，E6基因的表達可提高WS1細胞的微核形成率。HU或PALA不能使WS1細胞顯示的低微核形成率有所提高(圖7A)。PALA可導致細胞周期阻滯于G1期，但HU在所用濃度下不能顯著影響S期WS1細胞的比例(圖7B)，這與以前的研究(Linke，etal.(1996))相一致。相反，E6的表達可提高這些在正常條件下生長的細胞的微核形成率，并且HU和PALA均可導致微核形成率的進一步顯著提高(圖7A)，而處于S期的細胞數量也相應地顯著增加(圖7B)。在其它細胞類型中，E6的作用對象，這里推斷是p53，在限制微核形成方面具有明顯的重要性，因為采用正常視網膜色素上皮細胞(RPE-h)及其表達E6的衍生物時獲得了類似的結果。
HU和PALA在COLO 320DM細胞和WS1 E6細胞內均可使S期延長并誘導微核產生，這致使我們去評價S期出芽是否是WS1-E6細胞內微核形成的主要機制。利用血清缺乏將WS1-neo和WS1-E6細胞阻滯于G0期，然后在存在阿非迪霉素的情況下釋放，使細胞阻滯于G1/S交界(圖7C)。利用血清缺乏進行的同步化不提高WS1-neo細胞內的微核形成率，并且S期的微核形成率及出芽率均沒有增加(圖7D)。相反，當WS1-E6細胞發(fā)展至S期時去除其中的阿非迪霉素可導致核出芽率及微核形成率均顯著提高(圖7D)。由于DNA損傷不會誘導WS1或WS1-E6細胞的凋亡(Di Leonardo，et al.(1994)；Linke，et al.(1996)and Linke，et al.(1997))，因此在這些細胞中觀測到的S期微核形成的增加與凋亡程序無關。
O.在S期出芽和微核形成前無需產生凋亡程序；但它們可導致凋亡凋亡可產生核泡(Dini，et al.(1996))，并且推測可產生與微核類似的“核異?！?Duncan and Heddle(1984)and Duncan，etal.(1985))。但本文報導的分析結果表明，產生核芽的核并不象凋亡核那樣呈固縮及碎裂狀。處于單一S期的COLO 320DM細胞所產生的核芽及微核均不呈TUNEL陽性，這表明它們不含有破碎的DNA。盡管在HU處理的COLO 320DM培養(yǎng)物中，凋亡細胞的確有所增加，但這需要延長培養(yǎng)時間，并且在c-myc擴增基因的基本部分被去除之后才發(fā)生。此外，經歷出芽和微核形成的細胞還可存活數天，而這對微核形成前已激活凋亡程序的細胞而言是不可想象的。與上文所述相類似的時程實驗(如圖2)表明，單一S期內的出芽增加，而經歷凋亡的細胞數量大體保持不變，并且產生核芽的那些核中大多數不呈TUNEL陽性。最后，盡管它不是在正常成纖維細胞中所觀測到的凋亡(Di Leonardo et al.(1994))，并且p53功能的喪失通常會使細胞對可導致DNA損傷的生長條件所引起的凋亡更具有抗性(White(1994))，但推測由p53功能喪失而引起的乳頭狀瘤病毒E6致瘤基因的表達，可誘導正常二倍體成纖維細胞內的S期出芽及微核形成。
表1出芽及微核形成的定量結果BrdU標記類型 DM+核芽內 核內 各種類型的DM+核芽的比例1++ 26/60(43％)1’ ±+ 3/60(5％)2-+ 9/60(15％)2’ - ± 12/60(20％)3-- 10/60(17％)用BrdU對COLO 320DM的核進行脈沖標記，然后按圖6所述對BrdU結合及DMs進行分析。利用表熒光顯微技術對核進行觀測。將60個具有DM+核芽的核根據DM+核芽是否被BrdU標記(1，1’類)、DM+核芽所附屬的核是否被BrdU標記(2，2’類)、或核芽與核是否均未被BrdU標記(3類)進行分類。計算分屬于各種類型的核的數量并表示為該類型的核數/總記數的形式。
總之，許多癌細胞內均可產生諸如雙微染色體(DMs)等自主復制的環(huán)形DNA片段(Barker(1982)；Cowell(1982)and Benner，et al.(1991))。這些結構所編碼的蛋白可在體內提供生存優(yōu)勢，或對多種化學治療藥劑具有抗性。在S期出芽結構中，DMs優(yōu)先定位于間期細胞核的周邊，并且被選擇性封裝在核芽內，然后在DNA復制時，核芽被夾斷而形成微核。這一過程是微核產生的有絲分裂期后經典機制的替代途徑。含有DMs的微核從細胞內排出或DM DNA在胞內微核中降解均可實現(xiàn)DM含量的降低。無論在哪種情況下，細胞核中DM序列的喪失都可導致腫瘤表型、分化或凋亡的逆轉。
II.染色體DNA及額外染色體DNA的檢測與分析A.H2B-GFP表達載體的構建利用PCR從人胎盤基因組DNA中擴增出人H2B基因，所用引物可在H2B序列的兩個末端引入Kpn I和Bam HI位點(Zhong，et al.(1983))。
引物15’-CGGGTACCGCCACCATGCCAGAGCCAGCGAAGTCTGCT-3’引物25’-CGGGATCCTTAGCGCTGGTGTACTTGGTGAC-3’引物1在起始密碼子前部引入Kozak共有序列。PCR反應參數如下95℃10分鐘，在94℃1分鐘，50℃1分鐘，72℃2分鐘下循環(huán)25次，然后是72℃5分鐘。PCR產物用Kpn I和Bam HI消化，并將消化片段亞克隆到經KpnI和BamHI消化的pEGFPN1或pEGFPC1載體(Clontech，Palo Alto，CA)內(Yang，et al.(1996))，分別制成C端標記的H2B和N端標記的H2B。這些載體的CMV啟動子用一種哺乳動物細胞內的強啟動子EF1α啟動子替代(Mizushima andNagata(1990))。把EF1α啟動子啟動的H2B-GFP表達盒亞克隆到含有由SRα啟動子(Takebe，et al.(1988))啟動的殺稻瘟菌素S-抗性基因(Izumi，et al.(1991))的主鏈載體中。
B.細胞系及轉染在補加有10％FCS的DMEM培養(yǎng)基中單層培養(yǎng)HeLa細胞。通過改進的磷酸鈣沉淀法(Chen，et al.(1987))用20μg H2B-GFP表達載體(H2B-G或G-H2B)轉染將要鋪滿的細胞。轉染48小時后將轉染細胞重新鋪平板培養(yǎng)，并在轉染72小時后加入5μg/ml的殺稻瘟菌素S(Calbiochem，La Jolla，CA)。在藥物篩選15天后，在熒光顯微鏡下檢驗存活的細胞，并分離出GFP-陽性克隆。挑選一些克隆并擴大培養(yǎng)成細胞系，用于進一步的分析。
C.單核小體制備單核小體的純化是按照前人所述(Dubochet and Noll(1978)and Laybourn and Kadonaga(1991))進行并有少量修改。胰蛋白酶消化HeLa細胞和穩(wěn)定表達H2B-GFP的細胞(3×107)，收集細胞并用1×RSB緩沖液(10mM Tris pH7.6，15mM NaCl，1.5mM MgCl2)清洗兩次。離心后，將細胞沉淀重懸于含有1％ Triton-X 100的RSB緩沖液中，用松配杵瞬時勻漿5次以釋放細胞核。核通過離心收集，并用1ml緩沖液A(15mM Tris pH7.5，15mM NaCl，60mM KCl，0.34M蔗糖，0.5mM亞精胺，0.15mM精胺，0.25mM PMSF and 0.1％β-巰基乙醇)清洗兩次。最后將核重懸于1ml緩沖液A中，并加入10μl的0.1M CaCl2。
制備核小體梯帶的方法是在37℃下加入2μl細球菌核酸酶(Sigma，200單位/ml)(終濃度為0.4單位/ml緩沖液A)并保溫1、5、10、15、30和60分鐘。在每個時間點取出100μl等分試樣并加入2.5μl的0.5M EDTA以終止反應。每管加入30μl蒸餾水、20μl的10％ SDS和40μl的5M NaCl?；旌衔镉帽椒?氯仿抽提，并取5μl上清進行1.5％瓊脂糖凝膠電泳分析。
為制備單核小體，在1.5ml懸浮于緩沖液A的核(終濃度為2單位/ml緩沖液A)中加入15μl細球菌核酸酶(200單位/ml)進行限制性消化。37℃消化2小時后，加入30μl的0.5M EDTA以終止反應。消化產物在10000rpm下離心10分鐘，去除上清。沉淀重懸于450μl的10mM EDTA，加入50μl的5M NaCl以溶解染色質。14000rpm離心5分鐘后，上清用Beckman SW41轉子在5-30％的蔗糖梯度上26Krpm分級分離18小時。離心后收集1ml組分，并取少量等分試樣(50μl)用于DNA分析。剩余樣品(950μl)用280μl含有脫氧膽酸的100％ TCA沉淀并置于冰上10分鐘。然后將樣品在3000rpm下離心5分鐘，沉淀用丙酮清洗，再用70％冷乙醇清洗。沉淀經空氣干燥后重懸于20μl的1×SDS樣品緩沖液中，并通過15％ SDS-PAGE及Coomassie染色加以分析。取同樣的等分試樣用15％ SDS-PAGE進行分析，并以抗人H2B抗體(Chemicon)為一抗，結合辣根過氧化物酶的抗兔IgG為二抗進行蛋白免疫印跡測定。按照廠商說明用魯米諾增強試劑(NEN Life Science Products)檢測信號。
D.FACS分析通過胰蛋白酶消化收集HeLa細胞和表達H2B-GFP的HeLa細胞，在4℃下用70％乙醇固定3小時。細胞用含有RNAse的20μg/ml碘化丙錠(PI)染色。細胞熒光的測量采用Becton Dickinson FACScan。用FACScan標準光學器件區(qū)別并測量每個細胞的紅色(PI)及綠色(GFP)發(fā)射光。為消除由PI發(fā)射和GFP發(fā)射重疊所造成的假象而進行補色。細胞碎片和固定假象均被濾掉。數據分析采用Cell Quest，G1、S和G2/M部分的定量則采用Multicycle。
E.熒光顯微鏡檢查鋪展染色體表達H2B-GFP的HeLa細胞用秋水仙胺處理60分鐘，胰蛋白酶消化，收集，并重新在低滲緩沖液(10mM Tris pH7.4，10mM NaCl，5mM MgCl2)中懸浮10分鐘(1.5×106細胞/ml)。通過細胞甩片(90秒)將50μl膨脹的細胞附著在涂有多聚L-賴氨酸的玻片上，用3.7％的甲醛固定5分鐘，溶于PBS的0.1％ NP40固定10分鐘，再用DAPI(1μg/ml)復染。圖像收集采用配有DAPI(激發(fā)360nm/發(fā)射460nm)或FITC(激發(fā)460nm/發(fā)射535nm)濾光裝置的Nikon熒光顯微鏡。
免疫熒光細胞置12mm蓋片上生長，并按照前人所述(Sullivanet al.(1994))用抗著絲?？寡暹M行免疫熒光處理。簡單地說，即細胞用溶于PBS的4％甲醛固定，用含有0.1％ Triton-X 100并溶于PBS的1％ BSA(PBS-TX-BSA)封閉。一抗以1∶2000的比例用PBS-TX-BSA稀釋，加在蓋片上并于37℃保溫30分鐘。蓋片用PBS-TX清洗4次，每次4分鐘，然后用1∶200稀釋于PBS-TX-BSA的羅丹明偶聯(lián)羊抗人IgG(Southern Biotechnologies，Birmingham，AL)共保溫。蓋片在37℃下保溫30分鐘，然后用蒸餾水清洗4次，再空氣干燥。然后用Slow Fade(Molecular Probes，Eugene，OR)將其封固在載玻片上。顯微檢查用建在Zeiss Axiovert 100上的BioRad 1024共焦顯微鏡進行，物鏡采用63×1.4 NA Zeiss平場消色差。
活細胞細胞置25mm蓋片上生長，并用預熱的培養(yǎng)基封固在Dvorak-Stotler盒內(Nicholson Precision Instruments，Gaithersburg，MD)。用上述的BioRad 1024共焦顯微鏡采集圖像，物鏡為63×或40×1.3 NA Neofluar，產生GFP熒光的激光功率為0.3-1％。用DIC光學器件采集透見光圖像。利用Adobe Photoshop將熒光圖像疊加在DIC圖像上。
F.用H2B-GFP標記染色體用共焦顯微鏡觀測表達H2B-GFP的活細胞，以確定在間期及有絲分裂期細胞內染色質著色的模式。如圖12所示，H2B-GFP能夠高靈敏度地檢測細胞周期中所有時期的染色質。獲得該圖像時無需對細胞進行固定和滲透，它們可能會造成胞內結構的人為改變。H2B-GFP對核染色質具有高度特異性，因為在細胞質中觀測不到任何的熒光。此外，H2B-GFP可提供非常高的靈敏度。例如，可清晰地觀測到正在靠近赤道板的后隨姐妹染色單體。間期核內熒光強度的變化表明了染色質分布的不均一性。由H2B-GFP觀測到的核內染色質精細結構與此前報導的用4’，6-二脒苯吲哚(DAPI)染色所獲得的去褶合光截面圖像(Belmont，et al.(1994))相符。表達H2B-GFP的細胞的鋪展染色體也說明GFP與DAPI的染色模式相同(圖12E)。
在一些間期核內的核仁外周觀測到密集的GFP染色，這表明可能存在核仁外周異染色質區(qū)域(圖12A)。確定著絲粒的位置，以查明其定位是否與H2B-GFP濃染色區(qū)域相符。表達H2B-GFP的細胞被固定，用抗著絲粒的抗體染色，然后通過共焦顯微鏡觀察。如前人所述(Moroi，et al.(1981))，在某些間期核中有許多著絲粒位于核仁外周區(qū)域。這些著絲粒與H2B-GFP濃染色區(qū)域重疊。其它不位于核仁外周區(qū)域的著絲粒也往往與H2B-GFP濃染色區(qū)域相關。在核被膜的內表面同樣觀測到H2B-GFP濃染色區(qū)域，表明也存在外周異染色質。
G.活細胞中雙微染色體顯像H2B-GFP的可能應用之一是作為有絲分裂期時染色體分離的詳細分析手段。構建可高效轉移并表達H2B-GFP的逆轉錄病毒載體。構建并采用的是一種水泡性口膜炎病毒G糖蛋白(VSV-G)假型化逆轉錄病毒載體(載體的構建可參考U.S.Patent No.5,512,421和PCT/US95/11892)，因該系統(tǒng)可提供目前最高的病毒效價。將含有擴增c-myc和DMs的COLO 320DM細胞用H2B-GFP逆轉錄病毒感染，兩天后，幾乎100％的細胞均表達H2B-GFP蛋白。利用配有CCD照相機的表熒光顯微鏡能夠很容易地觀測到以有絲分裂細胞內小熒光點的形態(tài)存在的DMs。
H.HeLa細胞內H2B-GFP的穩(wěn)定表達通過對人胎盤基因組DNA的PCR擴增而獲得人H2B基因。由于組蛋白H2B為多拷貝基因(Baxevanis，et al.(1997))，所以該PCR擴增獲得了若干克隆。利用與報導的H2B序列(基因庫登記號X00088)(Zhong，et al.(1983))有最高同源性的擴增序列構建H2B-GFP載體。將H2B基因連接在經密碼子優(yōu)化的增強型GFP(EGFP)(Yang，et al.(1996))的C末端(H2B-G)或N末端(G-H2B)(圖8)，并將這些嵌合基因克隆到哺乳動物表達載體內。通過轉染將構建體引入HeLa細胞，熒光顯微鏡觀測結果表明H2B-G和G-H2B蛋白均定位在間期核及有絲分裂期染色體上。
為進一步描述H2B-GFP蛋白的特征，制備穩(wěn)定表達H2B-GFP的細胞系。在轉染細胞中加入殺稻瘟菌素并培養(yǎng)2周，并利用熒光顯微鏡分析抗藥性克隆，以識別出GFP陽性克隆。利用H2B-G或G-H2B抗殺稻瘟菌素克隆產生GFP陽性克隆的頻率相等(~10％)。盡管有報導稱，分離穩(wěn)定表達GFP的細胞系非常困難(Shima，et al.(1997))，但還是觀測到數個可穩(wěn)定表達H2B-G或G-H2B的細胞系。
I.H2B-GFP摻入核小體為確定H2B-GFP是否是核小體核心顆粒的組成部分，利用生物化學方法將核小體核心顆粒分步分離，并對H2B-GFP的存在情況進行分析。將分離出的表達H2B-GFP的核用細球菌核酸酶進行廣泛消化而產生單核小體(圖10A)，再通過含有以解離組蛋白H10.5M NaCl的蔗糖梯度離心進行分步分離，(Dubochet and Noll(1978)andLaybourn and Kadonaga(1991))。DNA的電泳分析結果顯示，級分2-4(主要為級分3)中含有與核小體核心顆粒預定大小(146bp)相同的DNA(圖10D)。通過15％SDS-PAGE分析樣品中的蛋白含量。圖10B顯示整個梯度上的蛋白分布。用抗人H2B抗體通過蛋白免疫印跡分析方法特異檢測出了H2B和H2B-GFP，這表明H2B-GFP融合蛋白存在于單核小體組分中，并且它在梯度中的分布與組蛋白相同(圖10C)。
J.H2B-GFP的摻入不影響細胞周期的進程將非同步化HeLa細胞和表達H2B-GFP的轉化體固定，碘化丙錠(PI)染色，并利用FACS進行分析。與親代HeLa細胞相比，GFP標記細胞的綠色發(fā)射光約產生三個對數級的遷移(圖11A)。通過測量PI的紅色發(fā)射光確定DNA的含量(圖11B)。結果顯示，表達H2B-GFP的非同步化HeLa細胞與親代HeLa細胞的細胞周期分布沒有什么區(qū)別。該結果清晰地表明，H2B-GFP蛋白對細胞周期進程的影響即便有也是非常小。此外，與親代細胞相同，利用胸腺嘧啶雙阻斷策略可使表達H2B-GFP的細胞成功地同步化。
K.討論這些數據表明，H2B-GFP為熒光法標記活細胞內染色體提供了一個新的策略。盡管GFP標記的體積較大(239個氨基酸殘基)，但在許多實例中都表明，被標記的蛋白仍具有功能并且可正確定向(Cubitt，et al.(1995)and Gerdes and Kaether(1996))。顯然，C端標記(H2B-G)和N端標記(G-H2B)的組蛋白均標記出瞬時轉染細胞內的染色體，而利用C端標記組蛋白還成功地建立了穩(wěn)定的細胞系。根據組蛋白八聚體的X射線晶體結構(Arents，et al.(1991))，組蛋白H3/H4四聚體負責組織核小體內DNA的中心旋轉路線，而H2A/H2B二聚體則結合在H3/H4四聚體的兩邊。由于早已了解增加離子強度可導致核小體解離成DNA和組蛋白組分(Wolffe(1995))，因此負責核小體穩(wěn)定性的初級相互作用是靜電力。0.5MNaCl可使組蛋白H1和非組蛋白從核小體上解離，但組蛋白H2A/H2B和H3/H4只有在鹽濃度分別達到0.8M NaCl和1.2M NaCl以上時才解離(Ohlenbusch，et al.(1967))。實驗數據表明，H2B-GFP能夠在高離子強度(0.5M NaCl)下與單核小體共分離。因此，很可能H2B-GFP蛋白是結合到核小體核心顆粒內部，而不是僅連接在核小體核心顆粒的外側。
用于活細胞內染色體分析的H2B-GFP策略與其它方法相比具有明顯的優(yōu)勢。盡管已有實驗說明可采用Hoechst 33342進行哺乳動物染色體的活體熒光標記(Belmont，et al.(1989)and Hiraoka andHaraguchi(1996))，但要使暴露于藥物的時間和藥物的濃度得到優(yōu)化，則必須對每個細胞系進行單獨分析(Arndt-Jovin，et al.(1989))。此外，由于Hoechst 33342的最大激發(fā)峰接近350nm，而高強度的UV照射可損傷細胞并導致細胞周期延遲或停止，因此必須小心控制UV激發(fā)的強度。DNA藥物，如二氫乙啡啶，的加入可通過干擾DNA復制而引起DNA突變(Arndt-Jovin，et al.(1989))。顯微注射羅丹明標記的組蛋白曾成功地用于果繩屬染色體的活體染色(Hiraoka，et al.(1989)and Minden(1989))，但它不適合于對大量哺乳動物細胞進行分析。與這些方法相比，文中采用的增強GFP方法(Yang，et al.(1996))的激發(fā)光為藍光(490nm)，與激發(fā)Hoechst所需的UV光激發(fā)相比，它所造成的傷害較小。GFP的圓柱桶狀結構可保護內部的發(fā)色團，它可減少由系統(tǒng)間交聯(lián)形成的單態(tài)氧所造成的光化學損傷(Yang，et al.(1996)and Ormo(1996))。由于DNA非常容易遭受光損傷，因此GFP是一種標記DNA的理想蛋白標記。此外還進行了長時間的延時成象，在不產生光褪色的17小時時間內每分鐘采集一個圖像。由于穩(wěn)定細胞系內的H2B-GFP蛋白通過轉基因整合而進行組成型表達，因此該細胞系尤其適合于長期分析。如文中所示，表達H2B-GFP的穩(wěn)定細胞系與親代HeLa細胞的細胞周期分布沒有什么區(qū)別。由于不同物種中組蛋白的一級結構非常保守(Wells(1986))，因此文中所述的H2B-GFP可用于不同物種的細胞。
GFP標記蛋白能夠與特定染色體區(qū)域結合，加上H2B-GFP的通用修飾能力，使這種蛋白推動了體內染色體行為的動力學分析。例如，通過與GFP融合的著絲粒結合蛋白(CENP-B)的表達，可對HeLa細胞內的著絲粒進行熒光標記。這使我們能夠分析有絲分裂期和間期細胞內的著絲粒運動(Shelby，et al.(1996))。最近，利用與染色體整合的lac操縱子以及在CHO(Robinett，et al.(1996))和芽殖酵母(Straight，et al.(1996))內表達lac阻抑物-GFP融合蛋白的方法對一種特定染色體區(qū)域進行了熒光標記。如果能夠實現(xiàn)用不同光譜的GFP變異體標記特定染色體區(qū)域，并結合H2B-GFP，我們將能夠同時檢測總染色體上多個特定位點的行為。例如，在固定細胞中觀測到的著絲粒與異染色質空間共定位的現(xiàn)象可通過用不同光譜的GFP變異體標記CENP-B而直接在活細胞核內得到證實。
H2B-GFP載體及其使用方法可在許多方面得到應用。由于H2B-GFP的強度代表了染色體的凝集狀況，因此我們可以研究染色體凝集和去凝集(Hiraoka，et al.(1989))、細胞核形成、以及間期核內的異染色質移動。此外，染色體分離的活體顯像使我們能夠詳細地分析異常染色體的動力學運動。例如，已分別在活細胞內顯現(xiàn)了染色體橋的形成和微核形成，它們通常代表了雙著絲點染色體和無著絲點染色體(Shimizu，et al.(1996))。在活細胞內同樣鑒別出了帶有擴增序列的雙微染色體，盡管它們的大小要小于正常染色體。H2B-GFP系統(tǒng)有助于基因組不穩(wěn)定性的分析，如非整倍性的形成、基因擴增、以及染色體丟失等，而利用固定鋪展染色體方法難以對這些問題加以分析。
這些結果表明，H2B-GFP融合蛋白可結合到核小體核心顆粒內部，并能夠在保持核及染色體結構的情況下進行染色體的高分辨率成象。這使我們能夠對染色體動力學的多個方面進行研究，如染色體凝集、核內染色質結構以及有絲分裂期間的分離等。
應該了解的是，盡管連同以上實施方案對本發(fā)明進行了描述，但前面的描述以及后面的實例均是用來說明，而不是限定，本發(fā)明的范圍。處在本發(fā)明范圍內的其它方面、優(yōu)點和修改對該領域的專家而言是顯而易見的，它們都將從屬于本項發(fā)明。
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權利要求
1.一種鑒定方法，用來鑒定可誘導細胞成熟或細胞死亡的治療藥劑，該方法包括將測試細胞與潛在的治療藥劑相接觸，其中該測試細胞含有確定水平的DM或額外染色體DNA，并且能夠經歷微核形成；以及測定所述測試細胞的DM或額外染色體DNA的水平，由此確定DM或額外染色體DNA可減少或從細胞內消除，則表明該藥劑是一種可促進微核形成從而導致細胞成熟或細胞死亡的治療藥劑。
2.權利要求1的方法，其中的測試細胞缺乏功能性腫瘤抑制蛋白。
3.權利要求1的方法，其中的測試細胞含有一種癌基因。
4.權利要求1的方法，其中的測定是通過FISH、流式細胞術、離心分步分離、或組蛋白-GFP標記來進行。
5.由權利要求1的方法鑒定的一種治療藥劑。
6.一種誘導適當細胞成熟或死亡的方法，該方法包括將適當細胞與能夠通過微核形成來誘導或加強該適當細胞內DM或額外染色體DNA消除的藥劑相接觸。
7.權利要求6的方法，其中的細胞缺乏功能性腫瘤抑制蛋白。
8.權利要求6的方法，其中的適當細胞含有一種擴增的癌基因。
9.權利要求6的方法，其中的適當細胞在體外、來自體內或在體內進行接觸。
10.一種對患有疾病的受試者進行治療的方法，該疾病涉及受試者中存在含有DM或額外染色體DNA，并能夠通過額外的微核形成消除DM或DNA的細胞，該方法包括給受試者施用有效劑量的一種藥劑，該藥劑可通過微核形成誘導或加強細胞內DM或額外染色體DNA消除。
11.權利要求10的方法，其中的細胞缺乏功能性腫瘤抑制蛋白。
12.權利要求10的方法，其中的細胞含有一種擴增的癌基因。
13.權利要求10的方法，其中的藥劑為羥基脲或其衍生物。
14.權利要求6或10的方法，其中該制劑為一種具下式的化合物 其中R1為H、烷基、芳基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基、?；?(CH2)n-X，其中n為1-4的整數，X為取代的烷基、烯基或炔基，并且取代基選自下列一組，包括鹵素、-OH、-NR2、-OR、-C(O)OR、-OC(O)R、酰胺和?；?，其中R為H、烷基或芳基；R2為H、烷基、芳基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基、-C(O)R’或-(CH2)n-X，其中n為1-4的整數，X為取代的烷基、烯基或炔基，并且其中的R’為烷基或芳基，取代基則如上文定義；R3為H、烷基、芳基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基、OR”、NR”2或-(CH2)n-X，其中n為1-4的整數，X為取代的烷基、烯基或炔基，并且取代基選自下列一組，包括-OH、-NR”2、-OR”、-C(O)OR”、-OC(O)R”、酰胺和酰基，其中R”為H、烷基或芳基；并且R4為H、烷基、芳基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基或-(CH2)n-X，其中n為1-4的整數，X為取代的烷基、烯基或炔基，并且取代基的選自下列一組，包括-OH、-NR”’2、-OR”’、-C(O)OR”’、-OC(O)R”’、酰胺和酰基，其中R”’為H、烷基或芳基。
15.權利要求6或10的方法，其中該制劑為下式的化合物 其中R1為H、烷基、芳基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基、?；?(CH2)n-X，其中n為1-4的整數，X為取代的烷基、烯基或炔基，并且取代基選自下列一組，包括鹵素、-OH、-NR2、-OR、-C(O)OR、-OC(O)R、酰胺和酰基，其中R為H、烷基或芳基；R2和R4各自獨立地為H、烷基、芳基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基、OR’、NR’2或-(CH2)n-X，其中n為1-4的整數，X為取代的烷基、烯基或炔基，并且取代基選自下列一組，包括-OH、-NR’2、-OR’、-C(O)OR’、-OC(O)R’、酰胺和?；渲蠷’為H、烷基或芳基；并且R3和R5各自獨立地為H、烷基、芳基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基或-(CH2)n-X，其中n為1-4的整數，n為1-4的整數；X為取代的烷基、烯基或炔基，并且取代基選自下列一組，包括-OH、-NR”2、-OR”、-C(O)OR”、-OC(O)R”、酰胺和?；?，其中R”為H、烷基或芳基。
16.一種檢測細胞內DM或額外染色體DNA的方法，該方法包括步驟將一種可檢測的標記蛋白插入細胞，其中該蛋白能夠與細胞內的DM和額外染色體DNA特異結合；以及檢測標記蛋白和/或DM或額外染色體DNA復合物，從而表明細胞內DM和額外染色體DNA的壓力。
17.權利要求16的方法，其中的蛋白為組蛋白或其類似物。
18.權利要求16的方法，其中的可檢測標記為一種熒光標記。
19.權利要求18的方法，其中的熒光標記為多管水母屬綠色熒光蛋白、多管水母屬紅色熒光蛋白或多管水母屬黃色熒光蛋白。
20.權利要求16的方法，其中的標記蛋白通過將細胞與一種載體相接觸而被引入細胞，該載體含有經可檢測標記的組蛋白融合蛋白的編碼DNA。
21.權利要求20的方法，其中的組蛋白融合蛋白為H2B-GFP。
22.權利要求20的方法，其中的載體為一種逆轉錄病毒載體。
23.一種監(jiān)控細胞內染色體DNA物質移動的方法，包括將一種經可檢測標記的蛋白引入細胞，其中該蛋白能夠與胞內染色體DNA特異結合而產生一種標記復合物；檢測標記復合物，從而檢測細胞內染色體DNA；以及將標記復合物與未復合染色體的位置進行比較。
24.權利要求23的方法，其中能夠與細胞內染色體DNA特異結合的蛋白為著絲粒結合蛋白或lac操縱子。
25.權利要求23的方法，其中染色體移動的選自下列現(xiàn)象，包括染色體凝集、染色體去凝集、核仁形成、異染色質移動、染色體斷裂、染色體橋形成、微核形成、基因擴增、非整倍性形成、染色體丟失和染色體易位。
26.一種檢測病理細胞表型的方法，該方法包括將一種經可檢測標記的蛋白引入細胞，其中該蛋白能夠與DM和額外染色體DNA特異結合而產生一種標記復合物；檢測標記復合物，從而檢測與病理性表型相關的DM和額外染色體DNA；以及將病理性表型與參照細胞的表型進行比較。
27.權利要求26的方法，其中的病理性表型為癌癥或腫瘤病。
全文摘要
本發(fā)明提供篩選測試物質的方法,通過該方法篩選能抑制、增強或除去細胞中微核化形成的雙微體(DM)或額外染色體DNA。本發(fā)明也提供一種方法,誘導能產生微核的細胞成熟或死亡。本發(fā)明也提供給患病的受試者治療的方法,所治療的細胞與具有DM和額外染色體DNA并能產生微核以捕捉它們的疾病相關。進一步提供一種檢測細胞中染色體和額外染色體DNA的方法。
文檔編號A61K48/00GK1383452SQ99803923
公開日2002年12月4日 申請日期1999年1月11日 優(yōu)先權日1998年1月12日
發(fā)明者G·M·瓦爾, H·M·舍帕德, N·施米朱, 特魯·坎達 申請人:新生物技術公司, 索爾克學院