本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及抗壞血酸鈉與三乙基四胺協(xié)同使用在抗乳腺癌藥物中的應(yīng)用及抗乳腺癌藥物。

背景技術(shù)：

過氧化氫在癌癥細胞生物學(xué)中發(fā)揮著不可或缺的作用。癌細胞比正常細胞產(chǎn)生更多的過氧化氫，首先由于過度反應(yīng)的酶在電子傳遞鏈上產(chǎn)生過多的活性氧(ros)，其次由于超氧化物歧化酶(sod)的過度表達，把過氧化物(o2^-)轉(zhuǎn)化為過氧化氫(h2o2)。

乳腺癌是全球女性癌癥相關(guān)死亡的主要原因。像許多惡性腫瘤一樣乳腺癌的特點是過度表達的sod隨著過氧化氫酶(cat)的下調(diào)，將過氧化氫轉(zhuǎn)化為水和氧氣。因此乳腺癌細胞維持細胞內(nèi)過氧化氫高于正常細胞，這表明乳腺癌細胞能夠積累和允許一定范圍內(nèi)的過氧化氫。然而，輕微提高癌細胞中的過氧化氫已經(jīng)被證明對抑制細胞周期和誘導(dǎo)細胞凋亡有利，這表明癌癥細胞中過氧化氫的選擇性超載可能是乳腺癌的治療策略。事實上，過氧化氫誘導(dǎo)劑已經(jīng)表現(xiàn)出成為抗癌藥物的潛質(zhì)。然而，大多數(shù)癌癥化療藥物對宿主是有毒性的。因此，現(xiàn)有藥物或天然產(chǎn)物選擇性地促進癌細胞的過氧化氫產(chǎn)生，同時保證正常的細胞活動，作為實現(xiàn)治療靈活性和選擇性的候選者是很有前途的。

抗壞血酸(asc)，也被稱為維生素c，是著名的天然抗氧化劑。它一直被認為是必不可少的自由基清除劑。先前的研究已經(jīng)報道，高濃度的asc能夠誘導(dǎo)自氧化，從而揭示了抗癌效果，而低濃度的asc未能顯示類似的效果。

在連續(xù)的單電子氧化反應(yīng)中，高濃度的asc給予氧2個電子導(dǎo)致脫氫抗壞血酸(dha)和過氧化氫的形成。asc連續(xù)的單電子氧化可以通過陰離子asc^2-，在二氧化物存在的情況下氧化產(chǎn)生asc^-，脫氫抗壞血酸和過氧化氫。

這個過程表示為以下公式：

抗壞血酸+h2o→asch^-+asc·^-

asc2^-+o2→asc·^-+o2·^-

2asc·^-+h⁺→asch^-+dha

2o2·^-+2h⁺→h2o2+o2

因此，重要的是要調(diào)查高濃度的asc是否與自然氧化相關(guān)，這對其抗癌效果至關(guān)重要。asc非常穩(wěn)定，在單獨存在的情況下幾乎不自然氧化。然而在金屬氧化物催化劑存在的時，例如鐵、銅、錳、asc自然氧化可以大幅提升，這就是證明了抗壞血酸離子的積累(asc·^-)并最終導(dǎo)致大量o2·^-和過氧化氫的產(chǎn)生。此外，o2·^-可以進一步降低過氧化氫接受asc的電子。asc在水溶液中自然氧化的催化劑的功能主要依賴于他們的組成部分，特別是氨基酸組，它被認為有促氧化的作用。三亞乙基四胺(teta)是一種端粒酶抑制劑，幾十年來在臨床上用于治療癌癥。先前的研究表明teta可以在人類卵巢癌細胞環(huán)境下通過抑制銅/鋅過氧化物歧化酶即sod1，克服順鉑的耐藥性。teta是一種堿性化合物，包含兩個氨基酸組并傾向于參與氧化還原以及水溶液中酸堿反應(yīng)。它擁有4個氮原子，1s22s22p3電子排列。每個氮原子有一個孤對電子，可以與asc的質(zhì)子配對。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，本發(fā)明提供抗壞血酸鈉與三乙基四胺協(xié)同使用在抗乳腺癌藥物中的應(yīng)用及抗乳腺癌藥物，抗壞血酸鈉與三乙基四胺協(xié)同使用具有良好的使乳腺癌細胞體積變少、質(zhì)量變輕的效果，本發(fā)明抗乳腺癌藥物具有優(yōu)異的治療乳腺癌、抑制乳腺癌細胞向其他臟器中轉(zhuǎn)移擴散的功效。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：抗壞血酸鈉和三乙基四胺協(xié)同使用在抗乳腺癌藥物中的應(yīng)用。

抗壞血酸鈉和三乙基四胺協(xié)同使用在制備抗乳腺癌藥物中的應(yīng)用。

抗壞血酸鈉、三乙基四胺和天然活性物協(xié)同使用在抗乳腺癌、抑制乳腺癌細胞向肺、脾、肝、腎和心臟轉(zhuǎn)移藥物中的應(yīng)用；其中，所述天然活性物包括賴氨酸、脯氨酸或綠茶提取物。

抗壞血酸鈉、三乙基四胺和天然活性物協(xié)同使用在制備抗乳腺癌、抑制乳腺癌細胞向肺、脾、肝、腎和心臟轉(zhuǎn)移藥物中的應(yīng)用；其中，所述天然活性物包括賴氨酸、脯氨酸或綠茶提取物。

一種抗乳腺癌藥物，其組分包括抗壞血酸鈉和三乙基四胺，其中，抗壞血酸鈉和三乙基四胺作為抗乳腺癌的主要活性成分。

作為優(yōu)化，所述藥物的劑型包括片劑、丸劑、膠囊劑、顆粒劑、注射液、注射用粉劑、注射用乳劑、口服溶液、口服混懸液、口服乳劑或緩釋片劑。

作為進一步優(yōu)化，所述藥物的劑型為片劑，包括如下質(zhì)量份的組分：40～50份抗壞血酸鈉、30～35份三乙基四胺、8～10份木薯淀粉、2～4份蜂蜜、2～3份羥甲基纖維素鈉、1～2份二氧化硅和8～12份水；所述藥物制備時將抗壞血酸鈉磨碎后與木薯淀粉、羥甲基纖維素鈉和二氧化硅混合均勻，過200～300目篩并取篩下物，將所述篩下物與三乙基四胺、蜂蜜和水混合，將混合物壓片后制得所述抗乳腺癌藥物。

作為一種改進方式，所述藥物的劑型為膠囊，采用如下方法制得：將45～55質(zhì)量份抗壞血酸鈉磨碎后與8～10質(zhì)量份辛烯基琥珀酸酯化淀粉混合均勻并過200～300目篩取篩下物，得到混合粉料，將所述混合粉料與30～40質(zhì)量份三乙基四胺和5～8質(zhì)量份玉米油混合均勻，將混合均勻后的混合物于膠體磨研磨3～5min，制得囊芯物，將明膠、羥丙基纖維素和水按照3～4：2～3：1～1.5的質(zhì)量比混合后加熱溶解均勻，得到囊壁材料，采用壓丸機并以所述囊芯物和所述囊壁材料為原料，制備成所述抗乳腺癌膠囊。

作為另一種改進方式，所述藥物的組分還包括賴氨酸、脯氨酸或綠茶提取物。

作為優(yōu)化，所述藥物的劑型為緩釋片劑；采用如下方法制得：將40～45質(zhì)量份抗壞血酸鈉、30～35質(zhì)量份三乙基四胺、15～20質(zhì)量份玉米多孔淀粉、20～25質(zhì)量份水和8～12份賴氨酸混合均勻并攪拌吸附10～20min，將攪拌吸附后的混合物于50～70℃下干燥處理1～2h，得到干燥混合物，將所述干燥混合物、飴糖、羥乙基纖維素和水按照75～85：10～15：5～7：6～10的質(zhì)量比混合均勻并進行壓片，制得所述抗乳腺癌藥物。

與現(xiàn)有的技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

1、本發(fā)明首先假設(shè)teta可能增強乳腺癌細胞中asc的自然氧化，從而提高細胞內(nèi)過氧化氫，進一步促進asc對乳腺癌細胞的選擇性細胞毒性，發(fā)明人通過創(chuàng)造性的實驗驗證調(diào)查了teta在asc溶液中產(chǎn)生h2o2的作用，用體外模型來研究它在調(diào)節(jié)乳腺癌細胞凋亡中的作用，以及通過使用一個體內(nèi)動物模型來研究潛在的分子機制。經(jīng)過上述假設(shè)和創(chuàng)造性的驗證，本發(fā)明首創(chuàng)性地發(fā)現(xiàn)抗壞血酸鈉和三乙基四胺協(xié)同使用具有優(yōu)異的抑制乳腺癌效果，證明teta能增強asc依賴的過氧化氫的生成，能夠協(xié)同增效過氧化氫介導(dǎo)的乳腺癌細胞選擇性毒性。

2、本發(fā)明采用體內(nèi)動物模型驗證asc協(xié)同teta抑制乳腺癌的效果，結(jié)果顯示采用asc協(xié)同teta的方式乳腺癌的重量和體積大小顯著減少，明顯優(yōu)于僅使用asc和僅使用teta的抑制效果，取得了意想不到好的抑制乳腺癌的效果。

3、本發(fā)明通過試驗驗證采用asc協(xié)同teta的治療方式，對患有基底樣乳腺癌、her2陽性乳腺癌、三陰性乳腺癌的乳腺癌患者均具有良好的治療以及抑制乳腺癌細胞轉(zhuǎn)移擴散的功效，為乳腺癌的治療提供了效果優(yōu)異的新途徑，具有良好的醫(yī)藥應(yīng)用前景。

4、采用asc和teta的方式僅會協(xié)同增效癌細胞的細胞毒作用，但對正常細胞的活性影響較小，對機體正常細胞的傷害力小，安全可靠性能更高，不會帶來副作用。

附圖說明

圖1為teta對asc氧化的影響圖。電極氧監(jiān)測儀檢測asc水溶液的耗氧率(ocr)。單獨1mmasc,30mteta/1mmasc，和30mteta分別加入10％fbs的dmem中。每個反應(yīng)中加入600u/毫升過氧化氫酶來確定o2的回歸。

圖2為mtt法評估m(xù)cf-7存活圖；*<0.005,#<0.0001,＝6。

圖3為在經(jīng)過6,12,24hours的1mmasc/10mteta處理后用mtt法檢測mcf-7細胞活性，＝6。

圖4為western檢測凋亡信號中，不同遞增劑量的asc/teta(1:100)的作用。

圖5為1mmasc/10mteta12小時后mcf-7細胞克隆形成實驗。

圖6為在mcf-7細胞中加入1mmasc，再分別加入10m,30m,or50m的teta并處理12小時，3個獨立的實驗統(tǒng)計分析，*<0.05相對控制組，#<0.01相對asc組，＝3。

圖7為asc/teta作用于各細胞系的選擇性毒性。mcf-7、mda-mb-157、mda-mb-231，u87，hcc-9204，h1299，hs578bst，huvec和v79細胞分別用1mm,3mm,和5mm的asc培養(yǎng)，同時加入10m,30m,or50m的teta保持teta對asc1:100的比例。通過mtt法檢測培養(yǎng)12小時后，asc/teta對不同細胞的細胞毒性；實驗重復(fù)三次。

圖8為分別用1mmasc,10mteta，1mmasc/10mteta,5mmnac和1mmasc/10mteta以及5mmnac處理mcf-7細胞4小時，用h2dcf熒光染色mcf-7細胞中的ros圖。

圖9為用1mmasc/10mteta，3mmasc/30mteta,，3mmasc/30mteta以及5mmnac處理mcf-7細胞12小時。western檢測ras的表達和h3乙酰化圖。

圖10為用1mmasc/10mteta對mcf-7細胞分貝處理6,12,24小時；western檢測ras的表達和h3乙?；瘓D。

圖11為用1mmasc,10mteta,5mmnac,1mmasc/10mteta和1mmasc/10mtetaplusnac處理mcf-7細胞12小時；用mtt法測量細胞活性圖，*<0.005,＝4.實驗重復(fù)三次。

圖12為乳腺癌和正常細胞中的cat表達水平—1mmasc,10mteta,300u/ml過氧化氫酶，1mmasc/10mteta,1mmasc/10mteta加過氧化氫酶處理mcf-7細胞12小時結(jié)果；克隆形成實驗,*<0.0001,#<0.0001,＝4。

圖13為乳腺癌和正常細胞中的cat表達水平—免疫印跡法測定hs578bst和mcf-7細胞中cat的表達水平圖。

圖14為乳腺癌和正常細胞中的cat表達水平—hs578bst細胞中cat的表達被catshrna抑制圖。

圖15為乳腺癌和正常細胞中的cat表達水平—catshrna處理后用mtt法測量hs578bst細胞活性，<0.005,＝4。

圖16為sod在asc/teta介導(dǎo)細胞凋亡中的作用—1mmasc,10mteta,100u/mlsod1,1mmasc/10mteta,1mmasc/10mtetaplussod用于處理mcf-7細胞12小時。克隆形成實驗被用于確定板植入率*<0.0001,#<0.05,＝4。

圖17為western評估hs578bst和mcf-7細胞中sod1的表達水平圖。

圖18為通過免疫印跡試驗檢測sod1shrna下調(diào)mcf-7細胞中sod1的表達圖。

圖19為經(jīng)sod1shrna處理后的mcf-7細胞活性由mtt實驗測量,*<0.05,＝4圖。

圖20為asc/teta對erk和sod表達的影響圖—不同時間段mcf-7細胞在3mmasc,30mteta,或3mmasc/30mteta的培養(yǎng)；western評估erk,ras,cyt-c的蛋白水平。

圖21為小鼠乳腺癌模型中asc/teta抑制腫瘤生成，5×10⁶mcf-7皮下注入磁性裸鼠后腿部，14天后隨機分為4組，(0.01mpbs)；asc(3g/kg體重)；teta(30mg/kg體重)；asc(3g/kg體重)+teta(30mg/kg體重)，分別經(jīng)腹腔內(nèi)注射，每日一次，處理后25天圖——臟器指數(shù)圖。

圖22為小鼠乳腺癌模型中asc/teta抑制腫瘤生成，5×10⁶mcf-7皮下注入磁性裸鼠后腿部，14天后隨機分為4組，(0.01mpbs)；asc(3g/kg體重)；teta(30mg/kg體重)；asc(3g/kg體重)+teta(30mg/kg體重)，分別經(jīng)腹腔內(nèi)注射，每日一次，處理后25天圖——不同組的腫瘤代表性圖片

圖23為小鼠乳腺癌模型中asc/teta抑制腫瘤生成，5×10⁶mcf-7皮下注入磁性裸鼠后腿部，14天后隨機分為4組，(0.01mpbs)；asc(3g/kg體重)；teta(30mg/kg體重)；asc(3g/kg體重)+teta(30mg/kg體重)，分別經(jīng)腹腔內(nèi)注射，每日一次，處理后25天——腫瘤體積p<0.0001,n＝6。

圖24小鼠乳腺癌模型中asc/teta抑制腫瘤生成，5×10⁶mcf-7皮下注入磁性裸鼠后腿部，14天后隨機分為4組，(0.01mpbs)；asc(3g/kg體重)；teta(30mg/kg體重)；asc(3g/kg體重)+teta(30mg/kg體重)，分別經(jīng)腹腔內(nèi)注射，每日一次，處理后25天圖——腫瘤的重量*p<0.05,#p<0.005,n＝6。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明。

一、材料和方法

1.1細胞培養(yǎng)。

所有的細胞系均購自中科院上海細胞庫(上海)。d-mem高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)(dmem,hyclone,sh30022.01b,usa)在37℃，5％co2濃度的co2培養(yǎng)箱中添加10wt.％的胎牛血清(fbs)(gibco，美國)。

1.2耗氧量測定。耗氧率(ocr,d[o2]/dt)的測定如下：在dmem(10wt.％fbs)中把一個克拉克電極氧監(jiān)測儀(ysiinc.)連接到esa生物多電極系統(tǒng)。測量和記錄teta對asc的耗氧量。通過添加過氧化氫酶測定h2o2的積累(sigma，c9322-1g，德國)。

1.3mtt比色法。mcf-7細胞在96-孔板(3×103細胞/)中培養(yǎng)，緊隨其后的是12小時或24小時的處理。媒介中包含的asc是受到mtt比色法之前的asc，因為asc的氧化產(chǎn)物干擾mtt比色。無血清的100μldmem加入到每個孔中，然后各孔再加3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-diphenytetrazoliumromide(mtt,sigma,德國)20μl/孔。37℃的溫度下培養(yǎng)4h，吸除各孔培養(yǎng)液后加150μl/孔的dimethylsulfoxide(dmso)，震動10min，檢測od490值。

1.4ros測量。使用h2dcf(sigma,德國)檢測細胞內(nèi)ros，步驟如下：10μm的h2dcf添加30min后，通過熒光顯微鏡分析細胞(keyencecorporation)。

1.5蛋白質(zhì)印跡法。使用冷凍的ripa裂解緩沖液(碧云天生物科技，上海，中國)獲得mcf-7細胞，蛋白質(zhì)濃度測定采用bca量化工具(碧云天生物科技,中國上海)；蛋白質(zhì)印跡法具體如下：anti-ac-h3，anti-sod1，anti-cat，anti-erk，anti-p-erk，anti-cyt-candanti-caspase9的一抗購買自巴傲得生物科技(南京，中國)，anti-parp，rabbitanti-caspase3，andanti-ac-h3購買自cellsignalingtechnology(丹佛，美國)，anti-raswaspurchasedfrombd,usa，andanti-gapdh的購買自earthox(米爾布雷，美國)。二抗是從南京巴傲得生物技術(shù)購買(南京，中國)，高靈敏度的化學(xué)發(fā)光底物eclsupersignalwestfemtomaximumsensitivitysubstrate從thermofisher購買。

1.6瞬時轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染前的24小時，1×105個細胞接種在24孔板中。根據(jù)制造商的協(xié)議，shrna(600ng/孔)和質(zhì)粒(大腸桿菌質(zhì)粒，cole1質(zhì)粒)(800ng/孔)被脂質(zhì)體3000轉(zhuǎn)染。

sod1,nm000454.3-582s1c1:

ccgggctgtagaaatgtatcctgatctcgagatcaggatacatttctacagctttttg

cat,nm001752.2-1371s1c1:

ccggcggagattcaacactgccaatctcgagattggcagtgttgaatctccgtttttg

1.7異種移植的研究。6周齡雌性裸鼠(balb/cnu)購自生命河實驗室(北京，中國)，動物實驗由重慶醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會批準，所有的程序都按照美國國立衛(wèi)生研究院的實驗動物喂養(yǎng)和使用指南。總而言之，將mcf-7細胞(5×106200l)皮下注入小鼠的后腿，0.72mg，90天釋放17-estradiol的顆粒被皮下植入到正反面促進腫瘤生長的最佳區(qū)域。腫瘤被允許生長14天到達3-5mm的最大尺寸，治療在第14天開始。小鼠隨機分為4組，包括控制組(0.01pbs)；asc(3克/公斤體重)；teta(30毫克/公斤體重)和asc(3克/公斤體重)+teta(30毫克/公斤體重)，每組10只老鼠。通過連續(xù)25天每日腹腔內(nèi)注射治療，每2天使用游標卡尺測量腫瘤大小，同時估計腫瘤體積基于以下公式：腫瘤體積(mm³)＝×2/2，其中l(wèi)是腫瘤的最大尺寸，w意味著腫瘤垂直方向的尺寸。腫瘤大小達到1,000mm³，用co2安樂處死動物。

1.8統(tǒng)計分析。mean±sd表示?；诟鲗嶒炘O(shè)計的要求，采用graphpadprism5軟件進行統(tǒng)計。即t-tests和2-wayanova。

二、結(jié)果

2.1teta協(xié)同抗壞血酸鈉氧化。

為了探究teta從asc促進h2o2生成的效果，分別測量了含有teta的asc的耗氧量，和缺乏teta的asc的耗氧量。正如圖表1所示，1mmasc在10wt.％fbs的dmem的耗氧量為55nmol/l/s；而增加30μm的teta后，耗氧量增加到110nmol/l/s，而僅有30μm的teta幾乎不消耗o2和產(chǎn)生h2o2。然而，在過氧化氫酶存在下(600u/ml)，asc/teta中h2o2的積累被顯著抑制，相對于asc或teta的單獨存在下。綜上所述，這些證據(jù)強有力地證明teta能增強asc依賴的過氧化氫的生成。

2.2asc/teta共同促進mcf-7細胞凋亡。

為了進一步檢測乳腺癌細胞中asc/teta誘導(dǎo)h2o2的細胞毒性，mcf-7細胞被分別加入asc(1mm)和不同劑量的teta(10μm，30μm，and50μm)12小時，mtt比色法結(jié)果表明，單獨加入asc導(dǎo)致mcf-7細胞增殖減少40％，而單獨加入teta本身并沒有表現(xiàn)出對細胞活性的影響。有趣的是相比單獨加入asc，加入asc和teta組合時細胞存活率顯著下降(圖2)。此外，24小時asc/teta的持續(xù)培養(yǎng)使細胞存活率進一步降低，表明asc/teta聯(lián)合抗癌作用呈時間劑量依賴性(圖3)。進一步的免疫印跡實驗表明asc/teta抑制mcf-7細胞活性通過caspase9和caspase3凋亡信號的上升(圖4)。形態(tài)學(xué)和細胞克隆實驗證實teta和asc介導(dǎo)的細胞毒作用于mcf-7人乳腺癌細胞(圖5和圖6)?？傊@些結(jié)果表明，teta和asc協(xié)同在體外具有抗乳腺癌的作用，且抗乳腺癌效果明顯高于僅使用asc的抗乳腺癌效果。

2.3asc和teta協(xié)同增強體外細胞毒性。

為了進一步驗證asc和teta的協(xié)同作用是特異性地針對腫瘤細胞的死亡，除了各種癌細胞系asmcf-7、mda-mb-157、mda-mb-231，u87，hcc-9204，h1299外，包括多樣的正常hs578bst，內(nèi)皮細胞，和v79用不同濃度的teta溶液(5μm，10μm，30μm,and50μm)孵育，與相應(yīng)劑量的asc(0.5mm、1mm、3mm和5mm)按照1：100比例配成teta/asc。mtt法檢測結(jié)果表明，asc和teta協(xié)同增效癌細胞的細胞毒作用，但對正常細胞的活性影響較小(圖7)。

2.4h2o2對于asc/teta誘導(dǎo)產(chǎn)生mcf-7細胞的細胞毒性至關(guān)重要。我們評估了mcf-7細胞的ros水平。經(jīng)過4小時的潛伏期單獨加入asc僅中度升高mcf-7細胞的ros水平，而單獨加入teta沒有顯示對ros產(chǎn)生任何影響。然而，相比其他組，asc/teta共培養(yǎng)導(dǎo)致了ros的急劇增加，而n-乙酰半胱氨酸(nac，sigma，v900429，德國)，除h2o2外，還降低了ros，asc/teta顯示了更少的熒光染色(圖8)?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明，teta不僅增效h2o2，也增效了mcf-7細胞中其他種類從asc中產(chǎn)生ros。

然而，ros包括過氧化氫(h2o2)、超氧陰離子(o2·^-)、羥基自由基，要確定asc/teta的細胞毒性是否特定地來自于h2o2。隨著asc/teta，nac被應(yīng)用于mcf-7細胞。

蛋白質(zhì)印跡法表明asc/teta聯(lián)合作用導(dǎo)致ras基因表達的抑制，并沒有被額外的nac而解除。相反的，雖然asc/teta也導(dǎo)致劑量依賴性h3乙酰化升高，但這種功效被5mmnac完全逆轉(zhuǎn)(圖9)。此外，asc/teta對ras表達的影響和h3乙?；憩F(xiàn)出時間依賴性(圖10)。數(shù)據(jù)表明，teta/asc抑制mcf-7細胞ras蛋白表達主要通過h2o2，同時上調(diào)h3乙?；饕峭ㄟ^其他類型的ros。最重要的是，5mmnac未能消除由asc/teta引起的細胞毒性?？傊?，這些結(jié)果表明(圖11)，在mcf-7細胞中，asc/teta誘導(dǎo)的h2o2是主要的細胞毒性物質(zhì)，可能通過抑制ras來表達。

2.5asc/teta誘導(dǎo)的mcf-7過氧化氫的選擇性細胞毒性源于cat表達的缺乏。隨后我們研究了asc/teta聯(lián)合對癌細胞和正常細胞的細胞毒性機制的差異?？寺⌒纬蓪嶒灆z測了asc/teta誘導(dǎo)細胞死亡的過氧化氫酶的作用。數(shù)據(jù)(圖12)表明，單獨加入asc適度降低了mcf-7細胞的平板效率，teta和過氧化氫酶顯示了相似的效果。然而，asc/teta的聯(lián)合顯著抑制mcf-7細胞的平板效率，但在過氧化氫酶存在的情況下，這種下降完全恢復(fù)了。那么我們通過免疫印跡法確定了在mcf-7細胞內(nèi)和普通細胞內(nèi)cat的表達水平。結(jié)果表明mcf-7細胞內(nèi)的cat表達水平明顯低于正常細胞(圖13)。為了進一步確定cat抵抗asc/teta誘導(dǎo)細胞死亡的重要性，shcat被轉(zhuǎn)染到正常乳腺上皮細胞hs578bst；它只是很大程度上抑制了cat在hs578bst細胞的表達(圖14)，但也大大損傷了細胞的活性(圖15)。這些強烈表明了癌細胞選擇性細胞毒性是由于cat下調(diào)導(dǎo)致，因此聯(lián)合使用teta和asc的細胞毒性主要是由h2o2介導(dǎo)。

2.6asc/teta誘導(dǎo)的mcf-7細胞的細胞毒性不由o2·^-介導(dǎo)。盡管已經(jīng)發(fā)現(xiàn)h2o2對于teta/asc介導(dǎo)細胞毒作用極為重要，但o2·^-抗癌效應(yīng)的可能性尚未排除。為了區(qū)分o2·^-和h2o2對teta/asc聯(lián)合誘導(dǎo)產(chǎn)生細胞毒性時的作用，100u/mlsod被應(yīng)用于1mmasc的mcf-7細胞和10μmteta的mcf-7細胞。相比于cat，sod未能挽回asc和teta都存在情況下細胞的存活，而是加劇了細胞的死亡(圖16)。這表明o2·^-并不有助于teta和asc介導(dǎo)腫瘤細胞的細胞毒性。意料之中，sod蛋白在mcf-7細胞中表達明顯高于正常細胞(圖17)。為了進一步證實這一發(fā)現(xiàn)，mcf-7細胞內(nèi)的sod1被shrna敲降(圖18)。在asc/teta聯(lián)用下，shsod1并未增強mcf-7細胞活性，而是導(dǎo)致更多細胞死亡(圖19)。這些數(shù)據(jù)表明,asc/teta對mcf-7的細胞毒性不是由o2·^-介導(dǎo)。

2.7asc/teta作用于癌細胞相關(guān)的信號

我們調(diào)查了參與asc/teta誘導(dǎo)細胞死亡的信號通路。如圖20所示，通過免疫印跡實驗表明，asc/teta聯(lián)合使用抑制了mcf-7細胞中erk1/2和sod1的表達。為了進一步明確asc和teta導(dǎo)致細胞死亡的類型，我們檢監(jiān)測了細胞色素c(cyt-c)，細胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)者。asc/teta誘導(dǎo)cyt-c有時間依賴性，這與之前mtt的結(jié)果一致。這些數(shù)據(jù)表明asc/teta誘導(dǎo)癌細胞凋亡可能是由ras-erk所介導(dǎo)的。

2.8teta增強體內(nèi)asc誘導(dǎo)的細胞毒性

為了檢驗聯(lián)用asc/teta是否對體內(nèi)的腫瘤細胞具有細胞毒性，小鼠體內(nèi)的移植腫瘤在經(jīng)過25天的聯(lián)用注射后，其差異無統(tǒng)計學(xué)意義，4組之間的臟器指數(shù)觀察(圖21)后表明asc/teta對這些器官毒性低。然而，在25天腫瘤體積組之間存在差異，對照組腫瘤體積為971.1±24.20mm³，單獨加入teta組體積為898±16.03mm³，單獨加入asc組體積為746.5±14.44mm³，但明顯降低的是asc/teta組，體積為278±16.42mm³。與之契合的是，腫瘤的重量分別為1.276±0.097g，0.969±0.095g，1.226±0.087g對應(yīng)對照組，asc組、teta組，但顯著下降到0.478±0.094g的是有由asc/teta處理的這組(圖22、23、24)。

三、抗乳腺癌藥物：

本發(fā)明發(fā)明人在創(chuàng)造性地發(fā)現(xiàn)asc和teta協(xié)同使用能夠顯著減少乳腺癌腫瘤體積大小和重量的基礎(chǔ)上，通過進一步的研究，給出了如下種抗乳腺癌藥物的組成方式，具體如下：

實施例1

一種抗乳腺癌藥物，劑型為片劑，包括如下質(zhì)量份的組分：50mg抗壞血酸鈉、35mg三乙基四胺、10mg木薯淀粉、4mg蜂蜜、3mg羥甲基纖維素鈉、2mg二氧化硅和12mg水；所述藥物制備時將抗壞血酸鈉磨碎后與木薯淀粉、羥甲基纖維素鈉和二氧化硅混合均勻，過200目篩并取篩下物，將所述篩下物與三乙基四胺、蜂蜜和水混合，將混合物壓片后制得所述抗乳腺癌藥物。

某患有基底樣乳腺癌的乳腺癌患者服用本實施例抗乳腺癌藥物，每天服用一片，連續(xù)服用16周后，檢測乳腺癌細胞有明顯的體積變小，證明本實施例抗乳腺癌患者對患有基底樣乳腺癌的患者具有良好的治療效果。

實施例2

一種抗乳腺癌藥物，劑型為膠囊，采用如下方法制得：將55mg抗壞血酸鈉磨碎后與10mg辛烯基琥珀酸酯化淀粉混合均勻并過300目篩取篩下物，得到混合粉料，將所述混合粉料與40mg三乙基四胺和8mg玉米油混合均勻，將混合均勻后的混合物于膠體磨研磨5min，制得囊芯物，將明膠、羥丙基纖維素和水按照4：3：1.5的質(zhì)量比混合后加熱溶解均勻，得到囊壁材料，采用壓丸機并以所述囊芯物和所述囊壁材料為原料，制備成所述抗乳腺癌膠囊。

某患有her2陽性乳腺癌的乳腺癌患者服用本實施例抗乳腺癌藥物，每天服用一粒膠囊，連續(xù)服用20周后，檢測乳腺癌細胞有明顯的體積變小，肉眼可見乳腺癌細胞的數(shù)量也變少，證明本實施例抗乳腺癌患者對患有her2陽性乳腺癌的患者具有良好的治療效果。

實施例3

一種抗乳腺癌藥物，劑型為緩釋片劑；采用如下方法制得：將45mg抗壞血酸鈉、35mg三乙基四胺、20mg玉米多孔淀粉、25mg水和12mg賴氨酸混合均勻并攪拌吸附20min，將攪拌吸附后的混合物于70℃下干燥處理2h，得到干燥混合物，將所述干燥混合物、飴糖、羥乙基纖維素和水按照85：15：7：10的質(zhì)量比混合均勻并進行壓片，制得所述抗乳腺癌藥物。

某患有三陰性乳腺癌的乳腺癌患者服用本實施例抗乳腺癌藥物，每天服用一片，連續(xù)服用15周后，檢測乳腺癌細胞有明顯的體積變小，肉眼可見乳腺癌細胞的數(shù)量也變少，且乳腺癌細胞向肺、脾、肝、腎和心臟中轉(zhuǎn)移量極少，證明本實施例抗乳腺癌患者對患有三陰性乳腺癌的患者具有良好的治療以及抑制乳腺癌細胞轉(zhuǎn)移擴散的功效。

四、發(fā)明內(nèi)容分析與討論：

鑒于乳腺癌的典型特征之一是sod過度表達，隨著cat表達的抑制，腫瘤細胞內(nèi)氧化應(yīng)激與正常細胞相比更高。wlassoff等人表明，來源于h2o2的羥基自由基在三苯氧胺-二茂(絡(luò))鐵共軛存在的情況下促進乳腺癌細胞凋亡。其他團隊已經(jīng)證明癌細胞中過量的過氧化氫的產(chǎn)生和積累可能引起癌癥細胞周期阻滯和細胞凋亡，這表明細胞內(nèi)h2o2濃度升高可能是治療乳腺癌的一種有效方法，因此一種能夠選擇性誘導(dǎo)h2o2生成的天然化合物的物質(zhì)有望成為治療乳腺癌的理想方法。

asc是一個有效的天然抗氧化劑，對癌癥治療一直被認為是有益的。有趣的是據(jù)報道,在癌細胞中asc通過貢獻一個電子而被氧化，與金屬離子發(fā)生氧化反應(yīng)產(chǎn)生抗癌的過氧化氫。另一團隊也表明，用1mmasc處理c6細胞4小時，觸發(fā)細胞內(nèi)cu的釋放，可以進一步促進asc氧化，這表明asc自氧化產(chǎn)生的過氧化氫可能對癌癥治療是有益的。然而，asc誘導(dǎo)的過氧化氫對治療癌癥的有效性仍然是有爭議的。首先，asc等離子體濃度與乳腺癌風險沒有明顯的關(guān)聯(lián)；其次，過氧化氫被發(fā)現(xiàn)能增強乳腺癌發(fā)生的風險。這兩種情況表明不僅需要高劑量的asc誘導(dǎo)細胞內(nèi)急劇升高的h2o2流，還需要一種從asc自然氧化中促進h2o2產(chǎn)生的試劑，可能是asc臨床上用于乳腺癌治療的關(guān)鍵?？紤]到人的asc循環(huán)濃度比較高，從20到80mol/l，在各個國家都相對穩(wěn)定，所以把asc作為藥物對乳腺癌作用是合理的。事實上，逐漸累積的證據(jù)表明高劑量的asc可能有利于乳腺癌的治療。yun等最近報道高劑量的asc選擇性殺傷kras和braf突變的結(jié)直腸癌細胞。同樣，另一團隊也表明，藥理濃度的asc能對各種大腸癌細胞系起到抑制增殖和誘導(dǎo)細胞凋亡的作用，可能是通過促進細胞內(nèi)氧化應(yīng)激來完成的。asc也表現(xiàn)出對胰腺癌細胞的抗癌特性，進一步提供的證據(jù)表明，高劑量的asc在金屬離子催化下，誘導(dǎo)癌細胞中過氧化氫流導(dǎo)致氧化應(yīng)激，最終使細胞凋亡。

這些結(jié)果表明，asc能夠?qū)е掳┘毎乃劳?，但因為不同癌細胞之間的差異性很大，并沒有相關(guān)研究證明asc能否導(dǎo)致乳腺癌細胞死亡，且采用如何濃度的asc能夠提高乳腺癌細胞死亡率，而不是促進乳腺癌的發(fā)生也有待研究商榷，以及采用怎么樣的物質(zhì)協(xié)同增效過氧化氫的乳腺癌細胞選擇性毒性都是有待研究的。

因此，本發(fā)明發(fā)明人通過一系列創(chuàng)造性的試驗研究，通過實驗數(shù)據(jù)證實，高劑量的asc是必不可少的誘導(dǎo)體外mcf-7細胞凋亡和抑制體內(nèi)腫瘤發(fā)生的物質(zhì)。雖然許多研究表明，asc可作為乳腺癌化療的輔助藥物，但這主要取決于在腫瘤細胞治療的過程中asc誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，而這還有待調(diào)查。

teta是有等排相似電荷缺陷的亞精胺與cu(ii)的螯合物。它通常用于治療wilson病。最近，其治療癌癥的潛力已被揭開；越來越多的證據(jù)表明，teta在通過抑制端粒酶活性對抗癌癥，在抗腫瘤血管形成中，通過調(diào)節(jié)代謝抑制癌細胞增殖以及誘導(dǎo)細胞死亡的過程中都起著重要的作用，然而，這些研究主要集中在teta的化學(xué)性質(zhì)對癌癥的作用，特別是氨基，和作為一個潛在的asc氧化催化劑的作用。我們是第一個發(fā)現(xiàn)，在水溶液中，teta通過增加asc氧化而提高h2o2產(chǎn)量。隨后，我們檢查了asc/teta聯(lián)用是否足以導(dǎo)致乳腺癌細胞死亡。在體外和體內(nèi)實驗證明，單獨的高劑量asc只對癌細胞產(chǎn)生輕微毒性，因此單獨的teta幾乎沒有任何作用。然而，asc/teta聯(lián)用顯著抑制mcf-7細胞活力，強烈提示asc/teta的組合聯(lián)用可以是一種很有前途診斷乳腺癌的新興輔助治療。然而，潛在的分子機制仍有待發(fā)現(xiàn)。

為了確定asc/teta對乳腺癌細胞的細胞毒性，h2dcf熒光染色ros后的結(jié)果表明，asc/teta顯著促進癌細胞生成ros。然后我們也確定了asc/teta誘導(dǎo)癌細胞死亡的ros類型。加入nac不抑制asc/teta的細胞毒作用，強有力證明了，來自于asc/teta的過氧化氫是ros的主要類型，這就是能選擇性殺傷乳腺癌細胞的原因。然而許多研究已經(jīng)證實，長期的細胞外的高濃度h2o2，在幾個月內(nèi)能促進乳腺癌細胞增殖，結(jié)果形成侵入性的表型。然而，我們的研究結(jié)果與wlassoff等人是一致的，根據(jù)他們的報道，h2o2是刺激細胞凋亡的三苯氧胺-二茂(絡(luò))鐵中對mcf-7共軛處理的羥基。這表明，h2o2依賴型乳腺癌最好的治療窗口將不會超過六個月。然而，在今后的研究中要進行asc/teta下細胞內(nèi)h2o2流的實時監(jiān)測是否如先前報道一樣。

有趣的是我們理解了teta/asc是否是癌細胞的選擇性毒性。之前已經(jīng)證明asc阻止某些癌細胞的生長，比如hela,sk-br-3,sk-br-3-dox,l929,和melb16,但并不影響一些其他細胞的生長：hef,ovcar,hep2,hep2va3,和v79。我們的研究表明，asc/teta選擇性毒性包括的腫瘤細胞有：mcf-7、mda-mb-157、mda-mb-231，u87，hcc-9204，h1299，但對正常hs578bst，huvec細胞系和v79有輕微的毒性。總之，這些數(shù)據(jù)表明asc/teta選擇性地殺傷一些特定類型的癌細胞，包括雌激素受體呈陽性的mcf-7乳腺癌細胞。

為了研究乳腺癌細胞中asc/teta選擇性毒性機制，通過shrna調(diào)節(jié)了sod1和cat的表達。有趣的是，sod1的下調(diào)未能改善asc/teta對癌細胞的細胞毒性，相反，過度的過氧化氫酶能有效抑制由asc/teta誘導(dǎo)癌細胞死亡。這證實了h2o2而非o2·^-是asc/teta誘導(dǎo)細胞死亡的因素。此外，為了進一步研究sod1和cat在乳腺癌細胞中的表達模式是否干擾細胞活性，shrna分別敲降了sod1和cat。與正常細胞相比sod1在mcf-7細胞中過度表達，shsod1rna導(dǎo)致mcf-7的細胞活性顯著降低，這表明內(nèi)源性sod1是維持乳腺癌細胞生理功能的關(guān)鍵。可能sod1,h2o2對癌細胞是一個重要的分子信號。據(jù)了解，一定水平的過氧化氫促進癌細胞增殖和生長。此外，由于對cat在mcf-7細胞中的表達水平較低，我們下調(diào)了hs578bst細胞中的cat，顯示細胞活力增強。這表明低水平的cat可能有益于細胞，通過阻斷過氧化氫的消耗，從而保持有益的細胞內(nèi)h2o2濃度。

大量的研究表明，ras-erk通路與乳腺癌細胞的生長和轉(zhuǎn)移有關(guān)。我們的數(shù)據(jù)還表明，asc/teta抑制ras和erk的表達具有時間和劑量依賴性。也抑制隨后的癌細胞凋亡，通過細胞色素c和凋亡蛋白酶的釋放已證實，雖然單獨的teta或asc也有類似的作用。在這項工作中，我們也觀察到使用asc/teta聯(lián)用可以導(dǎo)致mcf-7內(nèi)h3整體乙酰化，這與mcf-7細胞活性和h2o2產(chǎn)生無關(guān)。已有證據(jù)表明，通過sirt1抑制而提高組蛋白乙?；T導(dǎo)了乳腺癌細胞凋亡，可能通過上調(diào)p21。因此，進一步探討在特定基因的啟動子區(qū)域的組蛋白修飾是否參與asc/teta誘導(dǎo)乳腺癌細胞凋亡這將非常有趣。此外，我們發(fā)現(xiàn)asc/teta聯(lián)用也導(dǎo)致mcf-7細胞的sod1下調(diào)，這與sod1shrna實驗結(jié)果一致，說明asc/teta組合抗乳腺癌的作用一定程度上受到sod1抑制所介導(dǎo)。盡管其他研究也表明asc可能通過akt和rhoa分別參與調(diào)控乳腺癌細胞的增殖和遷移，但目前還不清楚asc/teta是否有效地通過同樣的途徑，這值得進一步驗證。

細胞模型的異體移植實驗證實了我們的研究結(jié)果。asc/teta的使用顯著地減少了腫瘤尺寸和重量，然而裸鼠的內(nèi)臟器官沒有受到影響。這個結(jié)果證實了teta聯(lián)合asc抑制體內(nèi)乳腺癌作用顯著。然而，在實驗中asc使用的劑量是3g/kg體重，相比之前劑量較高。需要對asc/teta進一步的藥理學(xué)和藥代動力學(xué)研究來測出乳腺癌治療的最佳給藥方式和劑量。同樣地，在對乳腺癌小鼠模型實驗中，asc聯(lián)合其它天然混合物，包括賴氨酸，脯氨酸和綠茶提取物的治療能顯著減少腫瘤重量和抑制肺、脾、肝、腎和心臟的轉(zhuǎn)移。類似地在動物實驗中，包括asc的天然抗氧化混合物也顯示能有效抑制放射誘導(dǎo)的腫瘤。也有報道苯并a芘誘導(dǎo)的大鼠模型，asc的高劑量口服給藥表現(xiàn)出顯著的抑癌和延長壽命作用。

另外，h2o2介導(dǎo)的asc/teta對癌細胞凋亡的影響，協(xié)同抗氧化特性具有潛在的阻止正常細胞被細胞間或細胞外高含量ros損傷的作用。從其他團隊的研究結(jié)果表明，這些額外的抗腫瘤發(fā)生的作用可能是通過抑制hif1。然而，有證據(jù)表明，藥物asc可能有副作用。asc誘導(dǎo)的紅細胞的促凝血和凝血酶原激活，以及體內(nèi)血栓形成已被報道。癌癥患者的紅細胞表現(xiàn)出asc對血栓形成影響的極度靈敏，這表明靜脈注射vc治療需要小心地反復(fù)確認。asc的衍生物，6-脫氧-6-氯代-抗壞血酸，在抑制癌細胞增殖中表現(xiàn)出更有效的作用，更可能用于臨床治療乳腺癌。

總之，目前的研究工作表明，與teta協(xié)同asc治療乳腺癌增強了過氧化氫的生成，從而抑制了腫瘤發(fā)生的ras/erk信號通路和誘導(dǎo)細胞凋亡。

本發(fā)明的上述實施例僅僅是為說明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對本發(fā)明的實施方式的限定。對于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其他不同形式的變化和變動。這里無法對所有的實施方式予以窮舉。凡是屬于本發(fā)明的技術(shù)方案所引申出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明的保護范圍之列。