專利名稱：：制備阿卡波糖的滲透控制的發(fā)酵方法阿卡波糖是有效的α-葡糖苷酶抑制劑，用作口服治療糖尿病的抗糖尿病藥物，商品名為Glucobay。該活性化合物通過發(fā)酵獲得；產(chǎn)生菌為土壤微生物游動放線菌SE50/110或由其衍生的突變體。通常，諸如阿卡波糖之類的活性化合物的發(fā)酵制備不通過方法的優(yōu)化是不經(jīng)濟(jì)的。因此通常必需大大提高可以達(dá)到的發(fā)酵的時空得率?？梢杂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種方法提高收率。這些方法包括例如產(chǎn)生菌的誘變處理以及從存活的細(xì)胞中選擇高產(chǎn)突變體；這些改造的產(chǎn)生菌株可以再經(jīng)過該步驟。也常常可以加入分子生物學(xué)技術(shù)來改造菌種。另一重要的途徑是優(yōu)選生產(chǎn)培養(yǎng)基；其組分和定量組成必須使得達(dá)到最大產(chǎn)物收率。最后，通過將產(chǎn)生菌暴露于生長和產(chǎn)物生成的最適條件下(氧供應(yīng)、溫度、pH、切應(yīng)力等)的發(fā)酵步驟也可以有助于提高收率。本發(fā)明涉及最后提到的優(yōu)化策略，即改進(jìn)發(fā)酵條件。令人驚訝的是，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)發(fā)酵溶液的重量克分子滲透壓濃度-在微生物發(fā)酵中通常不考慮的參數(shù)-對阿卡波糖發(fā)酵的最終收率具有相當(dāng)大的作用。由于決定性的重量克分子滲透壓濃度的范圍根本不在極端范圍內(nèi)，而在例如200-600mosmol/kg的中等重量克分子滲透壓濃度范圍內(nèi)，即在培養(yǎng)微生物的營養(yǎng)溶液中通常達(dá)到的范圍內(nèi)，因此這更令人驚訝。由于例如人類血液的重量克分子滲透壓濃度值為大約400mosmol/kg，因此在該范圍內(nèi)的重量克分子滲透壓濃度通常被稱作完全生理性重量克分子滲透壓濃度。令人吃驚的是，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)不僅低營養(yǎng)溶液重量克分子滲透壓濃度(例如＜200mosmol/kg)顯著降低生產(chǎn)力，而且較高的營養(yǎng)溶液重量克分子滲透壓濃度(例如＞600mosmol/kg)也顯著降低生產(chǎn)力，在這類條件下通常阿卡波糖培養(yǎng)物甚至沒有產(chǎn)物生成。根據(jù)阿卡波糖產(chǎn)生菌的生產(chǎn)力顯著的對重量克分子滲透壓濃度依賴性，研制出用于次級代謝物阿卡波糖發(fā)酵的新控制策略，該控制策略迄今尚未用于可比較的微生物發(fā)酵中，特別是在工業(yè)方面。該控制策略的原理是通過以適當(dāng)方式加入滲透活性底物，將重量克分子滲透壓濃度保持在所需的最佳范圍內(nèi)?？梢曰蛘呙看畏峙尤氲孜铮蛘哌B續(xù)加入底物進(jìn)行補料分批發(fā)酵中。然而，令人驚訝的是，也可以以完全連續(xù)的方法進(jìn)行次級代謝物發(fā)酵，即加入含有一種或多種底物的營養(yǎng)溶液使重量克分子滲透壓濃度保持恒定；在該類型的連續(xù)發(fā)酵中，在培養(yǎng)物中產(chǎn)生穩(wěn)態(tài)重量克分子滲透壓濃度。討論的滲透活性底物最好是促進(jìn)培養(yǎng)的產(chǎn)生菌生長的物質(zhì)。這些物質(zhì)尤其包括C源、N源和鹽?；蛘邔⒏鞣N底物或者將底物混合物加入培養(yǎng)物中，以保持穩(wěn)定的重量克分子滲透壓濃度。因此，本發(fā)明包括兩個基本方面1.控制策略，其目標(biāo)是在阿卡波糖發(fā)酵的培養(yǎng)液中維持規(guī)定范圍的重量克分子滲透壓濃度。2.維持所需重量克分子滲透壓濃度范圍的方法，其特征在于，每次加入單一份數(shù)的底物或?qū)⒌孜镞B續(xù)加入補料分批發(fā)酵中，或在完全連續(xù)發(fā)酵中加入完全營養(yǎng)溶液。在優(yōu)化阿卡波糖發(fā)酵的努力中，考查不同方法變型對生產(chǎn)力的影響。發(fā)現(xiàn)營養(yǎng)溶液組成以及進(jìn)行發(fā)酵的方式兩者都影響產(chǎn)物的收率。在野生型菌株以及高產(chǎn)高性能突變體中觀察到的結(jié)果相同或相似。對于培養(yǎng)基，不同的營養(yǎng)溶液組合物可以成功地用于阿卡波糖發(fā)酵(Frommer等人，DE2614393)。通常最好使用含有碳源、維生素和微量元素、鹽和緩中物質(zhì)的營養(yǎng)溶液。其中一個適宜的碳源實例是麥芽糖，它形成阿卡波糖分子的一個結(jié)構(gòu)要素。由于經(jīng)濟(jì)原因，最好使用較便宜的碳源，諸如淀粉水解產(chǎn)物，它含有葡萄糖、麥芽糖和高級葡萄糖寡聚物。適宜的氮源是個別的氨基酸，例如谷氨酸或天門冬氨酸、蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物或蛋白質(zhì)提取物或高蛋白原材料(諸如大豆粉、土豆粉、麩質(zhì))或其它含蛋白質(zhì)或含多肽的復(fù)合底物。將磷酸鹽和鐵鹽加入營養(yǎng)溶液以及使用緩沖物質(zhì)(例如碳酸鈣)控制pH證明是有利的。通過復(fù)合營養(yǎng)溶液底物和/或通過自來水向營養(yǎng)溶液供應(yīng)微量元素。如果使用軟化水，最好加入微量元素濃縮液。對于發(fā)酵步驟，最好將pH保持在生理范圍內(nèi)，即pH5-8、并向培養(yǎng)物提供充足的氧氣，以便避免限制培養(yǎng)物的生長。在30℃左右的溫度范圍內(nèi)獲得最佳生產(chǎn)力。由于阿卡波糖產(chǎn)生菌是絲狀菌，另外最好在攪拌式發(fā)酵中避免極高的攪拌速度，因此最好避免不再能耐受的剪應(yīng)力。在優(yōu)化發(fā)酵的過程中，驚訝地發(fā)現(xiàn)由營養(yǎng)溶液產(chǎn)生的重量克分子滲透壓濃度對阿卡波糖的生產(chǎn)力具有顯著的影響。這種影響決不會恰好限制在極端數(shù)值，而是完全在生理范圍內(nèi)。還令人驚訝的是，不僅較高的重量克分子滲透壓濃度導(dǎo)致生產(chǎn)力的大大降低，而且低重量克分子滲透壓濃度也導(dǎo)致生產(chǎn)力的大大降低。圖1和圖2中該關(guān)系變得很清楚。最佳重量克分子滲透壓濃度為大約400mosmol/kg。＞500mosmol/kg或＜300mosmol/kg的值都引起可探測的生產(chǎn)力的降低，＞600mosmol/kg或＜200mosmol/kg的值引起生產(chǎn)力的非常顯著的降低；在某些情況下，特別是在所述重量克分子滲透壓濃度范圍的極限或極限之外的情況下，可能根本測量不到阿卡波糖的生產(chǎn)。由于低重量克分子滲透壓濃度通常對微生物代謝活性沒有消極影響，而微生物通常耐受相當(dāng)高的重量克分子滲透壓濃度，因此微生物的這種關(guān)系令人驚訝。重量克分子滲透壓濃度對阿卡波糖生產(chǎn)力的影響暗示，如果在發(fā)酵期間將重量克分子滲透壓濃度保持在合適的范圍內(nèi)，那么應(yīng)該能夠成功地優(yōu)化發(fā)酵。在微生物培養(yǎng)期間，一方面用消耗營養(yǎng)溶液的滲透活性底物，另一方面用在生長期間釋放到營養(yǎng)溶液中生成的滲透活性產(chǎn)物，來測定重量克分子滲透壓濃度的趨勢。在阿卡波糖分批發(fā)酵的情況下，圖3所示趨勢的結(jié)果是發(fā)酵開始時重量克分子滲透壓濃度為500mosmol/kg，即為已經(jīng)誘導(dǎo)生產(chǎn)力輕微抑制的值。在發(fā)酵期間，重量克分子滲透壓濃度降低，通過最適范圍，然后達(dá)到再導(dǎo)致生產(chǎn)力降低的值?，F(xiàn)已努力研制能夠滲透控制操作模式的控制策略。通常，將營養(yǎng)溶液底物加入微生物培養(yǎng)物中的目的是產(chǎn)生由底物濃度產(chǎn)生的規(guī)定的代謝狀態(tài)。在該過程中作出的努力通常是或者避免底物限制，或者產(chǎn)生規(guī)定的底物限制。然而，在本情況下，控制的目標(biāo)是通過加入滲透活性營養(yǎng)溶液組分維持規(guī)定的合適的重量克分子滲透壓濃度范圍；然而，同時必需小心不要由于加入底物無意中引起的過量底物濃度或過度不平衡的底物濃度引起不利影響。試驗滲透控制的操作方法的三個變型1.在發(fā)酵期間每次加入少量新鮮的營養(yǎng)溶液；這可以使重量克分子滲透壓濃度階段性地達(dá)到需要的最適值。2.在補料分批發(fā)酵期間，加入一種或多種底物；用該方法可以將重量克分子滲透壓濃度在整個發(fā)酵期間保持在合適的范圍內(nèi)。3.連續(xù)加入新鮮營養(yǎng)溶液并且連續(xù)取出含產(chǎn)物的培養(yǎng)肉湯的完全連續(xù)發(fā)酵；在這種情況下，重量克分子滲透壓濃度同樣可以在整個發(fā)酵期間保持在合適的范圍內(nèi)，同時在培養(yǎng)物中達(dá)到最適于阿卡波糖發(fā)酵的穩(wěn)態(tài)。每次加入少量新鮮營養(yǎng)溶液是實施技術(shù)簡單的方法。然而，該方法的缺點是，重量克分子滲透壓濃度只是階段性地適合，而加入相對大量的新鮮底物，在某些情況下，對生物合成的調(diào)控可以具有干擾效應(yīng)。后一方面尤其在生物合成途徑涉及次級代謝物的情況下是重要的。每次加入少量新鮮營養(yǎng)溶液在實驗室規(guī)模下在搖瓶中進(jìn)行。令人驚訝的是，通過分批加入單一份數(shù)的新鮮營養(yǎng)溶液，將培養(yǎng)肉湯的重量克分子滲透壓濃度成功地保持在被認(rèn)為是最佳范圍的350-450mosmol/kg范圍內(nèi)，因此顯著提高產(chǎn)物的收率。(圖4重量克分子滲透壓濃度的趨勢，而表1阿卡波糖的最終收率)。這樣，可以在幾個時間點(例如48小時和96小時后)加入相對大量的營養(yǎng)溶液，或可以以較短的時間間隔加入相對少量的營養(yǎng)溶液，這近似于連續(xù)加入。在中試規(guī)模下，在發(fā)酵期間連續(xù)加入營養(yǎng)溶液并進(jìn)行試驗。實施例2描述了該方法。所用的營養(yǎng)底物是例如通常用于營養(yǎng)溶液中的碳源(淀粉水解產(chǎn)物)。其它營養(yǎng)溶液組分(氮源、鹽)或多種營養(yǎng)溶液組分的組合物也可以以同樣方式使用。培養(yǎng)肉湯的重量克分子滲透壓濃度可以保持在大約350-450mosmol/kg的合適范圍內(nèi)(圖5)?？梢郧宄乜闯?，在發(fā)酵開始時通過在發(fā)酵中開始連續(xù)加入大約40小時，可以防止重量克分子滲透壓濃度的降低。相反，對照發(fā)酵方法(不在滲透控制下)的重量克分子滲透壓濃度在整個發(fā)酵期間降低，如圖3所示。表2表明，通過在補料分批發(fā)酵中連續(xù)加入營養(yǎng)溶液組分達(dá)到的滲透控制的發(fā)酵步驟，使得收率明顯提高。表1由控制重量克分子滲透壓濃度的發(fā)酵引起的收率的提高每次加入少量新鮮的營養(yǎng)溶液</tables>表2由控制重量克分子滲透壓濃度的發(fā)酵引起的收率的提高連續(xù)加入營養(yǎng)溶液底物</tables>實施例3描述了滲透控制的完全連續(xù)發(fā)酵的步驟。次級代謝物的完全連續(xù)發(fā)酵在許多情況下原則上是不可能的，因為由于代謝的調(diào)控現(xiàn)象，直到生長基本上停止或完全停止后才達(dá)到最大生產(chǎn)力。然而，生長與產(chǎn)物生成之間的平行是可行的連續(xù)培養(yǎng)的必要的先決條件。因此，在阿卡波糖發(fā)酵中，完全連續(xù)的操作模式可以成功地進(jìn)行必定被認(rèn)為是絕對驚奇的。圖6表明，培養(yǎng)肉湯中的重量克分子滲透壓濃度通過連續(xù)生產(chǎn)步驟保持在合適范圍內(nèi)。圖7所示的結(jié)果是，通過幾次體積的改變，分批發(fā)酵的生產(chǎn)力成功地保持在最大值上。對本發(fā)明而言，重要的是指出最適重量克分子滲透壓濃度是菌株特異性參數(shù)。通過菌種改造技術(shù)產(chǎn)生的不同高性能菌株的最適重量克分子滲透壓濃度可能不同。菌種改造的目標(biāo)甚至可能是產(chǎn)生最適重量克分子滲透壓濃度改變的高性能突變體。因此，本發(fā)明說明書中提到的重量克分子滲透壓濃度值只是舉例說明，可用于所用的生產(chǎn)菌株。對每個新產(chǎn)生的高性能突變體必須測定其最適重量克分子滲透壓濃度，必須進(jìn)行滲透控制的發(fā)酵，以便以描述過的方式維持最適重量克分子滲透壓濃度。實施例實施例1每次將少量新鮮營養(yǎng)溶液加入阿卡波糖發(fā)酵中的重量克分子滲透壓濃度的控制在11搖瓶中將阿卡波糖產(chǎn)生菌株培養(yǎng)在90ml以下營養(yǎng)溶液中淀粉水解產(chǎn)物100g/l，酵母膏7g/l，酪蛋白水解產(chǎn)物3g/l，CaCO33g/l，K2HPO43g/l，自來水，pH6.9。營養(yǎng)溶液在高壓滅菌器中于121℃滅菌10分鐘，然后用種子培養(yǎng)物接種，于30℃、搖床頻率為250rpm下培養(yǎng)。在48小時和72小時后或在48小時和96小時后，每次加入20ml濃縮1.5倍的上述特定組分的營養(yǎng)溶液。進(jìn)料溶液在高壓滅菌器中于121℃滅菌10分鐘。通過測定冰點降低每天測定一次重量克分子滲透壓濃度；用HPLC每天測定一次阿卡波糖含量。實施例2將營養(yǎng)溶液底物連續(xù)加入阿卡波糖發(fā)酵中的重量克分子滲透壓濃度的控制在3000l發(fā)酵罐中將阿卡波糖產(chǎn)生菌株培養(yǎng)在1600l以下營養(yǎng)溶液中淀粉水解產(chǎn)物100g/l，酵母膏7g/l，酪蛋白水解產(chǎn)物3g/l，CaCO33g/l，K2HPO43g/l，自來水，pH6.9。營養(yǎng)溶液用連續(xù)方法滅菌(150℃，52秒)，裝入預(yù)先滅菌的發(fā)酵罐中，用產(chǎn)生的種子培養(yǎng)物在300l發(fā)酵罐中培養(yǎng)，在以下條件下發(fā)酵溫度31℃，罐壓1.0-1.8巴，攪拌150-220rpm，通氣速率500-1000l/min。從第48小時開始，將淀粉水解產(chǎn)物溶液以大約3.2l/h的進(jìn)料速率連續(xù)進(jìn)料；溶液在自來水含有163kg淀粉水解產(chǎn)物(終體積233l)，并且已于121-125℃滅菌20分鐘。通過測定冰點降低每天測定一次重量克分子滲透壓濃度。用HPLC每天測定一次阿卡波糖含量。實施例3阿卡波糖連續(xù)發(fā)酵的重量克分子滲透壓濃度的控制在3000l發(fā)酵罐中將阿卡波糖產(chǎn)生菌株培養(yǎng)在1600l以下營養(yǎng)溶液中淀粉水解產(chǎn)物100g/l，L-天冬酰胺·2H2O20g/l，K2HPO43g/l，MgSO4·7H2O2g/l，F(xiàn)eCl3·6H2O1g/l，Mg3(PO4)2·8H2O2g/l，MnCl2·4H2O0.1g/l，CoCl2·6H2O0.1g/l，ZnCl20.1g/l，自來水，pH6.8。營養(yǎng)溶液用連續(xù)方法滅菌(150℃，52秒)，裝入預(yù)先滅菌的發(fā)酵罐中，用產(chǎn)生的種子培養(yǎng)物在300l發(fā)酵罐中培養(yǎng)，在以下條件下進(jìn)行發(fā)酵溫度31℃，罐壓1.0-1.8巴，攪拌150-220rpm，通氣速率500-1000l/min。從第48小時開始，將淀粉水解產(chǎn)物溶液以大約3.2l/h的進(jìn)料速率連續(xù)進(jìn)料；溶液在自來水含有163kg淀粉水解產(chǎn)物(終體積233l)，并且已于121-125℃滅菌20分鐘。96小時后，從正運行的發(fā)酵中取出一份200l的培養(yǎng)肉湯，在無菌條件下轉(zhuǎn)移至預(yù)先滅菌的300l發(fā)酵罐中。然后以每天0.33倍發(fā)酵罐體積的流速將新鮮營養(yǎng)溶液連續(xù)送入該培養(yǎng)物中。從發(fā)酵罐中以同樣的速率取出含有產(chǎn)物的培養(yǎng)肉湯。按實施例2測定重量克分子滲透壓濃度和阿卡波糖。權(quán)利要求1.制備阿卡波糖的發(fā)酵方法，其特征在于，設(shè)定重量克分子滲透壓濃度并將其維持在200-600mosmol/kg的范圍內(nèi)。2.按照權(quán)利要求1的方法，其特征在于，設(shè)定重量克分子滲透壓濃度并將其維持在300-500mosmol/kg的范圍內(nèi)。3.制備阿卡波糖的發(fā)酵方法，其特征在于，在發(fā)酵過程中將一種或多種營養(yǎng)溶液組分加入生成阿卡波糖的培養(yǎng)物中。4.按照權(quán)利要求3的方法，其特征在于，加入一種或多種營養(yǎng)溶液組分使得培養(yǎng)物中的重量克分子滲透壓濃度保持在200-600mosmol/kg的范圍內(nèi)。5.按照權(quán)利要求3的方法，其特征在于，加入一種或多種營養(yǎng)溶液組分使得培養(yǎng)物中的重量克分子滲透壓濃度保持在300-500mosmol/kg的范圍內(nèi)。6.按照權(quán)利要求3-5的方法，其特征在于，以分批形式每次將一份的該營養(yǎng)溶液組分或幾種營養(yǎng)溶液組分加入培養(yǎng)物中。7.按照權(quán)利要求3-5的方法，其特征在于，將該營養(yǎng)溶液組分或幾種營養(yǎng)溶液組分連續(xù)加入培養(yǎng)物中。8.按照權(quán)利要求3-5的方法，其特征在于，將該營養(yǎng)溶液組分或幾種營養(yǎng)溶液組分連續(xù)加入培養(yǎng)物中，并從培養(yǎng)物中連續(xù)取出含產(chǎn)物的培養(yǎng)肉湯。9.制備阿卡波糖的發(fā)酵方法，其特征在于，分次每次從培養(yǎng)物中取出少量含產(chǎn)物的培養(yǎng)溶液，然后再分次每次將少量新鮮營養(yǎng)溶液加入培養(yǎng)物中。10.制備阿卡波糖的發(fā)酵方法，其特征在于以補料分批法進(jìn)行發(fā)酵，分批加入或連續(xù)加入進(jìn)料底物溶液。11.制備阿卡波糖的發(fā)酵方法，其特征在于以連續(xù)法進(jìn)行發(fā)酵。全文摘要本發(fā)明涉及制備阿卡波糖的新發(fā)酵方法。通過監(jiān)測和控制發(fā)酵溶液中的重量克分子滲透壓濃度可以大幅度地提高發(fā)酵的收率。文檔編號A61K31/70GK1178837SQ9711862公開日1998年4月15日申請日期1997年9月12日優(yōu)先權(quán)日1996年9月13日發(fā)明者J·博寧克,M·施德爾,U·斯特勒爾申請人:拜爾公司