腸道宏基因組特征作為2型糖尿病阿卡波糖療效篩選標志的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明具體涉及一種腸道微生物宏基因特征在作為2型糖尿病阿卡波糖療效篩 選標志物中的用途。
【背景技術】
[0002] 目前2型糖尿病治療領域并沒有藥物療效判斷，以及治療前的分型診斷。根據(jù)2 型糖尿病的病理生理機制，主要為胰島素抵抗和胰島素分泌缺陷。雖然2型糖尿病治療領 域內(nèi)分別有針對胰島素抵抗和胰島素分泌缺陷的藥物，但是對于患者本身以胰島素抵抗還 是分泌缺陷為主的分型診斷并沒有科學簡便可行的方法。
[0003] 現(xiàn)有臨床上有可行性的方案是，測量患者BMI，腰圍和胰島素水平。BMI，腰圍超過 中國人標準，或者通過患者空腹血糖和胰島素水平計算H0MAIR值即可判斷其存在胰島素 抵抗。而胰島素水平并無國際或國內(nèi)通用標準，一般以患者血糖和胰島素計算得ΗΟΜΑβ指 數(shù)來代表，但無法做為判斷胰島素抵抗和胰島素分泌缺陷的程度的指標，因此無法滿足精 準醫(yī)療的要求。
[0004] 臨床上目前能夠精確評判胰島素抵抗和β細胞功能的實驗為葡萄糖鉗夾實驗。 評判胰島素抵抗水平運用正糖高胰島素水平的葡萄糖鉗夾實驗，而β細胞胰島素分泌功 能運用高葡萄糖水平的鉗夾實驗。這兩種方法歷時長，患者需臥床4-5個小時，需名有經(jīng)驗 的醫(yī)護人員操作，對患者進行多點采血，實時監(jiān)測血糖，同時測定胰島素水平。代價高昂，患 者依從性差，不易在臨床開展。
[0005] 所謂精準醫(yī)學把臨床個體化診療的訴求提到了一個新的高度。腫瘤靶向藥物已經(jīng) 應用到臨床。然而，迄今并未找到一個2型糖尿病靶向治療的有效方案。2型糖尿病的治療 方案繁多，患者反應不一，是導致2型糖尿病的血糖控制率低下的一個原因。針對2型糖尿 病主要發(fā)病機制，胰島素分泌缺陷和胰島素抵抗的藥物種類不可謂不多，但是患者本身以 胰島素抵抗為主，還是胰島素分泌缺陷為主并沒有簡單確切的臨床診斷方法。
[0006]目前的研究把肝臟、脂肪（胰島素抵抗）和胰島β細胞（胰島功能）做為參 與2型糖尿病發(fā)病的主要器官。而最近腸道微生物群落以及腸道粘膜上皮吸收，屏障以 及內(nèi)分泌功能的病理生理在2型糖尿病的發(fā)病機制以及治療策略中的地位越來越受到重 視。比如腸道菌群宏基因組研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群在2型糖尿病患者和正?；颊咧杏酗@著 差異[Qin，J.，etal. ,Ametagenome-wideassociationstudyofgutmicrobiotain type2diabetes.Nature, 2012.]而腸道改道的減肥手術除了減輕肥胖患者的體重，出乎意 料得可使得肥胖型2型糖尿病患者的血糖在術后脫離藥物治療也能得到良好的控制，甚至 達到徹底治愈[Carlsson，L.M.S·，etal·，BariatricSurgeryandPreventionofType 2DiabetesinSwedishObeseSubjects.NewEnglandJournalofMedicine, 2012. 367 (8):p.695-704,Schauer,P.R. ,etal. ,Bariatricsurgeryversusintensivemedical therapyfordiabetes-3-yearoutcomes.NEnglJMed, 2014. 370(21):p. 2002-13]。而 模擬腸道激素作用的藥物，比如GLP-1激動劑以及DPPIV抑制劑等也已成為世界范圍內(nèi)處 方量最大的口服降糖藥物，并有不少相關心血管的受益。
[0007] 腸型[Arumugam,M. ,etal. ,Enterotypesofthehumangutmicrobiome. Nature, 2011. 473 (7346) :p. 174-80]的概念被PeerBork首次提出，意即腸道寄生菌組成 成分在人群中有比較固定的模式。人群中大概可以分成2-3類，隨著樣本的增多和測序技 術的提高，尤其是二代測序的推廣，目前的腸型分型為2類，一個普氏菌屬為主的普氏腸 型，一個是擬桿菌屬為主的擬桿腸型。目前看來腸型和人體的各種醫(yī)療健康指標并未找到 直接相關的證據(jù)，相應的基因功能研究提示不同腸型代謝維生素的能力有差異，且與宿主 葷素飲食習慣有關。然而，雖然腸道寄生菌群也被認為是參與藥物在人體內(nèi)代謝的一個 重要媒介[Haiser，H.J.andP.J.Turnbaugh,Isittimeforametagenomicbasisof therapeutics?Science, 2012. 336(6086) :p. 1253-5],目前無臨床試驗證據(jù)可以證明。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的在于針對上述現(xiàn)有技術存在的腸型和人體的各種醫(yī)療健康指標缺 少直接相關的證據(jù)的缺陷，提供了腸道宏基因組特征作為2型糖尿病阿卡波糖療效篩選標 志；具體提供了一種腸道微生物宏基因特征在作為2型糖尿病阿卡波糖療效篩選標志物中 的用途。本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)具有不同腸道寄生菌群的2型糖尿病患者，對糖尿病降糖藥物，阿 卡波糖的治療反應差別顯著，因而，以擬桿菌屬為主的擬桿腸型可作為2型糖尿病患者阿 卡波糖療效篩選標志。
[0009] 本發(fā)明的目的是通過以下技術方案來實現(xiàn)的：
[0010] 本發(fā)明涉及一種腸道微生物宏基因特征在作為2型糖尿病阿卡波糖療效篩選標 志物中的用途，所述腸道微生物宏基因特征為擬桿菌屬腸型。
[0011] 優(yōu)選的，所述擬桿菌屬腸型是通過對離體糞便中的寄生菌的DNA進行測序或PCR 擴增來確定的。
[0012] 優(yōu)選的，所述PCR擴增具體包括：提取離體糞便中寄生菌DNA，針對特異富集的菌 屬，進行16SrnaPCR擴增。
[0013] 優(yōu)選的，所述擬桿菌屬腸型是通過檢測離體血液樣本中的次級膽汁酸來確定的。 所述次級膽汁酸包括UDCA、TUDCA、GUDCA、DCA、TDCA、⑶CA、LCA、TLCA、GLCA。在本發(fā)明研究 的對象中，主要發(fā)現(xiàn)兩種腸型一個普氏菌為主的普氏腸型，一個是擬桿菌為主的擬桿腸型。 在擬桿腸型中，次級膽汁酸中的脫氧膽酸和石膽酸水平顯著低于普氏腸型，而有保護作用 的熊脫氧膽酸則高于普氏腸型。進一步腸道宏基因組分析，也發(fā)現(xiàn)熊去氧膽酸進一步降解 成石膽酸的K0明顯在普氏腸型中富集。說明兩種腸型的患者，其腸道菌群代謝膽汁酸的能 力有顯著差異。
[0014] 優(yōu)選的，所述次級膽汁酸的檢測包括如下步驟：
[0015]S1、樣品預處理：每75μL血液樣品，加入300μL含內(nèi)標甲醇，提取目標化合物并 沉淀蛋白，渦旋、離心，吸取上清，凍干，用50μL含25 % (體積）乙腈水溶液復溶，等待進 樣；
[0016]S2、檢測：采用1290Infinity液相及6460Α三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)用于樣品分 析；
[0017] 液相分離采用 100mmX2. 1mmACQUITYUPLCC8 色譜柱，粒徑L7μL?，Α相為 10mM NH4HC03水溶液，B相為純乙腈；初始時25% (體積）B相，保持0. 5分鐘，隨后在12. 5分鐘 內(nèi)線性升高到40% (體積）B相，接著，在lmin內(nèi)升高到90% (體積）B相，并沖洗系統(tǒng)3 分鐘，在0. 5分鐘恢復到25 % (體積）B相，平衡2. 5分鐘，流速為0. 35ml/min，柱溫35°C， 進樣體積5μL;
[0018] 質(zhì)譜采用ESI源負離子模式檢測，主要參數(shù)如下：GasTemp:350°C;Gas Flow:81/min；Nebulizer:40psi；SheathGasTemp:400°C；SheathGasFlow:81/min； Capillary:3500V；Nozzlevoltage:400V〇
[0019] 優(yōu)選的，擬桿菌屬腸型的2型糖尿病患者阿卡波糖療效包括降糖外改善胰島素抵 抗、降低次級膽汁酸、促進心血管風險降低。
[0020] 優(yōu)選的，所述降低有害次級膽汁酸的指標包括：GDCA，TDCA，TLCA，降低?；撬峤Y合 膽汁酸指標包括，TCA，TDCA，TLCA，TUDCA。
[0021] 優(yōu)選的，所述改善胰島素抵抗的指標包括空腹血糖下降，空腹C肽和胰島素水平 的下降，腰臀比下調(diào)，Η0ΜΑ胰島素抵抗指數(shù)下調(diào)，Adiponectin上調(diào)。
[0022] 優(yōu)選的，所述促進心血管風險降低的指標包括TOGFAA、TOGFAABB、內(nèi)皮素、VegfC 血漿因子的下降。
[0023] 本發(fā)明還涉及一種用于2型糖尿病阿卡波糖療效篩選的試劑盒，所述試劑盒包 括：
[0024] 收集離體糞便樣品或離體血液樣品的試劑；
[0025] 對離體糞便樣