糖尿病生物標(biāo)記物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明已根據(jù)CD4初始(CD45RO-CD62L+)與中樞記憶(CD45RO+CD62L+)的比率和CD4中樞記憶T細(xì)胞亞群的水平而發(fā)現(xiàn)一種新的1型糖尿病中自身胰島素產(chǎn)生下降的標(biāo)記物。一種在受試者中診斷自身免疫和其進(jìn)行性，更確切來說診斷糖尿病、前糖尿病、對糖尿病的易感性或療法/干預(yù)模態(tài)對一種或多種這些病狀的有效性水平的方法，所述方法可以通過以下方式進(jìn)行：通過對從受試者提取的樣品進(jìn)行免疫熒光分析確定CD4初始(CD45RO-CD62L+)T細(xì)胞的水平；通過對從受試者提取的樣品進(jìn)行免疫熒光分析確定CD4中樞記憶(CD45RO+CD62L+)T細(xì)胞的水平；以及定量地關(guān)聯(lián)所述CD4初始T細(xì)胞和中樞記憶T細(xì)胞的所述水平，其中CD4初始T細(xì)胞與CD4中樞記憶T細(xì)胞的低比率和/或高CD4中樞記憶T細(xì)胞表明自身免疫、對自身免疫的易感性、糖尿病、前糖尿病、對糖尿病的易感性或治療對一種或多種這些病狀的無效性。
【專利說明】糖尿病生物標(biāo)記物
[0001] 相關(guān)申請的交叉引用
[0002] 本申請要求2012年5月24日提交的美國臨時申請?zhí)?1/651，144的優(yōu)先權(quán)，所述 美國臨時申請以全文引用方式并入本文。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003] 本發(fā)明一般來講涉及自身免疫、糖尿病領(lǐng)域，并且更具體來說，涉及1型糖尿病和 免疫標(biāo)記物。

【背景技術(shù)】
[0004] 1型糖尿病（TlDM)最常見的形式是免疫介導(dǎo)的疾病，其中的胰島素分泌β細(xì)胞被 自身免疫應(yīng)答破壞。若干遺傳和環(huán)境因素都與所述疾病的發(fā)病相關(guān)，這涉及到特異性靶向 胰島素分泌β細(xì)胞的免疫細(xì)胞對胰島的進(jìn)行性炎性浸潤。這種病變在臨床發(fā)病前（前糖 尿?。┑囊欢尾淮_定時間（幾個月到幾年）形成并且在患者被診斷患有所述疾病之后繼續(xù) 發(fā)展。
[0005] 目前有一種方法使用抗體篩選和診斷T1DM。只要所述特異性抗體存在，隨著時間 的過去，顯性糖尿病往往就會發(fā)展。GAD65自身抗體（GAA)、ICA512自身抗體（ICA512AA) 或抗胰島素自身抗體（IAA)中一種或多種的表達(dá)與發(fā)展TlDM的風(fēng)險相關(guān)。GAD65自身 抗體（GAA)、ICA512自身抗體（ICA512AA)或抗胰島素自身抗體（IAA)中兩種或兩種以 上的表達(dá)與發(fā)展TlDM的高風(fēng)險相關(guān)。（Liping Yu等，Diabetes 2001年8月，第50卷， 第 8 期，1735-1740 ;Verge CF 等，Diabetes 45:926-933, 199 ;Verge CR 等，Diabetes 47:1857-1866, 1998 和 Bingley PJ 等，Diabetes 43:1304-1310,1994)。
[0006] 然而，這種篩選對于個體患者來說用處有限。雖然抗體篩選能夠檢測TlDM風(fēng)險的 增加水平，但是所述風(fēng)險是基于總的群體并且不能告知個體患者疾病是否會在例如接下來 幾個月發(fā)病或者所述個體是否可能會在接下來5至10年不患糖尿病。自身免疫破壞的強(qiáng) 度因不同患者而異。因此，需要一種會告知個體發(fā)展TlDM的個人風(fēng)險并且能夠指出疾病發(fā) 病的時間范圍的診斷方法。
[0007] 還需要改善分析TlDM自身免疫治療的主要終點(diǎn)。治療要從FDA得到管理批準(zhǔn)，臨 床試驗(yàn)必須在合適的主要終點(diǎn)顯示統(tǒng)計(jì)上顯著的影響。這種治療效果優(yōu)選表現(xiàn)一些顯而易 見和臨床上顯著的益處。在預(yù)防TlDM的治療的情況下，臨床疾病的延遲或不發(fā)展（這使這 些試驗(yàn)長達(dá)5或10年）。在干預(yù)患有臨床疾病的患者的情況下，合適的主要終點(diǎn)與代謝控 制和糖尿病并發(fā)癥相關(guān)。最常應(yīng)用而代謝主要終點(diǎn)-未達(dá)到治愈-是自身胰島素產(chǎn)生的 測量（刺激的C肽作為保留β-細(xì)胞功能的替代標(biāo)記物），其它的是HbAlc和胰島素使用。 TlDM患者中β -細(xì)胞功能的改善能夠預(yù)測更好的短期和長期臨床結(jié)果，這可能花費(fèi)幾年來 評估。對于TlDM和并發(fā)癥的治療，可以直接監(jiān)測血糖水平并且可以通過糖基化血紅蛋白 (例如HbAlc)的水平監(jiān)測改善的血糖控制，這已經(jīng)證明與短期和長期糖尿病并發(fā)癥相關(guān)。
[0008] 對于希望在疾病的后臨床階段中維持β細(xì)胞功能的治療來說，已經(jīng)使用刺激的C 肽濃度來測量TlDM的發(fā)展（Palmer JP等，Diabetes2004;53:250-264)。然而，使用C肽濃 度需要長期進(jìn)行重復(fù)的侵入性檢測（所謂的混合餐耐量試驗(yàn)），因此所述試驗(yàn)持續(xù)很長時 間以允許評估降低β-細(xì)胞功能并且因此降低C肽濃度的疾病的發(fā)展。
[0009] 因此，需要更好的標(biāo)記物作為試驗(yàn)的主要終點(diǎn)（預(yù)防和干預(yù)試驗(yàn)兩者）以及需要 更好的標(biāo)記物以便能夠更迅速和可靠地指出TlDM自身免疫的進(jìn)行性，從而分出前糖尿病 和糖尿病病狀的階段。還需要更好的分析法以便能夠測量治療TlDM的療法的有效性和/ 或檢測并發(fā)癥。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 已根據(jù)CD4初始（CD45RO-CD62L+) T細(xì)胞亞群與中樞記憶（CD45RO+CD62L+) T細(xì)胞 亞群的比率和在中樞記憶（⑶45RO+⑶62L+)T細(xì)胞亞群水平而發(fā)現(xiàn)一種新的1型糖尿病中 自身胰島素產(chǎn)生下降的標(biāo)記物。在受試者中診斷糖尿病、前糖尿病、對糖尿病的易感性或療 法對一種或多種這些病狀的有效性的方法可以通過如下方式進(jìn)行：通過對從患者提取的樣 品進(jìn)行免疫熒光分析確定⑶4初始（⑶45RO-⑶62L+) T細(xì)胞的水平；通過對從患者提取的樣 品進(jìn)行免疫熒光分析確定CD4中樞記憶（CD45RO+CD62L+)T細(xì)胞的水平，以及定量地關(guān)聯(lián)所 述⑶4初始T細(xì)胞和⑶4中樞記憶T細(xì)胞的水平，其中⑶4初始T細(xì)胞與⑶4中樞記憶T 細(xì)胞的低的或降低的比率，或高的或增加的CD4中樞記憶T細(xì)胞水平表明自身免疫疾病、前 自身免疫疾病、對自身免疫的易感性或治療對一種或多種這些病狀的無效性。在前糖尿病 情形中，TlDM特異性自身抗體的存在表明TlDM自身免疫本身的存在。因此，在本發(fā)明的一 個方面中，本文中描述的方法與確定是否存在糖尿病自身抗體組合使用。
[0011] 在本發(fā)明的一個方面中，公開了在受試者中確定療法對糖尿病和前糖尿病病狀的 有效性的方法，所述方法包括以下步驟：在受試者中開始療法，從所述受試者提取樣品，在 所述樣品中測量⑶4 T細(xì)胞初始（⑶45RO-⑶62L+)亞群與中樞記憶（⑶45RO+⑶62L+)亞群 的比率和/或CD4中樞記憶T細(xì)胞的水平，以及評估所述療法的有效性，其中在所述療法期 間比率的增加和/或低的/下降的CD4中樞記憶T細(xì)胞表明治療有效。
[0012] 在其它實(shí)施方案中，所述方法可以包括在所述受試者中開始療法，從所述受試者 提取樣品，測量所述樣品中的⑶4 T細(xì)胞中樞記憶（⑶45RO+⑶62L+)亞群，以及評估所述療 法的有效性，其中在所述療法期間低的或降低的CD4中樞記憶T細(xì)胞水平或CD4初始T細(xì) 胞與CD4中樞記憶T細(xì)胞亞群的高的或增加的比率表明治療有效。
[0013] 一些實(shí)施方案提供在受試者中監(jiān)測如糖尿病的自身免疫疾病的干預(yù)效果的方法， 所述方法包括：選擇經(jīng)歷自身免疫疾病或病狀治療的受試者，從所述受試者提取樣品，在所 述樣品中測量⑶4中樞記憶（⑶45RO+⑶62L+) T細(xì)胞亞群以及任選地測量⑶4 T細(xì)胞初始 (CD45RO-CD62L+)亞群，以及評估所述療法的有效性，其中在所述療法期間低的或降低的 ⑶4中樞記憶T細(xì)胞水平或⑶4初始T細(xì)胞與⑶4中樞記憶T細(xì)胞亞群的高的或增加的比 率表明治療有效。所述樣品是例如在療法開始之前（或在療法開始之后但是在細(xì)胞群體中 的變化起始之前）以及在療法進(jìn)行大約三個月和/或六個月時從所述受試者提取。
[0014] 在其它實(shí)施方案中，提供一種在受試者中診斷自身免疫疾病、前自身免疫疾病、對 自身免疫疾病的易感性或療法對一種或多種這些病狀的有效性的方法，所述方法包括：選 擇患有或疑似患有自身免疫疾病、前自身免疫疾病或具有對自身免疫疾病的易感性的受 試者，通過對從所述受試者提取的樣品進(jìn)行免疫熒光分析確定CD4初始（CD45R0-CD62L+) T細(xì)胞的水平；通過對從所述受試者提取的樣品進(jìn)行免疫熒光分析確定CD4中樞記憶 (⑶45R0+⑶62L+) T細(xì)胞的水平，以及定量地關(guān)聯(lián)所述⑶4初始T細(xì)胞和⑶4中樞記憶T細(xì) 胞的水平，其中CD4初始T細(xì)胞與CD4中樞記憶T細(xì)胞的低的或降低的比率，或高的或增加 的CD4中樞記憶T細(xì)胞水平表明自身免疫疾病、前自身免疫疾病、對自身免疫的易感性或治 療對一種或多種這些病狀無效。
[0015] -些實(shí)施方案提供一種確定直到自身免疫疾病發(fā)病的時間的方法，所述方法包 括：獲得具有對所述自身免疫病狀為特異性的自身抗體的受試者；從所述受試者提取一個 或多個樣品；在所述樣品中測量中樞記憶（CD45RO+CD62L+)T細(xì)胞亞群水平以及任選地測 量CD4 T細(xì)胞初始（CD45RO-CD62L+)亞群水平，以及計(jì)算兩個或更多個樣品之間或在不同 時間點(diǎn)對一個樣品進(jìn)行的兩個或更多個測量之間的所述CD4中樞記憶T細(xì)胞亞群水平的變 化和/或所述CD4初始T細(xì)胞與CD4中樞記憶T細(xì)胞亞群的比率的變化，其中所述比率的 降低和/或較高的CD4中樞記憶T細(xì)胞水平與自身免疫疾病發(fā)病的較短時間相關(guān)。舉例來 說，Log中樞記憶從基線的每個單位的增加都與C肽濃度的大約-0. 178ng/mL的隨后降低 相關(guān)。這種相關(guān)性可以用來測量和預(yù)測C肽水平下降的速度，因?yàn)檫@些T細(xì)胞群體中的數(shù) 量變化預(yù)示將要發(fā)生的C肽水平的數(shù)量變化。
[0016] -些實(shí)施方案提供一種確定不同干預(yù)模態(tài)（如用于糖尿病的不同臨床試驗(yàn)）的 有效性水平的方法。這種方法包括在受試者中開始療法，從所述受試者提取樣品，在所述 樣品中測量⑶4中樞記憶（⑶45R0+⑶62L+)T細(xì)胞亞群以及任選地測量⑶4 T細(xì)胞初始 (CD45R0-CD62L+)亞群，以及評估并且比較不同干預(yù)的有效性，其中所述比率的增加和/或 較低的CD4中樞記憶T細(xì)胞水平與較有效的干預(yù)相關(guān)。因此，提供了一種可靠地并且定量 地比較兩種或更多種不同臨床試驗(yàn)的活性臂（active arms)中所使用干預(yù)模態(tài)的有效性的 方式。
[0017] -些實(shí)施方案提供一種針對自身免疫的靶向藥物開發(fā)方法，所述方法包括：從一 個或多個受試者提取樣品，在所述樣品中分離中樞記憶（CD45R0+CD62L+)T細(xì)胞亞群以及 任選地分離⑶4 T細(xì)胞初始（⑶45R0-⑶62L+)亞群，以及根據(jù)這些細(xì)胞的疾病特異性特征 開發(fā)特異性地靶向這些細(xì)胞或這些細(xì)胞的子集的藥物。
[0018] 本文中闡述和描述將顯而易見的實(shí)施方案的這些和其它特征。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019] 以下附圖構(gòu)成本說明書的一部分并且被包括來進(jìn)一步說明本發(fā)明的某些方面。通 過參考這些附圖中的一個或多個并結(jié)合本文中提出的特定實(shí)施方案的詳細(xì)描述可以更好 地理解本發(fā)明。
[0020] 圖1是展示與基線相比在先前隨訪時T細(xì)胞中每單位變化的C肽損失降低的圖 表。展示了中樞記憶的降低和初始/中樞比率的增加。
[0021] 圖2A至2D展示⑶4 T細(xì)胞子集從基線的變化百分比，其標(biāo)識為（圖2A)初始群 體和（圖2B)中樞記憶群體以及（圖2C)初始：中樞記憶的比率和（圖2D) Treg群體，這 都是在治療開始（"〇個月"）之后以指定的時間間隔來測量。最后的治療是在第24個月。 實(shí)心圓圈是阿巴西普（abatac印t)治療的，空心圓圈是安慰劑；符號表示平均值，誤差線表 示95%置信區(qū)間。P值和虛線表明兩個組在所指時間點(diǎn)顯著不同。

【具體實(shí)施方式】
[0022] 1型糖尿?。═lDM)最常見的形式是免疫介導(dǎo)疾病，其中胰島素分泌β細(xì)胞被自身 免疫應(yīng)答破壞。T細(xì)胞在與TlDM相關(guān)的自身免疫中扮演核心角色。為了變得完全激活，據(jù) 信這些細(xì)胞需要至少兩種關(guān)鍵信號。（Marelli-Berg FM, Okkenhaug Κ, Mirenda V. A Trends Immun〇12007 ;28:267-73)。第一信號是在抗原呈遞細(xì)胞上的MHC分子的凹槽中的抗原與 T細(xì)胞受體之間的相互作用。第二信號是抗原遞呈細(xì)胞上的CD80和CD86與T細(xì)胞上的 CD28之間的相互作用。這種共刺激第二信號是細(xì)胞完全激活需要的，并且沒有它細(xì)胞就不 能起作用。因此，已經(jīng)有人建議將共刺激阻斷作為自身免疫和移植的治療模態(tài)。（Bluestone JA, StClair Eff, Turka LA. Immunity 2006 ；24:233-38)〇
[0023] 初始T淋巴細(xì)胞移動到二級淋巴器官的T細(xì)胞區(qū)域?qū)ふ铱乖f呈細(xì)胞（APC-s)所 呈遞的抗原。一旦被激活，它們就迅速增殖，從而產(chǎn)生的效應(yīng)細(xì)胞，所述效應(yīng)細(xì)胞能夠迀移 到發(fā)炎組織以對抗感染或在自身免疫的情況下破壞組織。在抗原清除時，一小部分的初始/ 激活T淋巴細(xì)胞繼續(xù)作為循環(huán)記憶細(xì)胞，從而能夠正常帶來保護(hù)并且在二次激發(fā)時提供增 強(qiáng)的應(yīng)答。兩種主要類型的記憶T細(xì)胞保留：巡視淋巴器官的中樞記憶細(xì)胞，和充當(dāng)如皮膚 和內(nèi)臟的外周組織中的前哨細(xì)胞的效應(yīng)記憶細(xì)胞。
[0024] 1型糖尿?。═lDM)自身免疫是受激活T淋巴細(xì)胞驅(qū)動。阿巴西普是一種共刺激 調(diào)節(jié)劑并且阻斷完全的T淋巴細(xì)胞激活。已在新近確診的患者的隨機(jī)雙盲試驗(yàn)中評估了 施用兩年阿巴西普的效果。在兩年中，阿巴西普顯著地減緩β細(xì)胞功能的降低。這個試 驗(yàn)的初步結(jié)果已經(jīng)在The Lancet上發(fā)表，文章標(biāo)題為"Co-stimulation modulation with abatacept in patients with recent-onset Type ldiabetes: a randomized, double-bl ind, placebo-controlled trial"（2011年6月28日在線公布）。這篇論文作為附錄A予 以包括并且是當(dāng)前提交申請的一部分。
[0025] 已經(jīng)分析了多種T細(xì)胞標(biāo)記物與糖尿病病程的任何相關(guān)性（剩余胰島素分泌β細(xì) 胞的破壞）。對于用減緩具有糖尿病體液生物標(biāo)記物（GAA、ICA512AA、IAA)的患者中自身免 疫破壞的化合物所治療的患者來說，已發(fā)現(xiàn)在治療期間CD4 T細(xì)胞初始（CD45R0-CD62L+) 與中樞記憶（⑶45R0+⑶62L+)亞群比率從基線顯著增加，并且隨后在療法結(jié)束之后回到基 線。還發(fā)現(xiàn)用阿巴西普的治療通過降低⑶4 T中樞記憶（CD45R0+⑶62L+)細(xì)胞的水平顯著 地減緩C肽的下降。
[0026] 對于未受治療來減緩糖尿病病程（剩余胰島素分泌β細(xì)胞的破壞）的患者來說， 發(fā)現(xiàn)較高的中樞記憶T細(xì)胞顯著地與隨后的C肽下降相關(guān)。因此，治療組中的這些T細(xì)胞 的降低與C肽下降的較慢速率顯著相關(guān)，并且這種T免疫細(xì)胞亞群（中樞記憶T細(xì)胞）可 被用作自身胰島素產(chǎn)生下降的替代免疫標(biāo)記物。
[0027] 因此，假設(shè)阿巴西普阻斷初始細(xì)胞被激活，并且與⑶4記憶T細(xì)胞相比，更高濃度 的CD4初始T細(xì)胞的存在表明化合物對于延遲前糖尿病受試者的TlDM發(fā)病是有效的，并且 對于延遲TlDM患者的胰島素產(chǎn)生的下降是有效的。阿巴西普通過降低⑶4中樞記憶T細(xì)胞 水平對自身免疫發(fā)揮其作用，因?yàn)樗钄郈D4初始到CD4中樞記憶T細(xì)胞的激活過程。這 種生物標(biāo)記物也可以在不存在如阿巴西普的化合物時，以用于診斷糖尿病或前糖尿病的進(jìn) 行性（聯(lián)用糖尿病抗體）以及確定對快速進(jìn)展的糖尿病的易感性。這種標(biāo)記物可以監(jiān)測自 身免疫破壞的強(qiáng)度和侵害性、胰島素分泌β細(xì)胞損失的速度。
[0028] 本文中描述的生物標(biāo)記物分析可以聯(lián)合已知的抗體測試來提供。這種組合提供對 糖尿病的易感性以及發(fā)病的時間框的測定。臨床發(fā)病后，它可以預(yù)測達(dá)到全部喪失自身胰 島素產(chǎn)生的時間-達(dá)到"完全糖尿病"的時間。
[0029] C肽是充當(dāng)胰島素原中的結(jié)構(gòu)連接的31氨基酸肽。它在胰島素原被酶催化裂解 時連同胰島素一起釋放進(jìn)入循環(huán)中。因此，在TlDM患者中發(fā)現(xiàn)低水平到不可檢測水平的C 肽，而T2DM患者在其疾病早期往往具有高于正常的胰島素/C肽水平。然而，對于C肽水平 可以有幾個參考范圍，這取決于如所使用分析法的類型、患者年齡以及患者在試驗(yàn)之前是 否禁食等因素。任何已知的分析法都可以用來定量C肽，如放射免疫分析法（RIA)和免疫 化學(xué)發(fā)光分析法（ICMA)。在RIA方法中，可以使用山羊抗C肽測量C肽。所述抗體（也識 別胰島素原）與胰島素沒有交叉反應(yīng)性。所述試驗(yàn)的分析靈敏度一般是〇.125ng/ml并且 需要整夜禁食。RIA方法提供適于正常成年人的0. 5-2ng/mL的參考范圍。在ICMA方法中， 使用兩個孵育周期的競爭性免疫分析法來提供大約〇. 3ng/mL的分析靈敏度。ICM方法提 供適于正常成年人的0. 9-4ng/mL的參考范圍并且患者必須禁食。對于小于12歲的兒童， 參考范圍是0. 0至0. 3ng/mL。對于10-12歲的兒童，參考范圍是0. 4至3. 3ng/mL，而對于 17歲及以上的個體。（LAB CORP)。為了評估胰島素分泌β細(xì)胞產(chǎn)生胰島素的能力，使用食 物激發(fā)試驗(yàn)，最常用的試驗(yàn)稱為混合餐耐量試驗(yàn)（MMTT)，其中在2或4個小時的時間內(nèi)采集 幾個血液樣品用于C肽測量。
[0030] 如本文中使用的術(shù)語"受試者"是患有或預(yù)期患有自身免疫性疾病的人或其它動 物。因此，在某些實(shí)施方案中，受試者需要本文中提供的治療性治療。優(yōu)選的受試者是哺乳 動物。受試者的實(shí)例包括但不限于人、馬、猴、犬、貓、小鼠、大鼠、奶牛、豬、山羊和綿羊。在 一些實(shí)施方案中，"受試者"一般是患有或預(yù)期患有糖尿病的人患者。在一些實(shí)施方案中， "受試者"是已經(jīng)在過去的200、100或50天內(nèi)確診患有糖尿病的人患者。在一些實(shí)施方案 中，"受試者"是患有1型糖尿病的人患者。在一些實(shí)施方案中，"受試者"是前糖尿病的人 患者。在一些實(shí)施方案中，"受試者"是已經(jīng)新近確診患有糖尿病但是仍然具有殘余的β細(xì) 胞功能的人患者。在一些實(shí)施方案中，"受試者"是除了 1型糖尿病患有自身免疫的人患者。 這種自身免疫包括但不限于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和多發(fā)性硬化。
[0031] 患有或預(yù)期患有自身免疫疾病或病狀的受試者或患有或疑似患有自身免疫疾病、 前自身免疫疾病或?qū)ψ陨砻庖呒膊〉囊赘行缘娜丝梢酝ㄟ^根據(jù)自身免疫疾病的診斷標(biāo)準(zhǔn) 進(jìn)行評估來選擇。替代地或另外，這種患者群體可以通過評估已知與自身免疫疾病、前自身 免疫疾病或?qū)ψ陨砻庖呒膊〉囊赘行韵嚓P(guān)的任何遺傳標(biāo)記物或自身抗體或其它生物標(biāo)記 物來選擇。
[0032] 本文中使用的術(shù)語"治療"或"治療中"定義為對患者應(yīng)用或施用治療劑，或?qū)?自患者的分離組織或細(xì)胞系應(yīng)用或施用治療劑，所述患者患有疾病、疾病的癥狀或有患病 傾向。希望治療涵蓋預(yù)防疾病發(fā)生、減緩疾病病程、使疾病逆轉(zhuǎn)或緩解、改善或影響疾病、癥 狀或疾病癥狀或疾病傾向。例如，用本文中描述的組合物治療受試者（例如，人受試者）可 以減緩、改善或終止1型糖尿病臨床發(fā)病之前、期間或之后的受試者中的自身免疫的進(jìn)行， 例如，針對胰腺β細(xì)胞的反應(yīng)。
[0033] 如本文中使用的術(shù)語"糖尿病病狀"意圖涵蓋糖尿病、前糖尿病或?qū)μ悄虿〉囊赘?性。
[0034] 治療可以是使用批準(zhǔn)用于臨床測試的藥物成分的治療，或可以是在臨床試驗(yàn)或臨 床前試驗(yàn)期間進(jìn)行的治療。
[0035] 如本文中使用的短語"延遲病程"在延遲糖尿病病程的情形中意指在1型糖尿病 的臨床發(fā)病之前或之后功能性殘余細(xì)胞群的損失被延遲。例如，所述延遲可以是延遲1、2、 3、4、5、6、9、12、15、18、21、24或更多個月，或可以延遲2、3、4或更多年。
[0036] 如本文中使用的術(shù)語"施用"意圖涵蓋直接和間接向其預(yù)期的作用位點(diǎn)遞送藥物 組合物的所有方式。
[0037] 術(shù)語"治療有效量"是指在必要的劑量和時段下有效實(shí)現(xiàn)所需治療結(jié)果的量。組 合物的治療有效量可根據(jù)多種因素而不同，如個體的疾病狀態(tài)、年齡、性別和體重，以及藥 物組合物在個體中引出所需應(yīng)答的能力。治療有效量也是其中治療有益效果超過藥理學(xué)試 劑的任何毒性或有害效果的量。
[0038] 雖然以上描述提供各種實(shí)施方案的實(shí)例和具體細(xì)節(jié)，但是應(yīng)理解，所描述實(shí)施方 案的一些特征和/或功能允許不脫離所描述實(shí)施方案的范圍的修改。以上描述意圖說明本 發(fā)明，其范圍只受在隨附權(quán)利要求書的語言限制。
[0039] 實(shí)施例
[0040] 根據(jù)下列實(shí)施例可以進(jìn)一步理解 申請人:教義的方面，所述實(shí)施例不應(yīng)當(dāng)被解釋為 以任何方式限制 申請人:教義的范圍。
[0041] 實(shí)施例1-試驗(yàn)
[0042] 如以上參考Lancet論文（以全文引用方式并入本文）所述，使用阿巴西普對確 診患有1型糖尿病的患者進(jìn)行2期臨床試驗(yàn)。適格患者已經(jīng)在過去的100天內(nèi)確診患有1 型糖尿病并且具有至少一種糖尿病相關(guān)的自身抗體（微量分析的胰島素抗體；谷氨酸脫羧 酶-65[GAD-65]抗體；胰島-細(xì)胞抗原-512[ICA-512]抗體；或胰島-細(xì)胞自身抗體）并且 具有0. 2nmol/L或更高的受激C肽濃度。
[0043] 通過在參與現(xiàn)場劃分將患者以2:1的比率隨機(jī)分配，使用雙盲方案得到用阿巴 西普或安慰劑的實(shí)驗(yàn)治療。在第1、14和28天給予阿巴西普（Orencia, Bristol-Myers Squibb, Princeton, NJ, USA)，并且隨后每28天以在IOOmL 0· 9 %氯化鈉輸注液中IOmg/ kg(每個劑量最大IOOOmg)的劑量，以30-min靜脈內(nèi)輸注方式來給藥，其中在第700天給予 最一劑（總共27個劑量）。使用生理鹽水輸液作為安慰劑?；颊卟唤邮苋魏涡g(shù)前用藥。
[0044] 集中分析血液樣品。用雙位點(diǎn)免疫酶分析法（Tosoh Bioscience, South San Francisco, CA, USA)從冷凍血漿測量C肽濃度。在給藥結(jié)束六個月之后，在3、6、12、18和 24個月以及在30個月獲得血液樣品。
[0045] 在參加研宄的112位患者中，隨機(jī)分配77位接受用阿巴西普的實(shí)驗(yàn)治療，并且分 配35位接受安慰劑。結(jié)果顯示：用阿巴西普進(jìn)行2年以上的共刺激調(diào)節(jié)使最新發(fā)病的1型 糖尿病中的β細(xì)胞功能降低減緩9.6個月。在兩年時，阿巴西普治療組的自身胰島素產(chǎn)生 比安慰劑組高59%。整個試驗(yàn)（用相同的胰島素用量）中，阿巴西普治療組也具有顯著更 好的HbAlc (血糖控制水平的測量）。即使所述疾病過程可能已經(jīng)發(fā)展若干年，早期干預(yù)的 有益效果暗示出T細(xì)胞激活仍然在1型糖尿病臨床診斷的時間前后發(fā)生。
[0046] 實(shí)施例2-流式細(xì)胞術(shù)
[0047] 對于阿巴西普和安慰劑臂兩者來說，在0、3、6、12和24個月時，對來自實(shí)施例1中 的臨床試驗(yàn)的受試者的血液樣品執(zhí)行流式細(xì)胞術(shù)分析，在試驗(yàn)結(jié)束之后六個月（30個月） 進(jìn)行另外的分析。流式細(xì)胞術(shù)是用于計(jì)數(shù)和檢驗(yàn)微觀顆粒（如細(xì)胞）的常規(guī)技術(shù)，它是通過 將微觀顆粒懸浮在流體流中并且使它們一次一個細(xì)胞通過激光和電子檢測設(shè)備來進(jìn)行?，F(xiàn) 代儀器通常具有多個激光和熒光檢測器。增加激光和檢測器的數(shù)目允許進(jìn)行多抗體標(biāo)記， 并且可以通過其表型標(biāo)記物更精確地識別目標(biāo)群體。
[0048] 在所述分析中使用熒光激活細(xì)胞分選（FACS)，它是流式細(xì)胞術(shù)的一種特殊化類 型。FACS提供一種將生物細(xì)胞的異質(zhì)混合物每次一個細(xì)胞分選到兩個或更多個容器中的方 法，所述方法是基于每個細(xì)胞的特定光散射和熒光特征以及對它們的表征。它是一種有用 的科學(xué)儀器，因?yàn)樗峁碜詥蝹€細(xì)胞的熒光信號的快速、客觀和定量的記錄以及對特 別感興趣的細(xì)胞的物理分離。熒光信號來自FACS之前已經(jīng)與細(xì)胞一起孵育的熒光標(biāo)記的 抗體。對于多標(biāo)記來說，每個抗體與不同熒光團(tuán)偶聯(lián)。使用的抗體對于感興趣的細(xì)胞標(biāo)記 物是特異性的。為了檢測⑶4+細(xì)胞，用熒光團(tuán)標(biāo)記抗⑶4抗體。對于⑶45RO的同時檢測 來說，還使用帶有另一個熒光團(tuán)的特異性抗CD45RO抗體。（熒光標(biāo)記的抗CD4和抗CD45RO 抗體可商購自各種來源，如BD Biosciences, San Jose, CA.)每個焚光團(tuán)都有特征峰激發(fā)和 發(fā)射波長，因此使在它們之間加以區(qū)分成為可能，例如，通過使用熒光激活細(xì)胞分選儀器， 如 Becton-Dickinson FACSCalibur 或 FACSAria 系統(tǒng)來進(jìn)行區(qū)分。
[0049] 在三個5色分析法中研宄七個T細(xì)胞標(biāo)記物。對于任何這些標(biāo)記物來說，在安慰 劑組中沒有發(fā)現(xiàn)從基線的變化。在治療組中，我們觀察到CD4和CD8T細(xì)胞中或CD8T細(xì)胞 的初始子集和記憶子集中沒有變化。
[0050] 然而，在治療期間的阿巴西普組中⑶4 T細(xì)胞初始（⑶45R0-⑶62L+)與中樞記憶 (⑶45R0+⑶62L+)亞群的比率從基線顯著地增加并且中止療法后又回到基線。在安慰劑組 的試驗(yàn)期間，更高的⑶4中樞記憶T細(xì)胞顯著地與隨后的C肽下降相關(guān)。在阿巴西普組中 這些T細(xì)胞的降低顯著地與C肽下降速率減慢相關(guān)。
[0051] 研宄還發(fā)現(xiàn)在阿巴西普組中，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞群體（⑶4+⑶25高）從基線降低，隨后 在中止療法后回到基線。然而，這些調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的降低顯示與初始/記憶群體的變化或 與C肽水平的變化不相關(guān)。
[0052] 表1提供⑶4初始T細(xì)胞與⑶4中樞記憶T細(xì)胞的比率從基線的最小二乘方平均 變化（作為log給出）和從基線起3、6、12和24個月的標(biāo)準(zhǔn)偏差和p值。從基線起30個 月以第30個月的數(shù)據(jù)給出，其中所述受試者在第30個月中止療法。藥物與安慰劑組之間 的P值是在同一次隨訪時各組之間的P值。
[0053] 表 1
[0054] LOG (初始T細(xì)胞/中樞記憶T細(xì)胞）
[0055]

【權(quán)利要求】
1. 一種在受試者中確定療法對自身免疫疾病或病狀的有效性的方法，所述方法包括： 選擇經(jīng)歷自身免疫疾病或病狀的療法的受試者， 從所述受試者提取樣品， 在所述樣品中測量⑶4中樞記憶（⑶45R0+⑶62L+) T細(xì)胞亞群并且任選地測量⑶4T細(xì) 胞初始（CD45R0-CD62L+)亞群，以及 評估所述療法的所述有效性，其特征在于：在所述療法期間 低的或降低的CD4中樞記憶T細(xì)胞水平，或 所述CD4T細(xì)胞初始亞群與所述CD4中樞記憶T細(xì)胞亞群的高的或增加的比率表明有 效的療法。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：在所述測量步驟之前，用標(biāo)記的抗CD45R0 抗體和標(biāo)記的抗CD62L抗體孵育所述樣品。
3. 如權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：測量包括使所述樣品經(jīng)受流 式細(xì)胞術(shù)。
4. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于：所述樣品是血液樣品。
5. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于：所述降低的CD4中樞記憶T細(xì) 胞水平或所述增加的比率是相對于在不同時間點(diǎn)所述提取的樣品的所述水平或比率而言。
6. 如權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于：所述降低的CD4中樞記憶T細(xì) 胞水平或所述增加的比率是相對于標(biāo)準(zhǔn)化的水平或比率而言，或相對于從療法開始之前提 取的樣品獲得的水平或比率而言。
7. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于：在所述療法期間低的或降低的 所述CD4中樞記憶T細(xì)胞水平表明有效的療法。
8. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于：測量包括測量所述CD4中樞記 憶T細(xì)胞亞群和所述CD4T細(xì)胞初始亞群兩者，并且其中在所述療法期間所述CD4T細(xì)胞初 始與所述CD4中樞記憶T細(xì)胞亞群的高的或增加的比率表明有效的療法。
9. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于：所述療法是針對糖尿病病狀。
10. 如權(quán)利要求9所述的方法，所述方法還包括： 確定糖尿病相關(guān)自身抗體的存在。
11. 如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于：所述糖尿病病狀是1型糖尿病。
12. -種在受試者中診斷自身免疫疾病、前自身免疫疾病、對自身免疫疾病的易感性或 療法對一種或多種這些病狀的有效性的方法，所述方法包括： 選擇患有或疑似患有自身免疫疾病、前自身免疫疾病或具有對自身免疫疾病的易感性 的受試者， 通過對從所述受試者提取的樣品進(jìn)行免疫熒光分析確定CD4初始（CD45R0-CD62L+)T 細(xì)胞的水平； 通過對從所述受試者提取的樣品進(jìn)行免疫熒光分析確定CD4中樞記憶 (CD45RO+CD62L+)T細(xì)胞的水平，以及 定量地關(guān)聯(lián)所述CD4初始T細(xì)胞和所述CD4中樞記憶T細(xì)胞的所述水平，其特征在于： 所述CD4初始T細(xì)胞與所述CD4中樞記憶T細(xì)胞的低的或降低的比率，或高的或增加的所 述CD4中樞記憶T細(xì)胞水平表明自身免疫疾病、前自身免疫疾病、對自身免疫的易感性或治 療對一種或多種這些病狀的無效性。
13. 如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于：所述自身免疫疾病是糖尿病或前糖尿病， 其中所述CD4初始T細(xì)胞與所述CD4中樞記憶T細(xì)胞的低的或降低的比率，或高的或增加 的所述CD4中樞記憶T細(xì)胞水平表明糖尿病、前糖尿病或?qū)μ悄虿〉囊赘行浴?br> 14. 如權(quán)利要求13所述的方法，所述方法還包括：確定糖尿病相關(guān)的抗體的存在，所述 糖尿病相關(guān)的抗體選自谷氨酸脫羧酶-65抗體、胰島-細(xì)胞抗原-512抗體、胰島素抗體或 其它胰島-細(xì)胞自身抗體。
15. 如權(quán)利要求12至14中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于：所述糖尿病病狀是1型糖 尿病。
16. 如權(quán)利要求12至15中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于：在分析之前用標(biāo)記的抗 ⑶45R0抗體孵育所述樣品。
17. 如權(quán)利要求12至16中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于：測量包括使所述樣品經(jīng)受 流式細(xì)胞術(shù)。
18. 如權(quán)利要求12至17中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于：所述樣品是血液樣品。
19. 如權(quán)利要求12至18中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于：所述降低和/或增加的水 平或比率是相對于在不同時間點(diǎn)來自所述提取的樣品的所述水平或比率而言，或相對于標(biāo) 準(zhǔn)化的水平或比率而言。
20. -種確定直到自身免疫疾病發(fā)病的時間或不同干預(yù)模態(tài)的有效性水平的方法，所 述方法包括： 獲得受試者； 從所述受試者提取一個或多個樣品； 在所述樣品中測量中樞記憶（⑶45RO+⑶62L+) T細(xì)胞亞群水平以及任選地測量⑶4T細(xì) 胞初始（⑶45RO-⑶62L+)亞群水平，以及 計(jì)算兩個或更多個樣品之間或在不同時間點(diǎn)對一個樣品進(jìn)行的兩個或更多個測量之 間的所述CD4中樞記憶T細(xì)胞亞群水平的變化，和/或所述CD4T細(xì)胞初始與所述CD4中樞 記憶T細(xì)胞亞群的比率的變化， 其特征在于：所述比率的降低和/或較高的CD4中樞記憶T細(xì)胞水平與自身免疫疾病 發(fā)病的較短時間或有效性較低的干預(yù)相關(guān)。
21. 如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于：所述受試者具有對所述自身免疫病狀為 特異性的自身抗體或其它生物標(biāo)記物。
22. 如權(quán)利要求20或權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于：所述受試者具有至少一 種糖尿病相關(guān)的抗體，所述糖尿病相關(guān)的抗體選自谷氨酸脫羧酶-65抗體、胰島-細(xì)胞抗 原-512抗體、胰島素抗體或其它胰島-細(xì)胞自身抗體，并且其中所述比率的降低和/或較 高的所述CD4中樞記憶T細(xì)胞水平與糖尿病發(fā)病的較短時間相關(guān)。
23. 如權(quán)利要求20至22中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于：Log中樞記憶T細(xì)胞從基 線的每個單位的增加都與C肽濃度降低大約-0. 178ng/mL相關(guān)。
24. 如權(quán)利要求20至23中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于：以介于2個月與12個月 之間的間隔從所述受試者提取至少兩個樣品。
25. 如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于：以介于3個月與6個月之間的間隔從所 述受試者提取至少兩個樣品。
26. 如權(quán)利要求20至23中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于：在間隔介于1個月與6個 月之間的至少兩個不同時間點(diǎn)測量從所述受試者提取的所述樣品。
27. 如權(quán)利要求20至26中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于：在所述測量步驟之前用標(biāo) 記的抗⑶45RO抗體孵育所述樣品。
28. 如權(quán)利要求20至27中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于：測量包括使所述樣品經(jīng)受 流式細(xì)胞術(shù)。
29. 如權(quán)利要求20至28中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于：所述樣品是血液樣品。
30. 如權(quán)利要求20至29中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于：所述水平的增加和/或所 述比率的降低是相對于開始療法之前的所述水平或比率而言，或相對于標(biāo)準(zhǔn)化的水平或比 率而言。
31. 如權(quán)利要求20至29中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于：所述水平的增加和/或所 述比率的降低是相對于來自同一樣品的在較早時間點(diǎn)的所述水平或比率。
32. -種針對自身免疫的靶向藥物開發(fā)方法，所述方法包括： 從一個或多個受試者提取樣品， 在所述樣品中分離中樞記憶（⑶45RO+⑶62L+) T細(xì)胞亞群以及任選地分離⑶4T細(xì)胞初 始（CD45RO-CD62L+)亞群，以及 根據(jù)這些細(xì)胞的疾病特異性特征開發(fā)特異性地祀向這些細(xì)胞或這些細(xì)胞的子集的藥 物。
33. 如權(quán)利要求32所述的方法，其特征在于：所述方法是針對糖尿病的靶向藥物開發(fā) 方法。
【文檔編號】A61P37/00GK104520707SQ201380027247
【公開日】2015年4月15日 申請日期:2013年5月24日 優(yōu)先權(quán)日:2012年5月24日
【發(fā)明者】泰漢摩·歐爾本 申請人:歐爾本生物科技有限責(zé)任公司