專利名稱：：一種阿卡波糖的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種a-葡糖苷酶抑制劑活性成分的制備方法，尤其涉及一種阿卡波糖的制備方法。
背景技術(shù)：
：阿卡波糖(acarbose)是有效的a-葡糖苷酶抑制劑，其分子結(jié)構(gòu)見下式1，臨床上廣泛用于治療非胰島素依賴的II型糖尿病。阿卡波糖的發(fā)酵生產(chǎn)必須優(yōu)化發(fā)酵條件來提高發(fā)酵單位，降低成本。但是游動放線菌(Actin叩lanessp.撥酵生產(chǎn)的同時，生成一系列的同分異構(gòu)體組分A、B、C、D、E、F、G和H(歐洲藥典5.1P2873—2874)。歐洲藥典明確規(guī)定雜質(zhì)的限度組分A<0.6%，B<0.5%，C<1.5%,D<1.0%，E<0.20/0,F<0.3%,G<0.3%，H<0,2%，別的雜質(zhì)均小于0.2%。其中雜質(zhì)A組分和C組分(如式2)的高壓液相檢測其保留時間與阿卡波糖十分接近，在提取過程中很難分離。因此在發(fā)酵過程中，提高發(fā)酵單位的同時控制雜質(zhì)A組分和C組分的含量變得尤為重要。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>式2對用游動放線菌生產(chǎn)阿卡波糖的研究表明，葡萄糖和麥芽糖為它的前體。其中葡萄糖不僅是阿卡波糖的前體，還是整個發(fā)酵過程的能量來源。因此發(fā)酵培養(yǎng)2天后開始流加葡萄糖和麥芽糖。但高濃度葡萄糖會對游動放線菌次級代謝產(chǎn)生反饋抑制作用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)中阿卡波糖產(chǎn)量不高和C組分難分離的缺陷，在發(fā)酵過程中補入本發(fā)明所述的氮源，能大幅提高阿卡波糖的產(chǎn)量，并通過控制該氮源的流加量，降低雜質(zhì)C的形成。本發(fā)明中，阿卡波糖的制備方法為(1)將游動放線菌斜面接種于斜面培養(yǎng)基進行斜面培養(yǎng)；(2)挑選生長豐滿的斜面接種于種子培養(yǎng)基進行種子培養(yǎng)；(3)發(fā)酵罐培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中向發(fā)酵培養(yǎng)基中流加葡萄糖和麥芽糖；其中，步驟(3)中還流加氮源，控制流加氮源后培養(yǎng)基中氨基氮的含量小于或等于0.15mg/ml，較佳的為0.13-0.15mg/mg，最佳的為0.135-0.145mg/ml。本發(fā)明中，所述的氮源為本領(lǐng)域制備阿卡波糖常規(guī)添加的氮源，包括有機氮源和銨態(tài)無機氮源中的一種或多種。有機氮源如蛋白胨、酵母粉、玉米漿和各類氨基酸等，較佳的為氨基酸及其鹽中的一種或多種；所述的氨基酸較佳的為谷氨酸和/或天門冬氨酸；所述的鹽較佳的為鈉鹽或鉀鹽；所述的銨態(tài)無機氮較佳的為銨鹽，優(yōu)選為氯化銨、氨水和硫酸銨中的一種或多種。因為發(fā)酵中后期當(dāng)流加過多的氮源時，阿卡波糖的發(fā)酵單位提高有限，但雜質(zhì)C組分的含量卻快速上升。由于C組分與阿卡波糖很難分離，因此會給提取工作帶來很大的困難。本發(fā)明通過調(diào)節(jié)氮源的流加量，使阿卡波糖產(chǎn)物中雜質(zhì)C組分的含量小于0.5wt%。在本發(fā)明另一較佳實施例中，在步驟(3)中，流加葡萄糖和麥芽糖后控制葡萄糖的含量為5-10mg/ml，更佳的為8-9mg/mL;麥芽糖的含量為20-25mg/ml，更佳的為23-24mg/ml。步驟(1)中，斜面培養(yǎng)采用現(xiàn)有的游動放線菌斜面培養(yǎng)的常規(guī)條件，優(yōu)選條件如下在25-28'C培養(yǎng)6-7天；斜面培養(yǎng)基較佳的含有淀粉水解液30-50mg/ml、蛋白胨4-6mg/ml、磷酸氫二鉀0.4-0.6mg/ml、硫酸鎂0.4-0.6mg/ml和瓊脂15-20mg/ml;其消前pH(消毒滅菌前的pH)為7.0;斜面培養(yǎng)基裝量為12-20%(百分比為體積百分比)。步驟(2)中，種子培養(yǎng)采用現(xiàn)有的游動放線菌種子培養(yǎng)的常規(guī)條件，優(yōu)選條件如下在25-28"C、200-240rpm培養(yǎng)44-48小時；種子培養(yǎng)基較佳地含有淀粉8-12mg/ml、甘油15-25mg/ml、熱炸黃豆餅粉15-25mg/ml和碳酸鈣2-3mg/ml;其消前pH為6.8;種子培養(yǎng)基裝量為12-20%(百分比為體積百分比)。步驟(3)中，發(fā)酵罐培養(yǎng)采用現(xiàn)有的游動放線菌發(fā)酵罐培養(yǎng)的常規(guī)條件，優(yōu)選條件如下溫度為25-28°C;接種量4-5%(百分比為體積百分比)；發(fā)酵罐裝量40-50%(百分比為體積百分比)；罐壓0.07-0.13Mpa;攪拌速度300-600rpm;通氣速率400L/hr;發(fā)酵培養(yǎng)基含有下述物質(zhì)淀粉水解液40-80mg/ml;葡萄糖30mg/ml;有機氮源10-20mg/ml;無機氮源0.8-1.2mg/ml;谷氨酸鈉4-6mg/ml;三價鐵鹽0.05-0.15mg/ml;磷酸鹽0.5-1.5mg/ml;碳酸鈣2-4mg/ml;其消前pH為6.8。其中，氮源為游動放線菌發(fā)酵所必須的基本物質(zhì)，有機氮源較佳的為酵母粉、酵母提取物、酵母膏、黃豆餅粉、玉米漿中的一種或幾種；無機氮源為銨鹽，最佳的是氯化銨；鐵是菌體有氧氧化必不可少的元素，當(dāng)使用非鐵制發(fā)酵罐如玻璃或不銹鋼罐時，需要添加三價鐵元素，較佳的為氯化鐵或硫酸鐵；磷酸鹽能促進微生物的生長繁殖，較佳的為磷酸氫二鉀；碳酸鈣能改善細(xì)胞的通透性和調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH。本發(fā)明所述的淀粉水解液由淀粉，較佳的為玉米淀粉經(jīng)a-淀粉酶于95-10(TC水解反應(yīng)30分鐘得到的。主要產(chǎn)物為葡萄糖、麥芽糖及少許麥芽三糖，其中葡萄糖含量為40-50%。另外，在步驟(3)的發(fā)酵罐培養(yǎng)開始40-72小時后，每隔6-12小時取樣檢測發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖、麥芽糖和氨基氮的含量。取樣檢測時還可用高壓液相檢測阿卡波糖的放罐單位；8天后放罐單位為2286-3300pg/ml。本發(fā)明所有原料及試劑均市售可得。本發(fā)明的積極進步效果是在用游動放線菌發(fā)酵生產(chǎn)阿卡波糖時，在發(fā)酵罐培養(yǎng)過程中流加氮源，控制培養(yǎng)基中氨基氮的含量小于或等于0.15mg/ml，使得阿卡波糖的產(chǎn)量大幅提高的同時降低雜質(zhì)C的生成。圖1是流加不同氮源的發(fā)酵時間-阿卡波糖產(chǎn)量圖。圖2是氨基氮含量-阿卡波糖產(chǎn)量和純度圖。具體實施例方式下面用實施例來進一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。下述各實施例中的游動放線菌(Actinoplanesspecies)ATCC31044。下述各實施例中的百分比皆為體積百分比。實施例l(1)將游動放線菌斜面接種于斜面培養(yǎng)基，28"C培養(yǎng)6天；斜面培養(yǎng)基淀粉水解液30mg/ml;蛋白胨5mg/ml;磷酸氫二鉀0.6mg/ml;硫酸鎂0.6mg/ml;瓊脂20mg/ml;消前pH-7.0;培養(yǎng)基裝量為20%;(2)挑選生長豐滿的斜面接種于種子培養(yǎng)基，于28"C、200rpm培養(yǎng)44小時；種子培養(yǎng)基淀粉10mg/ml;甘油20mg/ml;黃豆餅粉(熱炸)20mg/ml;碳酸轉(zhuǎn)2mg/ml;消前pH=6.8;750ml搖瓶種子培養(yǎng)基裝量為90ml;(3)發(fā)酵罐培養(yǎng)，40小時后每隔6小時取樣檢測葡萄糖、麥芽糖和氨基氮含量，根據(jù)測定結(jié)果流加葡萄糖、麥芽糖和谷氨酸，使其含量控制在葡萄糖5mg/ml、麥芽糖20mg/ml和氨基氮0.13mg/ml;同時用高壓液相檢測阿卡波糖的單位，8天后放罐單位為2840pg/ml，C組分含量為11.6pg/ml(占阿卡波糖產(chǎn)物0.41wt%);發(fā)酵培養(yǎng)基淀粉水解液40mg/ml;葡萄糖30mg/ml;黃豆餅粉10mg/ml;酵母粉10mg/ml;谷氨酸鈉4mg/ml;三氯化鐵0.05mg/ml;磷酸氫二鉀0.5mg/ml;氯化銨0.8mg/ml;碳酸轉(zhuǎn)2mg/ml;消前pH-6.8;發(fā)酵溫度25t:;10L發(fā)酵罐裝量為4.5L;接種量4%;罐壓0.07Mpa;攪拌300rpm;通氣速率400L/hr。實施例2(1)將游動放線菌斜面接種于斜面培養(yǎng)基，25i:培養(yǎng)7天；斜面培養(yǎng)基淀粉水解液50mg/ml;蛋白胨4mg/ml;磷酸氫二鉀0.4mg/ml;硫酸鎂0.4mg/ml;瓊脂15mg/ml;消前pH-7.0;斜面培養(yǎng)基裝量為12%;(2)挑選生長豐滿的斜面接種于種子培養(yǎng)基，于25。C、240rpm培養(yǎng)48小時；種子培養(yǎng)基淀粉8mg/ml;甘油15mg/ml;黃豆餅粉(熱炸)20mg/ml;碳酸鈣2mg/ml;消前pH=6.8;750ml搖瓶種子培養(yǎng)基裝量為150ml;(3)發(fā)酵罐培養(yǎng)，70小時后每隔12小時取樣檢測葡萄糖、麥芽糖和氯化銨，根據(jù)測定結(jié)果流加葡萄糖、麥芽糖和氯化銨，使其含量控制在葡萄糖10mg/ml、麥芽糖25mg/ml和氨基氮0.05mg/ml;同時用高壓液相檢測阿卡波糖的單位，8天后放罐單位為2286pg/ml，C組分含量為5.1pg/ml(占阿卡波糖產(chǎn)物0.22wt^);發(fā)酵培養(yǎng)基麥芽糖80mg/ml;葡萄糖30mg/ml;黃豆餅粉10mg/ml;玉米槳3mg/ml;谷氨酸鈉6mg/ml;三氯化鐵0.15mg/ml;磷酸氫二鉀1.5mg/ml;氯化銨1.2mg/ml;碳酸鈣4mg/ml;消前pH-6.8;發(fā)酵溫度為28。C;10L發(fā)酵罐裝量為5L;接種量5%;罐壓0.13Mpa;攪拌600rpm;通氣速率400L/hr。實施例3(1)將游動放線菌斜面接種于斜面培養(yǎng)基，25'C培養(yǎng)6天；斜面培養(yǎng)基淀粉水解液30mg/ml;蛋白胨6mg/ml;磷酸氫二鉀0.5mg/ml;硫酸鎂0.5mg/ml;瓊脂16mg/ml;消前pH=7.0;斜面培養(yǎng)基裝量為15%;(2)挑選生長豐滿的斜面接種于種子培養(yǎng)基，于25"C、220rpm培養(yǎng)46小時；種子培養(yǎng)基淀粉12mg/ml;甘油25mg/ml;黃豆餅粉(熱炸)15mg/ml;碳酸鈣2mg/ml;消前pH-6.8;750ml搖瓶種子培養(yǎng)基裝量為100ml;(3)發(fā)酵罐培養(yǎng)，48小時后每隔6小時取樣檢測葡萄糖、麥芽糖和氨基氮含量，根據(jù)測定結(jié)果流加葡萄糖、麥芽糖和天門冬氨酸，使其含量控制在葡萄糖8mg/ml、麥芽糖23mg/ml和氨基氮0.15mg/ml;同時用高壓液相檢測阿卡波糖的單位，8天后放罐單位為3300pg/ml，C組分含量為16.1pg/ml(占阿卡波糖產(chǎn)物0.49wt^);發(fā)酵培養(yǎng)基淀粉水解液80mg/ml;葡萄糖30mg/ml;酵母粉10mg/ml;玉米漿3mg/ml;谷氨酸鈉5mg/ml;三氯化鐵O.lmg/ml;磷酸氫二鉀1mg/ml;氯化銨1mg/ml;碳酸鈣3mg/ml;消前pH=6.8;發(fā)酵溫度25°C;10L發(fā)酵罐裝量為4L;接種量4.5%;罐壓O.lOMpa;攪拌400rpm;通氣速率400L/hr。實施例4(1)將游動放線菌斜面接種于斜面培養(yǎng)基，25"C培養(yǎng)7天；斜面培養(yǎng)基淀粉水解液30mg/ml;蛋白胨5mg/ml;磷酸氫二鉀0.5mg/ml;硫酸鎂0.5mg/ml;瓊脂16mg/ml;消前pH-7.0;斜面培養(yǎng)基裝量為12%;(2)挑選生長豐滿的斜面接種于種子培養(yǎng)基，于25"C、220rpm培養(yǎng)48小時；種子培養(yǎng)基淀粉10mg/ml;甘油20mg/ml;黃豆餅粉(熱炸)25mg/ml;碳酸鈣3mg/ml;消前pl^6.8;750ml搖瓶種子培養(yǎng)基裝量為100ml;(3)發(fā)酵罐培養(yǎng)，48小時后每隔6小時取樣檢測葡萄糖、麥芽糖和氨基氮含量，根據(jù)測定結(jié)果流加葡萄糖、麥芽糖和谷氨酸鈉，使其含量控制在葡萄糖9mg/ml、麥芽糖24mg/ml和氨基氮0.145mg/ml，同時用高壓液相檢測阿卡波糖的產(chǎn)量和純度；發(fā)酵培養(yǎng)基淀粉水解液60mg/ml;葡萄糖30mg/ml;黃豆餅粉10mg/ml;谷氨酸鈉5mg/ml;三氯化鐵0.1mg/ml;磷酸氫二鉀lmg/ml;氯化銨lmg/mh碳酸f丐3mg/ml;消前pH-6.8;發(fā)酵溫度為25。C;10L發(fā)酵罐裝量為4.5L;接種量4%;罐壓0.07Mpa;攪拌500rpm;通氣速率400L/hr。實施例5(1)將游動放線菌斜面接種于斜面培養(yǎng)基，28i:培養(yǎng)6天；斜面培養(yǎng)基淀粉水解液30mg/ml;蛋白胨5mg/ml;磷酸氫二鉀0.6mg/ml;硫酸鎂0.6mg/ml;瓊脂20mg/ml;消前pH-7.0;培養(yǎng)基裝量為20%;(2)挑選生長豐滿的斜面接種于種子培養(yǎng)基，于28。C、200rpm培養(yǎng)44小時；種子培養(yǎng)基淀粉10mg/ml;甘油20mg/ml;黃豆餅粉(熱炸)20mg/ml;碳酸鈣2mg/ml;消前pH=6.8;750ml搖瓶種子培養(yǎng)基裝量為90ml;(3)發(fā)酵罐培養(yǎng)，40小時后每隔6小時取樣檢測葡萄糖、麥芽糖和氨基氮含量，根據(jù)測定結(jié)果流加葡萄糖、麥芽糖和谷氨酸，使其含量控制在葡萄糖5mg/ml、麥芽糖20mg/ml和氨基氮0.135mg/ml;同時用高壓液相檢測阿卡波糖的單位，8天后放罐單位為2790pg/ml，C組分含量為10.6pg/ml(占阿卡波糖產(chǎn)物0.38wt^);發(fā)酵培養(yǎng)基淀粉水解液40mg/mh葡萄糖30mg/ml;黃豆餅粉10mg/ml;酵母粉10mg/ml;谷氨酸鈉4mg/ml;三氯化鐵0.05mg/ml;磷酸氫二鉀0.5mg/ml;氯化銨0.8mg/ml;碳酸鈣2mg/ml;消前pH-6.8;發(fā)酵溫度25。C;10L發(fā)酵罐裝量為4.5L;接種量4%;罐壓0.07Mpa;攪拌300rpm;通氣速率400L/hr。實施例6-12(1)將游動放線菌斜面接種于斜面培養(yǎng)基，25'C培養(yǎng)7天；斜面培養(yǎng)基淀粉水解液30mg/ml;蛋白胨5mg/ml;磷酸氫二鉀0.5mg/ml;硫酸鎂0.5mg/ml;瓊脂16mg/ml;消前pl^7.0;斜面培養(yǎng)基裝量為12%;(2)挑選生長豐滿的斜面接種于種子培養(yǎng)基，于28°C、220ipm培養(yǎng)48小時；種子培養(yǎng)基淀粉10mg/ml;甘油20mg/ml;黃豆餅粉(熱炸)20mg/ml;碳酸鈣2mg/ml;消前pH-6.8;750ml搖瓶種子培養(yǎng)基裝量為100ml;(3)搖瓶中培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)基淀粉水解液60mg/ml;葡萄糖30mg/ml;酵母粉10mg/ml;黃豆餅粉5mg/ml;谷氨酸鈉5mg/ml;三氯化鐵0.1mg/ml;磷酸氫二鉀1mg/ml;氯化銨1mg/ml;碳酸鈣3mg/ml;消前pH=6.8;750ml搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基裝量為100ml;接種量6%;發(fā)酵溫度為27°C，250rpm培養(yǎng)；48小時后每隔24添加葡萄糖、麥芽糖和氮源，葡萄糖添加量為2mg/ml、麥芽糖17mg/ml和氮源0.4mg/ml，7天后放瓶，HPLC檢測阿卡波糖發(fā)酵單位。上述步驟(^y中添加的氮源種類列于表1中表l<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>對比實施例1(1)將游動放線菌斜面接種于斜面培養(yǎng)基，25"C培養(yǎng)7天；斜面培養(yǎng)基淀粉水解液30mg/ml;蛋白胨5mg/ml;磷酸氫二鉀0.5mg/ml;硫酸鎂0.5mg/ml;瓊脂16mg/ml;消前pH-7.0;斜面培養(yǎng)基裝量為12%;(2)挑選生長豐滿的斜面接種于種子培養(yǎng)基，于28°C、220rpm培養(yǎng)48小時；種子培養(yǎng)基淀粉10mg/ml;甘油20mg/ml;黃豆餅粉(熱炸)20mg/ml;碳酸鈣2mg/ml;消前pH-6.8;750ml搖瓶種子培養(yǎng)基裝量為100ml;(3)發(fā)酵培養(yǎng)基淀粉水解液60mg/ml;葡萄糖30mg/ml;酵母粉10mg/ml;黃豆餅粉5mg/ml;谷氨酸鈉5mg/ml;三氯化鐵0.1mg/ml;磷酸氫二鉀lmg/ml;氯化銨lmg/ml;碳酸鈣3mg/ml;消前pl^6.8;750ml搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基裝量為100ml;接種量6%;發(fā)酵溫度為27'C,250rpm培養(yǎng)；48小時后每隔24小時添加葡萄糖、麥芽糖和無菌水，葡萄糖添加量為200mg、麥芽糖1700mg和無菌水2ml，7天后放瓶，HPLC檢測阿卡波糖發(fā)酵單位。對比實施例2(1)將游動放線菌斜面接種于斜面培養(yǎng)基，25'C培養(yǎng)7天；斜面培養(yǎng)基淀粉水解液30mg/ml;蛋白胨5mg/ml;磷酸氫二鉀0.5mg/ml;硫酸鎂0.5mg/ml;瓊脂16mg/ml;消前pf^7.0;斜面培養(yǎng)基裝量為12%;(2)挑選生長豐滿的斜面接種于種子培養(yǎng)基，于25X:、220rpm培養(yǎng)48小時；種子培養(yǎng)基淀粉10mg/ml;甘油20mg/ml;黃豆餅粉(熱炸)20mg/ml;碳酸鈣2mg/ml;消前pH-6.8;750ml搖瓶種子培養(yǎng)基裝量為100ml;(3)發(fā)酵罐培養(yǎng)，48小時后每隔6小時取樣檢測葡萄糖、麥芽糖，根據(jù)測定結(jié)果流加葡萄糖、麥芽糖，使其含量控制在葡萄糖9g/L、麥芽糖24g/L，同時用高壓液相檢測阿卡波糖的產(chǎn)量和純度；發(fā)酵培養(yǎng)基淀粉水解液60mg/ml;葡萄糖30mg/ml;黃豆餅粉10mg/ml;谷氨酸鈉5mg/ml;三氯化鐵0.1mg/ml;磷酸氫二鉀lmg/ml;氯化銨1mg/ml;碳酸鈣3mg/ml;消前pH:6.8;發(fā)酵溫度為25'C;10L發(fā)酵罐裝量為4.5L;接種量4%;罐壓0.07Mpa;攪拌500rpm;通氣速率400L/hr。對比實施例3(1)將游動放線菌斜面接種于斜面培養(yǎng)基，25'C培養(yǎng)7天；斜面培養(yǎng)基淀粉水解液30mg/ml;蛋白胨5mg/ml;磷酸氫二鉀0.5mg/ml;硫酸鎂0.5mg/ml;瓊脂16mg/ml;消前pH-7.0;斜面培養(yǎng)基裝量為12%;(2)挑選生長豐滿的斜面接種于種子培養(yǎng)基，于25-C、220rpm培養(yǎng)48小時；種子培養(yǎng)基淀粉10mg/ml;甘油20mg/ml;黃豆餅粉(熱炸)20mg/ml;碳酸鈣2mg/ml;消前pH:6.8;750ml搖瓶種子培養(yǎng)基裝量為100ml;(3)發(fā)酵罐培養(yǎng)，48小時后每隔6小時取樣檢測葡萄糖、麥芽糖和氨基氮含量，根據(jù)測定結(jié)果流加葡萄糖、麥芽糖和谷氨酸鈉，使其含量控制在葡萄糖9g/L、麥芽糖24g/L和氨基氮0.18mg/ml，同時用高壓液相檢測阿卡波糖的產(chǎn)量和純度；發(fā)酵培養(yǎng)基淀粉水解液60mg/ml;葡萄糖30mg/ml;黃豆餅粉IOmg/ml;谷氨酸鈉5mg/ml;三氯化鐵O.lmg/ml;磷酸氫二鉀lmg/ml;氯化銨lmg/ml;碳酸鈣3mg/ml;消前pl^6.8;發(fā)酵溫度為25'C;10L發(fā)酵罐裝量為4.5L;接種量4%;罐壓0.07Mpa;攪拌500rpm;通氣速率400L/hr。效果實施例1流加不同氮源對阿卡波糖產(chǎn)量的影響測定了對比實施例1和實施例6-12中阿卡波糖的產(chǎn)量(表2和圖1)。圖1中的對照是用對比實施例1的方法測得的產(chǎn)量。表2流加不同氮源對阿卡波糖產(chǎn)量的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>由表2和圖1可見，流加氮源后阿卡波糖的產(chǎn)量有一定的提高，其中谷氨酸鈉、天門冬氨酸和氯化銨對提高阿卡波糖產(chǎn)量有很顯著的效果。效果實施例2氨基氮含量對阿卡波糖產(chǎn)量和純度的影響該效果實施例中測定了實施例4、對比實施例2和3中阿卡波糖的產(chǎn)量以及雜質(zhì)C的含量，見表3和圖2。對比實施例2中未流加氮源(記為對照)，實施例4(記為A)控制氨基氮含量在0.145mg/ml，對比實施例3(記為B)中控制氨基氮含量在0.18mg/ml。表3控制發(fā)酵液中氨基氮含量對阿卡波糖產(chǎn)量和純度的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>由表3和圖2可見，A和B的阿卡波糖產(chǎn)量很接近，但是A中雜質(zhì)C的含量比B低很多。所以將氨基氮含量控制在本發(fā)明所述范圍內(nèi)不但能使阿卡波糖產(chǎn)量大幅提高，還能有效控制雜質(zhì)C的產(chǎn)生。權(quán)利要求1、一種阿卡波糖的制備方法，其包含下述步驟(1)將游動放線菌斜面接種于斜面培養(yǎng)基進行斜面培養(yǎng)；(2)挑選生長豐滿的斜面接種于種子培養(yǎng)基進行種子培養(yǎng)；(3)發(fā)酵罐培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中向發(fā)酵培養(yǎng)基中流加葡萄糖和麥芽糖；其特征在于步驟(3)中還流加氮源，控制培養(yǎng)基中氨基氮的含量小于或等于0.15mg/ml，但不包括0mg/ml。2、如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述氨基氮的含量為0.13-0.15mg/ml。3、如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所述氨基氮的含量為0.135-0.145mg/ml。4、如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的氮源為氨基酸及其鹽和銨態(tài)無機氮中的一種或多種。5、如權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于所述的氨基酸為谷氨酸和/或天門冬氨酸。6、如權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于所述的鹽為鈉鹽或鉀±卜■nrfi.o7、如權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于所述的銨態(tài)無機氮為氯化銨、氨水和硫酸銨中的一種或多種。8、如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于在步驟(3)中，流加葡萄糖和麥芽糖后，控制培養(yǎng)基中葡萄糖的含量為5-10mg/ml;麥芽糖的含量為20-25mg/ml。9、如權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于所述葡萄糖的含量為8-9mg/ml;麥芽糖的含量為23-24mg/ml。10、如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(1)中所述的斜面培養(yǎng)為在25-28'C培養(yǎng)6-7天；斜面培養(yǎng)基含有下述物質(zhì)淀粉水解液30-50mg/ml、蛋白胨4-6mg/ml、磷酸氫二鉀0.4-0.6mg/ml、硫酸鎂0.4-0.6mg/ml和瓊脂15-20mg/ml;斜面培養(yǎng)基的消前pH為7.0;斜面培養(yǎng)基裝量為12-20%;步驟(2)中的種子培養(yǎng)為在25-28°C、200-240rpm培養(yǎng)44-48小時；種子培養(yǎng)基含有下述物質(zhì)淀粉8-12mg/ml、甘油15-25mg/ml、熱炸黃豆餅粉15-25mg/ml和碳酸鈣2-3mg/ml;種子培養(yǎng)基的消前pH為6.8;種子培養(yǎng)基裝量為12-20%;步驟(3)中的發(fā)酵罐培養(yǎng)為在25-28"C培養(yǎng)；接種量4-5%;發(fā)酵罐裝量40-50%;罐壓0.07-0.13Mpa;攪拌速度300-600rpm;通氣速率400L/hr;發(fā)酵培養(yǎng)基含有下述物質(zhì)淀粉水解液40-80mg/ml;葡萄糖30mg/ml;有機氮源10-20mg/ml;無機氮源0.8-1.2mg/ml;谷氨酸鈉4-6mg/ml;三價鐵鹽0.05-0.15mg/ml;磷酸鹽0.5-1.5mg/ml;碳酸轉(zhuǎn)2-4mg/ml;發(fā)酵培養(yǎng)基的消前pH為6.8;上述接種量和裝量的百分比均為體積百分比。全文摘要本發(fā)明公開了一種阿卡波糖的制備方法，其包含下述步驟(1)將游動放線菌斜面接種于斜面培養(yǎng)基進行斜面培養(yǎng)；(2)挑選生長豐滿的斜面接種于種子培養(yǎng)基進行種子培養(yǎng)；(3)發(fā)酵罐培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中向發(fā)酵培養(yǎng)基中流加葡萄糖和麥芽糖；其特征在于步驟(3)中還流加氮源，控制流加氮源后培養(yǎng)基中氨基氮的含量小于或等于0.15mg/ml，但不包括0mg/ml。本發(fā)明克服現(xiàn)有技術(shù)中雜質(zhì)C組分難分離的缺陷，在發(fā)酵過程中補入氮源，并控制氮源的含量，能在大幅提高阿卡波糖的產(chǎn)量的同時降低雜質(zhì)C的形成。文檔編號C12N1/20GK101603066SQ20081003890公開日2009年12月16日申請日期2008年6月13日優(yōu)先權(quán)日2008年6月13日發(fā)明者琴張,胡海峰申請人:上海醫(yī)藥工業(yè)研究院