專利名稱：與紅細(xì)胞生成素受體結(jié)合的化合物和肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明特別提供了結(jié)合并激活紅細(xì)胞生成素受體(EPO-R)，或者，否則則作為EPO激動劑的肽和化合物。本發(fā)明涉及生物化學(xué)和藥物化學(xué)領(lǐng)域，具體地說，提供了一種用于治療人疾病的EPO激動劑。
背景技術(shù)：
紅細(xì)胞生成素(EPO)是一種165個氨基酸的糖蛋白類激素，在第24、38、83和126位氨基酸處有4個糖基化位點，其分子量約為34,000。它在產(chǎn)生時最初為前體蛋白，帶有23個氨基酸的信號肽。EPO可以3種形式存在α、β和脫唾液酸形式。α和β形式在糖成份上略有區(qū)別，但是具有相同的效力、生物活性和分子量。脫唾液酸形式是末端的糖(唾液酸)被去除的α或β形式。編碼EPO的DNA序列已被報道過。參見本文引用參考的Lin(1987)美國專利4,703,008。
EPO促進(jìn)紅細(xì)胞前體細(xì)胞的有絲分裂和分化，由此確保紅細(xì)胞的產(chǎn)生。它在以缺氧情況為主時產(chǎn)生于腎臟。在EPO誘導(dǎo)的紅細(xì)胞前體細(xì)胞分化過程中，發(fā)生珠蛋白合成的誘導(dǎo)，并提高血紅素復(fù)合物的合成以及鐵蛋白受體的數(shù)量。這能使細(xì)胞吸收更多的鐵并合成功能性的血紅蛋白。成熟紅細(xì)胞中的血紅蛋白與氧結(jié)合。因此，紅細(xì)胞和其中的血紅蛋白在給機體供氧方面起著重要的作用。已知的這一復(fù)雜過程是由EPO與紅細(xì)胞前體細(xì)胞表面相應(yīng)受體之間的相互作用引發(fā)的。參見例如Graber和Krantz(1978)《藥物學(xué)評論年刊》(Ann.Rev.Med)2951-66。
當(dāng)人體處于健康狀態(tài)，組織能夠從已有的紅細(xì)胞中得到足夠的供氧時，EPO在血漿中的濃度很低。這一正常的低濃度足以促進(jìn)對因老化而流失的紅細(xì)胞的替換。
當(dāng)循環(huán)系統(tǒng)中依靠血細(xì)胞的氧傳送降低而出現(xiàn)缺氧情況時，循環(huán)系統(tǒng)中EPO量增加。缺氧可能有以下原因因出血造成的大量失血，過量輻射對紅細(xì)胞的破壞，因高緯度或長期昏迷造成的氧攝入減少，或者各種類型的貧血。作為對組織處于缺氧壓力狀態(tài)的應(yīng)答，EPO將通過促進(jìn)紅細(xì)胞前祖細(xì)胞的增殖來增加紅細(xì)胞的產(chǎn)生。當(dāng)循環(huán)系統(tǒng)中紅細(xì)胞的數(shù)量超過正常組織需氧量所需時，循環(huán)系統(tǒng)中EPO減少。
由于EPO在紅細(xì)胞生成過程中至關(guān)重要，所以這一激素在診斷和治療以紅細(xì)胞生成低下或缺陷為特征的血液病中都具有潛在的用途。最近的研究為推測EPO療法在多種疾病、紊亂和血液學(xué)異常情況中的效用提供了基礎(chǔ)，這些疾病等包括β-地中海貧血(參見Vedovato等，(1984)《血液學(xué)學(xué)報》(ActaHaematol)71211-213)；囊性纖維變性(參見Vichinsky等(1984)《兒科雜志》(J.Pediatric)10515-21)；妊娠及月經(jīng)疾病(參見Cotes等(1993)《英國骨病和婦科學(xué)雜志》(Brit.J.Ostet.Gyneacol)90304-311；早期早熟性貧血(參見Haga等(1983)《兒科病學(xué)報》(Acta.Pediatr.Scand.)72827-831)；脊髓損傷(參見Claus-Walker等(1984)《生理學(xué)醫(yī)學(xué)康復(fù)文獻(xiàn)》(Arch.Phys.Med.Rehabil.)65370-374)；航空病(參見Dunn等(1984)《歐洲應(yīng)用生理學(xué)雜志》(Eur.J.Appl.Physiol.)52178-182)；急性失血(參見Miller等(1982)《英國血液學(xué)雜志》(Brit.J.Haematol.)52545-590)；衰老(參見Udupa等(1984)《實驗室臨床醫(yī)學(xué)雜志》(J.Lab.Clin.Med.)103574-580和581-588，Lipschitz等(1983)《血液》(Blood)63502-509)；各種伴隨異常紅細(xì)胞生成的腫瘤疾病(參見Dainiak等(1983)《癌癥》(Cancer)51101-1106和Schwartz等(1983)《耳鼻喉科》(Otolaryngol.)109269-272)和腎功能不全(參見Eschbach等(1987)《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》(N.Eng.J.Med.)31673-78)。
純化的、同源EPO已被描述過。參見Hewick美國專利4,677,195。編碼EPO的DNA序列被純化、克隆并表達(dá)，以產(chǎn)生具有相同生物化學(xué)和免疫學(xué)性能的合成多肽。已經(jīng)生產(chǎn)出了所具有的寡糖與天然的相同的重組EPO。參見Sasaki等(1987)《生物化學(xué)雜志》(J.Biol.Chem.)26212059-12076)。
盡管可以得到純化的重組EPO，但是對EPO誘導(dǎo)的成紅細(xì)胞增殖和分化機制知之甚少。還沒有人描述過EPO與未成熟紅細(xì)胞、血小板和巨核細(xì)胞的前祖細(xì)胞特殊的相互作用。這至少但不完全是由于正常成紅細(xì)胞和紅白血病細(xì)胞系上表面EPO受體分子較少。參見Krantz和Coldwasser《美國科學(xué)院院報》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)817574-7578；Branch等(1987)《血液》691782-1785；Mayeux等(1987)(FEBS letters)211229-233；Mufson和Gesner(1987)《(血液》691485-1490；Sakaguchi等，(1987)《生物化學(xué)和生物物理學(xué)研究通訊》(Biochem.Biophys.Res.Commun.)1467-12；Sawyer等(1987)《美國科學(xué)院院報》843690-3694；Sawyer等(1987)《生物化學(xué)雜志》2625554-5562和Todokoro等(1988)《美國科學(xué)院院報》844126-4130)。
放射性碘標(biāo)記的EPO和細(xì)胞表面蛋白形成的交聯(lián)復(fù)合物顯示，細(xì)胞表面蛋白包含分子量分別約85,000和100,000道爾頓的兩條多肽。最近，兩種交聯(lián)復(fù)合物經(jīng)V8蛋白酶消化后被發(fā)現(xiàn)具有相同的肽片段，這表明兩條結(jié)合EPO的多肽可能是相同或非常相似的基因的產(chǎn)物。參見Sawyer等(1988)同上。但是，大多數(shù)對細(xì)胞表面結(jié)合的研究揭示單一的一類結(jié)合位點，平均每個細(xì)胞表面300至600個，Kd約800pM(皮摩爾)。參見Sawyer等(1987)《美國科學(xué)院院報》843690-3694。但是，由輸注了Friend白血病病毒貧血株(FVA)的小鼠制備的EPO-應(yīng)答脾臟成紅細(xì)胞顯示，有一高一低解離常數(shù)分別為100pM和800pM的親和性結(jié)合位點。參見Sawyer等(1987)《生物化學(xué)雜志》2625554-5562和Landschulz(1989)《血液》731476-1478。鼠和人EPO受體蛋白的DNA序列和編碼肽序列已被描述過。參見D’Andrea等，PCT專利公開WO90/08822(公開于1990)。
EPO-R的克隆基因的可得性促進(jìn)了對這種重要受體的激動劑和拮抗劑的研究。重組受體蛋白的可得性允許在多種隨機和半隨機的肽多樣性產(chǎn)生系統(tǒng)中研究受體-配體的相互作用。這些系統(tǒng)包括1991年10月16日申請的美國專利申請778,233所述的“質(zhì)粒上的肽”系統(tǒng)，1991年6月20日申請的美國專利申請718,577和Cwirla等1990年8月在《美國科學(xué)院院報》876378-6382中所述的“噬菌體上的肽”系統(tǒng)，1992年9月16日申請的美國專利申請946,239中所述的“編碼的合成文庫”系統(tǒng)，這是1991年9月18人的申請762,522的一個部分續(xù)展申請，和1990年3月7日的美國專利申請492,462所述的“極大規(guī)模的固定化的聚合物合成”系統(tǒng)；公開于1990年12月13日的PCT專利公開90/15070；1990年12月6日的美國專利申請624,120；Fodor等，1991年2月15日，《科學(xué)》(Science)251767-773；Dower和Fodor，1991《醫(yī)學(xué)化學(xué)報道年刊》(Ann.Rep.Med.Chem.)26271-180；和1991年12月6日的美國專利申請805,727；以上專利公布和出版物均被本文引用參考。
但是，為了研究EPO受體介導(dǎo)的重要生物活性和治療疾病，人們?nèi)匀恍枰环N與EPO-R結(jié)合或否則則與之反應(yīng)的化合物。本發(fā)明就提供了這樣一種化合物。
發(fā)明概述在實施方式之一中，本發(fā)明提供了結(jié)合并激活EPO-R受體或者否則則起EPO激動劑作用的肽。這類肽的長度為10至40或40以上個氨基酸殘基，以長度為14至20個氨基酸為佳，它包含核心序列X3X4X5GPX6TWX7X8(SEQID NO)，每個氨基酸均由一個標(biāo)準(zhǔn)單字母縮寫標(biāo)示；X3可以是C、A、α-氨基-γ-溴丁酸或Hoc，Hoc是高半胱氨酸；X4可以是R、H、L或W；X5是M、F或I；X6獨立地選自20個遺傳性編碼的L-氨基酸或立體異構(gòu)的D-氨基酸中任意一個；X7可以是D、E、I、L或V；X8可以是C，A、α-氨基-γ-溴丁酸或Hoc，Hoc是高半胱氨酸，條件是X3或X8其中之一為C或Hoc。較好的是，肽具有核心序列YX2X3X4X5GPX6TWX7X8(SEQ IDNO)，每個氨基酸均由一個標(biāo)準(zhǔn)單字母縮寫標(biāo)示；X2和X6獨立地選自20個遺傳性編碼的L-氨基酸中任意一個；X3可以是C、A、α-氨基-γ-溴丁酸或Hoc，Hoc是高半胱氨酸；X4可以是R、H、L或W；X5可以是M、F或I；X7可以是D、E、I、L或V；X8可以是C，A、α-氨基-γ-溴丁酸或Hoc，Hoc是高半胱氨酸，條件是X3或X8其中之一為C或Hoc。
更好的是，肽具有核心序列X1YX2X3X4X5GPX6TWX7X8X9X10X11(SEQID NO)，每個氨基酸均由一個標(biāo)準(zhǔn)單字母縮寫標(biāo)示；X1、X2、X6、X9、X10和X11獨立地選自20個遺傳性編碼的L-氨基酸中任意一個；X3可以是C、A、α-氨基-γ-溴丁酸或Hoc，Hoc是高半胱氨酸；X4可以是R、H、L或W；X5可以是M、F或I；X7可以是D、E、I、L或V；X8可以是C，A、α-氨基-γ-溴丁酸或Hoc，Hoc是高半胱氨酸，條件是X3或X8其中之一為C或Hoc。
在較好的實施方式之一中，X3或X8都是C，肽因此具有核心序列X1YX2CX4X5GPX6TWX7CX9X10X11(SEQ ID NO)，更好地，肽具有核心序列X1YX2CX4X5GPX6TWX7CX9X10X11(SEQ ID NO)，X4可以是R或H；X5可以是F或M；X6可以是I、L、T、M或V；X7可以是D或V；X9可以是G、K、L、Q、R、S或T；X10可以是A、G、P、R或Y。在最佳實施方式中，肽具有核心序列X1YX2CX4X5GPX6TWX7CX9X10X11(SEQ ID NO)，X1可以是D、E、L、N、S、T或V；X2可以是A、H、K、L、M、S或T；X4是R或H；X9可以是K、R、S或T；X10是P。具體的、較好的肽包括但不限于以下肽GGLYLCRFGPVTWDCGYKGG；GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG；GGTYSCHFGPLTWVCKPQ；GGDYHCRMGPLTWVCKPLGG；VGNYMCHFGPITWVCRPGGG；GGNYMCHFGPITWVCRPGGG；GGVYACRMGPITWVCSPLGG；VGNYMAHMGPITWVCRPGG；GGPHHVYACRMGPLTWIC；GGTYSCHFGPLTWVCKPQ；GGLYACHMGPMTWVCQPLRG；TIAQYICYMGPETWECRPSPKA；YSCHFGPLTWVCK；
YCHFGPLTWVC；Ac-GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG；GGCRIGPITWVCGG；LGRKYSCHFGPLTWVCQPAKKD；GGTASCHFGPLTWVCKP QGG；GGNYYCRFGPITFECHPTGG；GGEYLCRMGPMTWVCTPVGG；GGLYTCRMGPITWVCLPAGG；GGTTSCHFGPLTWVCKPQGG；GGTFSCHFGPLTWVCKPQGG；GGTYSCHFGALTWVCKPQGG；GGTYSCHFGPLAWVCKPQGG；GGTYSCHFAPLTWVCKPQGG；GGTYSCHFGPATWVCKPQGG；GGTYSCHFGPLTAVCKPQGG；GGTYSCHFGPLTFVCKPQGG；TYSCHFGPLTWVCKPQ；YSCHFGPLTWVCKP；SCHFGPLTWVCK；GGTYSCFGPLTWVCKPQGG；TYSCHFGPLTWVCKPQGG；YSCHFGPLTWVC；GGTYSCHFGPLTFVCKPQGG；和HFGPLTWV.
在另一較好的實施方式中，本發(fā)明的肽被環(huán)化或二聚化。這類可被環(huán)化成C末端酰胺的肽的實例包括但不限于以下肽GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG；GGTYSCHFGPLTWVCKPQ；GGLYACHMGPMTWVCQPLRG；TIAQYICYMGPETWECRPSPKA；YSCHFGPLTWVCK；YCHFGPLTWVC；Ac-GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG；GGCRIGPITWVCGG；LGRKYSCHFGPLTWVCQPAKKD；GGTASCHFGPLTWVCKPQGG；
GGNYYCRFGPITFECHPTGG；GGEYLCRMGPMTWVCTPVGG；GGLYTCRMGPITWVCLPAGG；GGTTSCHFGPLTWVCKPQGG；GGTFSCHFGPLTWVCKPQGG；GGTYSCHFGALTWVCKPQGG；GGTYSCHFGPLAWVCKPQGG；GGTYSCHFAPLTWVCKPQGG；GGTYSCHFGPATWVCKPQGG；GGTYSCHFGPLTAVCKPQGG；GGTYSCHFGPLTFVCKPQGG；TYSCHFGPLTWVCKPQ；YSCHFGPLTWVCKP；YSCHFGALTWVCK；SCHFGPLTWVCK；GGTYSEHFGPLTWVKKPQGG；GGTYSCFGPLTWVCKPQGG；TYSCHFGPLTWVCKPQGG；YSCHFGPLTWVC；和GGTYSCHFGPLTFVCKPQGG.
本發(fā)明一種二聚體的實例如下GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG||GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG.
根據(jù)本發(fā)明的某些實施方式，獨立地選自20個遺傳性編碼的L-氨基酸或立體異構(gòu)的D-氨基酸中任意一個的兩個或兩個以上、以2至6個為佳的氨基酸殘基與上述核心序列的一個或兩個末端偶合。例如，為了方便肽的合成，常常在核心序列的一個或兩末端增加序列GG。本發(fā)明還提供了保留了EPO-R結(jié)合性能的以上肽及其衍生物與肽的肽模擬物的結(jié)合體。
本發(fā)明還提供了用本發(fā)明的新化合物治療與EPO缺乏相關(guān)的疾病的方法。本發(fā)明還提供了包含一種或多種本發(fā)明化合物和藥學(xué)上認(rèn)可的載體的藥物組合物。


圖1提供了本發(fā)明方法中使用的誘變寡聚物的序列。
圖2提供代表本發(fā)明肽的序列。
圖3顯示利用pVIII展示系統(tǒng)構(gòu)建的一新的噬菌粒誘變文庫。在此文庫中，與兩個半胱氨酸處一樣，酪氨酸、甘氨酸-脯氨酸和蘇氨酸-色氨酸殘基(下劃線)是固定的。半胱氨酸殘基之間的其它位置(在原AF11154擊中肽中以空心字體標(biāo)示)利用寡聚構(gòu)建法突變，使得每個氨基酸都可能以50％的頻率改變?yōu)槿魏纹渌被?。“X”表示隨機氨基酸位置。
圖4A-C顯示目前構(gòu)建和篩選的pIII至pVIII噬菌粒誘變文庫。粗體表示的氨基酸殘基是固定的，其余(以NNK表示)是隨機的。4A(ON3007)和4C(ON3017)分別被設(shè)計用來研究核心序列(酪氨酸至第二半胱氨酸)N末端和C末端外部側(cè)翼區(qū)的作用。4B(ON3016)以肽Y-CHFGPLTWVC為基礎(chǔ)，其中酪氨酸殘基與第一半胱氨酸直接相鄰。該文庫在核心序列相鄰的兩端都增加了附加的隨機殘基。
圖5顯示以GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG為基礎(chǔ)，用新的Lac-I展示載體(“頭片二聚體”(“Headpiece Dimer”))構(gòu)建和篩選的誘變文庫。X表示的氨基酸殘基是隨機的(NNK)，加下劃線的是輕度突變的(91∶3∶3∶3/91∶3∶3∶3/K)，空心的是重度突變的(70∶10∶10/70∶10∶10/K)。
圖6顯示以TIAQYICYMGPETWECRPSPKA為基礎(chǔ)，用新的Lac-I展示載體(“頭片二聚體”)構(gòu)建和篩選的誘變文庫。X表示的氨基酸殘基是隨機的(NNK)，空心字體的是固定的，兩個谷氨酸殘基是輕度突變的(91∶3∶3∶3/91∶3∶3∶3/K)。
圖7是選定的本發(fā)明肽的FDCP-1/hEPO-R生物測定結(jié)果圖示●表示GGCRIGPITWVCGG的結(jié)果；○表示GGLYLCRFGPVTWDCGYKGG的結(jié)果；■表示GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG的結(jié)果；▲表示GGDYHCRMGPLTWVCKPLGG的結(jié)果；表示VGNYMCHFGPITWVCRPGGG的結(jié)果；|表示GGVYACRMGPITWVCSPLGG的結(jié)果；+表示VGNYMAHMGPITWVCRPGG的結(jié)果；*表示EPO的結(jié)果。
圖8是EPO(▲和◆分別表示用EPO和10,000或20,000個細(xì)胞/孔進(jìn)行的測定結(jié)果)；和肽VGNYMCHFGPITWVCRPGGG(SEQ ID NO)(■和●分別表示用肽和10,000或20,000個細(xì)胞/孔進(jìn)行的測定結(jié)果)的TF-1生物測定結(jié)果圖示。
圖9A(對照)，9B(用500pM EPO處理)和9C(用25毫摩爾(mm)GGDYHCRMGPLTWVCKPLGG處理)是放大200倍的照片，顯示對經(jīng)苯肼處理小鼠的代表性脾臟細(xì)胞樣群進(jìn)行的MTT增殖測定結(jié)果。
圖10是通過與鏈霉親和素的寡聚反應(yīng)顯示生物素?；碾?即GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK(Ahx-生物素))活性提高的FDCP-1/hEPOR生物測定結(jié)果圖示。肽GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG和GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK(Ahx-生物素)表現(xiàn)出幾乎相同的活性，但是當(dāng)后者預(yù)先與鏈霉親和素復(fù)合時(即GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK(Ahx-生物素)-鏈霉親和素復(fù)合物)，它的活性強得多。在該測定中，在最低濃度時可看到極小的活性下降(5nM，按復(fù)合物中的肽計)。單獨的鏈霉親和素在高濃度時有邊緣活性。
圖11是顯示多克隆山羊抗生物素介導(dǎo)的肽AF11505活性提高的FDCP-1/hEPOR生物測定結(jié)果圖示。將GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK(Ahx-生物素)與山羊抗生物素抗體(GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK+G抗B)預(yù)復(fù)合將肽的活性與游離肽相比提高了一個數(shù)量級。單獨的純化抗體(G抗B)沒有制激效果。
圖12顯示制備GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG的二聚體肽類似物的合成方法。
圖13顯示GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG的二聚體肽類似物的IC50曲線。親和性利用與固定在mAB179上、PIG加尾的EPOR的放射性配體競爭結(jié)合測定法來測定。
圖14顯示利用FDCP-1/hEPOR細(xì)胞增殖測定法測得的GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG的二聚體肽類似物的體外生物活性。二聚體肽的EC50約20納摩爾濃度(nM)，其活性比親本肽提高了20倍。
圖15顯示FDC-P1/ER的細(xì)胞周期進(jìn)程。
圖16顯示對[125I]EPO與固定在瓊脂糖微珠上的EBP之間特異性偶聯(lián)的平衡結(jié)合分析，并顯示根據(jù)結(jié)合等溫線的線性轉(zhuǎn)化(Scatchard)得出的5nM±2的Kd。
圖17A、17B和17C顯示分別用肽GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG，GGTYSCHFGPLTWVCKPQ和LGRKYSCHFGPLTWCQPAKKD進(jìn)行的去缺氧性紅細(xì)胞增多癥(polycythemic exhypoxic)鼠生物測定的結(jié)果。
圖18A和18B顯示分別用肽TIAQYICYMGPETWECRPSPKA和包含兩個二硫鍵的GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG一個二聚體肽類似物進(jìn)行的去缺氧性紅細(xì)胞增多癥鼠生物測定的結(jié)果。
圖19A和19B顯示分別用EPO和GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG進(jìn)行的網(wǎng)織紅細(xì)胞測定結(jié)果。對兩個劑量組而言，n＝10個動物。EPO0.4、4.0、40.0單位/鼠，全劑量媒質(zhì)對照；GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG2.0、20.0、200.0微克/鼠，全劑量媒質(zhì)對照+DMSO(1-2％)200微克/鼠＝10毫克/千克。推論體外增殖測定數(shù)據(jù)顯示2微克GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG＝0.4單位EPO。
圖20A和20B顯示分別用EPO和GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG進(jìn)行的網(wǎng)織紅細(xì)胞測定結(jié)果。對兩個劑量組而言，n＝10個動物。EPO0.4、4.0、40.0單位/鼠，全劑量；GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG將劑量提高至1毫克/鼠，全劑量＝50毫克/千克，即2毫克/鼠，全劑量＝毫克/千克。
本發(fā)明和較佳實施方式的詳細(xì)說明以下術(shù)語的一般意義如下肽中氨基酸殘基的縮寫如下苯丙氨酸為Phe或F；酪氨酸為Leu或L；異亮氨酸為Ile或I；甲硫氨酸為Met或M；纈氨酸為Val或V；絲氨酸為Ser或S；脯氨酸為Pro或P;蘇氨酸為Thr或T；丙氨酸為Ala或A；酪氨酸為Tyr或Y；組氨酸為His或H；谷胺酰胺為Gln或Q；天冬酰胺為Asn或N；賴氨酸為Lys或K；天冬氨酸為Asp或D；谷氨酸為Glu或E；半胱氨酸為Cys或C；色氨酸為Trp或W；精氨酸為Arg或R；甘氨酸為Gly或G。
20個常規(guī)氨基酸的立體異構(gòu)體(即D-氨基酸)，非天然氨基酸例如a，a-二取代氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸和其它非常規(guī)氨基酸也可以作為本發(fā)明化合物的合適組分。這些非常規(guī)氨基酸的實例包括4-羥基脯氨酸、O-磷酸絲氨酸、N-乙酰基絲氨酸、N-甲酰基甲硫氨酸、3-甲基組氨酸、5-羥基賴氨酸以及其它類似的氨基酸和亞氨基酸(例如4-羥基脯氨酸)。
“激動劑”指一類生物活性配體，它們與各自具有互補生物活性的受體結(jié)合并激活后者，由此在受體內(nèi)引起生物應(yīng)答，或者加強受體已有的生物活性。
“宿主細(xì)胞”指可以或已經(jīng)被重組DNA載體轉(zhuǎn)化的真核細(xì)胞或原核細(xì)胞或一類細(xì)胞。出于本發(fā)明的目的，優(yōu)選的是原核細(xì)胞。
“肽”或“多肽”指單體為通過酰胺鍵連接的α氨基酸的聚合物。肽長為2個或者，通常為更多個氨基酸單體。
“藥學(xué)上認(rèn)可的鹽”指制藥行業(yè)常用的無毒堿金屬、堿土金屬和銨鹽，其中包括鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽、鈣鹽、鎂鹽、鋇鹽、銨鹽和魚精蛋白鋅鹽，它們的制備是本領(lǐng)域所熟知的。該術(shù)語還包括無毒的酸加成鹽，它們通常通過本發(fā)明化合物與合適的有機或無機酸反應(yīng)來制備。代表性的鹽包括鹽酸鹽、氫溴酸鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、乙酸鹽、草酸鹽、戊酸鹽、油酸鹽、十二烷酸鹽、硼酸鹽、苯甲酸鹽、乳酸鹽、磷酸鹽、甲苯磺酸鹽、檸檬酸鹽、馬來酸鹽、富馬酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、napsylate等。
“藥物或治療有效劑量或有效量”指足夠誘導(dǎo)產(chǎn)生所要求的生物結(jié)果的劑量水平。該結(jié)果可以是對疾病表現(xiàn)、癥狀或病因的緩解，或者任何其它要求的生物系統(tǒng)的改變。較好的是，該劑量足夠刺激EPO-R，并由此緩解與體內(nèi)EPO缺乏或紅細(xì)胞缺陷或缺少相關(guān)的癥狀。
“重組DNA克隆或表達(dá)載體”指編碼某種功能并可用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的DNA分子或RNA分子。處于本發(fā)明的目的，克隆載體通常主要在表達(dá)載體的構(gòu)建中起中間體的作用；表達(dá)載體被用于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，使得被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞產(chǎn)生由載體編碼的蛋白質(zhì)或其它產(chǎn)物。這類載體通常為“質(zhì)粒”，出于本發(fā)明的目的，這些質(zhì)粒通常是能夠在宿主細(xì)胞內(nèi)于染色體外維持的載體，但是也可以是整合到宿主細(xì)胞的基因組內(nèi)的載體。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)本發(fā)明的定義，將“克隆載體”稱為“載體”，將“表達(dá)載體”稱為“質(zhì)?！薄?br> 本發(fā)明提供了一種結(jié)合并激活或者否則則起EPO激動劑作用的化合物。這類化合物包括利用隨機肽多樣性生成系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)的“主導(dǎo)”肽化合物，和被構(gòu)建成分子結(jié)構(gòu)或形狀與主導(dǎo)化合物相同或相似但在易水解性或易蛋白酶解性方面和/或其它生物性能方面，例如受體親和性的提高、體外或體內(nèi)活性的提高方面與主導(dǎo)化合物不同的“衍生”化合物。
最初使用的隨機肽多樣性生成系統(tǒng)包括前文所述的“噬菌體上的肽”系統(tǒng)。隨機肽被設(shè)計成8個氨基酸的長度，在兩端有Cys殘基(這樣，總長為10個氨基酸)。在這些早期系統(tǒng)中，隨機肽的形式為融合蛋白的一部分，該蛋白包含噬菌體fd衍生物的pVIII外被蛋白(噬菌體上的肽)。融合蛋白、以及編碼融合蛋白的DNA在固定化的EPO-R上接受“篩選”。篩選過程包括融合蛋白與固定化受體的多輪孵育，挑選出與受體結(jié)合的融合蛋白(以及相伴DNA)，和生成更多的挑選出的融合蛋白。
通常，在三輪篩選后，分離出融合蛋白和相伴DNA，并進(jìn)行培養(yǎng)以產(chǎn)生用于ELISA的融合蛋白制劑，ELISA用來確定融合蛋白是否與受體特異性地結(jié)合。該測定的進(jìn)行與篩選相似，所不同的是在去除不結(jié)合的融合蛋白后，測試孔用兔抗噬菌體抗體(或者，對于質(zhì)粒上的肽系統(tǒng)，使用抗lac抗體)處理，再用堿性磷酸酶偶合的山羊抗兔抗體處理，然后用常規(guī)方法測定每孔中堿性磷酸酶的量。通過將測試孔與對照孔(無受體)比較，可以確定融合蛋白是否與受體特異性地結(jié)合。
用于篩選和ELISA方法的固定化受體包含EPO-受體的胞外區(qū)，而且是在重組宿主細(xì)胞中生成的。該受體分子可以在多種不同形式的宿主細(xì)胞中產(chǎn)生。一種有用的形式是被構(gòu)建成具有利于蛋白質(zhì)分泌和糖基磷酸脂膜錨定附著的信號肽(這種錨定附著形式被稱為“PIG-加尾”；參見Caras和Weddell，1989年3月3日，《科學(xué)》2431196-1198；和Lin等，1990年8月10日，《科學(xué)》249677-679，兩種均在本文中引用參考)。該系統(tǒng)允許從表達(dá)受體的細(xì)胞表面切割受體，并十分方便地收集割離的受體。較好的是，在PIG加尾受體的HPAP表位和受體本身之間插入一個蛋白酶切割位點，例如凝血酶切割位點。
重組受體蛋白用以下方法來固定。用抗受體抗體包被微量滴定板，用來容納固定化受體的測試孔用牛血清白蛋白(BSA)處理以抑制非特異性結(jié)合。在微量滴定板包被過的測試孔中加入具有凝血酶切割位點的PIG加尾受體，然后洗滌這些測試孔以去除非結(jié)合的受體。
在使用允許多價配體-受體相互作用的隨機肽生成系統(tǒng)時，必需認(rèn)識到，固定化受體的密度是決定將與固定化受體結(jié)合的配體的親和性的重要因素。在高受體密度下(即每個抗受體抗體包被的測試孔用0.25至0.5毫克受體處理)，與低受體密度情況(即每個抗受體抗體包被的測試孔用0.5至1納克受體處理)相比更易于發(fā)生多價結(jié)合。如果發(fā)生多價結(jié)合，則更可能分離到親和性較低的配體。通常，可以用高密度固定化受體鑒定主導(dǎo)化合物，然后在低受體密度下測試主導(dǎo)化合物的衍生物，以便分離出比主導(dǎo)化合物具有更高親和性的的化合物。
經(jīng)常，只在微量滴定板的間隔列中加入受體；“空白”列中BSA抑制的測試孔用作陰性對照以確定受體特異性反應(yīng)是否產(chǎn)生觀察得到的結(jié)果。然后在測試孔中加入融合蛋白制劑并孵育，以便發(fā)生與受體的結(jié)合；然后，洗滌測試孔以去除不結(jié)合的融合蛋白。
利用以上系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)了一種與EPO-R結(jié)合的肽。對編碼結(jié)合受體的融合蛋白的DNA進(jìn)行了測序。該肽具有以下序列GGCRIGPITWVCGG(SEQID NO)(N末端的GG殘基允許肽從噬菌體上割離)。通過ELISA測定，該肽始終表現(xiàn)出對BSA和對抗受體抗體的低親和性，以及對EPO-R的高親和性。而且，噬菌?？寺∈艿接坞xEPO和同源游離肽的競爭。而且，游離肽被發(fā)現(xiàn)與EPO-噬菌體、LacI-EPO融合蛋白和放射性配體之間有競爭。
然后對這種優(yōu)選肽進(jìn)行了誘變研究。為了產(chǎn)生編碼隨機肽的寡核苷酸集合，制備了圖1所示的誘變寡聚物，在其中的密碼子基元(NNK)中，N是A、C、G或T(等摩爾；根據(jù)所用的方法，可以使用其它核苷酸)，K是G或T(等摩爾)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，NNK基元編碼全部氨基酸，只編碼一個終止密碼子，并減少密碼子的偏性。有NNK基元可產(chǎn)生32個可能的密碼子1種情況為12種氨基酸，2種情況各自5種氨基酸，3種情況各自3種氨基酸，和三種終止密碼子中的1個。
再次在固定化的EPO-R上篩選誘變?nèi)诤系鞍祝约熬幋a這些蛋白的DNA。然后分離出融合蛋白和相伴NDA，進(jìn)行培養(yǎng)以生成用于ELISA的融合蛋白制劑，通過ELISA確定融合蛋白是否特異性地與受體結(jié)合。圖2顯示了由該研究獲得的較好的肽。這類肽的特征在于具有以下基元“X3X4X5GPX6TWX7X8”(SEQ ID NO)，其中每個氨基酸由一個標(biāo)準(zhǔn)單字母縮寫表示；X6獨立地選自20個遺傳性編碼的L-氨基酸或立體異構(gòu)的D-氨基酸中任意一個；X3可以是C、A、α-氨基-γ-溴丁酸或Hoc，Hoc是高半胱氨酸；X4可以是R、H、L或W；X5是M、F或I；X7可以是D、E、I、L或V；X8可以是C，A、α-氨基-γ-溴丁酸或Hoc，Hoc是高半胱氨酸，條件是X3或X8其中之一為C或Hoc。
為了粗略確定肽的親和性，用親和性選擇法對噬菌體文庫也進(jìn)行篩選，在其中，肽與EPO(100nM)競爭。一般重復(fù)該過程進(jìn)行2輪篩選。在以后輪次的篩選中，可以進(jìn)一步改變競爭的溫度(4℃至環(huán)境溫度)和時間(15至30分鐘)以及洗滌溶液的溫度(4℃至環(huán)境溫度)，以便挑選出具有高親和性的肽。使用該親和性選擇法，分離得到了具有以下共有基元的肽“X1YX2CX4X5GPX6TWX7CX9X10X11”(SEQ ID NO)，其中每個氨基酸由一個標(biāo)準(zhǔn)單字母縮寫表示；X1、X2、X6、X9、X10和X11獨立地選自20個遺傳性編碼的L-氨基酸或其立體異構(gòu)的D-氨基酸中任意一個；X4可以是R、H、L或W；X5是M、F或I；X7可以是D、E、I、L或V。在一種較好的實施方式中，肽包含以下氨基酸序列X1YX2CX4X5GPX6TWX7CX9X10X11(SEQ ID NO)，其中X4可以是R或H；X5可以是F或M；X6可以是I、L、T、M或V；X7是D或V；X9可以是G、K、L、Q、R、S或T；X10可以是A、G、P、R或Y。在最佳實施方式中，核心肽包含以下氨基酸序列X1YX2CX4X5GPX6TWX7CX9X10X11(SEQ ID NO)，其中X1可以是D、E、L、N、S、T或V；X2可以是A、H、K、L、M、S或T；X4可以是R或H；X9可以是K、R、S或T；X10是P。
以下表格列出了在親和性選擇過程中分離得到的該基元范圍內(nèi)的代表性肽實例。
表1通過親和性選擇得到的肽與100nM EPO競爭，15分鐘，4℃GGWVTCRMGPITWVCGVHGG(SEQ ID NO)GGQLLCGIGPITWVCRWVGG(SEQ ID NO)GGLYLCRMGPVTWECQPRGG(SEQ ID NO)GGKYSCFMGPTTWVCSPVGRGV (SEQ ID NO)GGWVYCRIGPITWVCDTNGG(SEQ ID NO)GGIYKCLMGPLTWVCTPDGG(SEQ ID NO)GGMYYCRMGPMTWVCKGAGG(SEQ ID NO)無競爭
GGTTQCWIGPITWVCRARGG(SEQ ID NO)GGPYHCRMGPITWVCGPVGG(SEQ ID NO)GGEYLCRMGPITWVCERYGG(SEQ ID NO)GGEYRCRMGPISWVCSPQGG(SEQ ID NO)GGNYTCRFGPLTWECTPQGGGA (SEQ ID NO)GGNYVCRMGPITWICTPAGG(SEQ ID NO)表2通過親和性選擇得到的肽第二次與100nM EPO競爭，15分鐘，4℃GGSWDCRIGPITWVCKWSGG(SEQ ID NO)GGDYTCRMGPMTWICTATRG(SEQ ID NO)GGDYNCRFGPLTWVCKPSGG(SEQ ID NO)GGSYLCRMGPTTWLCTAQRG(SEQ ID NO)GGDYHCRMGPLTWVCKPLGG(SEQ ID NO)VGNYMCHFGPITWVCRPGGG(SEQ ID NO)GGLYLCRMGPQTWMCQPGGG(SEQ ID NO)GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG(SEQ ID NO)GGDYVCRMGPMTWVCAPYGR(SEQ ID NO)GGLYECRMGPMTWVCRPGGG(SEQ ID NO)GGWYSCLMGPMTWVCKAHRG(SEQ ID NO)GGKYYCWMGPMTWVCSPAGG(SEQ ID NO)無競爭GGYVMCRIGPITWVCDIPGG(SEQ ID NO)GSCLQCCIGPITWVCRHAGG(SEQ ID NO)GGNYFCRMGPITWVCQRSVG(SEQ ID NO)GGEYICRMGPLTWECKRTGG(SEQ ID NO)GGLYACRMGPITWVCKYMAG(SEQ ID NO)GGQYLCTFGPITWLCRGAGGGS (SEQ ID NO)GGVYACRMGPITWVCSPLGG(SEQ ID NO)GGYTTCRMGPITWVCSAHGG(SEQ ID NO)表3通過親和性選擇得到的肽與100nM EPO競爭，15分鐘，室溫VGNYMCHFGPITWVCRPGGG(SEQ ID NO)
GGTYKCWMGPMTWVCRPVGG(SEQ ID NO)GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG(SEQ ID NO)GGDYHCRMGPLTWVCKPLGG(SEQ ID NO)GGNYYCRFGPITFECHPTGG(SEQ ID NO)GGLYACHMGPMTWVCQPLRGGGS (SEQ ID NO)GGEYKCYMGPITWVCKPEGG(SEQ ID NO)GGDYVCRMGPMTWVCAPYGRGGS (SEQ ID NO)無競爭GGNYVCRMGPITWICTPAGG(SEQ ID NO)GGDYTCRMGPMTWICTATRG(SEQ ID NO)GGEYLCRMGPMTWVCTPVGG(SEQ ID NO)GGSYLCRMGPTTWLCTAQRGGGN (SEQ ID NO)GGLYTCRMGPITWVCLPAGG(SEQ ID NO)GGLYKCRMGPMTWVCSPFGG(SEQ ID NO)表4通過親和性選擇得到的肽與100nM EPO競爭，30分鐘，室溫GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG(SEQ ID NO)GGDYHCRMGPLTWVCKPLGG(SEQ ID NO)VGNYMCHFGPITWVCRPGGG(SEQ ID NO)無競爭GGDYVCRMGPMTWVCAPYGR(SEQ ID NO)GGDYNCRFGPLTWVCKPSGG(SEQ ID NO)還用固定化EPO-R篩選了另一個誘變文庫，該文庫具有與一個隨機8元體連接的6個隨機氨基酸殘基，8元體兩側(cè)有2個半胱氨酸殘基。仍然用固定化EPO-R篩選誘變?nèi)诤系鞍滓约熬幋a這些蛋白的DNA。然后分離出融合蛋白和相伴NDA，進(jìn)行培養(yǎng)以生成用于ELISA的融合蛋白制劑，通過ELISA確定融合蛋白是否特異性地與受體結(jié)合。由該研究獲得的較好的肽的特征在于具有以下序列GGPHHVYACRMGPLTWIC(SEQ ID NO)，因此被包涵在核心序列“YX2X3X4X5GPX6TWX7X8”(SEQ ID NO)中，其中每個氨基酸由一個標(biāo)準(zhǔn)單字母縮寫表示；X2和X6獨立地選自20個遺傳性編碼的L-氨基酸或立體異構(gòu)的D-氨基酸中任意一個；X3可以是C、A、α-氨基-γ-溴丁酸或Hoc，Hoc是高半胱氨酸；X4可以是R、H、L或W；X5是M、F或I；X7可以是D、E、I、L或V；X8可以是C，A、α-氨基-γ-溴丁酸或Hoc，Hoc是高半胱氨酸，條件是X3或X8其中之一為C或Hoc，該核心序列的氨基末端與一個六氨基酸單元偶合，六氨基酸單元中每個氨基酸獨立地選自20個遺傳性編碼的L-氨基酸或立體異構(gòu)的D-氨基酸中任意一個。
計算了以上通用基元表示的幾種肽的IC50。用游離肽來測定該值，并列于以下表5。(以下每種肽均獨立合成，并在C末端酰胺化，但可以方便地將其制備成游離羧酸或酯或其它羧酰胺。)表5肽 IC50GGLYLCRFGPVTWDCGYKGG(SEQ ID NO) 1.67μMGGTYSCHFGPLTWVCKPQGG(SEQ ID NO) 237nmGGDYHCRMGPLTWVCKPLGG(SEQ ID NO) 179nmVGNYMCHFGPITWVCRPGGG(SEQ ID NO) 420nmGGVYACRMGPITWVCSPLGG(SEQ ID NO) 352nmVGNYMAHMGPITWVCRPGG(SEQ ID NO) 67μM除了以上所述之外，還在被設(shè)計用于富集更高親和性肽的條件下對高親和性EPO激動劑家族的肽進(jìn)行了其它誘變研究。如前所述，為了富集更高親和性的肽，用肽與EPO(100nM)競爭的親和性選擇法篩選文庫。該過程通常重復(fù)進(jìn)行2輪篩選。在以后輪次的篩選中，可以進(jìn)一步改變競爭的溫度(4℃至環(huán)境溫度)和時間(15至30分鐘)以及洗滌溶液的溫度(4℃至環(huán)境溫度)，以便挑選出具有高親和性的肽。使用該技術(shù)，仍然用固定化EPO-R篩選得到了一個誘變文庫，其中在側(cè)翼序列YXCRIGPITWVC兩側(cè)分別具有3個隨機氨基酸殘基(參見圖3)。仍然用固定化EPO-R篩選誘變?nèi)诤系鞍滓约熬幋a這些蛋白的DNA，然后分離和培養(yǎng)融合蛋白和相伴DNA以產(chǎn)生用于ELISA的融合蛋白制劑，通過ELISA來確定融合蛋白是否與受體特異性地結(jié)合。以下表6列出了由該研究得到的較好的肽。
表6GGEYICVMGPNTWVCSPTRGHGSGGEYLCRMGPMTWVSPFTRKGGGGQYICRFGPITWQSQPAGGGSGREYSCRMGPITWVCMPRASLGSGDYLCSMGPITWICVPERGGGSELWYSCRMGPVTWMCGRYQGGGS在另一誘變研究中，用固定化EPO-R還篩選到了一個誘變文庫，其中具有高度保守的固定殘基(即Y、C、G、P、T和W)，其它殘基是隨機的，在N末端的酪氨酸之前有10個附加殘基(參見圖4A)。仍然用固定化EPO-R篩選誘變?nèi)诤系鞍滓约熬幋a這些蛋白的DNA，然后分離和培養(yǎng)融合蛋白和相伴DNA以產(chǎn)生用于ELISA的融合蛋白制劑，通過ELISA來確定融合蛋白是否與受體特異性地結(jié)合。以下表7列出了由該研究得到的較好的肽。
表7QICRADRKGIYQCWYGPETWICggQQGYSLWLPWYNCVLGPYTWVCggYGGSAAVPWKYGCSLGPVTWVCggQIVSWGLYSGYLCMVGPVTWLCggGSGALSAAGWYGCRVGPLTWVCggSVVSHDAAGVYDCVIGPVTWICggIYSWTGILGSYVCWYGPDTWVCggSCIYVRFFYCYQCSEGPATWLCggTVAKGQSGVRYSCLRGPETWVCggVQPQYKWATMYQCWKGPSTWFCggKSGVWEMGSSYQCARGPRTWCCggCSVRRMDREYYRCCRGPFTWQCggKYQEEMFMGYQCLQGPKTQLCggVCPGSEFRVGYICAMGPYTWDCggSLCSSRCNSPYFCSIGPSTWRCggQASLGLPLKQYLCVLGPHTWLCggACKPAALFVQYGCVLGPMTWICggSCERAGGRWEYVCQWGPDTWLCggRVARQVQQVSYWCAHGPATCYCggHKYDTLMLTNYVCQRGPLTQLCgg在另一誘變研究中，用固定化EPO-R還篩選到了一個誘變文庫，其中具有高度保守的固定殘基(即Y、C、G、P、T和W)，其它殘基是隨機的，在第二半胱氨酸和(Gly)4-Ser接頭之間有10個附加殘基(參見圖4B)。在該文庫中，在保守的酪氨酸之前有兩個甘氨酸殘基，這有利于有效地割離信號肽。仍然用固定化EPO-R篩選誘變?nèi)诤系鞍滓约熬幋a這些蛋白的DNA，然后分離和培養(yǎng)融合蛋白和相伴DNA以產(chǎn)生用于ELISA的融合蛋白制劑，通過ELISA來確定融合蛋白是否與受體特異性地結(jié)合。以下表8列出了由該研究得到的較好的肽。
表8ggYHCEWGPETWICRPEISPLTVMggggYICDYGPLTWACKPAGATLLQPggggYTCRFGPVTWDCLPAINHNGVLggggYQ*FMGPETWVCAPEPRVERVSggggYLCRFGPETWTCAPERSVVTQSggggYVCDFGPTTWICRGQVMEHINTggggYMCNMGPLTWDCSPVRSTSMAWggggYHCEWGPETWICRPEISPLTVMggggYNCTMGPNTWVCTPAAESPAVFggggYGCRIGPITWICDDVSRSPRAggYTCRMGPQTWECLPMSEGVggYNCKFGPQTWDCSSANLKEVgYLCEMGPETWMCRPEDAKLGVggYGCKFGPVTWICEDLLLDPMYggYNCKFGPQTWDCSSANLKEVLVgYLCEMGPETWMCRPEDCEAWggYGCGLAPVTWECPQVSIPYGLSggggYGCRIGPTTWICD STVPQLREVggggYRCSWAPETWVCDNHSAgYLCNFGPITWDCVSSAQSEMQIgg在另一誘變研究中，用固定化EPO-R還篩選到了一個誘變文庫，其中具有高度保守的固定殘基(即Y、C、G、P、T和W)，而且第二酪氨酸與第一半胱氨酸直接相鄰，其它氨基酸是隨機的，包括酪氨酸N末端的4個殘基和第二半胱氨酸與接頭之間有5個殘基(參見圖4C)。N末端的隨機氨基酸之前仍然有兩個甘氨酸殘基，這有利于有效的加工。仍然用固定化EPO-R篩選誘變?nèi)诤系鞍滓约熬幋a這些蛋白的DNA，然后分離和培養(yǎng)融合蛋白和相伴DNA以產(chǎn)生用于ELISA的融合蛋白制劑，通過ELISA來確定融合蛋白是否與受體特異性地結(jié)合。以下表9列出了由該研究得到的較好的肽。
表9ggAELQYCKIGPETWVCDWPHIggggPYEGYCSGGPVTWECCVSVCggggQPLPYCSPGPTTWFCINWLFggggCSYGYCPMGPFTWMCRQRRLgg
ggVRGSYCQSGPPTWQCDLRFFggggRCARYCACGPGTWNCLGRCQggggLGRCYCVYGPLTWWCSQTSLggggLCVWYCSAGPWTWYCIYRSAggggKPGPYCSFGPETWVCTALGMggggRLGEYCEIGPITWICRLFLPggggPGLGYCDFGPLTWVCDGSVDggggLSSAYCRYGPETWICWAGTGggggVLHLYCYYGPETWDCLPIKAggggGGGVYCLVGPVTWLCGPAAMggggLTRNYCRIGPETWICQEVAIggggWSERYCVLGPLTWECVHLFAggggMPLKYCGMGPVTWVCCEAVSggggSVMRYCHFGPETWICPYDMPggggALYPYCLIGPMTWVCQVGWIggggTYGNYCRGGPGTWHCEDTRGggggASYCYCSKGPATWKCVGSILggggSLAAYCLQGPKTWPCVRRRLggggTDSLYCKLGPLTWHCQLYQKgggISQQYCWRGPATWVCLEWELgg除了以上誘變研究之外，還利用經(jīng)修改的C-末端Lac-I展示系統(tǒng)進(jìn)行了肽GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG的誘變，該系統(tǒng)中，借助于鑒定用高親和性擊中(“頭片二聚體”)降低了展示價(display valency)。本文引用參考的美國專利5,338,665詳細(xì)描述了Lac-I頭片二聚體(HPD)展示系統(tǒng)。主要的是，在前述誘變研究中高度保守的殘基(即Y、C、G、P、T和W)被輕度突變，保守性較低的殘基(即H、F、L和V)受到較高程度的突變。酪氨酸殘基之前有4個隨機氨基酸，其后有一個隨機氨基酸。誘變產(chǎn)物的C末端以6個隨機氨基酸結(jié)束，它們在半胱氨酸之后。圖5詳細(xì)顯示了該文庫構(gòu)建物。
用固定在mAb179上的PIG加尾EPO-R對文庫進(jìn)行了4輪篩選，期間利用來自第二輪的EPO洗液進(jìn)行以后的洗脫以富集親和性更高的克隆。將得到的DNA插入片段混合克隆到麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)載體中，允許它們以C末端融合蛋白的形式表達(dá)。隨機挑選不同的MBP融合克隆制成粗細(xì)胞裂解物，然后在ELISA中測定與EPO-R的結(jié)合。該研究得到的較好的肽列于以下表10。
表10RTKEYSCQMGPLTWICVPKSSKARYMCHMGPLTWVCRPEVGGKAYMCRLGPVTWVCSPRIKLLLRGYECYMGPLTWVCRSSKPRTIAQYICYMGPETWECRPSPKANGRTYSCQLGPVTWVCSRGVRRLGRKYSCHFGPLTWVCQPAKKDMKTKYKCYMGPLTWVCEGSSKTKYRCEMGPLTWVCERWLTRLYSCHMGPSTWVCSTALRKRGQLYACHFGPVTWVCKRRKRVSGILYECHMGPLTWVCTPSRRRGSKTYSCQLGPVTWVCGRKRARGKYQCQFGPLTWECLPIRPRVTRMYRCRMGPLTWVCERKPSLYECHLGPLTWECRPRRRERGHMYSCQLGPVTWVCKPLSGRITPTYHCKFGPQTWVCAPKRSALTKGNRMYQCHMGPLTWVCQPTRIHMKTKYKCYMGPLTWVCEGSRLKHLGKYDCSFGPQTWVCKPRRSLERRVYECQMGPLTWECKPGVKGITPTYHCKFGPQTWVCAPKRSALTKLGRKYSCHFGPVTWVCQPAKKDRGRGYSCQMGPVTWVCKRERYFRLREYRCHMGPQTWVCNGHHSKSGALYDCQMGPITWVCRANRQKTNQVYGCKFGPKTWVCKPAPRITRGMYACHMGPQTWVCRPTQPRVLSNYECTMGPKTWVCKPLRLK用Lac-I頭片二聚體展示系統(tǒng)得到的肽，其最突出的特征之一是保守性半胱氨酸兩側(cè)區(qū)域多個正電荷的累積。在RGQLYACHFGPVTWVCKRRKRV中尤其如此，該序列在其C末端有5個這樣的延伸殘基。輕度誘變的氨基酸(即Y、C、G、P、T和W)絕對保守，但是在突變較嚴(yán)重的位置產(chǎn)生了新的基元。尤其有意義的是在許多肽中出現(xiàn)了多一個附加酪氨酸殘基(參見例如LLRGYECYMGPLTWVCRSSKPR)，以及在TIAQYICYMGPETWECRPSPKA的半胱氨酸之間有兩個谷氨酸殘基。
除了以上誘變研究之外，還利用經(jīng)修改的類似于前述系統(tǒng)的C-末端Lac-I展示系統(tǒng)進(jìn)行了肽TIAQYICYMGPETWECRPSPKA的誘變。主要的是，在前述誘變研究中高度保守的殘基(即Y、C、G、P、T和W)是固定的，保守性較低的殘基(即H、F、L和V)是隨機的。此外，兩個谷氨酸殘基被輕度突變。酪氨酸殘基之前有4個隨機氨基酸，其后有一個隨機氨基酸。誘變產(chǎn)物的C末端以6個隨機氨基酸結(jié)束，它們在半胱氨酸之后。圖6詳細(xì)顯示了該文庫構(gòu)建物。
用固定在mAb179上的PIG加尾EPO-R對文庫進(jìn)行了3輪篩選，期間利用來自第二輪的EPO洗液進(jìn)行以后的洗脫以富集親和性更高的克隆。先用人Fcγ-EBP試劑，然后用Sigma Chemical Co.St.Louis，Missouri的與堿性磷酸酶結(jié)合的山羊抗人Fcγ進(jìn)行探測，如此挑選菌落。然后，對鑒定出的HPD質(zhì)粒進(jìn)行鑒定和測序。該研究得到的較好的肽列于以下表11。
表11ALKKYDCYFGPETWECLARRPHERRFYKCRFGPETWECTLFGQEYRCHLGPETWQCSPVRVGFRPEYMCRMGPETWECGGARPGSRKYwCRMGPETWECMKPVRLGLKAYGCRYGPETWDCRSVILIIRQPYICHMGPETWECGRYPAGKGASYHCIMGPETWECIPQRVWMKQLYSCIMGPETWECRPGVERQRHYYRCALGPETWECRPMSPETKRLYHCHMGPETWECHGPMRKTRPSYRCAFGPVTWECIPARRHKSYvCTFGPETWECTGAIRRRGRMYNCRMGPETWECKGQSKDRRRYYRCWMGPETWECSPVSNKVADNYDCPIGPVTWECIHVRASVQKKYLCHFGPETWECGPDRDWQTWYICERGPETWECRWLVLYRMPYRCKMGPETWECVGGRGRYSREYSCRMGPETWECXRGFLR
然后將以上肽序列混合物克隆到麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)載體中，使它們表達(dá)為C末端融合蛋白。隨機挑選不同的MBP融合克隆制成粗細(xì)胞裂解物，然后在ELISA中測定與EPO-R的結(jié)合。該研究得到的較好的肽列于以下表12。
表12RSMWYRCQMGPQTWVCGPRSASSRREYICHLGPQTWVCGPGGRKGSPSYHCHLGPLTWVCKPHRMRMVGRYQCHMGPRTWVCKPWHGGTARYQCHFGPLTWVCKPSLKGELRGYICHFGPVTWVCKPNGSRLKQGYQCQLGPQTWVCRPLRMPKERKYECQFGPRTWVCQPTRANVRKVYACHMGPVTWVCVPGYKGSGQRYVCRMGPETWVCRSYRGLERRSYSCQMGPVTWVCGRQMGQVKNNYRCQFGPVTWVCKAFRSGASYDCQMGPITWVCRANRQK被發(fā)現(xiàn)與EPO-受體特異性結(jié)合的代表性肽還在以細(xì)胞為基礎(chǔ)的功能性測定中接受了測試。測定之一使用FDCP-1，即以生長因子依賴型鼠多能前紅細(xì)胞生成性前祖細(xì)胞系(參見Dexter等(1980)《實驗醫(yī)學(xué)雜志》(J.Exp.Med.)1521036-1047)作為親代細(xì)胞系。在補充以WEHI3條件培養(yǎng)基(含有IL-3的培養(yǎng)基，ATCC編號T1B68)時，該細(xì)胞系能夠增殖但是不能分化。按照下文用人或鼠的EPO-R轉(zhuǎn)染親代細(xì)胞系，以分別生產(chǎn)FDCP-1-hEPO-R或產(chǎn)FDCP-1-mEPO-R細(xì)胞系。在人或鼠EPO存在下，這些轉(zhuǎn)染細(xì)胞系能夠增殖但不能分化。
簡而言之，在必需生長因子存在下，將這些細(xì)胞培養(yǎng)至半穩(wěn)態(tài)密度。然后在PBS中洗滌細(xì)胞，并在沒有生長因子的完全培養(yǎng)基中饑餓16至24小時。在測定了細(xì)胞的存活率后，制備成每50微升約105個細(xì)胞的儲備液(制備在無生長因子的完全培養(yǎng)基中)。在96孔的組織培養(yǎng)板上測試待測化合物的連續(xù)稀釋液(與噬菌體結(jié)合或其它形式結(jié)合或固定化肽相反，一般是游離的、溶液相的肽)，每孔的最終體積為50微升。在每孔中加入細(xì)胞(50微升)，孵育24至48小時，此時，陰性對照將死亡或靜息。然后利用本領(lǐng)域已知技術(shù)測定細(xì)胞的增殖，例如與3H-胸苷相關(guān)聯(lián)，用它的摻入顯示細(xì)胞增殖的MTT測定(參見Mosmann(1983)《免疫學(xué)方法雜志》(J.Immunol.Methods)6555)。圖7顯示了對EPO和表5所列的肽的這一測定的結(jié)果。在基于FDCP-1/hEPO-R細(xì)胞的生物測定中與EPO受體結(jié)合，并表現(xiàn)出活性的肽是本發(fā)明的優(yōu)選化合物。
第二種以細(xì)胞為基礎(chǔ)的測定使用TF-1細(xì)胞系。參見本文引用參考的Kitamura等(1989)《血液》73375-380。圖8顯示了代表性的結(jié)果。圖8顯示了EPO和游離肽VGNYMCHFGPITWVCRPGGG(SEQ ID NO)對細(xì)胞系TF-1增殖的影響。
進(jìn)一步表明本發(fā)明化合物作為EPO激動劑能力的另一種以細(xì)胞為基礎(chǔ)的測定以3H-胸苷摻入經(jīng)苯肼處理的小鼠的脾臟細(xì)胞為基礎(chǔ)。圖9A至9C顯示了該測定的結(jié)果。
可用于證明本發(fā)明化合物活性的其它生物測定法可參見本文引用參考的以下文獻(xiàn)Greenberger等(1983)《美國科學(xué)院院報》802931-2935(EPO依賴性紅細(xì)胞生成性前祖細(xì)胞系)；Quelle和Wojchowski等(1991)《生物化學(xué)雜志》266609-614(B6SUt.EP細(xì)胞中蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化)；Dusanter-Fourt等(1992)《生物化學(xué)雜志》28710670-10678(人EPO應(yīng)答細(xì)胞內(nèi)EPO-受體的酪氨酸磷酸化)；Quelle等(1992)《生物化學(xué)雜志》26717055-17060(FDC-ER細(xì)胞內(nèi)胞質(zhì)溶膠蛋白(pp100)的酪氨酸磷酸化)；Worthington等(1987)《實驗血液學(xué)》(Exp.Hematol.)1585-92(血紅蛋白的比色測定)；Kaiho和Miuno(1985)《生物化學(xué)年刊》(Anal.Biochem.)149117-120(用2，7-二氨基芴檢測血紅蛋白)；Patel等(1992)《生物化學(xué)雜志》26721300-21302(c-myb的表達(dá))；Witthuhn等(1993)《細(xì)胞》(Cell)74227-236(JAK2的締合與酪氨酸磷酸化)；Leonard等(1993)《血液》821071-1079(GATA轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá))；Ando等(1993)《美國科學(xué)院院報》909571-9575(通過環(huán)化D2和D3來調(diào)節(jié)G1/3的轉(zhuǎn)移)；以及鈣流量。
一種由Molecular Devices Corp.設(shè)計，稱為微生理測試儀(microphysiometer)的儀器據(jù)報道已被成功地用于測定激動劑和拮抗劑對各種受體的作用。這種設(shè)備的基礎(chǔ)是測定胞外介質(zhì)應(yīng)答受體的激活而發(fā)生的酸化程度改變。
根據(jù)一種較好的實施方式，本發(fā)明的肽被二聚化或寡聚化，由此提高本文所公開的主導(dǎo)化合物的親和性和/或活性。為了在細(xì)胞增殖測定中檢測肽的二聚化或寡聚化對EPO模擬活性的作用，合成了一種GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG的C末端被生物素?；念愃莆?即GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK(Ahx-生物素))。
以上肽與鏈霉親和素以4∶1的摩爾比在室溫下孵育1小時。然后，在PIG加尾的EPO-R結(jié)合測定中加入復(fù)合物以測定IC50。對不與鏈霉親和素復(fù)合的肽也進(jìn)行相同的實驗。與不曾與鏈霉親和素孵育的肽350nM的IC50的相比，預(yù)復(fù)合的肽被發(fā)現(xiàn)具有20nM的IC50。這一高出10倍的表觀親和性升高被推定是因為肽-鏈霉親和素復(fù)合物的多價狀態(tài)。由于以上比較使用的是游離肽的濃度而不是有效復(fù)合物的濃度(在理論上低于前者4倍)，所以實際作用還要大。
此外，如上所述在無血清的HEPES緩沖的RPMI中按4∶1的摩爾比預(yù)孵育肽與鏈霉親和素。在FDCP-1/hEPO-R生物測定中，與游離的GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK(Ahx-生物素)和非生物素?；挠H代肽，即GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG一起，測試復(fù)合物對細(xì)胞增殖的刺激作用。圖10顯示了該測定的結(jié)果，游離肽的EPO-ED50相近(約1微摩爾濃度(μM))，而預(yù)先形成的鏈霉親和素復(fù)合物的EPO-ED50低于10納摩爾濃度，小兩個數(shù)量級。單獨的鏈霉親和素在高濃度時有一定的刺激作用，這可能是因為被細(xì)菌內(nèi)毒素所污染。
此外，在與山羊抗生物素IgG二聚化時，發(fā)現(xiàn)其生物活性提高。圖11顯示，通過按2∶1的摩爾比預(yù)先孵育GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK(Ahx-生物素)和純化的山羊抗生物素IgG，可使EPO-ED50降低一個數(shù)量級。這種生物活性的提高可能是由于抗體對肽的二聚化作用。單獨的抗生物素抗體對細(xì)胞沒有作用。而且，使用GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK(Ahx-生物素)-鏈霉親和素復(fù)合物可以觀察到EPO-ED50降低100倍。因此，通過二聚化或寡聚化本發(fā)明的主導(dǎo)肽，可以提高這些肽的親和性和/或活性。
在另一實施方式中，利用圖12所示的方法制備包含兩個二硫鍵的GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG的二聚體肽類似物。簡而言之，在Tentagel樹脂上裝配第一肽鏈。將Fmoc-Lys(Alloc)與Knorr接頭偶合，Alloc基團(tuán)被用作正交保護(hù)基。在第一肽鏈中，使用的是Cys(Acm)。在完成第一肽鏈后，Alloc基團(tuán)被去除，在賴氨酸殘基的側(cè)鏈胺上合成第二肽鏈。在該肽鏈中，使用的是Cys(trt)。合成完畢后，從樹脂上割離肽并純化。然后將肽環(huán)化成含有一個二硫鍵的化合物。然后，通過碘氧化反應(yīng)形成第二個二硫鍵，形成二環(huán)二聚體。
圖13和14顯示二聚體在體外與EPOR的結(jié)合和生物活性。在一排測試孔中用固定在mAb179上、PIG加尾的EPOR測定二聚體的親和性。平衡競爭結(jié)合測定的結(jié)果顯示親和性約為2納摩爾濃度(nM)，與親代肽GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG相比提高了200倍，與GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK(Ahx-生物素)-鏈霉親和素復(fù)合物相比高出5倍。如通過FDCP-1/hEPO-R細(xì)胞增殖所測得的，體外生物活性由400nM(親代肽)的EC50提高了約20倍，至20nM。因此，通過二聚化或寡聚化本發(fā)明的主導(dǎo)肽，可以顯著提高這些肽的親和性和/或活性。
本發(fā)明的肽和其衍生物可以與結(jié)合EPO-R的化合物結(jié)合，構(gòu)建成對受體的親和性比構(gòu)成結(jié)合物的兩種化合物都高的化合物。這類肽的發(fā)現(xiàn)還有助于鑒定結(jié)合EPO-R上相同位點的肽，因為鑒定者可以使文庫或篩選方法具有偏性，以消除具有互補性“非抑制性”基元的肽。
優(yōu)選的基元序列還提供了測定本發(fā)明EPO激動劑最小形式的方法。使用1992年9月16日申請的美國專利申請946,239所述的“被編碼的合成文庫”(ESL)，(該申請是1991年9月18日申請的762,522的部分續(xù)展申請)或1990年3月7日申請的492,462，1990年12月6日申請的624,120，1991年12月6日申請的805,722中所述的“極大規(guī)模的固定化聚合物合成法”，不僅能夠確定具有所述活性的肽的最小形式，而且能夠合成構(gòu)成這類的肽的全部肽，這類肽在一個、兩個或更多個殘基上與優(yōu)選基元(或最小基元)不同。然后可以篩選該肽集合結(jié)合EPO受體的能力。以上固定化聚合物合成系統(tǒng)或其它肽合成方法還可以被用于合成本發(fā)明每一肽化合物的截短類似物、缺失類似物、以及既截短又有缺失的類似物。
也可以利用本領(lǐng)域熟知的經(jīng)典方法，例如標(biāo)準(zhǔn)固相技術(shù)來制備本發(fā)明的肽。這些標(biāo)準(zhǔn)方法包括絕對(exlusive)固相合成法、部分固相合成法、片段縮聚法、經(jīng)典溶液合成法、以及甚至利用重組DNA技術(shù)。參見本文引用參考的Merrifield(1963)《美國化學(xué)協(xié)會雜志》(J.Am.Chem.Soc.)852149。在固相上，合成通常使用一個α氨基保護(hù)樹脂，從肽的C末端開始。合適的起始材料可以通過例如將要求的α氨基酸固定到氯甲基化的樹脂、羥基甲基化的樹脂或二苯甲基胺樹脂上來制備。以上氯甲基化的樹脂之一是Bio RadLaboratories，Richmond，CA的商品名為BIO-BEADS SX-1的樹脂，Bodonszky等在1996年的《化學(xué)索引》(Chem.Ind.)(London)381597中描述了羥甲基樹脂的制備方法。Pietta和Marshall在1970年的《化學(xué)通訊》(Chem.Commn)650中描述了二苯甲基胺樹脂(BHA)，而且可以向BeckmanInstruments，Inc.，Palo Alto，CA購得鹽酸形式的該樹脂。
所以，按照Gisin在1973年的(Helv.Chim.Acta)561467中所述，通過借助于例如碳酸氫銫催化劑，將α氨基被保護(hù)的氨基酸與氯甲基化的樹脂偶合來制備本發(fā)明的化合物。在最初的偶合之后，在有機溶劑中，在室溫下，選擇三氟乙酸(TFA)或鹽酸(HCl)去除α氨基保護(hù)基。
α氨基保護(hù)基是本領(lǐng)域肽分步合成法中常用的那些。前者包括酰基類保護(hù)基(例如甲?；⑷阴；⒁阴；?，芳香族聚氨酯類保護(hù)基(例如芐氧基羰基(Cbz)和取代的Cbz)，脂肪族聚氨酯類保護(hù)基(例如正丁氧基羰基(Boc)、異丙氧基羰、環(huán)己氧基羰基)和烷基類保護(hù)基(例如芐基、三苯基甲基)。較好的保護(hù)基是Fmoc。側(cè)鏈保護(hù)基(一般為醚、酯、三苯甲游基、PMC等)在偶合過程中保持不變，而且在氨基末端保護(hù)基去保護(hù)或偶合過程中不裂解。側(cè)鏈保護(hù)基必須能夠在最終肽合成完畢后，在不改變靶肽的條件下被去除。
Tyr的側(cè)鏈保護(hù)基包括四羥基吡喃基、叔丁基、三苯甲游基、芐基、Cbz、Z-Br-Cbz和2，5-二氯芐基。Asp的側(cè)鏈保護(hù)基包括芐基、2，6-二氯芐基、甲基、乙基和環(huán)己基。Thr和Ser的側(cè)鏈保護(hù)基包括乙?；⑵S氧基、三苯甲游基、四羥基吡喃基、芐基、2，6-二氯芐基和Cbz。Thr和Ser的側(cè)鏈保護(hù)基是芐基。Arg的側(cè)鏈保護(hù)基包括硝基、甲苯磺酰基(Tos)、Cbz、金剛烷氧基羰基基磺?；?Mts)或Boc。Lys的側(cè)鏈保護(hù)基包括Cbz、2-氯芐氧基羰基(2-Cl-Cbz)、2-溴芐氧基羰基(2-BrCbz)、Tos或Boc。
在去除了α氨基保護(hù)基之后，留存的被保護(hù)的氨基按照要求的順序逐步偶合。通常在溶液，例如二氯甲烷(CH2Cl2)、二甲基甲酰胺(DMF)混合物中，使用合適的羰基活化劑例如2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸(HBTU)或二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)，各被保護(hù)氨基以過量約3倍進(jìn)行反應(yīng)。
在完成了所要求的氨基酸序列后，通過用三氟乙酸(TFA)或氟化氫(HF)等試劑將需要的肽從樹脂上分離，所述的試劑不僅從樹脂上去偶合肽，而且去偶合全部留存的側(cè)鏈保護(hù)基。在使用氯甲基化樹脂時，氟化氫處理產(chǎn)生游離的肽酸。使用二苯甲基胺樹脂時，氟化氫處理直接產(chǎn)生游離的肽酰胺?；蛘?，使用氯甲基化樹脂時，可以通過用氨處理肽樹脂來去偶合側(cè)鏈被保護(hù)的肽，以生成所需的側(cè)鏈被保護(hù)的酰胺，或用烷基胺處理來生成側(cè)鏈被保護(hù)的烷酰胺或二烷基酰胺。然后再通過氟化氫處理以常規(guī)方法去除側(cè)鏈保護(hù)基，以生成游離的酰胺、烷酰胺或二烷基酰胺。
在制備本發(fā)明酯的過程中，使用的是用于制備肽酸的樹脂，而側(cè)鏈被保護(hù)的肽是利用堿和合適的醇，即甲醇來分離的。然后以常規(guī)方法用氟化氫處理去除側(cè)鏈保護(hù)基，生成所需的酯。這些固相肽合成法是本領(lǐng)域熟知的，在Stewart的“固相肽合成法”(Freeman and Co.，San Francisco，1969)中有進(jìn)一步的描述。
以上方法還可以用于合成其中20個天然的、遺傳性編碼的氨基酸之外的氨基酸在任一本發(fā)明化合物中一處、兩處或更多處被用于取代的肽。例如，可以用萘基丙氨酸取代色氨酸來促進(jìn)合成。其它可以取代到本發(fā)明肽中的合成氨基酸包括L-羥基丙基、L-3，4-二羥基苯基丙氨酰、δ氨基酸例如L-δ-羥基賴氨酰和D-δ-甲基丙氨酰、L-α-甲基丙氨酰、β氨基酸和異喹啉基。D-氨基酸和非天然合成氨基酸也可以摻入本發(fā)明的肽中。
可以用其它側(cè)鏈替換由20個遺傳性編碼的氨基酸(或D氨基酸)構(gòu)成的天然側(cè)鏈，例如用烷基、低級烷基、4-、5-、6-、至7元環(huán)烷基、酰胺、酰胺低級烷基、酰胺二(低級烷基)、低級烷氧基、羥基、羧基及其低級酯衍生物等基團(tuán)，和4-、5-、6-、至7元雜環(huán)來替換。尤其是，可以使用脯氨酸類似物，即其中的脯氨酸殘基被從5元改變?yōu)?、6或7元。環(huán)基可以是飽和或不飽和的，如果是不飽和的，可以是芳香族的或是非芳香族的。
環(huán)基可以是飽和和非飽和的，如果是非飽和的，可以是芳香族的或是非芳香族的。雜環(huán)基團(tuán)宜包含一個或一個以上氮、氧和/或硫雜原子。這些基團(tuán)的實例包括呋咱基、呋喃基、咪唑烷基、咪唑基、咪唑磷基、異噻唑基、異噁唑基、嗎啉基(例如嗎啉代)、噁唑基、哌嗪基(例如1-哌嗪基)、哌啶基(例如1-哌啶基、哌啶子基)、吡喃基、吡嗪基、吡唑烷基、吡唑啉基、吡唑基、噠嗪基、吡啶基、嘧啶基、吡咯烷基(例如1-吡咯烷基)、吡咯啉基、吡咯基、噻二唑基、噻唑基、噻吩基、硫代嗎啉基(例如1-硫代嗎啉代)、和三唑基。這些雜環(huán)基團(tuán)可以是取代或非取代的。當(dāng)基團(tuán)是經(jīng)取代的時，取代基可以是烷基、烷氧基、鹵素、氧、或者是取代或非取代的苯基。
可以通過磷酸化來修飾本發(fā)明的肽，Hruby等42描述了用于制造本發(fā)明化合物的肽衍生物的其它方法。所以，本發(fā)明的肽還可以作為合成生物活性類似的肽模擬物的基礎(chǔ)。
本發(fā)明的肽化合物，包括肽模擬物，可以被共價修飾成非蛋白質(zhì)類聚合物中一種或多種，例如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯，其方法參見本文引用參考的美國專利4,640,835；美國專利4,496,689；美國專利4,301,144；美國專利4,670,417；美國專利4,791,192；或美國專利4,179,337。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，許多技術(shù)可用來構(gòu)建生物活性與相應(yīng)的肽化合物相同或類似，但是在溶解性、穩(wěn)定性和易水解性和易蛋白酶解性方面的活性優(yōu)于這些肽的肽模擬物。參見例如Morgan和Gainor(Ann.Rep.Med.Chem.)24243-252(1989)。以下將描述用于制備肽模擬物的方法，這些模擬物在N末端氨基、C末端羧基被修飾和/或肽中的一個或一個以上酰胺鍵被改變?yōu)榉酋０锋I?？梢岳斫獾氖?，在同一肽模擬物中可以同時結(jié)合兩種或兩種以上的此類修飾作用(例如在同一肽中，C末端的羧基被修飾，而且在兩個氨基酸之間包含一個-CH2-氨基甲酸酯鍵)。
肽通常被合成為游離酸的形式，但是如前所述可以方便地制備成酰胺或酯的形式。還可以對本發(fā)明肽的氨基末端和/或羧基末端進(jìn)行修飾，以產(chǎn)生本發(fā)明的其它化合物。氨基末端修飾包括甲基化(例如-NHCH3或-NH(CH3)2)、乙?；?、增加一個羧苯甲酰基，或用包含羧化官能度的保護(hù)基保護(hù)氨基末端，所述保護(hù)基為RCOO-，其中的R選自萘基、羥芐基、類固醇劑以及類似的基團(tuán)。羧基末端修飾包括用羰酰胺基團(tuán)代替游離酸，或在羧基末端形成一個環(huán)內(nèi)酰胺以引入結(jié)構(gòu)張力。
氨基末端修飾如上所述，而且包括烷基化、乙?；?、增加羧苯甲酰基，或形成琥珀酰亞胺基團(tuán)等。具體地說，N-末端然后可以如下反應(yīng)
(a)通過與酸性鹵化物(例如RC(O)Cl)或酸酐反應(yīng)來形成酰胺基團(tuán)，其通式為RC(O)NH-，其中R同上。通常，可以通過在惰性稀釋劑(例如二氯甲烷)中令等摩爾或過量(例如約5當(dāng)量)的酸性鹵化物與肽接觸來進(jìn)行反應(yīng)，惰性稀釋劑中宜包含過量(例如約10當(dāng)量)的叔胺，例如二異丙基乙基胺，用于清除反應(yīng)過程中產(chǎn)生的酸。反應(yīng)條件則是常規(guī)的(例如室溫下反應(yīng)30分鐘)。在對末端氨基烷基化以形成低級烷基N取代之后再用酸性鹵化物進(jìn)行以上反應(yīng)可生成通式為RC(O)NR-的N烷基酰胺基；(b)通過與琥珀酸酐反應(yīng)來形成琥珀酰亞胺基團(tuán)。和過去一樣，可以使用大致等摩爾量或過量的(例如約5當(dāng)量)琥珀酸酐，氨基被利用本領(lǐng)域的已知方法轉(zhuǎn)化為琥珀酰亞胺，這些方法包括在合適的惰性溶劑(例如二氯甲烷)中利用過量(例如10當(dāng)量)叔胺。參見本文引用參考的Wollenberg等的美國專利4,612,132?？梢岳斫獾氖?，琥珀酸基團(tuán)可以被例如C2-C6烷基或-SR取代基取代，這些取代基是以常規(guī)方法制備的，用于在肽的N末端生成取代琥珀酰亞胺。這類烷基取代基是按照以上Wollenberg等所述的方法，通過低級鏈烯基(C2-C6)與馬來酸酐反應(yīng)制得的，而-SR取代基是通過RSH與馬來酸酐反應(yīng)制得的，其中的R同上；(c)通過在合適的惰性稀釋劑(例如二氯甲烷)中與大致等摩爾量或過量CBZ-Cl(即芐氧基羰基氯)或取代CBZ-Cl反應(yīng)來形成芐氧基羰基-NH-或取代芐氧基羰基-NH-基團(tuán)，惰性溶劑中最好包含用于清除反應(yīng)過程中產(chǎn)生的酸的叔胺；(d)通過在合適的惰性稀釋劑(例如二氯甲烷)中與大致等摩爾量或過量R-S(O)2Cl反應(yīng)，將末端氨基轉(zhuǎn)化為磺酰胺基，其中的R同上，由此形成磺酰胺基。較好的是，惰性稀釋劑中含有過量(例如10當(dāng)量)的叔胺，例如二異丙基乙基胺，用于清除反應(yīng)過程中產(chǎn)生的酸。反應(yīng)條件則是常規(guī)的(例如室溫下反應(yīng)30分鐘)；(e)通過在合適的惰性稀釋劑(例如二氯甲烷)中與大致等摩爾量或過量(例如5當(dāng)量)R-OC(O)Cl或R-OC(O)OC6H4-對-NO2反應(yīng)，將末端氨基轉(zhuǎn)化為氨基甲酸酯，其中的R同上，由此形成氨基甲酸酯基團(tuán)。較好的是，惰性稀釋劑中含有過量(例如10當(dāng)量)的叔胺，例如二異丙基乙基胺，用于清除反應(yīng)過程中產(chǎn)生的酸。反應(yīng)條件則是常規(guī)的(例如室溫下反應(yīng)30分鐘)；以及(f)通過在合適的惰性稀釋劑(例如二氯甲烷)中與大致等摩爾量或過量(例如5當(dāng)量)R-N＝C＝O反應(yīng)，將末端氨基轉(zhuǎn)化為脲基(即RNHC(O)NH-)，其中的R同上，由此形成脲基團(tuán)。較好的是，惰性稀釋劑中含有過量(例如約10當(dāng)量)的叔胺，例如二異丙基乙基胺，用于清除反應(yīng)過程中產(chǎn)生的酸。反應(yīng)條件則是常規(guī)的(例如室溫下反應(yīng)30分鐘)。
此外，或者，可以修飾C末端。在制備C末端羧基被酯代替(即-C(O)OR，其中的R同上)的肽模擬物的過程中，使用的是用于制備肽酸的樹脂，用堿和合適的醇例如甲醇來分離側(cè)鏈被保護(hù)的肽。然后以常規(guī)方式，利用氟化氫處理來去除側(cè)鏈保護(hù)基，由此獲得所需的酯。
在制備C末端羧基被酰胺，即-C(O)NR3R4替代的肽模擬物過程中，使用二苯甲基胺樹脂作為肽合成的固相載體。在合成完畢后，將肽從載體上釋放的氟化氫處理直接產(chǎn)生游離的肽酰胺(即C末端為-C(O)NH2)?；蛘?，將在肽合成過程中使用氯甲基化樹脂與利用氨反應(yīng)從載體上分離側(cè)鏈被保護(hù)的肽相結(jié)合，產(chǎn)生游離的肽酰胺，與烷基胺或二烷基胺反應(yīng)則產(chǎn)生側(cè)鏈被保護(hù)的烷酰胺或二烷基酰胺(即，C末端是-C(O)NRR1，其中的R和R1同上。然后以常規(guī)方式，利用氟化氫處理來去除側(cè)鏈保護(hù)，由此獲得游離的酰胺、烷酰胺或二烷基酰胺。
在另一種形式的實施方式中，可以通過以N末端的氨基分別內(nèi)部置換C末端羧基的-OH或酯基的-OR來誘導(dǎo)C末端羧基或酯基的環(huán)化，形成環(huán)肽。例如，在合成并分離肽酸后，可以在例如二氯甲烷(CH2Cl2)、二甲基甲酰胺(DMF)之類溶液中利用合適的羧基活化劑，例如二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)，將游離酸轉(zhuǎn)化成活化的酯。然后通過以N末端的胺內(nèi)部置換活化的酯來形成環(huán)肽。與聚合反應(yīng)相比，用很稀的溶液就能加強分子內(nèi)環(huán)化反應(yīng)。這些方法是本領(lǐng)域熟知的。
還可以通過環(huán)化本發(fā)明的肽，或者在肽的兩個末端引入脫氨基或脫羧基基團(tuán)，由此消除氨基或羧基基團(tuán)，從而降低肽的易蛋白酶解性或限定肽的構(gòu)象。本發(fā)明的C末端官能團(tuán)包括酰胺、酰胺低級烷基、酰胺二(低級烷基)、低級烷氧基、羥基和羧基，以及它們的低級酯衍生物，和藥學(xué)上認(rèn)可的鹽。
本文引用參考的Hruby等，《生物化學(xué)雜志》(Biochem.J.)268(2)249-262(1990)描述了可用于制造本發(fā)明化合物的肽衍生物的其它方法。所以，本發(fā)明的肽化合物還可以作為具有類似生物活性的非肽類化合物的結(jié)構(gòu)模型。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，有許多技術(shù)可以用于構(gòu)建生物活性與主導(dǎo)肽相同或相近，但是在溶解性、穩(wěn)定性和易水解性和易蛋白酶解性方面的活性優(yōu)于主導(dǎo)肽的化合物。參見本文引用參考的Morgan和Gainor，(Ann.Rep.Med.Chem.)24243-252(1989)。這類技術(shù)包括用磷酸酯、酰胺化物、氨基甲酸酯、磺酰胺、仲胺和N-甲基氨基酸構(gòu)成的骨架置換肽骨架。
只需在合成過程中用適當(dāng)保護(hù)的氨基酸類似物取代氨基酸反應(yīng)物，利用常規(guī)的肽合成法就可以制備肽鍵(-C(O)NH-)被例如-CH2-氨基甲酸酯鍵、磷酸酯鍵、-CH2-磺酰胺鍵、脲鍵、仲胺鍵(-CH2NH-)和烷基化的肽鍵置換[-C(O)NR6-，其中的R6是低級烷基]的肽模擬物。
合適的反應(yīng)物包括例如氨基酸羧基被適合形成上述連接鍵之一的部分取代的氨基酸同類物。例如，如果要以-CH2-氨基甲酸酯鍵(-CH2OC(O)NR-)取代肽中的-C(O)NH-鍵，那么先將適當(dāng)保護(hù)的氨基酸的羧基(-COOH)還原成-CH2OH基團(tuán)，然后再利用常規(guī)方法轉(zhuǎn)化成-OC(O)Cl官能度或?qū)ο趸妓狨?，?OC(O)O-C6H4-對-NO2-官能度。以上兩種官能團(tuán)與固體載體上部分合成的肽的N末端游離胺或烷基化胺反應(yīng)都將形成-CH2OC(O)NR-連接鍵。有關(guān)形成這類-CH2-氨基甲酸酯鍵更為詳細(xì)的說明可參見Cho等，科學(xué)》2611303-1305(1993)。
同樣，以本文引用參考的美國專利申請07/943,805、08/081,577和08/119,700中所述的方式，可以以磷酸酯鍵置換肽內(nèi)的酰胺鍵。
將適當(dāng)保護(hù)的氨基酸的羧基(-COOH)還原成-CH2OH基團(tuán)，然后再利用常規(guī)方法將羥基轉(zhuǎn)化成合適的離去基團(tuán)例如甲苯磺?；蓪㈦膬?nèi)的酰胺鍵置換成-CH2-磺酰胺鍵。甲苯磺酰基化衍生物與例如硫代乙酸反應(yīng)，然后水解和氧化性氯化，將形成-CH2-S(O)2Cl官能團(tuán)，該官能團(tuán)置換不在羧基位置被適當(dāng)保護(hù)的氨基酸的羧基。在肽合成過程中使用該適當(dāng)保護(hù)的氨基酸類似物可引入置換肽內(nèi)酰胺鍵的-CH2S(O)2NR-鍵，由此形成肽模擬物。有關(guān)氨基酸的羧基轉(zhuǎn)化成-CH2-S(O)2Cl基團(tuán)更為詳細(xì)的說明，可參見例如本文引用參考的Weinstein，Boris，《氨基酸的化學(xué)和生物化學(xué)》(Chemistry &Biochemistry of Amino Acids)Vol.7，pp.267-357，Marcel Dekker，Inc.NewYork(1983)。
按照本文引用參考的美國專利申請08/147,805中所述的方式，可將肽內(nèi)的酰胺鍵置換成脲鍵。
以-CH2NH-鍵置換肽內(nèi)酰胺鍵的仲胺鍵可使用例如其酰胺鍵中的羰基鍵已被利用常規(guī)方法還原成CH2基團(tuán)的、適當(dāng)保護(hù)的二肽類似物來制備。例如，以二甘氨酸為例，在去保護(hù)后可將酰胺還原成胺，即H2NCH2CH2NHCOOH，后者然后以N-被保護(hù)的形式用于下一步偶合反應(yīng)。這種通過還原二肽內(nèi)酰胺鍵中羰基來制備此類類似物的方法是本領(lǐng)域所熟知的。
被適當(dāng)保護(hù)的氨基酸類似物與相應(yīng)的氨基酸一樣，以相同的方式用于常規(guī)肽合成法中。例如，通常在該反應(yīng)中使用3當(dāng)量的被保護(hù)氨基酸類似物。使用的是惰性有機稀釋劑，例如二氯甲烷或DMF時，且當(dāng)有作為反應(yīng)副產(chǎn)物的酸形成時，反應(yīng)溶劑通常含有過量的叔胺以清除反應(yīng)過程中產(chǎn)生的酸。特別好的叔胺是二異丙基乙基胺，通常按過量約10倍使用。反應(yīng)的結(jié)果是在肽模擬物中引入具有非肽鍵的氨基酸類似物?？梢愿鶕?jù)要求重復(fù)這種取代，使得肽內(nèi)從零到全部酰胺鍵均被非酰胺鍵置換。
本發(fā)明的肽還可以被環(huán)化，或在肽的兩個末端引入脫氨基或脫羧基殘基，由此消除末端的氨基或羧基，以便降低肽的易蛋白酶解性或限定其構(gòu)象。本發(fā)明的C末端官能團(tuán)包括酰胺、酰胺低級烷基、酰胺二(低級烷基)、低級烷氧基、羥基和羧基，以及它們的低級酯衍生物，和藥學(xué)上認(rèn)可的鹽。
根據(jù)另一較佳的實施方式，殘基X3和X4獨立地選自C和Hoc。所以，本發(fā)明的化合物可以以包含分子內(nèi)二硫鍵的環(huán)化形式存在?；蛘撸梢酝ㄟ^制備分子間二硫鍵產(chǎn)生二聚化合物。這些分子間或分子內(nèi)二硫鍵衍生物可以如下表示

其中的m和n獨立地為1或2。
本發(fā)明的其它實施方式提供了這些二硫化物衍生物的類似物，其中的硫被CH2基團(tuán)或其它硫的電子等排物所置換。這些類似物可以從X3或X8之一為C或Hoc而另一個為α-氨基-γ-丁酸的本發(fā)明化合物，利用以下本領(lǐng)域已知的方法，通過分子間或分子內(nèi)置換來制備

其中的p是1或2。本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易理解的是，使用其它α-氨基-γ-丁酸和高半胱氨酸的類似物也可以發(fā)生以上置換。
除了上述環(huán)化方法之外，還可以使用其它非二硫化物肽環(huán)化法。這類其它環(huán)化方法包括例如酰胺環(huán)化法以及涉及到硫代醚鍵形成的環(huán)化法。所以，本發(fā)明化合物可以以包含一個分子內(nèi)酰胺鍵或一個分子內(nèi)硫代醚鍵的環(huán)化形式存在。為了證明酰胺環(huán)化法的可行性，合成了一段以ggTYSCHFGPLTWVCKPQgg為基礎(chǔ)的肽，其中的第一半胱氨酸被賴氨酸置換，第二半胱氨酸置換成谷氨酸，通過這兩個殘基側(cè)鏈間的酰胺鍵形成一個環(huán)化單體。此外，為了證明硫代醚環(huán)化法的可行性，合成了一段以ggTYSCHFGPLTWVCKPQgg為基礎(chǔ)的肽，其中的第一半胱氨酸被賴氨酸置換，通過賴氨酸殘基側(cè)鏈與C末端半胱氨酸間的硫代醚鍵形成一個環(huán)化單體。由此，除了二硫化物環(huán)化法之外，酰胺環(huán)化法和硫代醚環(huán)化法均可方便地用于環(huán)化本發(fā)明的化合物。
或者，可以用一個α取代的乙酸，例如以α-氯乙酸、α-溴乙酸或α-碘乙酸之類的α-鹵乙酸在肽的氨基末端加冒，其中的α取代基是離去基團(tuán)。X3是C或Hoc的本發(fā)明化合物可以通過用X3殘基的硫置換離去基團(tuán)來環(huán)化。參見本文引用參考的Barker等(1992)(J.Med.Chem.)352040-2048和Or等(1991)《有機化學(xué)雜志》(J.Org.Chem.)563146-3149。
本發(fā)明化合物可在體外用作理解EPO生物作用的優(yōu)良工具，包括評價許多被認(rèn)為影響EPO的產(chǎn)生和EPO與EPO-R結(jié)合，或者受其影響的因子(例如EPO信號傳導(dǎo)/受體激活的機制)。本發(fā)明化合物還可以用在開發(fā)其它結(jié)合EPO-R的化合物，因為本發(fā)明化合物提供了促進(jìn)這種開發(fā)的重要的結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系(SAR)。
而且，根據(jù)與EPO受體結(jié)合的能力，本發(fā)明的肽可以用作在活細(xì)胞、固定細(xì)胞、生物液、組織勻漿、純化的天然生物材料等中檢測EPO受體的試劑。例如，通過標(biāo)記這些肽，可以鑒定在表面具有EPO-R的細(xì)胞。此外，根據(jù)與EPO受體結(jié)合的能力，本發(fā)明的肽可以用于原位染色、FACS(熒光激活細(xì)胞分選)、Western印跡、ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定)等。此外，根據(jù)與EPO受體結(jié)合的能力，本發(fā)明的肽可以用于受體的純化或純化在細(xì)胞表面表達(dá)EPO受體的細(xì)胞(或可向內(nèi)穿透的細(xì)胞)。
本發(fā)明的化合物還可以用作商品化研究用試劑，用于各種醫(yī)學(xué)研究和診斷。這類用途包括但不限于(1)在各種功能測定中用作定量候選EPO激動劑活性的標(biāo)定標(biāo)準(zhǔn)；(2)在隨機肽篩選中用作抑制劑，即用于查找新的EPO受體的肽配體家族，所述的肽可以抑制目前所謂EPO肽的恢復(fù)；(3)用于與EPO受體共結(jié)晶，即本發(fā)明的肽可形成與EPO受體結(jié)合的晶體，從而能夠測定受體/肽結(jié)構(gòu)X射線結(jié)晶學(xué)；(4)測定紅細(xì)胞前體細(xì)胞分化并繼而激發(fā)珠蛋白合成的誘導(dǎo)以及血紅素復(fù)合物合成增加和鐵蛋白受體數(shù)量增加的能力；(5)用于維持EPO依賴性細(xì)胞系的增殖與生長，例如FDCP-1-mEPO-R細(xì)胞系和TF-1細(xì)胞系；(6)其它研究和診斷用途，其中宜激活EPO受體，或者最好用已知量的某種EPO激動劑標(biāo)定這種激活作用，等等。
本發(fā)明化合物還可以對包括人在內(nèi)的溫血動物給藥，用于在體內(nèi)刺激EPO與EPO-R結(jié)合。所以，本發(fā)明包含治療與EPO缺乏相關(guān)的疾病的方法，該方法包括給予足量的某種本發(fā)明化合物，該量足以在體內(nèi)刺激EPO-R，并由此緩解與EPO缺乏相關(guān)的癥狀。例如，本發(fā)明化合物可用于治療末期腎功能衰竭/透析；與AIDS相關(guān)的貧血，與慢性炎性疾病(例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和慢性關(guān)節(jié)炎)相關(guān)的貧血，自身免疫疾病和惡性腫瘤；以及用于在手術(shù)前增加病人的紅細(xì)胞數(shù)量。
本發(fā)明的其它實施方式提供了本發(fā)明化合物在治療并不以紅細(xì)胞缺失或缺陷為特征的疾病的應(yīng)用，例如作為輸血前的預(yù)處理。此外，使用本發(fā)明化合物可以縮短出血時間，所以可以用在病人的手術(shù)前給藥或可能出現(xiàn)出血的適應(yīng)征中。此外，本發(fā)明化合物可用在巨噬細(xì)胞的激活中。
由于EPO沒有對血管內(nèi)皮細(xì)胞的促有絲分裂和趨向化作用以及對中樞擬副交感神經(jīng)元的作用(參見例如Amagnostou等(1990)《美國科學(xué)院院報》875978-5982和Konishi等(1993)《腦研究》(Brain Res.)60929-35)，本發(fā)明的化合物還可以用作治療各種血管疾病中，例如促進(jìn)傷口愈合、旁側(cè)冠狀血管的生長(例如可能發(fā)生于心肌梗塞之后的那類)、外傷、和血管移植后的處理，以及治療各種神經(jīng)疾病，后者通常以乙酰膽堿的絕對水平低或與其它神經(jīng)活性物質(zhì)例如神經(jīng)遞質(zhì)相比的相對水平低為特征。
所以，本發(fā)明包括藥物組合物，其中至少以本發(fā)明的肽或其它化合物之一為有效成份，并結(jié)合以藥學(xué)上認(rèn)可的載體或稀釋劑。本發(fā)明化合物可以通過口服、腸胃外(肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈(IV)或皮下注射)、透皮(被動或者使用離子電滲透法或電穿孔法)、透粘膜(鼻、陰道、直腸或舌下)途徑或使用可生物腐蝕的植入體給藥，或者配制成適合各種給藥途徑的劑量形式。
適于口服的固體劑型包括膠囊、片劑、丸劑、粉劑和顆粒劑。在這種固體劑型中，活性化合物至少與一種惰性的、藥學(xué)上認(rèn)可的載體，例如蔗糖、乳糖或淀粉混合。正如常規(guī)過程，這種劑型中還可以包含除惰性稀釋劑之外的其它物質(zhì)，例如硬脂酸鎂之類的潤滑劑。在膠囊、片劑和丸劑中，這些劑型還可以包含緩沖劑。片劑和丸劑還可以制成另外帶有腸溶包衣的。
適于口服的液體劑型包括藥學(xué)上認(rèn)可的乳劑、液劑、懸浮劑和糖漿，酏劑中需含有本領(lǐng)域常用的稀釋劑，例如水。除了這些稀釋劑之外，組合物還可以包含佐劑，例如潤濕劑、乳化和懸浮劑，以及甜味劑、賦味劑和香味劑。
適于腸胃外給藥的本發(fā)明制劑包括無菌的水性或非水性溶液、懸浮液或乳液。非水性溶劑或媒質(zhì)的實例為聚丙二醇、聚乙二醇，植物油例如橄欖油和玉米油，以及注射用的有機酯，例如草酸乙酯。這些劑型中還可以包含佐劑，例如保藏劑、濕潤劑、乳化劑和分散劑。它們可以通過例如經(jīng)滯留細(xì)菌的濾膜過濾，通過在組合物中加入殺菌劑，通過照射組合物，或者通過加熱組合物來滅菌。它們還可以用無菌水或其它無菌的注射用介質(zhì)在臨使用前制備。
適于直腸或陰道給藥的組合物最好是栓劑，其中除了活性物質(zhì)之外還可以包含可可脂或栓劑用蠟之類的賦形劑。還可以利用本領(lǐng)域熟知的常規(guī)賦形劑制備適于經(jīng)鼻或舌下給藥的組合物。
本發(fā)明組合物中活性成份的劑量是不定的；但是，活性成份的含量必須使得能夠獲得合適的劑型。選用的劑量取決于要求的療效，給藥途徑和療程。對于哺乳動物，通常的給藥的劑量水平在每日0.001至10毫克/千克體重之間。
由以上公開內(nèi)容可以看出，本發(fā)明具有廣泛的用途。所以，以下實施例以說明的方式而不是限定方式給出。
實施例1固相肽合成法本發(fā)明的各種肽在Milligen/Biosearch 9600自動儀上，利用Merrifield固相肽合成技術(shù)(參見Stewart，J.M.和Young，J.D.，《固相肽合成》(SolidPhase Peptide Sythesis)，第二版，(Pierce Chemical，Rockford，IL，1984))來合成。使用的樹脂是PAL(Milligen/Biosaarch)，即以5-(4’-Fmoc-氨基乙基-3，5’-二甲氧基苯氧基)戊酸為連接劑的交聯(lián)聚苯乙烯。使用PAL樹脂，在將肽從樹脂上分離后得到羧基末端的酰胺。用F-moc進(jìn)行氨基酸上的伯胺保護(hù)，側(cè)鏈保護(hù)為用于絲氨酸和酪氨酸羥基的叔丁基，用于谷胺酰胺的三苯甲游基，和用于精氨酸胍基的Pmc(2，2，5，7，8-五甲基苯并二氫呋喃磺酸酯)。每一步偶合用BOP(六氟磷酸苯并三唑基N-氧三二甲基氨基膦)或HOBt(1-羥基苯并三唑)進(jìn)行一小時或兩小時。
在用酰胺化的羧基末端合成肽時，用90％三氟乙酸、5％乙二硫醇和5％水構(gòu)成的混合物，最初在4℃，然后在1.5小時內(nèi)逐步升溫至室溫，由此分離裝配完全的肽。通過過濾將去保護(hù)的產(chǎn)物與樹脂分離，并用二乙醚沉淀。在徹底干燥之后，通過C18反相高效液相色譜，使用乙腈/水在0.1％三氟乙酸中形成的濃度梯度純化產(chǎn)物。
實施例2生物測定A.FDCP-1/mEPO-R在生長因子(2.5nm EPO)存在下將FDCP-1/mEPO-R細(xì)胞(105)培養(yǎng)至半穩(wěn)態(tài)密度。細(xì)胞在PBS中洗滌2次，然后在去除生長因子的完全培養(yǎng)基中饑餓24小時。
用臺盼藍(lán)染色測定細(xì)胞的活性。在無生長因子的完全培養(yǎng)基中制備每50微升含有所要求的細(xì)胞數(shù)量的儲備液。在96孔的組織培養(yǎng)板上將待測化合物稀釋2倍(最終，每孔50微升)。
在各孔中加入細(xì)胞(每孔50微升)并孵育24至48小時(此時，陰性對照將死亡)。利用MTT測定法來測定細(xì)胞的增殖。
B.TF-1又進(jìn)行了Kitamura等所述的方法《血液》，73375-380(1989)，本文引用參考)以證明本發(fā)明化合物作為EPO激動劑的活性，該方法涉及具有EPO生長依賴性的TF-1細(xì)胞系。圖8顯示了代表性的結(jié)果。圖8顯示了EPO和肽VGNYMCHFGPITWVCRPGGG對TF-1細(xì)胞系的細(xì)胞增殖的作用。
C.脾細(xì)胞的增殖又使用了Krystal所述的方法(《實驗血液學(xué)》(Exp.Hematol.)11649-660(1983)，本文引用參考)以確定本發(fā)明化合物作為EPO激動劑的能力，該方法是以3H-胸苷摻入脾細(xì)胞為基礎(chǔ)的微測定法。簡而言之，B6C3F1小鼠被連續(xù)兩天每日輸注苯肼(60毫克/千克)。第三天，取出脾細(xì)胞，并用MTT測定確定細(xì)胞在24小時內(nèi)的增殖能力。圖9A(對照)，9B(用500皮摩爾濃度(pM)處理)和9C(用25微升GGDYHCRMGPLTWVCKPLGG處理)給出了放大200倍的照片，顯示的是代表性脾細(xì)胞種群的增殖情況。
D.細(xì)胞增殖EPO-應(yīng)答性細(xì)胞系，F(xiàn)DC-P1/ER的肽依賴性生長1.材料和方法a.樣品的制備將肽懸浮在DMSO中成為1×10-2M的儲備液，按10倍遞增連續(xù)稀釋，形成以下100倍的溶液1×10-31×10-41×10-51×10-61×10-71×10-8在各細(xì)胞測試孔中加入2微升的各儲備稀釋液，如下所述形成200微升的最終體積，形成以下最終濃度1×10-51×10-61×10-71×10-81×10-91×10-10b.細(xì)胞增殖測定i.細(xì)胞源FDC-P1/ER(Dexter等，《實驗醫(yī)學(xué)雜志》(1980)1521036-1047，本文引用參考)，是一種已被充分描述清楚的非轉(zhuǎn)化鼠骨髓衍生細(xì)胞系，其中已經(jīng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了紅細(xì)胞生成素受體。細(xì)胞表現(xiàn)出EPO依賴性增殖。
c.實驗方案將維持在RPMI 1640/10％胎牛血清/抗體和10單位/毫升(U/ml)紅細(xì)胞生成素中的細(xì)胞培養(yǎng)至穩(wěn)定期。收獲細(xì)胞并重懸在無生長因子(紅細(xì)胞生成素)的新鮮培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24小時。計數(shù)細(xì)胞，并重懸成800,000細(xì)胞/毫升的濃度。在96孔微量滴定板的各孔中加入約4萬(50微升)細(xì)胞。在每三個平行測試孔中加入肽。對各系列的肽進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)量效測定。在培養(yǎng)42小時后(約等于2倍倍增時間)，各孔用1微居里(μCi)/孔的胸苷脈沖。將細(xì)胞再培養(yǎng)6小時，此時收獲細(xì)胞并計數(shù)，以評價作為細(xì)胞增殖指示劑的胸苷的摻入。
d.結(jié)果根據(jù)紅細(xì)胞生成素受體細(xì)胞系和無受體親代細(xì)胞系對肽進(jìn)行了評價。在大多數(shù)情況下，肽已事先在一截短的人紅細(xì)胞生成素受體細(xì)胞系上進(jìn)行了評價。結(jié)果被表示為獲得使用重組紅細(xì)胞生成素所得最大活性一半所需的肽量。以表格顯示來報道代表性結(jié)果以及相對結(jié)合數(shù)據(jù)。(參見后文的表17-22。)E.酪氨酸的磷酸化肽誘導(dǎo)的紅細(xì)胞生成素和胞內(nèi)蛋白酪氨酸的磷酸化1.材料和方法a.樣品的制備肽在DMSO中懸浮成1×10-2M的濃度。
b.實驗方案將維持在RPMI 1640/10％胎牛血清/抗體和10單位/毫升紅細(xì)胞生成素中的FDC-P1/muER細(xì)胞培養(yǎng)至穩(wěn)定期。收獲細(xì)胞并重懸在無生長因子(紅細(xì)胞生成素)的新鮮培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24小時。計數(shù)細(xì)胞，并重懸成500,000細(xì)胞/毫升的濃度。在eppendorf試管中加入1毫升(ml)細(xì)胞(500,000)。在細(xì)胞中加入1微升1×10-3的肽溶液(最終濃度為1×10-5摩爾濃度(M))，并在37℃培養(yǎng)10分鐘。對各次測定都進(jìn)行一份紅細(xì)胞生成素的對照(最終濃度為10單位/毫升)。在4℃，以14,000rpm離心收集細(xì)胞。將細(xì)胞重懸在100微升SDS裂解緩沖液中，并接受SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。將凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素薄膜上，用1∶1000稀釋的抗磷酸酪氨酸抗體(Upstate Biotechnology Incorporated)檢測1小時。薄膜用Tris緩沖鹽溶液洗滌，并用抗鼠辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗體再次檢測。用ECL Wstern印跡試劑(Amersham)顯示反應(yīng)反應(yīng)蛋白。
C.結(jié)果在紅細(xì)胞生成素應(yīng)答性細(xì)胞系中，紅細(xì)胞生成素與其受體的結(jié)合誘導(dǎo)受體和多種胞內(nèi)蛋白的酪氨酸的磷酸化，這些胞內(nèi)蛋白包括Shc、vav和JAK2激酶。對包括GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG在內(nèi)的多種肽進(jìn)行了分析，以評價它們模擬使用紅細(xì)胞生成素所觀察到的應(yīng)答的能力。根據(jù)結(jié)合作用和增殖作用標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷，在紅細(xì)胞生成素應(yīng)答性細(xì)胞中，活性肽引起與紅細(xì)胞生成素相同的磷酸化方式。以上結(jié)果表明，活性肽通過紅細(xì)胞生成素誘導(dǎo)的信號傳導(dǎo)路徑引起它們的應(yīng)答反應(yīng)。以表格形式報道結(jié)果以及結(jié)合和增殖數(shù)據(jù)。(參見后文的表17-22。)F.細(xì)胞應(yīng)答的動力學(xué)利用DNA測定肽誘導(dǎo)的細(xì)胞周期的起始1.實驗方案將FDC-P1/muER細(xì)胞培養(yǎng)至穩(wěn)定期，約等于3.0×106個細(xì)胞/毫升。收集細(xì)胞，將其重懸在無因子的新鮮培養(yǎng)基中，再培養(yǎng)18小時，然后將細(xì)胞分在3個燒瓶中，細(xì)胞密度相同-因子，+EPO和+肽。然后用10單位/毫升或10微摩爾濃度的肽刺激細(xì)胞。在以下時刻收集三百萬細(xì)胞第0、6、8、10和12小時。(參見圖15)。細(xì)胞用冷的PBS洗滌兩次，并通過將細(xì)胞沉淀重懸在100微升冷PBS然后加入900微升70％冷乙醇來固定。用50微克/毫升碘丙錠染色細(xì)胞，并在FACS掃描流動細(xì)胞計數(shù)儀上進(jìn)行測定。用Becton DicKinson CellFIT軟件的SOBR型測定各時期細(xì)胞的百分比。
在細(xì)胞沿細(xì)胞周期的進(jìn)程中，紅細(xì)胞生成素(10單位/毫升)與GGTYSCHFPLTWVCKPQGG(1×10-5摩爾濃度)是等效的。在10小時后引入紅細(xì)胞生成素或肽，相比介質(zhì)對照的15％，約45％的細(xì)胞處于S期。該結(jié)果表明，肽能夠引起動力學(xué)與重組紅細(xì)胞生成素相同的應(yīng)答。
G.集落分析鼠骨髓和人外周血集落分析1.材料與方法在標(biāo)準(zhǔn)無菌肝素真空試管(vacutainer tube)中收集獲自健康個體的10毫升外周血樣品。每個實驗從約10頭小鼠的大腿骨節(jié)獲取鼠骨髓。所有試劑來自Stem Cell Technologies Inc.(Vancouver，Canada)。
a.實驗方案簡而言之，進(jìn)行具核細(xì)胞計數(shù)，以確定原始樣品中具核細(xì)胞的數(shù)量和濃度。以外周血為例，在室溫下對樣品進(jìn)行通過Ficoll-Hypaque(1.007克/毫升)梯度的400g離心30分鐘。小心地抽取位于Ficoll-Hypaque界面的單核細(xì)胞，并稀釋至約10毫升的最終體積。離心收集獲自鼠骨髓或人外周血的細(xì)胞并傾析去除上清液。將沉淀的細(xì)胞重懸在新鮮培養(yǎng)基中，并進(jìn)行前述收集。將洗滌后的細(xì)胞稀釋在Iscove培養(yǎng)基/2％胎牛血清中，形成以下濃度用于平板培養(yǎng)正常骨髓1×105低密度細(xì)胞正常血液4×105低密度細(xì)胞根據(jù)制造商的說明將細(xì)胞加到甲基纖維素薄膜上。在以下最終濃度下對肽進(jìn)行測定“無EPO”甲基纖維素培養(yǎng)基中1×10-6和1×10-5摩爾濃度。將當(dāng)量細(xì)胞數(shù)平板培養(yǎng)在“完全”甲基纖維素培養(yǎng)基中，以獲得最大的集落形成。對每個無EPO測定進(jìn)行一個對照平板培養(yǎng)，用于確定背景集落形成。在培養(yǎng)10天和18天后兩次測評集落。
b.結(jié)果如表13至15所示，在鼠骨髓和人外周血中，GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG能夠促進(jìn)集落的形成，雖然其水平明顯低于在“完全”甲基纖維素培養(yǎng)基(紅細(xì)胞生成素3單位/毫升)上獲得的。
表13 以人外周血樣品進(jìn)行的集落測定(供體男性)(起始時間2/10/94)時間 樣品 CFU-EMBFU-EPBFU-ECFU-GM2/23/940 XX X XDMSOXX X XEPO(METHOCULT) 11 25X XEPO(3U/ml) 77 X XAFFY 244 10-5M 10 5 X XAFFY 244 10-6M 11 5 X X3/4/94 0 XX X XDMSO XX X XEPO(METHOCULT) 111139EPO(3U/ml)47 7 3AFFY 244 10-5M 79 2 4AFFY 244 10-6M 6111 2CFU-E集落形成單位-紅細(xì)胞性(1-2簇)MBFU-E成熟爆發(fā)形成單位-紅細(xì)胞性(3-8簇)PBRU-E原始爆發(fā)形成單位-紅細(xì)胞性(大于或等于9簇)CFU-GM集落形成單位粒細(xì)胞性/單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞表14集落形成細(xì)胞的數(shù)量(鼠骨髓)1/28/942/10/94AFFY11157/AFFY224前祖細(xì)胞對照 EPO 10-5M 10-6MCFU-E 0 23 23BFU-E 0 500CFU-GM 0 3002/10/94AFFY11157/AFFY224前祖細(xì)胞對照 EPO 10-5M 10-6MCFU-E 0 000BFU-E 0 30 24CFU-GM 0 000AFFY11157＝ggTYSCHFGPLTWVCKPQgg
表15 集落形成細(xì)胞的數(shù)量(鼠骨髓)2/21/943/1/94 AFFY11157/AFFY224前祖細(xì)胞 對照 EPO 10-5M10-6MCFU-E 0 39 0BFU-E 0 3120CFU-GM 0 ＞10 0 03/14/94AFFY11157/AFFY224前祖細(xì)胞 對照 EPO 10-5M10-6MCFU-E 0 01 0PBFU-E 0 10 8 0MBFU-E 0 04 0CFU-GM 0 26 0 0H.肽誘導(dǎo)的增殖對紅細(xì)胞生成素不應(yīng)答的細(xì)胞系的肽依賴性生長a.實驗方案如上文D部分所述測定肽。使用各細(xì)胞系對應(yīng)的有絲分裂原/生長因子，繪制生長曲線，用于評價生長能力。
b.結(jié)果如表16所示，GGTYSCHFGPLTXVCKPQGG不能夠激發(fā)非紅細(xì)胞生成素應(yīng)答性細(xì)胞系的生長應(yīng)答，其中既包括造血細(xì)胞系也包括非造血細(xì)胞系。
表16 用61233進(jìn)行的細(xì)胞增殖測定細(xì)胞類型 物種EPO61233 生長因子應(yīng)答造血細(xì)胞TF-1 人 + + GM-CSF，IL3(紅細(xì)胞性)M-07E人 - - GM-CSF，IL3(成巨核細(xì)胞性)AML193 人 - - GM-CSF，G-CSF，IL3(單核細(xì)胞性)T細(xì)胞克隆人 ND - IL2成骨細(xì)胞TE85 人 - - 血清MC3T3鼠 - - 血清乳腺細(xì)胞T47D 人 ND - 孕酮
I.以固定化EBP為基礎(chǔ)的[125I]EPO競爭性結(jié)合測定在大腸桿菌中表達(dá)并過量產(chǎn)生人紅細(xì)胞生成素受體(EPO結(jié)合蛋白，EBP)的胞外區(qū)域。與用作大腸桿菌中的許多其它重組真核蛋白一樣，該蛋白在實驗室規(guī)模的發(fā)酵中表現(xiàn)為不可溶性產(chǎn)物，經(jīng)重折疊和純化后得到活性蛋白質(zhì)。作為該方法產(chǎn)生的EBP含有一個游離的巰基，對該基團(tuán)的修飾不影響配體的溶液相結(jié)合。為了固定化EBP用于平衡結(jié)合測定和作為競爭性結(jié)合測定的基礎(chǔ)，為使EBP與瓊脂糖微珠的共價結(jié)合而對該結(jié)果進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。Sufolink微珠(Pierce Chemical Co.Rockford，IL)的碘乙?；罨瘜W(xué)具有游離硫醇特異性，從而確保了該連接一般是不可逆的。EBP-Sulfolink微珠是如下制造的Sulfolink凝膠懸浮液(10ml)與偶合緩沖液(40ml50mM Tris，pH8.3，5mM EDTA)混合，然后任凝膠沉淀。去除上清液，在洗滌后的微珠中直接加入待結(jié)合的EBP(0.3-1mg/ml的偶合緩沖液溶液)?；旌衔镌谑覝叵螺p微晃動30分鐘，任微珠在室溫下沉淀1小時。分離出上清液并保留，微珠用20毫升偶合緩沖液洗滌兩次。同上收集洗液。然后在室溫下用0.05M半胱氨酸20毫升處理微珠30分鐘以封閉未結(jié)合位點。最后，微珠先用50毫升1M的NaCl洗滌，再用30毫升PBS洗滌，然后重懸在20毫升PBS中，于4℃保存待用。通過將原EBP溶液的OD280與反應(yīng)上清液和兩份20毫升洗液的總OD280比較，測定出與微珠共價結(jié)合的EBP的量。通常，使用的EBP中40％至60％與微珠結(jié)合。
通過將EBP微珠(50微升)加入各反應(yīng)試管來開始結(jié)合測定。在含有0.3至30nM125I-EPO(NEN Research Products，Boston MA，100微居里/微克)的試管中測定總結(jié)合。為了測定非特異性結(jié)合，加入比相應(yīng)的125I-EPO濃度過量1000倍的非標(biāo)記EPO。各反應(yīng)的體積都用結(jié)合緩沖液(PBS/0.2％BSA)定容至500微升。試管在室溫下輕微晃動孵育5小時(經(jīng)實驗測定，該時間對建立平衡態(tài)已足夠)。5小時后，將各反應(yīng)混合物通過一塞有玻璃纖維的1ml移液管管尖。試管用1毫升洗滌緩沖液(PBS/5％BSA)洗滌，將該洗液以及另外2份1毫升的洗液通過移液管管尖并收集以用于測定游離EPO濃度。有關(guān)[125I]EPO與固定在瓊脂糖微珠上的EBP之間特異性結(jié)合的平衡結(jié)合測定顯示，根據(jù)結(jié)合等溫線的線性轉(zhuǎn)化(Scatchard)，Kd值為5nM±2。(參見圖16)如下進(jìn)行候選肽的競爭性結(jié)合測定。將各肽溶解在DMSO中制備成1mM的儲備溶液。所有反應(yīng)試管(雙份)在各自總共500微升的結(jié)合緩沖液中含有50微升EBP微珠，0.5nM[125I]EPO和0至500μM肽。在各測定試管中將DMSO的最終濃度都調(diào)節(jié)至2.5％，該值沒有可測性影響，因為就測定對DMSO靈敏度的檢查證明高至25％的DMSO(VV)對結(jié)合沒有不利的影響。在每次測試中通過結(jié)合含有大量過量的非標(biāo)記的EPO(1000nM)的試管來測定非特異性結(jié)合。在每次測試中將不加肽的初始測定點包括在內(nèi)，以確定總結(jié)合。結(jié)合混合物在室溫下輕微晃動培養(yǎng)過夜。然后用Micro-clumns(Isolab，Inc.，Akron，Ohio)收集微珠并用3毫升的洗滌緩沖液洗滌。將含有洗滌后微珠的色譜柱放在12×75mm的玻璃試管中，用γ計數(shù)器測定被結(jié)合的放射性水平。將結(jié)合的[125I]EPO表示為相當(dāng)于對照結(jié)合(總和＝100％)的百分比，并在就非特異性結(jié)合進(jìn)行了校正后對肽濃度制圖。IC50定義為將[125I]EPO與EBP微珠的結(jié)合減少50％的肽濃度。全部數(shù)據(jù)都是關(guān)于IC50為50μM的GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG(RWJ61233)的。(參見后文表17至22)
表17.GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG取代系列SEQ ID 序列

EPO-ED50磷酸化1NO. (μM)

GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG 1 0.1 +61231GGTASCHFGPLTWVCKPQGG 24 IA -61520GGTTSCHFGPLTWVCKPQGG 24 IA -61598GGTFSCHFGPLTWVCKPQGG 12 IA -61277GGTYSCHFGALTWVCKPQGG 2 0.1 +61278GGTYSCHFGPLAWVCKPQGG 18 IA -61313GGTYSCHFAPLTWVCKPQGG 16 IA -61314GGTYSCHFGPATWVCKPQGG 1 .2 +61395GGTYSCHFGPLTAVCKPQGG ＞100 IA -62145GGTYSCHFGPLTFVCKPQGG 6 0.2561530GGTYSC-FGPLTWVCKPQGG 40 IA -*獲得EPO依賴性增殖最高水平一半所需的量(11pM)1在10μM濃度測得2IA＝無活性的

相對于RWJ-61233的結(jié)合

注全部肽都是環(huán)化的(61394除外)但是以COOH末端的酰胺形式(-CONH2)接受測定61233＝AFFY11157＝AFFY 244
表18.GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG截短系列RWJ No.序列

EPO-ED50磷酸化1(μM)

GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG 1 0.1 +61596GGTYSCHFGPLTWVCKPQ1.60.08+61597TYSCHFGPLTWVCKPQGG8 2 +61230TYSCHFGPLTWVCKPQ 6 2 +61232YSCHFGPLTWVCKP9 20 +/-61279YSCHFGPLTWVCK 14 3 +/-61477YSCHFGPLTWVC 50 IA2 -61895YSCHFGALTWVCK 32 IA61513Y-CHFGPLTWVC 12 2 +61177SCHFGPLTWVCK 18 IA -AF11154 GGCRIGPITWVCGG13 IA -61394HFGPLTWV ＞100 IA -*獲得EPO依賴性增殖最高水平一半所需的量(11pM)1在10uM濃度測得2IA＝無活性的

相對于RWJ-61233的結(jié)合

注全部肽都是環(huán)化的(61394除外)但是以COOH末端的酰胺形式(-CONH2)接受測定61233＝AFFY11157＝AFFY244
表19.序列類似的肽RWJ 序列

EPO-ED50磷酸化1No.(μM)

GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG 1 0.1 +61721

＞100 IA261718GGLYACHMGPMTWVCQPLRG 0.60.161719GGEYLCRMGPMTWVCTPVGG 8 961720GGLYTCRMGPITWVCLPAGG ND -61717GGNYYCRFGPITFECHPTGG ＞100(S1)IA*獲得EPO依賴性增殖最高水平一半所需的量(11pM)1在10μM濃度測得2IA＝無活性的

相對于RWJ-61233的結(jié)合

注全部肽都是環(huán)化的(61394除外)但是以COOH末端的酰胺形式(-CONH2)接受測定61233＝AFFY11157＝AFFY244
Table 20.第4位取代的系列RWJ No.(X) 序列

EPO-ED50(μM)*鼠受體 截短的人受體

GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG 1 0.1 0.161231 GGTASCHFGPLTWVCKPQGG 24 IA261520 GGTTSCHFGPLTWVCKPQGG 24 IA61598 GGTFSCHFGPLTWVCKPQGG 12 IA61894 p-NO2-Phe GGTXSCHFGPLTWVCKPQGG 17 IA 0.862019 p-NO2-Phe GGTXSCHFGPLTWVCKPQGG 18 IA 3.062020 p-F-PheGGTXSCHFGPLTWVCKPQGG 8 1.0 0.162021 3，5-二溴-tyr GGTXSCHFGPLTWVCKPQGG 30 IA IA*獲得EPO依賴性增殖最高水平一半所需的量(11pM)1在10μM濃度測得1ND＝未測定2IA＝無活性的

相對于RWJ-61233的結(jié)合

注全部肽都是環(huán)化的(61394除外)但是以COOH末端的酰胺形式(-CONH2)接受測定61233＝AFFY11157＝AFFY244
Table 21.第17位取代的系列序列No. 序列 相對結(jié)合**EPO-ED50(μM)鼠受 截短的 人受體體人受體65876 GGTYSCHFGPLTWVCK＞20*100.310AQGG**相對于61233的結(jié)合＝AFFY11157＝AFFY244*溶解性受到限制
Table 22.GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG為基礎(chǔ)的差異活性系列RWJ No. 序列

EPO-ED50(μM)*鼠受體 截短的人受體

GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG10.1 0.161596GGTYSCHFGPLTWVCKPQ 1.6 0.080.0261718GGLYACHMGPMTWVCQPLRG0.6 0.1 0.08AF11288 GGLYACHMGPMTWVCQPLRG0.2 0.15ND161757LGRKYSCHFGPLTWVCQPAKKD 10.110.15(H22)AF11654 TIAQYICYMGPETWECRPSPKA 10.2 0.0262145GGTYSCHFGPLTFVCKPQGG60.250.562146Ac-GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG 40.030.0661894GGTXSCHFGPLTWVCKPQGG17 IA2 0.8p-NO2-Phe62019GGTXSCHFGPLTWVCKPQGG18 IA 3.0p-NH2-Phe62020GGTXSCHFGPLTWVCKPQGG81.0 0.1p-F-Phe*獲得EPO依賴性增殖最高水平一半所需的量(11pM)1在10μM濃度測得1ND＝未測定2IA＝無活性的

相對于RWJ-61233的結(jié)合

注全部肽都是環(huán)化的(61394除外)但是以COOH末端的酰胺形式(-CONH2)接受測定61233＝AFFY11157＝AFFY244J.去缺氧性紅細(xì)胞增多癥(Polycythemic Exhypoxic)鼠生物測定雌性BDF1小鼠(18至20克)接受18小時0.40±0.02大氣壓和6小時環(huán)境氣壓的適應(yīng)循環(huán)(在低壓艙中)，為期14天。
在給予r-HuEPO或測試樣品前的72小時，將鼠維持在環(huán)境氣壓下。為了給適應(yīng)后的小鼠注射，將測試樣品和r-HuEPO標(biāo)準(zhǔn)物稀釋。媒質(zhì)包括含0.1％BSA(w/v)的PBS。對于每種稀釋液，給10小鼠皮下注射0.5ml。在48小時后給予59Fe。給予59Fe 48小時后采取血樣。測定每份樣品的血細(xì)胞比容和放射活性。后文表23和圖17A至17C中給出了劑量范圍和結(jié)果(兩次不同的測定)。
表23劑量n 對數(shù)(log)平均值EPO標(biāo)準(zhǔn)物 0.000U 10 0.260.025 10 1.650.050 10 2.740.100 10 3.28DMSO 1.40％ 7 0.580.35％ 5 0.60244-1 0.25μg 7 0.620.508 0.761.009 0.92244-2 2.009 1.384.0010 1.818.009 2.26244-3 14.010 2.4428.010 3.1556.09 3.160.1mg AFFY244≈1Ur-HuEPO(8.3ng)此外，利用以上去缺氧性紅細(xì)胞增多癥鼠生物測定，對TIAQYICYMGPETWECRPSPKA和含有兩個二硫鍵的GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG的二聚體肽類似物(AF12080)進(jìn)行了測試。圖18A至18B給出了去缺氧性紅細(xì)胞增多癥鼠生物測定的結(jié)果。此外，后文表24給出了EPO和各種模擬肽的大致當(dāng)量。
表24肽 相當(dāng)于0.025單位EPO的肽當(dāng)量(納摩爾濃度)GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG 3.8(RWJ61233/AFFY11157)GGTYSCHFGPLTWVCKPQ 0.5(RWJ61596)LGRKYSCHFGPLTWVCQPAKKD 3.1(RWJ61757)TIAQYICYMGPETWECRPSPK11-21(AAFY11654)GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG 二 0.035聚體(AFFY12080)K.網(wǎng)織紅細(xì)胞測定正常的未處理過的雌性BDF1小鼠被連續(xù)3天皮下給予EPO或?qū)嶒灮衔?0.5ml，S.Q.)。媒質(zhì)PBS，10％PEG8000，0.25％BSA，并加入DMSO。在第三天，小鼠還被給予(0.1ml，I.P.)葡聚糖鐵(100mg/ml)。在第五天，用CO2麻醉小鼠，并利用心臟穿刺放血。利用三唑橙染色和流動細(xì)胞計數(shù)(網(wǎng)織紅細(xì)胞計數(shù)程序(retic-count program))測定網(wǎng)織紅細(xì)胞的百分比。人工測定血細(xì)胞比容。利用以下公式計算校正后的網(wǎng)織紅細(xì)胞百分比％網(wǎng)織紅細(xì)胞(RETIC.)(校正值)＝％RETIC.(實測值)×血細(xì)胞比容(Hct.)(個體值)/Hct.(一般值)圖18A至18B和圖19A至19B給出了利用以上網(wǎng)織紅細(xì)胞測定測得的結(jié)果。
L.集落測定紅細(xì)胞系集落的形成1.材料與方法將取自正常供體的人具核骨髓細(xì)胞平板培養(yǎng)在半固體甲基纖維素培養(yǎng)基(0.9％甲基纖維素，30％胎牛血清，1％牛血清白蛋白，10-42-巰基乙醇，2mM L-谷胺酰胺)中。簡而言之，收集細(xì)胞，加入經(jīng)緩沖的氯化銨裂解紅細(xì)胞。將細(xì)胞重懸在含2％胎牛血清的培養(yǎng)基中，并以2×105個細(xì)胞每平板的密度進(jìn)行一式兩份的平板培養(yǎng)。對12天后形成的紅細(xì)胞素和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞(G-M)集落進(jìn)行顏色和形態(tài)測評。在研究中包含一個對照平板，其中含有用于獲得樣品的GM集落形成的重組人生長因子IL-3、GM-CSF和SCF(3/GM/S)。
每2×105個具核細(xì)胞的集落數(shù)紅細(xì)胞系 G-M生長因子(nM) 平板1 平板2 平板1平板2對照(無因子) 0 0 00EPO(0.24)113 106 12 9RWJ 61233(1000) 292312RWJ 61233(10,000)8075203/GM/S(0.7/0.7/2.7) 0 0 176 2122.結(jié)果根據(jù)以上數(shù)據(jù)，很明顯，GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG(RWJ61233/AFFY11157)能夠在沒有其它細(xì)胞因子存在下促進(jìn)紅細(xì)胞系集落的形成。此外，肽不能夠促進(jìn)GM系細(xì)胞集落的形成，由此表現(xiàn)出對紅細(xì)胞系嚴(yán)格的特異性。
應(yīng)該認(rèn)為，以上說明是為了說明本發(fā)明而不是限定本發(fā)明。在閱讀了以上說明書后，對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，許多實施方式將是顯而易見的。所以，本發(fā)明的范圍不應(yīng)由以上說明書來確定，而應(yīng)該由后文的權(quán)利要求來確定，而且包括與權(quán)利要求所及相當(dāng)?shù)娜糠秶１疚囊脜⒖剂怂黾暗娜课墨I(xiàn)和參考資料，包括專利公告。
權(quán)利要求
1.長度為10至40個氨基酸、結(jié)合紅細(xì)胞生成素受體的肽，它包含氨基酸序列X3X4X5GPX6TWX7X8，其中每個氨基酸均由一個標(biāo)準(zhǔn)單字母縮寫標(biāo)示；X6獨立地選自20個遺傳性編碼的L-氨基酸中任意一個；X3是C；X4是R、H、L或W；X5是M、F或I；X7是D、E、I、L或V；X8是C。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽，它包含氨基酸序列YX2X3X4X5GPX6TWX7X8，其中每個氨基酸均由一個標(biāo)準(zhǔn)單字母縮寫標(biāo)示；X2和X6各自獨立地選自20個遺傳性編碼的L-氨基酸中任意一個；X3是C；X4是R、H、L或W；X5是M、F或I；X7是D、E、I、L或V；X8是C。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的肽，它包含氨基酸序列X1YX2X3X4X5GPX6TWX7X8X9X10X11，其中每個氨基酸均由一個標(biāo)準(zhǔn)單字母縮寫標(biāo)示；X1、X2、X6、X9、X10和X11各自獨立地選自20個遺傳性編碼的L-氨基酸中任意一個；X3是C；X4是R、H、L或W；X5是M、F或I；X7是D、E、I、L或V；X8是C。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的肽，其中X4是R或H；X5是F或M；X6是I、L、T、M、E或V；X7是D或V；X9是G、K、L、Q、R、S或T；X10是A、G、P、R或Y。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的肽，其中X1是D、E、L、N、S、T或V；X2是A、H、K、L、M、S或T；X4是R或H；X9是K、R、S或T；X10是P。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽，它選自GGLYLCRFGPVTWDCGYKGG；GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG；GGTYSCHFGPLTWVCKPQ；GGDYHCRMGPLTWVCKPLGG；VGNYMCHFGPITWVCRPGGG；GGNYMCHFGPITWVCRPGGG；GGVYACRMGPITWVCSPLGG；VGNYMAHMGPITWVCRPGG；GGPHHVYACRMGPLTWIC；GGTYSCHFGPLTWVCKPQ；GGLYACHMGPMTWVCQPLRG；TIAQYICYMGPETWECRPSPKA；YSCHFGPLTWVCK；YCHFGPLTWVC；Ac-GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG；GGCRIGPITWVCGG；LGRKYSCHFGPLTWVCQPAKKD；GGTASCHFGPLTWVCKPQGG；GGNYYCRFGPITFECHPTGG；GGEYLCRMGPMTWVCTPVGG；GGLYTCRMGPITWVCLPAGG；GGTTSCHFGPLTWVCKPQGG；GGTFSCHFGPLTWVCKPQGG；GGTYSCHFGALTWVCKPQGG；GGTYSCHFGPLAWVCKPQGG；GGTYSCHFAPLTWVCKPQGG；GGTYSCHFGPATWVCKPQGG；GGTYSCHFGPLTAVCKPQGG；GGTYSCHFGPLTFVCKPQGG；TYSCHFGPLTWVCKPQ；YSCHFGPLTWVCKP；SCHFGPLTWVCK；GGTYSCFGPLTWVCKPQGG；TYSCHFGPLTWVCKPQGG；YSCHFGPLTWVC；GGTYSCHFGPLTFVCKPQGG；和HFGPLTWV.
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽，它選自GGLYLCRFGPVTWDCGYKGG；GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG；GGDYHCRMGPLTWVCKPLGG；VGNYMCHFGPITWVCRPGGG；GGVYACRMGPITWVCSPLGG；VGNYMAHMGPITWVCRPGG；GGPHHVYACRMGPLTWIC；GGTYSCHFGPLTWVCKPQ；GGLYACHMGPMTWVCQPLRG；TIAQYICYMGPETWECRPSPKA；YSCHFGPLTWVCK；YCHFGPLTWVC；和HFGPLTWV.
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽，所述的氨基酸序列是環(huán)化的。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的肽，它選自GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG；GGTYSCHFGPLTWVCKPQ；GGLYACHMGPMTWVCQPLRG；TIAQYICYMGPETWECRPSPKA；YSCHFGPLTWVCK；YCHFGPLTWVC；Ac-GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG；GGCRIGPITWVCGG；LGRKYSCHFGPLTWVCQPAKKD；GGTASCHFGPLTWVCKPQGG；GGNYYCRFGPITFECHPTGG；GGEYLCRMGPMTWVCTPVGG；GGLYTCRMGPITWVCLPAGG；GGTTSCHFGPLTWVCKPQGG；GGTFSCHFGPLTWVCKPQGG；GGTYSCHFGALTWVCKPQGG；GGTYSCHFGPLAWVCKPQGG；GGTYSCHFAPLTWVCKPQGG；GGTYSCHFGPATWVCKPQGG；GGTYSCHFGPLTAVCKPQGG；GGTYSCHFGPLTFVCKPQGG；TYSCHFGPLTWVCKPQ；YSCHFGPLTWVCKP；YSCHFGALTWVCK；SCHFGPLTWVCK；GGTYSEHFGPLTWVKKPQGG；GGTYSCFGPLTWVCKPQGG；TYSCHFGPLTWVCKPQGG；YSCHFGPLTWVC；GGTYSCHFGPLTFVCKPQGG；和
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽，所述的氨基酸序列是二聚化的。
11.根據(jù)權(quán)利要求11所述的肽，它包含以下氨基酸序列GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGGGTYSCHFGPLTWVCKPQGG.
12.包含權(quán)利要求1所述的化合物和藥學(xué)上認(rèn)可的載體的藥物組合物。
13.治療以缺乏紅細(xì)胞生成素或紅血細(xì)胞群缺少或缺陷為特征的疾病患者的方法，它包括給病人使用治療有效量的權(quán)利要求1所述的肽。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中的疾病是末期腎功能衰竭或透析；AIDS相關(guān)性貧血，自身免疫疾病，或惡性腫瘤；β-地中海貧血；囊性纖維變性；早期早熟性貧血；與慢性炎性疾病相關(guān)的貧血；脊髓損傷；急性失血；衰老和伴隨有異常紅細(xì)胞產(chǎn)生的腫瘤疾病。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中的肽包含氨基酸序列YX2X3X4X5GPX6TWX7X8，其中每個氨基酸均由一個標(biāo)準(zhǔn)單字母縮寫標(biāo)示；X2和X6各自獨立地選自20個遺傳性編碼的L-氨基酸中任意一個；X3是C；X4是R、H、L或W；X5是M、F或I；X7是D、E、I、L或V；X8是C。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中的肽包含氨基酸序列X1YX2X3X4X5GPX6TWX7X8X9X10X11，其中每個氨基酸均由一個標(biāo)準(zhǔn)單字母縮寫標(biāo)示；X1、X2、X6、X9、X10和X11各自獨立地選自20個遺傳性編碼的L-氨基酸中任意一個；X3是C；X4是R、H、L或W；X5是M、F或I；X7是D、E、I、L或V；X8是C。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中X4是R或H；X5是F或M；X6是I、L、T、M或V；X7是D或V；X9是G、K、L、Q、R、S或T；X10是A、G、P、R或Y。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中X1是D、E、L、N、S、T或V；X2是A、H、K、L、M、S或T；X4是R或H；X9是K、R、S或T；X10是P。
19.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中的肽選自GGLYLCRFGPVTWDCGYKGG；GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG；GGTYSCHFGPLTWVCKPQ；GGDYHCRMGPLTWVCKPLGG；VGNYMCHFGPITWVCRPGGG；GGNYMCHFGPITWVCRPGGG；GGVYACRMGPITWVCSPLGG；VGNYMAHMGPITWVCRPGG；GGPHHVYACRMGPLTWIC；GGTYSCHFGPLTWVCKPQ；GGLYACHMGPMTWVCQPLRG；TIAQYICYMGPETWECRPSPKA；YSCHFGPLTWVCK；YCHFGPLTWVC；Ac-GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG；GGCRIGPITWVCGG；LGRKYSCHFGPLTWVCQPAKKD；GGTASCHFGPLTWVCKPQGG；GGNYYCRFGPITFECHPTGG；GGEYLCRMGPMTWVCTPVGG；GGLYTCRMGPITWVCLPAGG；GGTTSCHFGPLTWVCKPQGG；GGTFSCHFGPLTWVCKPQGG；GGTYSCHFGALTWVCKPQGG；GGTYSCHFGPLAWVCKPQGG；GGTYSCHFAPLTWVCKPQGG；GGTYSCHFGPATWVCKPQGG；GGTYSCHFGPLTAVCKPQGG；GGTYSCHFGPLTFVCKPQGG；TYSCHFGPLTWVCKPQ；YSCHFGPLTWVCKP；SCHFGPLTWVCK；GGTYSCFGPLTWVCKPQGG；TYSCHFGPLTWVCKPQGG；YSCHFGPLTWVC；GGTYSCHFGPLTFVCKPQGG；和HFGPLTWV.
20.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中的肽是環(huán)化的。
21.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中的肽是是二聚化的。
22.治療以缺乏紅細(xì)胞生成素或紅血細(xì)胞群缺少或缺陷為特征的疾病患者的方法，它包括給病人使用治療有效量的某種肽，所述的肽長度為10至40個氨基酸，它結(jié)合紅細(xì)胞生成素受體，并包含氨基酸序列X3X4X5GPX6TWX7X8(SEQ IDNO)，每個氨基酸均由一個標(biāo)準(zhǔn)單字母縮寫標(biāo)示；X6獨立地選自20個遺傳性編碼的L-氨基酸中任意一個；X3是C；X4是R、H、L或W；X5是M、F或I；X7是D、E、I、L或V；X8是C。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中的疾病是末期腎功能衰竭或透析；AIDS相關(guān)性貧血，自身免疫疾病，或惡性腫瘤；β-地中海貧血；囊性纖維變性；早期早熟性貧血；與慢性炎性疾病相關(guān)的貧血；脊髓損傷；急性失血；衰老和伴隨有異常紅細(xì)胞生產(chǎn)的腫瘤疾病。
24.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中的肽包含氨基酸序列YX2X3X4X5GPX6TWX7X8，其中每個氨基酸均由一個標(biāo)準(zhǔn)單字母縮寫標(biāo)示；X2和X6各自獨立地選自20個遺傳性編碼的L-氨基酸中任意一個；X3是C；X4是R、H、L或W；X5是M、F或I；X7是D、E、I、L或V；X8是C。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中的肽包含氨基酸序列X1YX2X3X4X5GPX6TWX7X8X9X10X11，其中每個氨基酸均由一個標(biāo)準(zhǔn)單字母縮寫標(biāo)示；X1、X2、X6、X9、X10和X11各自獨立地選自20個遺傳性編碼的L-氨基酸中任意一個；X3是C；X4是R、H、L或W；X5是M、F或I；X7是D、E、I、L或V；X8是C。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中X4是R或H；X5是F或M；X6是I、L、T、M或V；X7是D或V；X9是G、K、L、Q、R、S或T；X10是A、G、P、R或Y。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中X1是D、E、L、N、S、T或V；X2是A、H、K、L、M、S或T；X4是R或H；X9是K、R、S或T；X10是P。
28.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中的肽選自GGLYLCRFGPVTWDCGYKGG；GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG；GGTYSCHFGPLTWVCKPQ；GGDYHCRMGPLTWVCKPLGG；VGNYMCHFGPITWVCRPGGG；GGNYMCHFGPITWVCRPGGG；GGVYACRMGPITWVCSPLGG；VGNYMAHMGPITWVCRPGG；GGPHHVYACRMGPLTWIC；GGTYSCHFGPLTWVCKPQ；GGLYACHMGPMTWVCQPLRG；TIAQYICYMGPETWECRPSPKA；YSCHFGPLTWVCK；YCHFGPLTWVC；Ac-GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG；GGCRIGPITWVCGG；LGRKYSCHFGPLTWVCQPAKKD；GGTASCHFGPLTWVCKPQGG；GGNYYCRFGPITFECHPTGG；GGEYLCRMGPMTWVCTPVGG；GGLYTCRMGPITWVCLPAGG；GGTTSCHFGPLTWVCKPQGG；GGTFSCHFGPLTWVCKPQGG；GGTYSCHFGALTWVCKPQGG；GGTYSCHFGPLAWVCKPQGG；GGTYSCHFAPLTWVCKPQGG；GGTYSCHFGPATWVCKPQGG；GGTYSCHFGPLTAVCKPQGG；GGTYSCHFGPLTFVCKPQGG；TYSCHFGPLTWVCKPQ；YSCHFGPLTWVCKP；SCHFGPLTWVCK；GGTYSCFGPLTWVCKPQGG；TYSCHFGPLTWVCKPQGG；YSCHFGPLTWVC；GGTYSCHFGPLTFVCKPQGG；和HFGPLTWV.
29.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中的肽是環(huán)化的。
30.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中的肽是是二聚化的。
全文摘要
本發(fā)明涉及長度為10至40個或40個以上的氨基酸殘基、具有序列X
文檔編號A61P7/06GK1192748SQ96196094
公開日1998年9月9日 申請日期1996年6月7日 優(yōu)先權(quán)日1995年6月7日
發(fā)明者N·C·賴頓, W·J·道爾, R·S·張, A·K·摩騰, L·K·喬利夫, D·約翰遜, L·馬爾卡希 申請人:奧爾托藥品有限公司, 阿弗麥克斯技術(shù)股份有限公司