專利名稱：聯(lián)合療法治療hiv和其它病毒性感染的制作方法
1.本發(fā)明的范圍本發(fā)明為申請?zhí)枮?8/481957(申請日期為1995年6月7日)的部分連續(xù)申請。
本發(fā)明涉及使用新的聯(lián)合療法治療病毒性感染，尤其是HIV感染的方法。所述新的聯(lián)合療法采用肽DP-178，DP-107或片斷，類似物和/或其同系物，以及至少一種其它的治療劑。
DP-178是一種相應(yīng)HIV-1LAI橫跨膜蛋白(TM)gP41的氨基酸638到673的肽。DP-178包括其部分，類似物，及DP-178的同系物，它們都表現(xiàn)出抗病毒活性。抗病毒活性包括(但不限于)抑制HIV向未感染的CD-4+細(xì)胞傳播。而且，本發(fā)明還涉及使用DP-.178和DP-178片斷和/或類似物或同系物作為逆轉(zhuǎn)錄病毒(特別是HIV)向未感染的人或非人細(xì)胞傳播的抑制劑。本發(fā)明還涉及抗病毒肽DP-107，一種相應(yīng)HIV-1LAI橫跨膜蛋白(TM)gP41氨基酸558到595的肽，這些氨基酸存在于其它的包膜病毒中。更準(zhǔn)確地說，本發(fā)明涉及DP-107，其片斷和/或類似物或同系物與其它治療劑合并使用以治療病毒性感染，尤其是HIV感染的用途。而且，本發(fā)明還涉及包含DP-178或DP-107和至少一種其它治療劑的新的藥用組合物。
2.本發(fā)明的背景2.1人免疫缺陷病毒人免疫缺陷病毒(HIV)是一種致病性逆轉(zhuǎn)錄病毒和引起獲得性免疫缺陷綜合病(AIDS)和相關(guān)疾病的成因因子(Barre-Sinossi，F(xiàn).etal.，1983，Science 220868-870；Gallo，R.et al.，1984，Science 224500-503)。至少有兩種不同的HIV類型HIV-1(Barre-Sinossi，F(xiàn).et al.，1983，Science 220868-870；Gallo，R.et al.，1984，Science 224500-503)和HIV-2(Clavel，F(xiàn).etal.，1986，Science 223343-346；Guyader，M.et al.，1987，Nature 326662-669)。而且，這些類型病毒中的每一型群體都存在著大量的遺傳異質(zhì)性。人CD-4+T-淋巴細(xì)胞感染一種HIV病毒時將導(dǎo)致該型細(xì)胞衰竭，并最終引起機(jī)遇性感染，神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂，腫瘤形成，而過早死亡。
HIV屬逆轉(zhuǎn)錄病毒的慢病毒科中的一員(Teich，N.et al.，1984；RNA Tumor Viruses，Weiss，R.et al.，eds.，CSH-Press，PP.949-956)。逆轉(zhuǎn)錄病毒為小包膜病毒，它含有一種二倍體的單股RNA基因組，通過病毒編碼的逆轉(zhuǎn)錄酶(一種RNA誘導(dǎo)的DNA聚合酶)產(chǎn)生的一種DNA中間產(chǎn)物進(jìn)行復(fù)制(Varmus，H.，1988，Science 2401427-1439)。其它逆轉(zhuǎn)錄病毒包括致瘤病毒如人T-細(xì)胞白血病病毒(HTLV-I，-II，-III)，和貓白血病病毒。HIV病毒顆粒由病毒核心組成，而該核心又由稱作P24和P18的蛋白質(zhì)構(gòu)成。病毒核心含有病毒RNA基因組和復(fù)制過程中所需的上述酶類。十四烷基葡萄糖胺聚糖組成的病毒外殼包繞著病毒核心，外面再包著一層由感染的宿主細(xì)胞膜衍化的脂膜外套。HIV包膜表面的糖蛋白經(jīng)合成形成一種單-160KD的前體蛋白，在病毒繁殖期間，這種前體蛋白在一種細(xì)胞蛋白酶的作用下分裂成兩種糖蛋白gP41和GP120。gP41是一種透膜蛋白，而gP120為一種細(xì)胞外蛋白，它與gP41以非共價的形式(可能是三聚體或多聚體的方式)連在一起(Hammerwskjold，H.and Rekosh，D.，1989，Biochem.Biophys.Acta 989269-280)。
HIV以CD-4+T淋巴細(xì)胞作為靶細(xì)胞是因為CD-4表面蛋白起著HIV-1病毒細(xì)胞受體的作用(Dalgleish，A.et al.，1984，Nature312767-768，Maddon et al.，1986，Cell 47333-348)。病毒進(jìn)入細(xì)胞后則依賴gP120結(jié)合在細(xì)胞CD-4+受體分子上，同時gP41也固定在病毒膜上的包膜糖蛋白復(fù)合體上(McD-ougal，J.S.et al.，1986，Science231∶382-385；Maddon，P.J.et al.，1986，Cell 47∶333-348)，這就解釋了HIV對CD-4+細(xì)胞的親和性。
2.2HIV的治療HIV感染是一種全球流行的傳染病，HIV相關(guān)疾病提出了一個嚴(yán)重的世界性衛(wèi)生問題。盡管作出了巨大的努力以成功地設(shè)計有效的治療藥物，但目前并不存在針對AIDS的有療效的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物。為試圖開發(fā)此類藥物，曾考慮過針對病毒生命周期的幾個階段進(jìn)行治療性干擾(Mitsuya，H.et al.，1991，F(xiàn)ASEB J.52369-2381)。干擾可能抑制HIV對細(xì)胞膜的結(jié)合，也可能抑制HIV RNA基因組反轉(zhuǎn)錄到DNA中，或者抑制病毒從宿主細(xì)胞中排出以感染新的靶細(xì)胞。
為開發(fā)能夠抑制病毒進(jìn)入細(xì)胞(即HIV感染的最早階段)的藥物，曾做了一些嘗試。在這方面，注意力主要集中在CD-4+，即針對HIV的細(xì)胞表面受體上。例如，重組體的可溶性CD-4已表明能在病毒顆粒遇到嵌入細(xì)胞膜的CD-4分子之前即與之結(jié)合，以阻斷HIV的感染性(Smith，D.H.et al.，1987，Science 238∶1704-1707)。某些原始HIV-1株對重組體的CD-4的抑制作用很不敏感(Daar，E.etal.，1990，Ann.Int.Med.112∶247-253)。此外，重組體的可溶性CD-4的臨床試驗已得出無定論的結(jié)果(Schooley，R.et al.，1990，Ann，Int.Med.112247-253；Kahn，J.O.et al.，1990，Ann.Int.Med.112∶254-261；Yarchoan，R.et al.，1989，Proc.Vth.Int.Conf.on AIDS，P564，MCP137)。
以病毒編碼的逆轉(zhuǎn)錄酶的靶向的藥物，包括2’，3’-雙脫氧核苷類似物如AZT，ddI，ddC，及d4T，已經(jīng)開發(fā)出來，并顯示出抗HIV活性(Mitsuya，H.et al.，1991，Science 249∶1533-1544)。這些核苷類似物雖然有益，卻是非治療性的，這可能與抗藥性HIV突變型迅速出現(xiàn)有關(guān)(Lander，B.et al.，1989，Science 243∶1731-1734)。此外，這些藥物常常顯示出毒副作用如骨髓抑制，嘔吐及肝功能異常。
HIV病毒復(fù)制的后期，也可認(rèn)為是開發(fā)抗HIV藥物的可能目標(biāo)，因為該期涉及到某些病毒蛋白至關(guān)重要的病毒特異性的二次加工。后期加工依賴于某種病毒蛋白酶的活性，而正在開發(fā)的藥物也正是抑制這種酶(Erikson，J.，1990，Science 249∶527-533)。這些候選藥物的臨床結(jié)果尚有疑問。
注意力還放在開發(fā)疫苗來治療HIV感染方面。HIV-1包膜蛋白(gP160，gP120，gP41)已認(rèn)為是存在于AIDS患者中的抗-HIV抗體的主要抗原(Barin et al.，1985，Science 228∶1094-1096)。迄今為止，這些作為抗原的蛋白似乎是開發(fā)抗-HIV的最有前景的候選物。為此，一些團(tuán)體已開始利用gP160，gP120，和/或gP41的不同部分作為宿主免疫系統(tǒng)的免疫原靶子。例如，請參考Ivanoff，L.et al.，U.S.Pat.No.5,141,867；Saith，G.et al.，WO 92/22,654；Schafferman，A.，WO 91/09,872；Formoso，C.et al.，WO 90/07,119。然而，涉及所述候選疫苗的臨床結(jié)果仍遙遙無期。
最近，可誘導(dǎo)全身、免疫應(yīng)答的雙股RNAs已與抗病毒劑如干擾素，疊氮胸苷(AZT)和膦?；姿猁}一道聯(lián)合用于治療病毒性感染(參看Carter，W.，U.S.Patent No.4,950,652)。此外，嘧啶核苷類似物和尿苷磷酸化酶抑制劑的聯(lián)合療法已用于治療HIV(參看Sommadossi，J.P.et al.，U.S.Patent No.5077280)。盡管上述特異性療法已證明是有益的，但一般來說聯(lián)合療法具有相互拮抗作用的可能性，就像在體外試驗中合并使用疊氮胸苷(AZT)和病毒唑所表現(xiàn)的那樣(參看U.S.PatentNo.4950652)。而且，假如大多數(shù)抗-HIV治療劑毒性高且療效差，則聯(lián)合療法就存在著很大問題。因而需要一種高效無毒的聯(lián)合療法。
本發(fā)明根據(jù)病毒融合抑制劑(DP-178，DP-107等)與其它抗病毒劑的合并使用提出一種新的聯(lián)合療法。DP-178和DP-107均為新的治療劑，它們能阻止病毒與細(xì)胞融合，因而非常有效地預(yù)防了病毒在細(xì)胞與細(xì)胞之間的傳播。另外，體外研究和動物試驗證實DP-178和DP-107無毒性作用。本發(fā)明提供了將上述肽類與另一種抗病毒劑或任何其它治療劑合并使用的第一份報告。
3.本發(fā)明的概述本發(fā)明涉及將有效劑量的DP-178，或它的一種藥學(xué)上可接受的衍生物與至少一種其它的治療劑合并使用以治療或預(yù)防哺乳動物(包括人)病毒性感染，尤其是HIV感染的方法。
本發(fā)明還涉及將有效量的DP-107，或它的藥學(xué)上可接受的衍生物與至少一種其它的治療劑合并使用以治療或預(yù)防哺乳動物(包括人)病毒性感染，尤其是HIV感染的方法。
更準(zhǔn)確地說，本發(fā)明涉及將有效量的DP-107，DP-178，或它們的一種藥學(xué)上可接受的衍生物與至少一種其它的抗病毒劑合并使用以治療或預(yù)防哺乳動物(包括人)病毒性感染的方法。本發(fā)明包括活性劑(例如DP-107，DP-178或另一種抗病毒劑)的給藥方法同時給藥，或按先后次序給藥，包括周期性給藥。周期療法涉及在一段時間內(nèi)給予第一種抗病毒化合物，接著在另一段時間內(nèi)給予第二種抗病毒化合物，然后重復(fù)這種給藥順序(即周期)，以降低此種療法產(chǎn)生的耐藥性。本發(fā)明涉及聯(lián)合使用DP-107，DP-178或它們的一種藥學(xué)上可接受的衍生物和至少一種其它的治療劑，特別是至少一種其它的抗病毒劑，它們可產(chǎn)生協(xié)同作用，即比單獨使用一種藥物或一種療法效果好。
本發(fā)明還涉及DP-178，DP-107或它們的一種藥學(xué)上可接受的衍生物與至少一種其它抗病毒劑(和病毒融合抑制劑有不同的作用部位)的聯(lián)合使用。建立在聯(lián)合使用上的這些治療劑可產(chǎn)生雙重作用(不管是協(xié)同作用還是增效作用)基礎(chǔ)上的這種組合提供了一種改進(jìn)的治療方法。
本發(fā)明也涉及把有效量的DP-107，DP-178或它們的一種藥學(xué)上可接受的衍生物與至少一種其它的治療劑，尤其是至少一種其它的抗病毒劑合并使用以治療或預(yù)防哺乳動物(包括人)的HIV感染的方法。
本發(fā)明涉及的抗病毒劑的新的組合提供了一種治療手段，它不僅可以減少藥物達(dá)到抗病毒活性所需的有效劑量(從而降低了毒性)，而且還可以通過多種機(jī)制攻擊病毒，從而增強(qiáng)抗病毒的確切效果。同樣，所述的新的抗病毒組合提供了一種防止病毒對單一療法產(chǎn)生耐藥性的方法，因而也為臨床醫(yī)生提供了一種更為有效的治療。
本發(fā)明的另一方面包括治療或預(yù)防病毒性感染，尤其是HIV感染的藥用組合物和制劑，其中所述的組合物包括有效量的DP-178，DP-107，或它們的一種藥學(xué)上可接受的衍生物，至少一種另加的治療劑和一種藥學(xué)上可接受的載體。
與DP-178，DP-107或它們的一種藥學(xué)上可接受的衍生物聯(lián)合使用的治療劑涉及到各種各樣的已知治療方法。但最好是將DP-107或DP-178與另一種具有不同攻擊模式的治療劑合并使用。這些治療劑包括(但不限于此)抗病毒劑，如細(xì)胞活素(Cytokines)如rIFNα，rIFNβ，rIFNγ；逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，如AZT，3TC，ddI和其它的雙脫氧核苷或雙脫氧氟代核苷；病毒mRNA封端(capping)的抑制劑，如病毒唑；HIV蛋白酶抑制劑，如ABT-538和MK-639；兩性霉素B，作為一種脂鍵結(jié)合分子而具有抗-HIV活性，及錐栗精胺(castanospermine)，作為糖蛋白加工的抑制劑。
因此，本發(fā)明提供了一種改進(jìn)的抗病毒治療方法，用于治療廣譜病毒包括HIV的感染。
本發(fā)明也提供了旨在增加療效的聯(lián)合療法，該療法優(yōu)于使用單一治療劑的療法。
此外，本發(fā)明提供了可以減輕DP-178和DP-107和/或由肽構(gòu)成的治療劑的毒性的聯(lián)合療法，從而提供了一種較高的治療指數(shù)。
本發(fā)明提供了一種防止病毒對單一療法產(chǎn)生耐藥性的聯(lián)合療法。
3.1定義本文使用的“病毒性感染”一詞用于描述一種疾病狀態(tài)，更確切地說，系指病毒侵入健康的細(xì)胞，利用細(xì)胞的生殖機(jī)制進(jìn)行繁殖或復(fù)制，最后使細(xì)胞溶化并導(dǎo)致細(xì)胞死亡，病毒顆粒釋放后，再通過新產(chǎn)生的子代病毒感染其它的細(xì)胞。某些病毒引起的潛伏感染也是病毒感染的一個可能結(jié)果。
本文使用的術(shù)語“治療或預(yù)防病毒性感染”意指抑制特定病毒的復(fù)制，抑制病毒的傳播，預(yù)防病毒在其宿主中自我安置，改善或減輕病毒感染引起的疾病癥狀。如果病毒負(fù)載減輕，死亡率和/或發(fā)病率降低，則可認(rèn)為治療是有效的。
本文使用的術(shù)語“協(xié)同作用”涉及一種聯(lián)合療法，它比單純使用任何兩種或多種單一的治療劑所產(chǎn)生的加合作用更為有效。本文使用的協(xié)同效果涉及到使用較低用量(劑量)的單一療法以治療或預(yù)防病毒性感染的能力。所述的較低劑量導(dǎo)致較低的毒性，而不降低藥效。此外，協(xié)同效果能增加療效，即增強(qiáng)抗病毒活性。最后，協(xié)同能避免或減輕病毒對任何單一療法產(chǎn)生的耐藥性。DP-178或DP-107與另一種治療劑之間的協(xié)同相互作用的測定是以本文5.5節(jié)描述的抗病毒測定法獲得的結(jié)果為基礎(chǔ)。這些測定方法的結(jié)果采用Chou和Talalay組合法(Chou and Talalay，1984，Adv，Enzyme Regul.2227-55)和“微機(jī)劑量-效果分析”軟件來分析(Chou and Chou，1987，Softwareand manual.P19-64.Elsevier Biosoft，Cambridge，UK)以求獲得一種組合指數(shù)。組合指數(shù)值＜1表示協(xié)同作用，值＞1表示拮抗作用，值＝1表示增效作用。
這些測定法的結(jié)果也可采用Fritchard和Shipman的方法(Fritchard and Shipman，1990，Antiviral Research 14∶181-206)來分析。這種計算機(jī)程序是通過對結(jié)果的三維圖解分析來確定抗病毒劑之間的相互協(xié)同或拮抗作用的一種測定方法。
術(shù)語“藥學(xué)上可接受的載體”涉及一種載體媒介，它不干擾活性成份的生物學(xué)活性效應(yīng)，在化學(xué)上不活潑，且對給藥病人無毒性作用。
本文使用的術(shù)語“藥學(xué)上可接受的衍生物”系指下文5.1.2節(jié)中描述的與DP-178或DP-107肽相應(yīng)的任何同系物，類似物，或片斷，它顯示出抗病毒活性，且對受試者相對無毒性。
術(shù)語“治療劑”系指能有助于治療病毒性感染或由此而引起的疾病的任何分子，化合物或藥物，尤指抗病毒劑。
本文涉及的肽定義為由肽鍵共價結(jié)合的兩個或多個氨基酸組成的有機(jī)化合物。肽也可指構(gòu)成氨基酸的數(shù)量，即二肽含有兩個氨基酸殘基，三肽含有三個，等等。含10個或10個以下氨基酸的肽可稱為寡肽，而10個以上氨基酸殘基組成的肽稱為多肽。
本文定義的肽序列用代表氨基酸殘基一個字母符號來表示如下A(丙氨酸)R(精氨酸)N(天門冬酰胺)D(天門冬氨酸)C(半胱氨酸)Q(谷氨酰胺)E(谷氨酸)G(甘氨酸)H(組氨酸)I(異亮氨酸)L(亮氨酸)K(賴氨酸)M(蛋氨酸)F(苯丙氨酸)P(脯氨酸)
S(絲氨酸)T(蘇氨酸)W(色氨酸)Y(酪氨酸)V(纈氨酸)4.圖的概述

圖1由HIVLAI衍生的DP-178氨基酸序列(SEQ ID1)；由HIV-1SF2(DP-185；SEQ ID: 3)，HIV-1RF(SEQ ID4)，和HIV-1MN(SEQ ID5)衍生的DP-178同系物；由兩株原型HIV-2株，即HIV-2rod(SEQ ID6)和HIV-2NIHZ(SEQ ID7)的氨基酸序列衍生的DP-178同系物；對照肽DP-180(SEQID2)，一種與DP-178氨基酸殘基以雜混次序結(jié)合的肽；與DP-178無關(guān)的DP-118(SEQ ID10)，它能抑制HIV-1細(xì)胞游離病毒的感染；與DP-178無關(guān)的DP-125(SEQ ID8)，曾表明可抑制HIV-1細(xì)胞游離病毒的感染(Wild et al.，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8910，537-10，541)；與DP-178無關(guān)的DP-116(SEQ ID9)經(jīng)細(xì)胞游離病毒感染測定后表明不能抑制HIV-1感染(Wild，et al.，1992，Proc.Natl.Acad.Sci USA 8910，537-10，541)。所有的圖均采用上述單字母氨基酸碼。
圖2合成肽抑制HIV-1細(xì)胞-游離病毒感染。IC50系指與未經(jīng)治療的對照比較，肽抑制來自感染細(xì)胞的RT繁殖達(dá)50％時的濃度。對照用和處理過的培養(yǎng)物相同濃度的病毒感染未處理的細(xì)胞培養(yǎng)物后產(chǎn)生的RT的濃度。
圖3合成肽DP-178(SEQ ID1)抑制HIV-1和HIV-2細(xì)胞-游離病毒感染。IC50與未經(jīng)處理的對照比較，抑制RT繁殖達(dá)50％所需的肽濃度。對照用和處理過的培養(yǎng)物同樣濃度的病毒感染未處理細(xì)胞培養(yǎng)物后產(chǎn)生的RT的濃度。
圖4DP-178(SEQ ID1)和DP-116(SEQ ID9)對CEM細(xì)胞的細(xì)胞毒性研究。表明了細(xì)胞繁殖數(shù)據(jù)。
圖5A-CDP-178-衍生的肽的抗病毒數(shù)據(jù)。本文列出的肽是由環(huán)繞HIV-1BRU株DP-178區(qū)(如gP41氨基酸殘基615-717)的周邊區(qū)域衍生出來的。在這種情況下，肽在該區(qū)域含有DP178點突變，突變的氨基酸殘基用陰暗背景表示。當(dāng)出現(xiàn)此種情況，即受試肽有一個氨基和/或羧基端基加入或除去時(此類肽上發(fā)現(xiàn)的標(biāo)準(zhǔn)氨基-和乙酰基-阻斷基則除外)，此類變型會標(biāo)明。
圖5A測試肽名右邊緊挨著的一欄標(biāo)明了測試肽的大小，并指出該肽是否由一個氨基酸肽“移行”(walk)過所述的DP178區(qū)衍生而來。右邊再過去一欄標(biāo)明了測試肽是否會有點突變，而該欄右邊一欄標(biāo)明DP178衍化的氨基酸序列是否加入或去除某些氨基酸殘基。
圖5B測試肽名右邊緊挨著的一欄標(biāo)明該肽是否為DP178的片斷，右邊過去一欄指明該肽是否含有點突變，再往右一欄標(biāo)明該肽是否含有從DP178序列本身加入或去除去的某些氨基酸。
圖5C測試肽名右邊一欄標(biāo)明該肽是否含有點突變。而它右邊一欄則標(biāo)明DP178序列本身是否加入或除去氨基酸殘基。
圖6DP107和DP107gP41區(qū)截斷肽的抗病毒數(shù)據(jù)。如圖5C定義的IC50，采用純化的肽已獲得IC50的值，而標(biāo)有星號(*)者除外，因為在這種情況下，IC50是由原肽制劑獲得的。
圖7猴免疫缺陷病毒(SIV)TM(融合)蛋白DP178-類區(qū)的抗病毒數(shù)據(jù)。“NT”表示未測試。
5.本發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明涉及哺乳動物(包括人)HIV感染的治療方法，該方法包括給予有效量的DP-107，DP-178或它們的一種藥學(xué)上可接受的衍生物和至少一種有效量的其它治療劑。最好這種治療劑是另外一種抗病毒劑。
本方法提供了一種治療病毒性感染，尤其是HIV感染的改良方法。必須特別指出的是，本發(fā)明提供了一種治療HIV感染的協(xié)同組合，它包括有效量的DP-178，DP-107或它們的藥學(xué)上可接受的衍生物和至少一種可用于治療病毒性疾病的抗病毒化合物。DP-178，DP-107或一種藥學(xué)上可接受的衍生物最好與逆轉(zhuǎn)錄病毒抑制劑，病毒蛋白酶抑制劑，細(xì)胞活素或細(xì)胞活素抑制劑，或病毒融合抑制劑聯(lián)合使用。一名患者接受了本發(fā)明的聯(lián)合療法，對其足量給藥以抑制病毒活性，抑制病毒表達(dá)，或抑制病毒傳播。
本發(fā)明的方法包括聯(lián)合療法，即DP-178，DP107和至少一種其它的治療劑或者同時使用(如作為一種混合物，或分開但同時使用)；或者按先后次序(包括周期療法)使用。周期療法涉及在一段時間內(nèi)給予第一種抗病毒化合物，隨后在另一段時間內(nèi)給予第二種抗病毒化合物并重復(fù)這種給藥次序(即周期)，以減輕對所述療法之一產(chǎn)生的耐藥性。本發(fā)明還涉及周期療法，該療法包括給予本發(fā)明的第一種肽后，再給予另一種抗病毒劑，然后給予本發(fā)明的又一種肽等等，即將所述的兩種病毒融合抑制劑DP-107和DP-178或其衍生物與其它抗病毒劑聯(lián)合使用。本發(fā)明還包括所述肽的聯(lián)合使用，如DP-107和DP-107的聯(lián)合使用。
給予DP-178，DP-107或一種藥學(xué)上可接受的衍生物和一種或多種治療劑的“聯(lián)合療法”既包括兩種治療劑可作為一種治療混合物一起使用，也包括兩種治療劑可分開給予但同時使用，如經(jīng)過不同的靜脈途徑進(jìn)入同一個體?！奥?lián)合療法”還包括分開給藥，即先給一種藥物，再給第二種藥物。
本申請人的新療法涉及將抑制病毒融合和病毒在細(xì)胞與細(xì)胞之間的傳播的肽與另一種治療劑聯(lián)合使用。不受理論的限制，本發(fā)明部分是建立在這種信念上，即相信HIV從感染的第一天起，就一天24小時不停地復(fù)制。因此，在病毒感染的不同階段采用抗病毒劑治療是有益的。
本文公開的聯(lián)合療法首次提出了把作用于病毒感染初期階段的病毒融合抑制劑與具有不同作用目標(biāo)的抗病毒劑結(jié)合使用。
DP-178和DP-107作用的部位在病毒表面，它防止來自感染宿主細(xì)胞的游離病毒和細(xì)胞與細(xì)胞之間的病毒傳播。因此，不受理論的限制，申請人相信DP-178或DP-107與一種或多種具有不同作用靶向或不同作用機(jī)理的藥物聯(lián)合使用可提供相加作用或協(xié)同作用。本發(fā)明的聯(lián)合療法具有藥物用量較小，較低毒性的濃度的特點。聯(lián)合療法不僅可減少藥物達(dá)到抗病毒活性所需的有效劑量，從而降低了它的毒性，而且還由于通過多種機(jī)制攻擊病毒而提高了絕對的抗病毒效果。最后，本發(fā)明的聯(lián)合療法也提供了一種防止或減輕產(chǎn)生病毒耐藥性機(jī)會的手段。
與DP-178和/或DP-107聯(lián)合使用的優(yōu)選的治療劑包括(但不限于此)五種不同的攻擊病毒的模式抑制逆轉(zhuǎn)錄酶，抑制病毒mRNA封端，抑制HIV蛋白酶，抑制蛋白糖基化，及抑制病毒融合。采用這些攻擊模式的藥物包括(但不限于此)抗病毒劑如細(xì)胞活素，比如rIFNo，rIFNβ，rIFNγ；逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑如AZT，3TC，D4T，ddI，及雙脫氧氟代核苷；病毒mRNA封端抑制劑如病毒唑；HIV蛋白酶抑制劑如ABT-538和MK-639；兩性霉素B，作為一種脂結(jié)合分子而具有抗HIV活性；及錐栗精胺，作為一種糖蛋白加工的抑制劑。
5.1.用DP-178或DP-107治療HIV5.1.1.DP-178和DP-107肽DP-178或DP-107為通過抑制病毒融合而表現(xiàn)出強(qiáng)有力的抗病毒活性的肽。這些肽包括DP-178(一種gP41衍化的36氨基酸肽)DP-178的片斷和/或類似物，及與DP-178類似的肽。此外，這些肽還包括可表現(xiàn)出抗病毒活性且與DP-107(一種38氨基酸肽)類似的肽，這些肽與HIV-1LAI橫跨膜gP41蛋白的殘基558-595一致，并存在于其它包膜病毒蛋白中。本發(fā)明的肽用作非人和人逆轉(zhuǎn)錄病毒，特別是HIV傳播的抑制劑，其細(xì)節(jié)在本文和美國專利中均有描述(美國專利連續(xù)申請?zhí)枺?8/073028，申請日期為1993年6月7日；美國專利連續(xù)申請?zhí)?8/264531，申請日為1994年6月23日；美國專利連續(xù)申請?zhí)?8/255208，申請日為1994年6月7日；美國專利連續(xù)申請?zhí)?8/360107，申請日為1994年12月20日；美國專利連續(xù)申請?zhí)?8/374666，申請日為1995年1月27日；美國專利連續(xù)申請?zhí)?8/470896，申請日為1995年6月6日；及美國專利連續(xù)申請?zhí)?8/485264，申請日為1995年6月7日)在此，作為一個整體結(jié)合在本發(fā)明中作為參考。
盡管不受任何藥效理論的限制，然而，提出了下列模式用以解釋DP-178的有效力的抗-HIV活性。在病毒蛋白中，gP41，DP-178與位于gP41外區(qū)C-端的公認(rèn)的α-螺旋區(qū)一致，且似乎和gP41上的遠(yuǎn)側(cè)部位有關(guān)，它的相互作用的結(jié)構(gòu)受亮氨酸鏈狀切口(motif)(一種盤管狀螺旋結(jié)構(gòu))的影響，一般稱作DP-107。這兩區(qū)的聯(lián)系反映了分子鍵或“分子扣環(huán)”直接參與了融合過程。亮氨酸鏈狀切口可能參與了膜的融合，而C-端α-螺旋的切口作為一種分子安全裝置在病毒導(dǎo)致的膜融合過程中調(diào)節(jié)亮氨酸鏈的可利用性。
合成的如DP-107和DP-178這樣的肽將成為HIV感染和融合的強(qiáng)有力的抑制劑，這很可能與它們能和病毒的gP41形成復(fù)合物并干擾它的融合過程有關(guān)；例如在病毒蛋白由天然結(jié)構(gòu)向融合狀態(tài)的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換過程中，所述的DP-107和DP-178肽可到達(dá)它們各自在病毒的gP41上的結(jié)合部位，并發(fā)揮一種破壞作用。
與gP41外區(qū)(含DP-107和DP-178區(qū))一致的截斷的重組gP41蛋白(gP41的融合肽，橫跨膜區(qū)和細(xì)胞質(zhì)區(qū)除外)不能抑制HIV-1導(dǎo)致的融合。然而，當(dāng)將單個突變體導(dǎo)入，以破壞DP-107區(qū)的盤管螺旋狀結(jié)構(gòu)—一種引起DP-107肽生物學(xué)活性全部喪失的突變-無活性的重組蛋白則轉(zhuǎn)換成有活性的HIV-1誘發(fā)融合的抑制劑。這種轉(zhuǎn)換是由有效力的DP-178區(qū)從亮氨酸鏈區(qū)(即DP-107區(qū))的分子扣環(huán)上脫出而引起的。
本發(fā)明的DP-178肽與來自HIV-1LAI株的橫跨膜蛋白gP41的氨基酸殘基638-673一致，且有36個氨基酸序列(從氨基端到羧基端讀出如下)NH2-YTSLIHSLIEESQNQQFKNEQELLELDKWASLWNWF-COOH(SEQ ID1)DP-178在本申請人的共同未決的美國專利申請(連續(xù)申請?zhí)枮?8/470896，申請日為1995年6月6日；申請?zhí)?8/374666，申請日1995年1月27日；申請?zhí)?8/264531，申請日1994年6月23日；申請?zhí)?8/255208，申請日1994年6月7日)中已有描述，在此結(jié)合到本發(fā)明中作為參考。
除了全長DP-178(SEQ ID1)36鏈節(jié)，本發(fā)明所述的肽可包括顯示抗病毒活性的DP-178肽(SEQ ID1)的截斷部分。這種截斷的DP-178(SEQ ID1)肽可包括含3-36個氨基酸殘基的肽(即肽的大小范圍在三肽至36鏈節(jié)多肽之間)，而且還包括(但不限于此)下文表I和表II列出的那些肽。這些表中的肽序列按從氨基端(左邊)到羧基端(右邊)排列。“X”代表一個氨基(-NH2)，而“Z”代表一個羧基(-COOH)。另外，如同下面表述的那樣，“X”和/或“Z”可代表一個疏水基團(tuán)，一個乙?；?，一個FMOC基團(tuán)，一個酰氨基，或一個共價鍵連結(jié)的大分子。
DP-107為一種38個氨基酸，與HIV-1LAI橫跨膜(TM)gP41蛋白的殘基558-595一致，能表現(xiàn)出有效力的抗病毒活性。DP-107為一種HIV-1-衍化的抗病毒肽，在其它非-HIV-1包膜病毒中也有發(fā)現(xiàn)。DP-107在本申請人共同未決的美國專利申請(連續(xù)申請?zhí)?8/470896，申請日1995年6月6日；申請?zhí)?8/374656，申請日1995年1月27日；申請?zhí)?8/2645 31，申請日1994年6月23日；申請?zhí)?8/255208，申請日1994年6月7日)中已有較全面的描述，在此結(jié)合到本發(fā)明中作為參考。
DP-107或DP-178截斷物的缺失部分也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。這些缺失部分由從DP107或像DP107的肽序列去除一個或多個氨基酸組成，而生成的肽序列長度的下限為4-6個氨基酸。這些缺失物可能涉及肽序列的一個單一的相鄰部分或多個獨立的部分。一個或多個這樣的缺失物可被導(dǎo)入DP107或DP107的截斷物中，只要這些缺失物產(chǎn)生的肽仍可為本文描述的107X178X4，ALLOMTI5或PLZIP搜索切口所識別，或者要么表現(xiàn)出抗融合或抗病毒活性，要么表現(xiàn)出調(diào)整涉及盤管螺旋狀肽結(jié)構(gòu)的細(xì)胞內(nèi)過程的能力。
DP107和DP107截斷物在本申請人的共同未決的美國專利申請(連續(xù)申請?zhí)枮?8/374666，申請日為1995年1月27日)中已有較全面的描述。在此結(jié)合到本發(fā)明中作為參考。
表IDP-178(SEQ ID1)羧基截斷物X-YTS-ZX-YTSL-ZX-YTSLI-ZX-YTSLIH-ZX-YTSLIHS-ZX-YTSLIHSL-ZX-YTSLIHSLI-ZX-YTSLIHSLIE-ZX-YTSLIHSLIEE-ZX-YTSLIHSLIEES-ZX-YTSLIHSLIEESQ-ZX-YTSLIHSLIEESQN-ZX-YTSLIHSLIEESQNQ-ZX-YTSLIHSLIEESQNQQ-ZX-YTSLIHSLIEESQNQQE-ZX-YTSLIHSLIEESQNQQEK-ZX-YTSLIHSLIEESQNQQEKN-ZX-YTSLIHSLIEESQNQQEKNE-ZX-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQ-ZX-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQE-ZX-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQEL-ZX-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL-ZX-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLE-ZX-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLEL-ZX-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELD-ZX-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDK-ZX-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKW-ZX-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWA-ZX-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWAS-ZX-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASL-ZX-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLW-ZX-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWN-ZX-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNW-ZX-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-Z
使用單字母氨基酸代碼。
附“ X”可代表一個氨基，一個疏水基團(tuán)，包括(但不限于此)芐氧羰基，丹酰，或T-丁氧羰基，一個乙酰基，一個9-芴基甲氧羰基(FMOC)，一個大分子載體基包括(但不限于)脂質(zhì)-脂肪酸軛合物，聚乙二醇，或碳水化物。
“Z”可代表一個羧基；一個氨基；一個T-丁氧羰基；一個大分子載體基包括(但不限于)脂質(zhì)-脂肪酸軛合物，聚乙二醇，或碳水化物。
表IIDP-178(SEQ ID1)氨基截斷物X-NWF-ZX-WNWF-ZX-LWNWF-ZX-SLWNWF-ZX-ASLWNWF-ZX-WASLWNWF-ZX-KWASLWNWF-ZX-DKWASLWNWF-ZX-LDKWASLWNWF-ZX-ELDKWASLWNWF-ZX-LELDKWASLWNWF-ZX-LLELDKWASLWNWF-ZX-ELLELDKWASLWNWF-ZX-QELLELDKWASLWNWF-ZX-EQELLELDKWASLWNWF-ZX-NEQELLELDKWASLWNWF-ZX-KNEQELLELDKWASLWNWF-ZX-EKNEQELLELDKWASLWNWF-ZX-QEKNEQELLELDKWASLWNWF-ZX-QQEKNEQELLELDKWASLWNWF-ZX-NQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-ZX-QNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-ZX-SQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-ZX-ESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-ZX-EESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-ZX-IEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-ZX-LIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-ZX-SLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-ZX-HSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-ZX-IHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-ZX-LIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-ZX-SLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-ZX-TSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-ZX-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-Z
使用單字母氨基酸代碼。
附“X”可代表一個氨基；一個疏水基團(tuán)，包括(但不限于)芐氧羰基，丹酰，或T-丁氧羰基；一個乙?；?；一個9-芴基甲氧羰基；一個大分子載體基包括(但不限于)脂質(zhì)-脂肪酸軛合物，聚乙二醇，或碳水化物。
“Z”可代表一個羧基；一個氨基團(tuán)；一個T-丁氧羰基；一個大分子載體基包括(但不限于脂質(zhì)-脂肪酸軛合物，聚乙二-醇，或碳水化物。
5.1.2 DP-178和DP-107類似物和同系物本發(fā)明的抗病毒肽也包括DP-178類似物和/或DP-178截斷部分，它們包括(但不限于)含有DP-178(SEQ ID1)序列，或DP-178截斷的序列，含有一個或多個氨基酸取代物，插入物和/或缺失物的肽。下文將敘述的DP-178同系物的類似物也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明的DP-178類似物顯示出抗病毒活性，而且還具有另外的優(yōu)點，例如像增加生物利用率，和/或穩(wěn)定性，或降低宿主的免疫識別。
HIV-1和HIV-2包膜蛋白結(jié)構(gòu)不同，但在HIV-1和HIV-2的DP-178對應(yīng)區(qū)內(nèi)存在著一種明顯的氨基酸保護(hù)作用。氨基酸保護(hù)具有周期性特點，提示有一些結(jié)構(gòu)和/或功能的保護(hù)。因此，有一類氨基酸取代物可能包括那些氨基酸的改變，推測那些改變可穩(wěn)定本發(fā)明的DP-178肽的結(jié)構(gòu)。
氨基酸取代物具有保護(hù)或非保護(hù)性質(zhì)。保護(hù)性的氨基酸取代物由具有類似電荷、大小，和/或疏水特性的氨基酸去取代DP-178(SEQID1)肽序列的一個或多個氨基酸所組成，例如，像從谷氨酸(E)到天門冬氨酸(D)的氨基酸取代。當(dāng)只制得保護(hù)性取代物時，生成的肽在功能上與DP-178(SEQ ID1)或由DP-178衍生的DP-178肽等價。非保護(hù)性取代物由具有不同電荷，大小，和/或疏水特點的氨基酸取代DP-178(SEQ ID1)肽序列的一個或多個氨基酸所組成，例如，像從谷氨酸(E)到纈氨酸(V)的取代。
氨基酸插入物可由單個氨基酸殘基或范圍為2-15個氨基酸長度的殘基段組成。一個或多個插入物可以被導(dǎo)入DP-178(SEQID1)，DP-178片斷，類似物和/或DP-178同系物中。
DP-178(SEQ ID1)，DP-178片斷，類似物，和/或DP-178同系物的缺失物也包含在本發(fā)明范圍內(nèi)。這類缺失物由從DP-178或DP-178類肽序列中除去1個或多個氨基酸所組成，而生成的肽序列長度的下限為4-6個氨基酸。這類缺失物可能涉及所述的肽序列的單個相鄰部分或多個獨立的部分。
本發(fā)明的肽還進(jìn)一步包括DP+178(SEQ ID1)的同系物和/或表現(xiàn)出抗病毒活性的DP-178的截斷物。這類DP-178同系物為肽類，其氨基酸序列由其它病毒(即非HIV-1LAI)肽區(qū)的氨基酸序列構(gòu)成，且與衍化出DP-178(SEQ ID1)的gP41肽區(qū)一致。這些病毒可以包括(但不限于)其它的HIV-1株和HIV-2株。由其它HIV-1(即非HIV-1LAI)株的對應(yīng)的gP41肽區(qū)衍化的DP-178同系物可包括如下肽序列NH2-YTNTIYTLLEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-COOH(DP-185；SEQID3)；NH2-YTGIIYNLLEESQNQQEKNEQELLELDKWANLWNWF-COOH(SEQ ID4)；NH2-YTSLIYSLLEKSQIQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-COOH(SEQ ID5)。SEQ ID3(DP-185)，SEQ ID4，及SEQ ID5分別由HIV-1SF2，HIV-1RF，及HIV-1MN株衍化而來。下劃線的氨基酸殘基指與所述的DP-178(SEQ ID1)肽對應(yīng)位置的殘基不同的那些殘基。所述DP-178的一個同系物—DP-185(SEQ ID3)在下文第6節(jié)提到的工作實例中將有描述，并證實DP-185(SEQ ID3)能表現(xiàn)出抗病毒活性。本發(fā)明的DP-178同系物也包括截斷物，氨基酸取代物，插入物，和/或缺失物，如同上文描述的那樣。
此外，如圖1所示，HIV-1和HIV-2株與DP-178系列對應(yīng)的區(qū)之間存在著明顯的相似性。由所述的HIV-2NIHZ株衍化的一種DP-178同系物具有36個氨基酸組成的序列(從氨基端到羧基端讀出)如下NH2-LEANISQSLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWL-COOH(SEQ ID7)表III和表IV列出了HIV-2NHZDP-178同系物的一些可能的截斷物，它們由3-36個氨基酸殘基的肽組成(即肽的大小范圍從一個三肽至36鏈節(jié)的多肽)。這些表中列出了從氨基端(左邊)到羧基端(右邊)的肽序列?！癤”可代表一個氨基(-NH2)，“Z”代表一個羧基(-COOH)。如下文所述，“X”和/或“Z”可替換著代表一個疏水基團(tuán)，一個乙酰基，一個FMOC基，一個氨基，或一個共價結(jié)合的大分子。
表IIIHIV-2NHZDP-178同系物羧基截斷物X-LEA-ZX-LEAN-ZX-LEANI-ZX-LEANIS-ZX-LEANISQ-ZX-LEANISQS-ZX-LEANISQSL-ZX-LEANISQSLE-ZX-LEANISQSLEQ-ZX-LEANISQSLEQA-ZX-LEANISQSLEQAQ-ZX-LEANISQSLEQAQI-ZX-LEANISQSLEQAQIQ-ZX-LEANISQSLEQAQIQQ-ZX-LEANISQSLEQAQIQQE-ZX-LEANISQSLEQAQIQQEK-ZX-LEANISQSLEQAQIQQEKN-ZX-LEANISQSLEQAQIQQEKNM-ZX-LEANISQSLEQAQIQQEKNMY-ZX-LEANISQSLEQAQIQQEKNMYE-ZX-LEANISQSLEQAQIQQEKNMYEL-ZX-LEANISQSLEQAQIQQEKNMYELQ-ZX-LEANISQSLEQAQIQQEKNMYELQK-ZX-LEANISQSLEQAQIQQEKNMYELQKL-ZX-LEANISQSLEQAQIQQEKNMYELQKLN-ZX-LEANISQSLEQAQIQQEKNMYELQKLNS-ZX-LEANISQSLEQAQIQQEKNMYELQKLNSW-ZX-LEANISQSLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWD-ZX-LEANISQSLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDV-ZX-LEANISQSLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDVF-ZX-LEANISQSLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFT-ZX-LEANISQSLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTN-ZX-LEANISQSLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNW-ZX-LEANISQSLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWL-Z采用單字母氨基酸代碼。
此外，“X”可代表一個氨基，一個疏水基團(tuán)，包括(但不限于)芐氧羰基，丹酰，或T-丁氧羰基；一個乙?；灰粋€9-芴基甲氧羰基(FMOC)；一個大分子載體基包括(但不限于)脂質(zhì)-脂肪酸軛合物，聚乙二醇，或碳水化物。
“Z”可代表一個羧基，一個氨基；一個T-丁氧羰基；一個大分子載體基包括(但不限于)脂質(zhì)-脂肪酸軛合物，聚乙二醇，或碳水化物。
表IVHIV-2NHZDP-178同系物氨基截斷物X-NWL-ZX-TNWL-ZX-FINWL-ZX-VFTNWL-ZX-DVFTNWL-ZX-WDVFTNWL-ZX-SWDVFTNWL-ZX-NSWDVFTNWL-ZX-LNSWDVFTNWL-ZX-KLNSWDVFTNWL-ZX-QKLNSWDVFTNWL-ZX-LQKLNSWDVFTNWL-ZX-ELQKLNSWDVFTNWL-ZX-YELQKLNSWDVFTNWL-ZX-MYELQKLNSWDVFTNWL-ZX-NMYELQKLNSWDVFTNWL-ZX-KNMYELQKLNSWDVFTNWL-ZX-EKNMYELQKLNSWDVFTNWL-ZX-QEKNMYELQKLNSWDVFTNWL-ZX-QQEKNMYELQKLNSWDVFTNWL-ZX-IQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWL-ZX-QIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWL-ZX-AQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWL-ZX-QAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWL-ZX-EQAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWL-ZX-LEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWL-ZX-SLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWL-ZX-QSLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWL-ZX-SQSLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWL-ZX-ISQSLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWL-ZX-NISQSLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWL-ZX-ANISQSLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWL-ZX-EANISQSLEQAQIQQEKNMYELQKINSWDVFTNWL-ZX-LEANISQSLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWL-Z采用單字母氨基酸代碼。
此外，“ X”可代表一個氨基，一個疏水基團(tuán)，包括(但不限于)芐氧羰基，丹酰，或T-丁氧羰基；一個乙酰基；一個9-芴基甲氧羰基(FMOC)；一個大分子載體基包括(但不限于)脂質(zhì)-脂肪酸軛合物，聚乙二醇，或碳水化物。
“Z”可代表一個羧基；一個氨基；一個T-丁氧羰基；一個大分子載體基包括(但不限于)脂質(zhì)-脂肪酸軛合物，聚乙二醇，或碳水化物。
5.1.3.DP-178和DP-107的制備本發(fā)明的肽可用該領(lǐng)域熟知的技術(shù)合成或制備。如參看(reighton，1983，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和分子原理，W.H.Freeman and Co.，NY，在此結(jié)合到本發(fā)明中作為參考。例如，短肽能在一種固體載體上或在溶液中合成。較長的肽能用重組DNA技術(shù)制得。編碼本發(fā)明的肽的核苷系列可用該領(lǐng)域內(nèi)普通技術(shù)人員熟知的技術(shù)合成和/或克隆，及表達(dá)。如參看Sambrook等人分子克隆，A Laboratory Manual Vols.1-3，ColdSpring Harbor Press，NY.(1989)。
本發(fā)明的肽可以以一個或者多個聯(lián)接肽的氨基酸殘基的鍵為非肽鍵替換合成。這些替換的非肽鍵可利用為該領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的反應(yīng)形成，且可以包括(但不限于)亞氨基，酯，酰肼，氨基脲，及偶氮鍵等。在本發(fā)明的另一實施例中，含以上描述的序列的肽可利用存在于其氨基和/或羧基端的其它化學(xué)基團(tuán)來合成，這樣可增加這些肽的穩(wěn)定性，生物利用率，和/或抑制活性等。例如，疏水基團(tuán)像芐氧羰基，丹酰，或T-丁氧羰基可以加到肽的氨基端上。同樣地，一個乙?；?-芴基甲氧羰基也可被置于肽的氨基端上。(參看上文表I至表IV的“X”)另外，所述疏水基團(tuán)。t-丁氧羰基，或一個氨基也可加到肽的羧基端。(參看文表I至表IV中的“Z”)。而且，本發(fā)明的肽也可通過改變它們的空間構(gòu)型而合成。例如，可使用肽的一個或多個氨基酸殘基的D-異構(gòu)體，而非通常的L-異構(gòu)體。而且還進(jìn)一步，本發(fā)明的肽的至少一個氨基酸殘基可用一個公知的非自然存在的氨基酸殘基取代。這些改變有助于增加本發(fā)明所述肽的穩(wěn)定性，生物利用率和/或抑制活性。
此外，上文描述的任何肽可以有一個共價地連接在它們的氨基和/或羧基端上的非肽大分子載體基。例如，這些大分子載體基可包括脂質(zhì)-脂肪酸軛合物，聚乙二醇，或碳水化物。DP-178和DP-107的截斷物，類似物和同系物在本申請人的共同未決的申請中已有全面描述(申請?zhí)?8/073028，申請日1993年6月7日；申請?zhí)?8/264531，申請日1994年6月23日；申請?zhí)?8/255208，申請日1994年6月7日；和申請?zhí)?8/360107，申請日1994年12月20日)，在此結(jié)合在本發(fā)明中作為參考。
5.1.4.本發(fā)明肽的治療用途本發(fā)明所述的DP-178(SEQ ID1)肽，及DP-178片斷，類似物，和同系物表現(xiàn)出有效力的抗病毒活性。本發(fā)明的DP-107類和DP-178類的肽優(yōu)選表現(xiàn)出抗病毒活性。因此，所述的肽可以用作人和非人病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒，特別是HIV對未感染細(xì)胞傳播的抑制劑。
用本發(fā)明的肽可抑制人逆轉(zhuǎn)錄病毒的傳播，這些逆轉(zhuǎn)錄病毒包括(但不限于)HIV-1和HIV-2的所有病毒株以及人T-淋巴細(xì)胞病毒(HTLV-I和II)。本發(fā)明的肽可抑制非人逆轉(zhuǎn)錄病毒的傳播，這些非人逆轉(zhuǎn)錄病毒包括(但不限于)牛造白細(xì)胞組織增生病毒，貓肉瘤和白血病病毒，猴免疫缺陷癥、肉瘤和白血病病毒及羊進(jìn)行性肺炎病毒。
本發(fā)明的肽可抑制非逆轉(zhuǎn)錄病毒的傳播，這些非逆轉(zhuǎn)錄病毒包括(但不限于)人呼吸道合胞病毒，犬瘟熱病毒，新城病病毒，人副流感病毒，及流感病毒。
本發(fā)明還進(jìn)一步包括在聯(lián)合療法中使用所述的肽治療上述的逆轉(zhuǎn)錄病毒和非逆轉(zhuǎn)錄病毒。
5.2用在DP-178或DP-107的聯(lián)合使用中的抗病毒劑根據(jù)本發(fā)明所述，DP-178或DP-107(一種病毒融合抑制劑)可與其它治療劑聯(lián)合使用以增強(qiáng)其可達(dá)到的抗病毒效果。優(yōu)選將DP-178或DP-107與其它抗病毒劑結(jié)合使用。這類可與DP-178或DP-107一起使用的其它抗病毒劑包括(但不限于)作用于與病毒復(fù)制有關(guān)的不同靶分子的藥物，如逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，病毒蛋白酶抑制劑，糖基化抑制劑；作用于與病毒傳播有關(guān)的不同靶分子的抗病毒劑；作用于同一分子的不同位點的抗病毒劑；以及預(yù)防或降低病毒耐藥性發(fā)生的抗病毒劑。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將了解能表現(xiàn)上述活性模式的各種抗病毒治療劑。
所述的DP-178或DP-107或其藥學(xué)上可接受的衍生物也可以與逆轉(zhuǎn)錄病毒抑制劑如核苷衍生物聯(lián)合使用。核苷衍生物為嘌呤和嘧啶核苷的改良型，它們?yōu)镽NA和DNA的構(gòu)成阻斷劑。正在研究中的許多核苷衍生物作為潛在的抗-HIV治療劑可在整個基因組轉(zhuǎn)錄之前即提前終止病毒DNA復(fù)制。這些衍生物缺乏能結(jié)合到后成的核苷上的3’取代基，從而造成鏈的終止。核苷衍生物如3’疊氮基-3’-胸苷(AZT)和雙脫氧肌苷(ddI)在體外和體內(nèi)均用作HIV-1復(fù)制的抑制劑。核苷類似物是目前唯一批準(zhǔn)的治療HIV感染和AIDS的藥物(Fischl et al，1987 N.Engl.J.Med.317，185-191；Mitsuya and Broder，1987，Nature，325，773-778)。這類化合物通過抑制逆轉(zhuǎn)錄酶引起cDNA合成的阻斷而發(fā)生作用(Mitsuya and Broder，1987)；這些抑制劑在HIV-1的感染周期的初期起作用并抑制其被結(jié)合進(jìn)T-細(xì)胞基因組。然而，疊氮胸苷治療導(dǎo)致耐藥HIV株的產(chǎn)生(Larder 1989，1991，Ibid.)并使長期治療的AIDS病人出現(xiàn)毒性作用(Fischl et al.1987，N.Engl.J.Med.317185-191；Creagh-Kirk，et al.，1988，J.A，M.A.2603045-3048)。
而且，所述的DP-178或DP-107或其藥學(xué)上可接受的衍生物可與核苷衍生物聯(lián)合使用，這些核苷衍生物包括(但不限于)2’，3’-二脫氧腺苷(ddA)；2’，3’-二脫氧鳥苷(ddG)；2’，3’-二脫氧肌苷(ddI)；2’，3’-二脫氧胞苷(ddC)；2’，3’-二脫氧胸苷(ddT)；2’，3’-二脫氧-二脫氧胸苷(d4T)和3’-疊氮基-2’，3’-二脫氧胞苷(AZT)。另外也可選擇使用鹵代核苷衍生物，優(yōu)選2’，3’-二脫氧-2’-氟代核苷類包括(但不限于)2’，3’-二脫氧-2’-氟代腺苷；2’，3’-二脫氧-2’-氟代肌苷；2’，3’-二脫氧-2’-氟代胸苷；2’，3’-二脫氧-2’-氟代胞苷；和2’，3’-二脫氧-2’，3’-二脫氫-2’-氟代核苷類包括(但不限于)2’，3’-二脫氧-2’，3’-脫氫-2’-氟代胸苷(Fd4T)。優(yōu)選本發(fā)明的2’，3’-二脫氧-2’-氟代核苷類為氟鍵在β構(gòu)型上的核苷類，包括(但不限于)2’，3’-二脫氧-2’-β-氟代腺苷(F-ddA)，2’，3’-二脫氧-2’-β-氟代肌苷(F-ddI)，及2’，3’-二脫氧-2’-β-氟代胞苷(F-ddC)。這類組合允許使用較低劑量的核苷衍生物，因而降低了其毒性，且不失去因使用抗病毒肽產(chǎn)生的抗病毒活性。此外，該組合降低或避免了病毒耐藥性。
本發(fā)明范圍內(nèi)的抗病毒肽和核苷衍生物的優(yōu)選的組合包括有效量的DP-107，DP-178或其藥學(xué)上可接受的衍生物和有效量的AZT，用以治療HIV感染；也包括有效量的DP-107，DP-178或藥學(xué)上可接受的衍生物和有效量的ddI。
根據(jù)本發(fā)明所述，DP-178或DP-107或其藥學(xué)上可接受的衍生物也可與尿苷磷酸化酶抑制劑聯(lián)合使用，這類抑制劑包括(但不限于)無環(huán)尿苷化合物，包括芐基無環(huán)尿苷(BAU)；芐氧基芐基無環(huán)尿苷(BBAU)；氨甲基芐基無環(huán)尿苷(AMBAU)；氨甲基芐氧基芐基無環(huán)尿苷(AMB-BAU)；羥甲基芐基無環(huán)尿苷(HMBAU)；及羥甲基芐氧基芐基無環(huán)尿苷(HMBBAU)。
根據(jù)本發(fā)明所述，DP-178或DP-107或其藥學(xué)上可接受的衍生物也能和細(xì)胞活素或細(xì)胞活素抑制劑聯(lián)合使用，包括(但不限于)rIFNα，rIFNβ，rIFNγ，TNFα抑制劑，及MNX-160。人r干擾素-αA(＞108 IU/mg)和r干擾素γ(1.4×108 IU/mg)可從HoffmanLaRoche處獲得。人rIFNβ Ser 17(1.0×108 IU/mg)可從TritonBiosciences處獲得。參考標(biāo)準(zhǔn)物可從以下單位獲得世界衛(wèi)生組織(人IFNα WHO標(biāo)準(zhǔn)B，69，19和人IFNβ，WHO號G-023-902-527)或國家過敏性和感染性疾病研究所(人r-干擾素，國家衛(wèi)生所號G-023-901-530)。
根據(jù)本發(fā)明所述，DP-178或DP-107或其藥學(xué)上可接受的衍生物可與病毒蛋白酶抑制劑包括(但不限于)Mk-639(Merck)，Invirase(Saquinavir，Roche)，ABT-538(Abbott，CAS Reg.No.155213-67-5)，AG1343，VX0478(Burroughs Wellcome/Glaxo，CAS Reg.No.16184-49-9)，DMP450，SC-52151(Telinavir)聯(lián)合使用。一般認(rèn)為蛋白酶抑制劑主要是在病毒裝配期間或之后(即病毒芽生)起作用，以抑制病毒體發(fā)育到成熟的感染狀態(tài)。例如，ABT-538在體外已顯示出有效力的抗病毒活性，在體內(nèi)顯示出滿意的藥代動力學(xué)和安全性特征(Ho，et al.，1995，Nature 373123-126)。對AIDS患者給ABT-538可引起血漿HIV-1水平呈指數(shù)下降和CD4淋巴細(xì)胞計數(shù)大大升高。病毒血癥(plasma viraemia)隨著ABT-538的治療呈指數(shù)下降反映了游離病毒體的清除和因藥物基本上阻斷感染的新范圍而引起的HIV-1感染細(xì)胞的喪失。ABT-538治療減輕了病毒介導(dǎo)的CD4淋巴細(xì)胞的破壞。當(dāng)把這種治療與抑制HIV感染早期階段和病毒融合的DP-178和/或DP-107聯(lián)合使用時將可能產(chǎn)生協(xié)同作用并取得顯著的臨床效果。
DP-178或DP-107或其藥學(xué)上可接受的衍生物也能與干擾5’-mRNA過程的抗HIV藥物如病毒唑(病毒唑(Virazole)來自ViratelInc)聯(lián)合使用。雖然病毒唑的作用機(jī)理尚不清楚，但據(jù)認(rèn)為該藥在mRNA封端結(jié)構(gòu)的形成上與鳥嘌呤競爭和/或干擾這些分子的功能性甲基化作用。這些病毒雖可逃脫DP-178和/或DP-107對病毒融合的抑制作用，但卻被病毒唑阻斷，因而顯示出DP-178和/或DP-107和病毒唑抗HIV機(jī)制的協(xié)同作用。
此外，DP-178，DP-107或其藥學(xué)上可接受的衍生物可與治療劑如兩性霉素B(Fungizone，由Gibro獲得)聯(lián)合使用，它為一種多烯microlide抗真菌抗生素，它與甾醇相互作用并與其發(fā)生不可逆性結(jié)合。兩性霉素B代表獨特的一類治療劑，它能與多種脂包膜病毒，包括HIV發(fā)生抑制作用。盡管兩性霉素在體內(nèi)顯示出嚴(yán)重毒性，但這種藥物的甲酯形式卻表現(xiàn)出抗HIV活性和在體外的低細(xì)胞毒性。因此，兩性霉素B或它的甲酯可與DP-178，DP-107或其藥學(xué)上可接受的衍生物聯(lián)合使用。這種聯(lián)合療法允許臨床醫(yī)師使用一種較低(即較少毒性劑量的兩性霉素B或它的甲酯，而不考慮其抗病毒活性的喪失，因為它是和抗病毒肽DP-178或DP-107聯(lián)合使用的。
根據(jù)本發(fā)明所述，DP-178或DP-107或其藥學(xué)上可接受的衍生物也可與糖蛋白加工的抑制劑如錐栗精胺(Boehringer Mannheim)聯(lián)合使用。錐栗精胺為一種抑制糖蛋白加工的植物生物堿，而顯示出抗-HIV作用，因為HIV含有兩個大的糖基化蛋白gP120和gP41。蛋白糖基化在gP120與CD4的相互作用上起重要作用。在錐粟精胺存在下合成的子代病毒體感染的條件下，其HIV的感染性減弱。因此DP-178，DP-107或其藥學(xué)上可接受的衍生物與錐粟精胺聯(lián)合使用可產(chǎn)生協(xié)同作用以抑制病毒的侵入，因而減弱感染。
治療HIV的方法中，優(yōu)選的組合療法包括使用有效量的DP-107，DP-178或其藥學(xué)上可接受的衍生物和有效量的ddI；使用一種有效量的DP-107，DP-178或其藥學(xué)上可接受的衍生物和有效量的3TC；以及使用有效量的DP-107，DP-178或其藥學(xué)上可接受的衍生物和有效量的病毒唑。
治療HIV的方法中，更優(yōu)選的聯(lián)合療法包括使用有效量的DP-107，DP-178或其藥學(xué)上可接受的衍生物和有效量的β-干擾素。
用于治療HIV的方法中，另外的一種聯(lián)合療法包括使用有效量的DP-107，DP-178或其藥學(xué)上可接受的衍生物和一種有效量的蛋白酶抑制劑。
為了評價DP-178，DP-107或其藥學(xué)上可接受的衍生物與上文描述的抗病毒治療劑聯(lián)合使用的潛在的治療效果，可用這一領(lǐng)域內(nèi)周知的方法對這些組合療法進(jìn)行測試。例如，一種DP-178和AZT聯(lián)合使用抑制HIV細(xì)胞毒性，合胞體形成，逆轉(zhuǎn)錄酶活性，或病毒RNA或蛋白生成的能力可在體外測試，如實施例6所述。
5.2.1抑制HIV的聯(lián)合療法的治療用途如上文描述的改進(jìn)的或協(xié)同的DP-178或DP-107聯(lián)合治療可根據(jù)本發(fā)明在體內(nèi)使用，以防止合胞體的形成和HIV病毒體的產(chǎn)生，從而抑制受試患者體內(nèi)HIV的發(fā)展。本發(fā)明的聯(lián)合療法對緩解或治療與HIV-感染的免疫抑制病人相關(guān)的疾病也是有用的。例如，抗病毒肽DP-178，DP-107或其藥學(xué)上可接受的衍生物與抗真菌劑，抗病毒劑可合并用于抑制HBV，EBV，CMV，及其它的機(jī)遇性感染(包括TB)。
本發(fā)明的抗病毒肽DP-178，DP-107或其藥學(xué)上可接受的衍生物最好用于抑制HIV感染。聯(lián)合療法的有效劑量可如下文所述在適宜的藥物載體中進(jìn)行配制并按任何適宜的途徑給藥，包括(但不限于)注射(如靜脈注射、腹膜注射、肌肉注射、皮下注射等)；上皮或粘膜內(nèi)吸收(如口腔粘膜，直腸和陰道上皮，鼻咽部粘膜，腸道粘膜等)；口服，透皮或任何其它的藥學(xué)領(lǐng)域可使用的途徑。
5.3.藥物制劑，劑量和給藥形式5.3.1藥用組合物本發(fā)明用于治療或預(yù)防人病毒性感染的藥用組合物含有作為活性劑的DP-178，DP-107或其藥學(xué)上可接受的衍生物和至少一種其它的治療劑如另一種抗病毒劑。本發(fā)明的藥用組合物提供了可產(chǎn)生加合和/或協(xié)同效果的聯(lián)合療法。
優(yōu)選所述藥用組合物含有DP-178或DP-107或其藥學(xué)上可接受的衍生物，還含有至少一種其它的抗病毒劑如逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，蛋白酶抑制劑，mRNA加工的抑制劑，蛋白糖基化作用的抑制劑和病毒融合的抑制劑。這類治療劑包括(但不限于)核苷類似物或鏈終止劑(如二脫氧核苷)。
在本發(fā)明范圍內(nèi)的可與DP-178或DP-107或其藥學(xué)上可接受的衍生物聯(lián)合使用的其它適宜的治療劑包括(但不限于)2-脫氧-D-葡萄糖(2-dGlc)、脫氧野尻霉素，無環(huán)鳥苷，病毒唑(virazole)利福平(rifadin)，金剛烷胺、rifabutine，更昔洛韋(ganciclover)、(DHPG)、氟化碘化阿糖胞嘧啶(fluoroiodoaracytosine)、碘苷、三氟胸腺嘧啶核苷、阿糖腺苷(ara-A)、ara-AMP、溴乙烯基去氧尿苷、溴乙烯阿糖尿嘧啶(BV-aral)，由Bristol-Meyers Squibb生產(chǎn)(1-β-D-阿糖呋喃糖苷-E-5-[2-溴乙烯基〕尿嘧啶))，金剛乙胺，苯己庚二酮、二芳基脒，(s)-(對硝基芐基)-6-硫代肌苷和膦?；姿猁}。
本發(fā)明所包括的新的藥用組合物包括(但不限于)DP-178，DP-107或一種藥學(xué)上可接受的衍生物和利福平(rifadin)；DP-178或DP-107和AZT；DP-178或DP-107和ddI；DP-178或DP-107和ddC；DP-178或DP-107和金剛烷胺；DP-178或DP-107和無環(huán)鳥苷；DP-178或DP-107和Z-脫氧-D-葡萄糖；DP-178或DP-107和脫氧野尻霉素；DP-178或DP-107和α-干擾素及DP-178或DP-107和更昔洛韋。本發(fā)明包括含有DP-178或DP-107，或一種藥學(xué)上可接受的衍生物，和隨意選擇一種以上的其它治療性化合物的藥用組合物。
本發(fā)明的肽也可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)給藥。這些藥物最好系統(tǒng)配制及給藥。配制和給藥方法的技術(shù)在“Remington’sPharmaceutical Science”一書中可以發(fā)現(xiàn)(18版，1990，Mack PublishingCo.，Easton，PA)。適宜的途徑可包括口腔，直腸，透膜，或腸道給藥；胃腸外給藥，包括粘膜內(nèi)，皮下，髓內(nèi)注射，以及鞘內(nèi)，直接心室內(nèi)，靜脈內(nèi)，腹膜內(nèi)，鼻內(nèi)，或眼內(nèi)注射，僅僅列舉這些。最好的給藥方式為靜脈。為適于注射，本發(fā)明的藥物可以配成水溶液，最好為生理相容的緩沖液，如Hanks’溶液，Ringer’s溶液，或生理鹽水緩沖液。對于透膜給藥，制劑中應(yīng)使用適于穿透屏障的滲透劑。這些滲透劑是該領(lǐng)域內(nèi)普遍知道的。
此外，所述的肽也可用于先前未曾感染而急性暴露于一種HIV病毒的個體作為一種預(yù)防性措施。所述肽的這種預(yù)防性使用的實例包括(但不限于)病毒母嬰傳播的預(yù)防和其它一些存在HIV傳播可能性的固定場所，如衛(wèi)生保健部門的事故；像衛(wèi)生工作者暴露于HIV污染的血制品下。在這樣的情況下，本發(fā)明的肽可以起到預(yù)防性疫苗的作用，其中宿主將產(chǎn)生針對本發(fā)明的肽的抗體，通過如抑制HIV的進(jìn)一步感染以中和HIV病毒。因此，本發(fā)明的肽用作預(yù)防性疫苗的實施方案包括給予宿主一定濃度的有效肽以產(chǎn)生足夠中和HIV的免疫應(yīng)答，如抑制HIV感染細(xì)胞的能力。精確的濃度取決于所給予的特異性肽，但也可使用這一領(lǐng)域內(nèi)普通技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來測定免疫應(yīng)答的產(chǎn)生。用作疫苗的肽通常肌注給藥。
所述的肽可和適宜的添加劑配在一起以增強(qiáng)免疫學(xué)應(yīng)答。這類添加劑包括(但不限于)礦物質(zhì)凝膠如氫氧化鋁；表面活性物質(zhì)如溶血卵磷脂，普盧龍尼克(pluronic)多元醇，聚陰離子；其它肽類；油乳劑；以及其它潛在的人用添加劑如卡介苗(BCG)和小棒狀桿菌(Corynebacterium parvum)。許多方法可用來引入本文描述的疫苗制劑中。這些方法包括(但不限于)口服，皮內(nèi)，肌內(nèi)，腹膜內(nèi)，靜脈，皮下和鼻內(nèi)途徑。
本發(fā)明給予肽的有效劑量可用該領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員所周知的方法，如設(shè)置一些參數(shù)像生物半衰期，生物利用率，及毒性來確定。下文第6節(jié)給出了一些數(shù)據(jù)，如已證實DP-178在體內(nèi)達(dá)到有效劑量所需的循環(huán)血液水平為10ng/ml的肽。
5.3.2劑量在治療患有病毒感染的哺乳動物(包括人)時，必須給予病人有效治療量的DP-178，DP-107或一種藥學(xué)上可接受的衍生物，即給予足以抑制病毒復(fù)制的量。例如，將DP-178或DP-107按大約每天0.1-1.0mg/kg的劑量輸注，持續(xù)12周。優(yōu)選的劑量為20-35mg；根據(jù)體表面積得出的DP-178或DP-107或其一種藥學(xué)上可接受的衍生物的等效日劑量約為7-70mg。最優(yōu)選的劑量大約為20mg-35mg，大約持續(xù)12周。DP-178，DP-107或一種藥學(xué)上可接受的衍生物給藥劑量的間隔約為每天一次到四次，最好是每兩天一次到每天一次。給藥的最佳劑量是使DP-178，DP107或其一種藥學(xué)上可接受的衍生物的血漿峰濃度達(dá)到1mg/ml-10mg/ml。這點可通過將緩沖鹽水中成分配制成2.0％的無菌注射液(為化學(xué)領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員熟知的任何適宜的鹽溶液均可使用)而做到。通過連續(xù)輸注通過HPLC測定血濃度確定量的DP-178或DP-107，可以維持所需的血濃度。
與DP-178，DP-107或其一種藥學(xué)上可接受的衍生物聯(lián)合使用的治療劑如抗病毒劑的有效劑量是以該領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的各種抗病毒劑的推薦劑量為基礎(chǔ)的。例如，疊氮胸苷(AZT)，2’，3’-二脫氧肌苷(ddI)和β干擾素的劑量可在標(biāo)準(zhǔn)臨床醫(yī)師參考書中找到。此外，其它治療劑包括抗病毒劑的劑量在文獻(xiàn)中已有報道，例如，ABT-538為口服給藥，第一天為600-1200mg/天，以后每天一次(Ho，etal.，1995，Nature 373123-126)。在測試了這些劑量與DP-178，DP-107或一種藥學(xué)上可接受的衍生物聯(lián)合使用的有效性后，這些推薦的或公知的劑量優(yōu)選比使用下面第5.4節(jié)描述測定方法，檢驗組合物形成的DP-178，DP-107或藥學(xué)上可接受的衍生物的劑量的有效性，所確定的劑量低10％-50％。必須注意到，當(dāng)出現(xiàn)毒性反應(yīng)，骨髓，肝或腎功能不全或嚴(yán)重的藥物與藥物間的相互作用時，臨床醫(yī)生應(yīng)知道如何和何時終止，中斷或調(diào)整藥物至較低劑量。相反，如果臨床反應(yīng)不夠充分(出現(xiàn)毒性除外)，臨床醫(yī)生也應(yīng)知道如何調(diào)整治療至較高的水平。
一個有效的治療劑量是指該經(jīng)合物的足以引起病人癥狀改善或存活期延長的用量。這類化合物的毒性和治療效果可按標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)程序經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)或?qū)嶒瀯游飦泶_定，如確定半數(shù)致死量LD50(實驗群體中有50％致死的劑量)和半數(shù)有效量ED50(實驗群體中50％達(dá)到治療有效果的劑量)。毒性和治療有效果的劑量比率叫做治療指數(shù)，它可用比率LD50/ED50表示。治療指數(shù)大的化合物最好。從這些細(xì)胞培養(yǎng)測定和動物研究獲得的數(shù)據(jù)可用來確定人的劑量使用范圍。這類化合物的劑量最好位于這樣一個循環(huán)血液的濃度范圍內(nèi)，即包括ED50且無毒性或毒性很低。根據(jù)使用的劑型和采用的給藥途徑，劑量可在此范圍內(nèi)變化。對于本發(fā)明方法使用的任何化合物而言，其治療有效果劑量可從細(xì)胞培養(yǎng)測定中初步推出。劑量可從動物模型達(dá)到包含IC50(即與細(xì)胞培養(yǎng)確定的未治療對照者比較，受試化合物達(dá)到感染細(xì)胞RT繁殖最大抑制量一半時的濃度)在內(nèi)的循環(huán)血漿濃度范圍推出。這些資料可用于較精確地確定人的使用劑量。例如，血漿中的濃度可用高效液相色譜(HPLC)測定。
5.4藥物制劑和給藥途徑含有DP-178，DP-107或一種藥學(xué)上可接受的衍生物的藥用組合物可直接給予病人，或在藥用組合物中與適宜的載體或賦形劑混合使達(dá)到治療病毒感染，特別是HIV感染的劑量。本申請的化合物制劑和給藥技術(shù)可在“Remington’s Pharmaceutical Sciences”(MackPublishing Co.，Easton，PA)的最新版本上發(fā)現(xiàn)。
如下文第6節(jié)舉出的實例所示，本發(fā)明的肽的抗病毒活性可表現(xiàn)出一種顯性(Pronounced type)和亞性(subtype)特異性，即特異的肽僅對抑制特異性的病毒活性有效。本發(fā)明的這種特征有許多優(yōu)點。例如，有一個優(yōu)點體現(xiàn)在診斷試劑領(lǐng)域，其中一項是可利用本發(fā)明的肽的抗病毒特異性來鑒別某一病毒分離株的類型。至于對HIV而言，一個優(yōu)點就是可以很容易確定一個病毒分離株是否含有HIV-1或HIV-2株。例如，未感染的CD-4+細(xì)胞可以被一株鑒定為含HIV DP-178(SEQ ID1)肽的分離株同時感染，此后可用上文5.2節(jié)中描述的技術(shù)對細(xì)胞上清液的逆轉(zhuǎn)錄病毒活性進(jìn)行測定。那些逆轉(zhuǎn)錄病毒活性完全或幾乎完全受到抑制的病毒分離株含HIV-1。而那些病毒活性未被改變或僅有少量減輕的病毒分離株可認(rèn)為不含HIV-1。這類病毒分離株則可用本發(fā)明的一種或多種其它的DP-178肽進(jìn)行處理，然后再測定其病毒活性，以鑒定該病毒分離株的類型。
使用藥學(xué)上可接受的載體按本發(fā)明的方法將本文公開的混合物配制成適宜的劑型，以用于全身給藥將包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。正確選用載體和適當(dāng)?shù)纳a(chǎn)工藝，可使本發(fā)明的組合物，特別是配成溶液的組合物，能通過胃腸外途徑給藥，如靜脈注射。所述的化合物可采用該領(lǐng)域熟知的并且藥學(xué)上可接受的載體配成適宜于口服給藥的劑型。這類載體能使本發(fā)明的化合物配制成片劑，丸劑，膠囊，液體劑，凝膠，糖漿，淤漿劑和混懸劑等等，以方便接受治療的病人口服攝入。
給藥的適當(dāng)途徑可包括口腔，直腸，透膜，或腸道給藥；胃腸外給藥包括肌內(nèi)，皮下，髓內(nèi)注射，以及鞘內(nèi)，直接心室內(nèi)，靜脈內(nèi)，腹膜內(nèi)，鼻內(nèi)或眼內(nèi)注射；透皮，局部用藥，陰道等等。劑型包括(但不限于)片劑，錠劑；散劑，懸浮劑，栓劑，溶液，膠囊，霜劑，貼劑，微泵劑等等。
為方便起見，本發(fā)明使用的藥用組合物可使用一種或多種含賦形劑和輔助劑(便利加工活性化合物)的生理學(xué)可接受的載體以常規(guī)方式配制成藥學(xué)上可使用的制劑。合適的制劑取決于所選的給藥途徑。
為方便注射，本發(fā)明的治療劑可配成水溶液，最好是生理上相容的緩沖液如Hanks’s溶液，Ringer’s溶液，或生理鹽水緩沖液。對于透膜給藥，制劑中應(yīng)使用適于透過屏障的滲透劑，這些滲透劑是該領(lǐng)域內(nèi)普遍熟知的。
口服給藥的化合物可通過將活性化合物與該領(lǐng)域熟知的藥學(xué)上可接受的載體結(jié)合而較方便地配制成。這類載體能將本發(fā)明的化合物配制成片劑，丸劑，糖衣丸，膠囊，液體劑，凝膠，糖漿，淤漿劑，懸浮劑等等。以方便接受治療的病人口服攝入。藥物的口服制劑可用固體賦形劑磨碎成均勻的混合物，再加工成顆粒，必要時加入適宜的輔助劑，制成片劑或糖衣片的片芯。適宜的賦形劑主要是填料如糖，包括乳糖，蔗糖，甘露醇，或山梨糖醇；纖維素制品劑如玉米淀粉，小麥淀粉，米淀粉，馬鈴薯淀粉，明膠，西黃蓍膠，甲基纖維素，羥丙基甲基纖維素，羧甲基纖維素鈉和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果必要，可以加入崩解劑，如交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮，瓊脂，或藻酸或其鹽類如藻酸鈉。
糖衣片芯應(yīng)提供適當(dāng)?shù)陌隆榇四康?，可采用濃縮糖溶液，溶液中可任意含有阿拉伯樹膠，滑石，聚乙烯吡咯烷酮，carbopol凝膠，聚乙二醇和/或二氧化鈦，硝基纖維素溶液，以及適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑或溶劑混合物。染料或顏料可加入到片劑或糖衣片的包衣中用以區(qū)別或標(biāo)示活性化合物各劑量的不同的組合。
用于口服的藥用組合物包括由明膠制成的裝填式膠囊，以及由明膠和一種增塑劑如甘油或山梨醇制成的密封軟膠囊。裝填式膠囊含有與填充劑如乳糖，粘合劑如淀粉和/或潤滑劑如滑石或硬脂酸鹽和可選穩(wěn)定劑混合形式的活性成分。在軟膠囊中，活性化合物可溶解或懸浮于適當(dāng)?shù)囊后w中，如脂肪油，液體石蠟，或液狀聚乙二醇。此外，還可加入穩(wěn)定劑?？诜乃兄苿┒紤?yīng)是方便這種給藥的合適的劑型。
對于口腔給藥而言，所述組合物可采用片劑或錠劑等方便的形式配制。
對于吸入給藥，本發(fā)明使用的化合物可用氣霧劑噴射的形式很方便地釋放出來，這可通過高壓包或噴霧器，或者使用某種合適的拋射劑如二氯二氟甲烷，三氯氟代甲烷，二氯四氟乙烷，二氧化碳或其它適合的氣體來實現(xiàn)。在高壓氣霧劑的情況下，劑量單位可通過一個閥的計量釋放來確定。用作吸入器或吹氣器的明膠的膠囊和藥筒的可制成含有所述化合物和一種適宜的粉末基質(zhì)如乳糖或淀粉的粉末混合物。
所述化合物可配制成便于胃腸外給藥如注射，包括集合藥團(tuán)注射或連續(xù)靜脈滴注。便于注射的制劑可表現(xiàn)為單位劑量形式，如安瓿或多劑量的制劑可表現(xiàn)為單位劑量形式，如安瓿或多劑量容器并加入保存劑。所述組合物也可采用混懸液，溶液或以油或水為介質(zhì)的乳劑形式，且可含有配方劑如懸浮劑，穩(wěn)定劑和/或分散劑。
用于胃腸外給藥的藥用組合物包括活性物質(zhì)的水溶液，即水溶形式。此外，活性物質(zhì)的懸浮液可制成適宜的油狀注射懸浮液。適合的親油溶劑或載體包括脂肪油如芝麻油，或合成的脂肪酸酯，如油酸乙酯或甘油三酯，或脂質(zhì)體。水性注射懸浮液可含有增加懸浮液粘度的物質(zhì)，如羧甲基纖維素鈉，山梨醇，或葡聚糖。所述懸浮液也可有選擇地包含合適的穩(wěn)定劑或增加化合物溶解度的物質(zhì)，以制備高濃度的溶液。
粉針劑的活性成分可與合適的媒體，如無菌去熱源注射水配合，然后使用。
所述的化合物也可配制成直腸組合物如栓劑或滯留灌腸劑，如含常規(guī)栓制基質(zhì)如可可脂或其它的甘油酯。
除了已描述過的制劑外，所述的化合物還可配制成一種長效(depot)制劑。這種長效制劑可采用植入法(如皮下或肌肉)或肌注給藥。因此，所述的化合物可用合適的聚合物或疏水物質(zhì)來配制(如一種可接受的油乳劑)或離子交換樹脂，或微溶的衍生物如一種微溶的鹽來配制。
本發(fā)明的疏水化合物的一種藥物載體為含芐醇，一種非極性表面活性劑，一種與水混溶性有機(jī)聚合物和水相的一種共溶體系。該共溶體系可為VPD共溶體系。VPD是一種由3％重量/容量(W/V)芐醇溶液，8％W/V的非極性表面活性劑多乙氧基醚，及65％W/V的聚乙二醇300在無水乙醇中組成的溶液。而VPD共溶體系(VPD5W)由1∶1稀釋的VPD與5％的葡萄糖在水溶液中配成。這種共溶體系能較好地溶解疏水性化合物，而本身對全身給藥產(chǎn)生的毒性很低。自然，一種共溶體系在不破壞其溶解度和毒性特點的情況下，其比例可有較大的變化。而且，共溶成份的同一性可以變化如其它的低毒性的非極性表面活性劑可用來取代多乙氧基醚；聚乙二醇的所占分?jǐn)?shù)值可以改變；其它生物相容的聚合物可取代聚乙二醇，如聚乙烯吡咯烷酮；以及其它的糖或多糖可代替葡萄糖。
所述藥用組合物也可包括合適的固相或凝膠相載體式賦形劑。這類載體或賦形劑的例子包括(但不限于)碳酸鈣，磷酸鈣，各種糖，淀粉，纖維素衍生物，明膠，及聚合物如聚乙二醇。適于本發(fā)明使用的藥用組合物也包括其中包含以達(dá)到其預(yù)定目的有效量的活性成分的組合物。所述的有效量的確定方法完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)，特別是根據(jù)本文已詳盡公布的那些內(nèi)容。
5.5抗病毒活性的測定本發(fā)明的聯(lián)合療法顯示的抗病毒活性可以用體外測定法較容易地測出，如下文描述的那樣，可以測定所述肽的抑制合胞體形成的能力，或者其抑制無細(xì)胞病毒感染的能力。采用這些測定法，一些參數(shù)如肽對某一病毒株表現(xiàn)的相對抗病毒活性和/或肽對特定毒株的特異性抑制活性可以測出。細(xì)胞融合測定法可以用來測定肽在體外抑制HIV-誘導(dǎo)的合胞體形成的能力。這樣一種測定法可包括在HIV慢性感染的細(xì)胞和一種待測定治療劑存在的情況下，培養(yǎng)未感染的CD-4+細(xì)胞(如Molt或CEM細(xì)胞)。對于每種聯(lián)合療法而言，都可測出一種濃度范圍。該范圍應(yīng)包括不加肽的對照培養(yǎng)物。采用該領(lǐng)域內(nèi)普通技術(shù)人員公知的標(biāo)準(zhǔn)條件下培養(yǎng)。經(jīng)過一個適宜的培養(yǎng)期后(如37℃下培養(yǎng)24小時)，可在顯微鏡下檢查培養(yǎng)物是否存在多核巨細(xì)胞，它是細(xì)胞融合和合胞體形成的指征。
逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)測定法可以用來檢測所述的肽在與另一種抗病毒劑聯(lián)合使用時，對無細(xì)胞HIV感染CD-4+細(xì)胞的抑制能力，這種測定法包括在所述的肽和抗病毒劑聯(lián)合使用時對病毒和CD-4+細(xì)胞的適宜培養(yǎng)濃度(即TCID50)進(jìn)行測定。采用該領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員熟知的培養(yǎng)條件。除了不加肽的對照培養(yǎng)之外，如上所述，還可使用一定范圍內(nèi)濃度的肽。將培養(yǎng)物溫育一定時期(如7天)后，采用標(biāo)準(zhǔn)程序制備一種無細(xì)胞上清液，再檢測作為成功感染的一個指標(biāo)的RT活性。RT活性可用Goff等(Goff.s.el al.，1981，J.Virol.38239-248)和/或Willey等(Willey，R.et al.，1988，J.Virol.62139-147)描寫的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行檢測。這些參考文獻(xiàn)結(jié)合在本發(fā)明中作為參考。
本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法可用來測定非逆轉(zhuǎn)錄病毒活性。例如，請參見Pringle等關(guān)于呼吸道合胞病毒和副流感病毒活性測定技術(shù)的探討(Pringle，C.R.el al.，1985，J.Medical Virology 17377-386)。不可參見“Zinsser Microbiology”一書(1988，Joklik，W.K.et al.，eds.，Appleton&Lange，Norwalk，CT，19 th ed.)，作為對該技術(shù)的綜述。在此結(jié)合到本發(fā)明中作為參考。
5.5.1抗病毒化合物對不同階段HIV感染的活性測定研究抗病毒化合物對不同階段HIV感染(急性、細(xì)胞混合培養(yǎng)、慢性)的活性的三種不同的體外測定方法已為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知(Lambert et al.，1993，Antiviral Res.21327-342)。這些方法可用來評價DP-178，DP-107或一種藥學(xué)上可接受的衍生物與一種已描述過的抗病毒劑聯(lián)合使用的效果。全部測定均在24穴板(Nnnc)上進(jìn)行，每樣三份，5倍連續(xù)稀釋的抑制劑在100％二甲基亞砜(DMSO)中制得，以達(dá)到200×最終濃度。將1/200體積的稀釋液加到培養(yǎng)穴中，以產(chǎn)生最終濃度為0.5％DMSO和所需濃度的抑制劑。試驗或者按兩種抑制劑的固定比(即，1∶10或1∶40，AZTDP-178)的稀釋液，或者按變化的濃度進(jìn)行。
首先，急性感染測定法以體內(nèi)CD-4+細(xì)胞喪失引起的快速復(fù)制和細(xì)胞病變效應(yīng)為模式。測定對急性感染的Molt4細(xì)胞的治療可表明抗病毒化合物在抑制HIV-1感染在T細(xì)胞中的傳播是有效的。對于這些測定法而言，每穴3×104的未感染的Molt4細(xì)胞被感染了50TCIDS的HIV-1(LA1株)。抑制劑的備料在100％DMSO中制備，在0天(當(dāng)天)即病毒吸收期1.5小時后立即加入。在第1天和第4天將含有同樣濃度的抑制劑的培養(yǎng)基加到培養(yǎng)物中。第7天收獲樣品。
第二，含有已整合的原病毒并表現(xiàn)出中到低水平連續(xù)的病毒表達(dá)的慢性感染細(xì)胞很可能代表了體內(nèi)感染了病毒體的貯主，它最終導(dǎo)致疾病惡化。在生長培養(yǎng)基中的慢性感染細(xì)胞經(jīng)三次沖洗后被轉(zhuǎn)移到每穴密度為6×104細(xì)胞的板上。抑制劑在0天加入。在第1天和第3天將含同樣濃度抑制劑的生長培養(yǎng)基加入到培養(yǎng)物中。第5天收獲后測定。
第三，這些研究中使用的細(xì)胞混合培養(yǎng)測試是體內(nèi)感染的恰當(dāng)?shù)哪Ｐ?，因為它涉及到培養(yǎng)物中細(xì)胞與細(xì)胞的融合和傳播以及HIV-1的細(xì)胞外傳播。對于這種測定而言，將3×104未感染的Molt4細(xì)胞與每穴3×103H9/LA1或CEM/LA1慢性感染的細(xì)胞在24穴板上混合培養(yǎng)。在0天加入抑制劑，在第1天和第3天將含抑制劑的生長培養(yǎng)基加到測定板上。第5天收獲后測定?？共《净钚杂脦讉€參數(shù)測量經(jīng)處理培養(yǎng)丸狀細(xì)胞的Westum斑點分析，RT水平及上清液中P24抗原水平。
聯(lián)合用藥效果可用Chou和Talalay的多元藥物分析法(Chou andTalalay，1984，Adv.Enzyme Regul.2227-55)和“微機(jī)量效分析法”軟件(Chou and Chou，1987，Software and manual.P19-64.Elsevier Biosoft，Cambridge，UK)的方程進(jìn)行計算CI=(D)1)(Dx)1+(D)2)(Dx)2+α(D)1(D)2(Dx)1(Dx)2]]>其中，CI是聯(lián)合治療指數(shù)，(DX)1是藥物1單獨使用達(dá)到X％效果所需的劑量，(D)1是與(D)2聯(lián)合治療時產(chǎn)生相同X％效果所需藥物1的劑量。類似地，(DX)2和(D)2的值是由藥物2推導(dǎo)出來的。α值可采用平均效果方程fa/fu＝(D/Dm)m由量效曲線的位置來確定。其中，fa是受劑量D影響的分?jǐn)?shù)，fu是未感染的分?jǐn)?shù)，Dm是達(dá)到50％效果所需的劑量，而m是量效曲線的斜率。對于互相排斥的藥物(即作用模式類似)，兩種藥物在平均效果圖上呈單獨直線及互相平行的直線。相互不排斥的藥物(即各自不獨立的作用模式)在平均效果圖上將給出平行的直線，但其混合物則給出一條拱形上行的曲線。如果藥物相互排斥，α則為零；如果它們相互不排斥，α則為1。假定相互不排斥藥物獲得的值總是稍大于相互排斥的藥物。CI值小于1表示協(xié)同作用，其值大于1表示拮抗作用，其值等于1表示加合作用。
聯(lián)合用藥效果也用MacSynergy計算機(jī)程序(Pritchard andShipman，1990，Antiviral Research 14181-206)計算。這種計算機(jī)程序也接受藥物與藥物相互作用的三維圖像分析?？共《净衔锫?lián)合使用所觀察到的協(xié)同作用的量可用MacSynergy程序計算和用三維條線圖上藥物相互作用的百分?jǐn)?shù)和藥物濃度對應(yīng)作圖來表示。協(xié)同作用的量在圖上用條線的高度表示，而拮抗作用則作為負(fù)值標(biāo)在圖上底線的下面。
6.實例DP-178(SEQ ID1)是一種有效力的HIV-1感染抑制劑在本例中，DP-178(SEQ ID1)已表明為一種有效力的HIV-1調(diào)解的CD-4+細(xì)胞-細(xì)胞融合和無細(xì)胞病毒感染的抑制劑。在融合測定中，這種肽在濃度為1-10ng/ml時可完全阻斷病毒誘導(dǎo)的合胞體形成。在感染性測定中，阻斷感染的抑制濃度稍高些，為90ng/ml。已進(jìn)一步表明，DP-178(SEQ ID1)對HIV-1的抗病毒活性有高度的特異性。此外，一種合成的肽DP-185(SEQ ID3)作為HIV-1衍生的一種DP-178同系物也發(fā)現(xiàn)能阻斷HIV-1調(diào)解的合胞體形成。
6.1材料和方法6.1.1肽的合成Fast Moc化學(xué)公司的應(yīng)用生物系統(tǒng)模型341A肽合成劑可用來合成肽。采用Rink樹脂(Advanced Chemtech)可制備酰胺化的肽，而含游離羧基端基的肽可在Wang(對-烷氧基-芐基-醇)樹脂(Bachen)上合成。首先殘基將雙偶聯(lián)到適合的樹脂上，接著使殘基單偶聯(lián)。偶聯(lián)的每一步都跟隨著乙酐封端過程。用三氟乙酸(TFA)(10ml)，水(0.5ml)，茴香硫醚(0.5ml)，乙二硫醇(0.25ml)和結(jié)晶苯酚(0.75g)處理以使肽從樹脂上解離出來。提純用反相高壓液相色譜法進(jìn)行。約50mg粗肽樣品在Waters Delta Pak C18柱(19mm×30cm，15μ球形填料)上用線性梯度洗脫；水/乙腈0.1％TFA。將凍干的肽貯存干燥并制備肽的水溶液(約1mg/ml)。電子噴射質(zhì)譜產(chǎn)生下列結(jié)果DP-178(SEQID1)44491.87(計算值為4491.94)；DP-180(SEQ ID2)4491.45(計算值為4491.94)；DP-185(SEQ ID3)未做(計算值為4546.97)。
6.1.2病毒HIV-1LAI病毒從R.Gallo(Popovic，M.et al.，1984，Science224∶497-508)處獲得并在含10％胎牛血清的RPMI1640中培養(yǎng)的CEM細(xì)胞上繁殖。使感染的CEM細(xì)胞的上清液通過一個0.2μm的濾器，采用AAS細(xì)胞系以支持病毒復(fù)制，感染效價用微量感染性測定進(jìn)行估算。為此目的，將25μl的連續(xù)稀釋病毒液加入到一塊96穴的微量滴定板中的濃度為2×105/ml的75μl AA5細(xì)胞上。待測的每份病毒稀釋液準(zhǔn)備3份。細(xì)胞培養(yǎng)8天，每隔一天加入新鮮的培養(yǎng)基。感染后第8天，對上清液樣品檢測病毒復(fù)制，作為逆轉(zhuǎn)錄酶活性釋放到上清液中的證據(jù)。根據(jù)Reed和Muench公式計算TCID50(Reed，L.J.et al.，1938，Am.J.Hyg，27493-497)。用于這類研究的HIV-1LAI和HIV-1MN種系的效價在AA5細(xì)胞系中測定，它們的效價大約分別為1.4×106和3.8×104TCID50/ml。
6.1.3細(xì)胞融合測定如以前所述，約7×104Molt細(xì)胞與慢性感染HIV-1ALI病毒的1×104CEM細(xì)胞在96穴板(one-half area cluster plates；Costar，Cambridge，MA)，最終體積為100μl的培養(yǎng)基上培養(yǎng)(Mattews，T.J.etal.，1987，Proc.Natl.Acad，Sci.USA 845424-5428)。加入1體積10μl的肽抑制劑，將該細(xì)胞混合物在37℃下培養(yǎng)24小時。然后，用放大40倍的顯徽鏡(單視野鏡下可觀察到整個穴的情況)對多核巨細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)檢查。
6.1.4無細(xì)胞病毒感染測定將合成肽或者與247TCID50(圖2描述了該實驗)或者與62TCID50(圖3描述了該實驗)單位的HIV-1LAI病毒或25TCID50單位的HIV-2NIHZ和CEM CD4+細(xì)胞在肽濃度為0，0.04，0.4，4.0和40μg/ml時于37℃培養(yǎng)7天。每分鐘對產(chǎn)生的逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)活性計數(shù)用下文6.1.5節(jié)描述的測定法確定(參看Reed，L.J.et al.，1938，Am.J.Hyg.27493-497，關(guān)于TCID50計算的說明)。
6.1.5逆轉(zhuǎn)錄酶測定微量逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)測定為Goff等(Goff.s.el al.，1981，J.Vrol.38239-248)和Willey等(Willey，R.et al.，1988，J.Virol.62139-147)采用。將取自病毒/細(xì)胞培養(yǎng)的上清液調(diào)整到1％三硝基甲苯-X100。將10μl的上清液樣品加入到96穴U形底微量滴定板中的50μl的RT混合物中，使樣品在37℃培養(yǎng)90分鐘。RT混合物含有75mM KCl，2mM二硫蘇糖醇，5mM MgCl2，5μg/ml Poly A(Pharmacia，cat.No.27-4110-01)，(0.25單位/ml Oligo dT(Pharmacia，cat.No.27-7858-01)，0.05％NP40，50mM Tris-HCl，pH7.8，0.5μM非放射活性脫氧胸苷三磷酸(dTTP)，及10μCi/ml32P-dTTP(Amersham，Cat.No.PB.10167)。
培養(yǎng)一個時期后，將40μl反應(yīng)混合物涂到一種Schleicher和Schuell(S+S)NA 45膜上(或DE81紙上)，該膜浸透了2×SSC緩沖液(0.3MNaCl和0.003M檸檬酸鈉)，并鋪在S+SMinifold上，上面加一張GB003(S+S)濾紙，采用部分真空過濾。在完全真空的條件下，用200μl 2×SSC將minifold的每一穴沖洗4遍。從minifold上取下膜在盛有過量2×SSC的Pyrex盤中至少洗2次。最后，用吸濕紙把膜上的水份吸干，放在Whatman3號紙上，用偏氯綸包裝紙覆蓋，置于薄膜上于-70℃過夜。
6.2結(jié)果6.2.1肽對感染細(xì)胞誘導(dǎo)的合胞體形成的抑制作用抗病毒活性的初步篩選就是測定肽阻斷合胞體形成的能力，這種合胞體形成是由未感染Molt4細(xì)胞與HIV-1慢性感染的CEM細(xì)胞混合培養(yǎng)過夜誘發(fā)的。在此給出幾個這類實驗的結(jié)果。在第一種實驗中，系列DP-178(SEQ ID1)肽濃度(在10μg/ml和12.5ng/ml之間)可用來測定其對細(xì)胞融合過程的阻斷的影響。對于這些實驗而言，將用HIV-1LAl、HIV-1MN、HIV-1RF，或HIV-1SF2病毒慢性感染了的CEM細(xì)胞和未感染的Molt4細(xì)胞一起混合培養(yǎng)過夜。圖4的結(jié)果表明DP-178(SEQ ID1)對HIV-1的每個毒株提供全面保護(hù)作用直到DP-178(SEQ ID1)的最低濃度。抑制HIV-1LAI的最低濃度為12.5ng/ml；而對所有其它的HIV-1病毒來說，本研究所用DP-178(SEQ ID1)的最低濃度為100 ng/ml。第二種肽DP-180(SEQ ID2)含有和DP-178(SEQ ID1)相同的氨基酸殘基，但按隨機(jī)次序排列，結(jié)果即使在40μg/ml的高濃度下(圖4)也未顯示出抗融合活性。這些觀察表明DP-178(SEQ ID1)的抑制效果是基本序列特異性，且與非特異性肽/蛋白的相互作用無關(guān)。DP-178抑制作用的實際終點(即最低有效抑制濃度)是在1-10ng/ml范圍內(nèi)。
此外的一系列實驗涉及到一種DP-178(SEQID1)同系物的制備和它抑制HIV-1誘導(dǎo)的合胞體形成的能力的測定。如圖1所示，DP-185(SEQ ID3)的序列和DP-178(SEQ ID1)稍有不同，在于它的基本序列取自HIV-1sF2株，且含有一些與DP-178(SEQ ID1)接近N端有關(guān)的氨基酸差異。如圖4所示，DP-185(SEQ ID3)即使在312.5ng/ml(已測量的最低濃度)時，亦表現(xiàn)了抑制活性。
此外的一系列實驗涉及到DP-178(SEQ ID1)HIV-1和HIV-2抑制活性的比較。如圖5所示，DP-178(SEQ ID1)在肽濃度低于1ng/ml時亦可阻斷HIV-1調(diào)解的合胞體形成。然而DP-178(SEQ ID1)即使在高達(dá)10μg/ml的濃度下也不能阻斷HIV-2調(diào)解的合胞體形成。DP-178(SEQ ID1)作為HIV-1調(diào)解的細(xì)胞融合抑制劑的這種驚人的4log選擇性證實了在DP-178(SEQ ID1)作用中的意外HIV-1的特異性。DP-178(SEQ ID1)可抑制HIV-1調(diào)解的細(xì)胞融合，但在同樣的細(xì)胞型和實驗濃度下，這種肽卻不能抑制HIV-2調(diào)解的細(xì)胞融合這一事實進(jìn)一步證實DP-178(SEQ ID1)的抗病毒作用的高度選擇性。
6.2.2肽對無細(xì)胞病毒感染的抑制作用接著是測定DP-178(SEQ ID1)阻斷無細(xì)胞HIV-1病毒感染CD-4+CEM細(xì)胞的能力。如圖2結(jié)果所示，該實驗測定了DP-178(SEQID1)阻斷HIV-lLAI分離株感染CEM細(xì)胞的能力。本實驗包括三個對照肽DP-116(SEQ ID9)，DP-125(SEQ ID8)，及DP-118(SEQID10)。DP-116(SEQ ID9)代表一種用這種測定法曾證實無活性的肽，而DP-125(SEQ ID8)；Wild，C.et al.，1992，Proc.Natl.Acad，Sci.USA 8910，537)和DP-118(SEQ ID10)則是用此種方法測定證實有活性的肽。每個濃度(0，0.04，0.4，4，和40μg/ml)的肽與247 TCID50單位的HIV-1LAI病毒和CEM細(xì)胞共同培養(yǎng)。培養(yǎng)7天后，測定無細(xì)胞的上清液中是否存在作為成功感染標(biāo)記的RT活性。圖2所示結(jié)果證實DP-178(SEQ ID1)在濃度低至90ng/ml(IC50＝90ng/ml)時可抑制HIV-1病毒分離株調(diào)解的重新感染過程。作為對比，兩種陽性對照肽DP-125(SEQ ID8)和DP-118(SEQ ID10)卻有高達(dá)60倍的IC50濃度(約為5μg/ml)。
在另一試驗中，采用CEM細(xì)胞和HIV-lLAl或HIV-2NTHZ測定DP-178(SEQ ID1)對HIV-1和HIV-2的抑制作用。這些實驗使用了62TCID50HIV-1LAI或25 TCID50HIV-2NTHZ共培養(yǎng)7天。如圖3所示，DP-178(SEQ ID1)抑制HIV-1感染的IC50約為31ng/ml。作為對比，DP-178(SEQ ID1)對HIV-2NTHZ表現(xiàn)出高得多的IC50，因此使DP-178(SEQ ID1)作為HIV-1的抑制劑要比作為HIV-2的抑制劑多兩個Logs。該發(fā)現(xiàn)與上文(6.2.1節(jié))描述的融合抑制試驗的結(jié)果一致，并進(jìn)一步證實了高度的選擇性水平(即對HIV-1的作用超過HIV-2)。
7.實例HIV-1抑制劑IDP-178(SEQ ID1)是無細(xì)胞毒性的本實例表明，36個氨基酸合成肽抑制劑DP-178(SEQ ID1)對培養(yǎng)中的細(xì)胞即使在所試的最高肽濃度下(40μg/ml)仍無細(xì)胞毒性。
7.1材料和方法細(xì)胞繁殖和毒性測定將每種肽濃度下的約3.8×105CEM細(xì)胞于T25燒瓶中，37℃時，培養(yǎng)3天。如圖1所示，測試的肽為DP-178(SEQ ID1)和DP-116(SEQ ID9)。每種肽使用的濃度為0，2.5，10，和40μg/ml。細(xì)胞計數(shù)在培養(yǎng)時間為0，24，48和72小時時進(jìn)行。
7.2結(jié)果有效力的HIV-1抑制劑DP-178(SEQ ID1)是否顯示出任何細(xì)胞毒性，可通過測定該肽對培養(yǎng)細(xì)胞的繁殖和生存能力的影響給予評價。除了各種濃度的DP-178(SEQ ID1)外，CEM細(xì)胞還在一種以前作為HIV抑制劑但表明無效的肽DP-116(SEQ ID9)存在的情況下進(jìn)行培養(yǎng)(Wild，C.et al.，1992，Proc，Natl.Acad.Sci.USA 8910537-10541)。此外，細(xì)胞還在無二者中任何一個肽的情況下進(jìn)行培養(yǎng)。
細(xì)胞毒性研究的結(jié)果證實，DP-178(SEQ ID1)對培養(yǎng)中的細(xì)胞不顯示出細(xì)胞毒性作用。如下面表V所示，即使在DP-178(SEQ ID1)最高測試濃度(40μg/ml)時培養(yǎng)3天，細(xì)胞的繁殖和生存能力特點都與DP-116(SEQ ID9)或無肽對照組無明顯不同。細(xì)胞繁殖數(shù)據(jù)也用圖表形式表達(dá)在圖6中。如上文第6節(jié)提供的實例證實，DP-178(SEQ ID1)在肽濃度1-10ng/ml范圍時，可完全抑制HIV-1調(diào)解的合胞體形成，而在濃度最少為90ng/ml時，可完全抑制無細(xì)胞病毒的感染。因此，本研究證實，即使肽濃度比HIV抑制劑量高3個log，DP-178(SEQID1)也不表現(xiàn)出細(xì)胞毒性作用。
表V％生存能力肽 時間(小時)肽 濃度μg/ml 0 24 48 72DP178 40 98 97 95 97(SEQID1)10 98 97 98 982.5 98 93 96 96DP116 40 98 95 98 97(SEQID9)10 98 95 93 982.5 98 96 98 99無肽 098 97 99 988.實例DP-107和DP-178肽截斷物和突變物的抗病毒活性本節(jié)提供的實例表示了DP-107和DP-178肽截斷物和突變物的抗病毒活性的一項研究。它證實幾種DP107和DP178的改性肽也顯示出較大的抗病毒活性。
8.1材料和方法抗-HIV測定抗病毒測定的操作如上文6.1節(jié)所述。測定使用HIV-1/IIIb和/或HIV-2NIHZ分離株。除非圖5A-C另有說明，否則使用純化的肽。
肽本研究提供的肽的特性是1)圖5A-C表示含有DP178區(qū)的HIV-1BRU分離株及其周圍區(qū)域衍生的肽。這一區(qū)域的跨距(spanned)特指從gP41氨基酸殘基615到氨基酸殘基717之間。列出的肽含有這一區(qū)域的截斷物和/或突變物(它不同于DP178序列的氨基酸序列)。而且，如圖所示，某些肽有氨基端和/或羧基端(加入或除去)；圖6表示代表DP107和/或環(huán)繞HIV-1BRU分離株的DP107氨基酸序列的gP41區(qū)的截斷物。如圖所示，某些肽未受到阻斷和生物素羧基化(biotinylated)。
阻斷的肽含有一個?；鵑-端和一個氨基C-端。
8.2結(jié)果圖5A-C列出已經(jīng)獲得的第1組DP-178衍生的肽的抗-HIV資料。所示完整的、非突變DP178肽(在圖5A-C中稱為T20)的結(jié)果為對于4ng/ml而言。
在圖5中，一些DP178截斷物，如它們的低ID50值所表明的，顯示出一種高水平的抗病毒活性。例如，這些截斷物包括測試的肽T-50，T-624，T-636至T-641，T-645至T-650，T-652至T-654和T-656。T-50代表一種測試的肽，它含有一個點突變，如殘基的陰影背景所示。HIV-1衍生的測試肽表現(xiàn)出一種不同的株特異性抗病毒活性，這些肽在對HIV-2 NIHZ分離株的試驗中均未發(fā)現(xiàn)合適的抗-HIV-2抗病毒活性。
圖5B列出的肽為測試肽，代表DP178的氨基端(T-4)或羧基端(T-3)的一半。氨基端肽無活性(IC50＞400μg/ml)，而羧基端肽表現(xiàn)出有效力的抗病毒活性(IC50＝3μg/ml)。一些其它的測試肽也表現(xiàn)出高水平的抗病毒活性。這些肽包括如T-61/T-102，T-217至T-221，T-235，T-381，T-677，T-377，T-590，T-378，T-591，T-271至T-272，T-611，T-222至T-223和T-60/T-224。某些抗病毒肽含有點突變和/或氨基酸殘基的增加物(它們不同于DP178氨基酸序列)。
圖5C中，點突變和/或氨基端和/或羧基端改變已導(dǎo)入DP178本身的氨基酸序列中。如圖所示，大多數(shù)列出的測試肽表現(xiàn)出有效力的抗病毒活性。
如圖6所示，DP107肽(在圖5中稱為T21)也已產(chǎn)生并受到測試。圖6也提供了有關(guān)阻斷和未阻斷的資料，它們含有來自gP41區(qū)的另外的氨基酸殘基(DP107存在于gP41區(qū)中)。這些肽的絕大多數(shù)，如它們的低IC50值所表明的，顯示出抗病毒活性。
因此，本節(jié)提出的結(jié)果證實，不僅全長DP-107和DP-178肽表現(xiàn)出有效力的抗病毒活性，而且這些肽的截斷物也具有明顯的抗病毒特性。
9.實例潛在的SIV DP178/DP107類似物抗病毒特性在該實例中，采用上文所述的計算機(jī)輔助搜索切口可以鑒定猴免疫缺陷病毒(SIV)DP178樣肽，并測定其抗-SIV活性。已證實鑒定出來的幾個肽表現(xiàn)出有效力的抗病毒能力。
9.1材料和方法抗-SIV抗病毒測定該測定Langolis等已有報道(Langolis，A.J.et al.，1991，AIDS Research and Human Retroviruses 7713-720)。
肽符合本研究特點的肽為T-391至T-400，如圖7所示的那樣。這些肽代表經(jīng)STV TM蛋白的DP178類區(qū)的一種移行(walk)。
每種肽經(jīng)2-倍連續(xù)稀釋至100μg/ml到約100ng/ml的范圍，然后進(jìn)行測試。對每種測定，也使用一個不含肽的穴。
9.2結(jié)果圖7概括的數(shù)據(jù)代表了通過對SIV TM蛋白的DP178類區(qū)的“肽移行”獲得的抗病毒資料。
如圖7所示，肽T-391至T-400經(jīng)測試后顯示出和原肽同樣的有效力的抗病毒活性。
因此，本文前述的計算機(jī)輔助搜索(如8節(jié)舉出的例子)可成功地鑒別具有開發(fā)抗-SIV抗病毒化合物前景的病毒肽區(qū)。
本發(fā)明不限于已描述過的具體實施例這一范圍(打算對本發(fā)明各個方面作專門的闡述)，功能上等效的方法和成份均包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。確實，除了本文已表明的和已敘述的那些內(nèi)容外，本發(fā)明的各種修改對該領(lǐng)域的技術(shù)熟練人員(已可從前面的敘述及附圖了解到)來說是顯而易見的。這類修改也在附加的權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種治療受試者HIV感染的方法，該方法包括給予有效量的DP-107或其一種藥學(xué)上可接受的衍生物和有效量的至少一種治療劑。
2.一種治療受試者HIV感染的方法，該方法包括給予有效量的DP-178或其一種藥學(xué)上可接受的衍生物和有效量的至少一種治療劑。
3.權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的方法，其中所述的治療劑為一種抗病毒劑。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述抗HIV劑為逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，病毒蛋白酶抑制劑，細(xì)胞活素(cytokine)，細(xì)胞活素抑制劑，糖基化作用抑制劑或病毒mRNA加工抑制劑。
5.權(quán)利要求3的方法，其中所述抗病毒劑為核苷類似物。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述核苷類似物為AZT、ddI、ddC、ddA、d4T或3TC。
7.權(quán)利要求3的方法，其中所述抗病毒劑為α-干擾素，β-干擾素或γ-干擾素。
8.權(quán)利要求2的方法，其中所述DP-178衍生物為含有T-624，T-636至T-641，T-645至T-650，T-652至T-654，或T-656組的肽。
9.一種抑制HIV復(fù)制的方法，包括給予受治療者有效量的DP-107或其一種藥學(xué)上可接受的衍生物和有效量的至少一種治療劑。
10.一種抑制HIV復(fù)制的方法，包括給予受治療者有效量的DP-178或其一種藥學(xué)上可接受的衍生物和有效量的至少一種治療劑。
11.一種抑制HIV逆轉(zhuǎn)錄病毒向細(xì)胞傳播的方法，包括使有效量的DP-107或其一種藥學(xué)上可接受的衍生物和有效量的至少一種治療劑接觸所述細(xì)胞的方法。
12.一種抑制HIV逆轉(zhuǎn)錄病毒向細(xì)胞傳播的方法，包括使有效量的DP-178或其一種藥學(xué)上可接受的衍生物和有效量的至少一種治療劑接觸所述細(xì)胞的方法。
13.權(quán)利要求9，10，11或12的方法，其中所述治療劑為抗病毒劑。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述抗病毒劑為逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，病毒蛋白酶抑制劑，細(xì)胞活素，細(xì)胞活素抑制劑，糖基化作用抑制劑或病毒mRNA加工抑制劑。
15.權(quán)利要求13的方法，其中所述抗病毒劑為核苷類似物。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述核苷類似物為AZT、ddI、ddC、ddA、d4T或3TC。
17.權(quán)利要求13的方法，其中所述抗病毒劑為α-干擾素，β-干擾素或γ-干擾素。
18.權(quán)利要求1，2，9或10的方法，其中所述給藥是有順序的。
19.權(quán)利要求1，2，9或10的方法，其中所述給藥是同時進(jìn)行的。
20.權(quán)利要求1，2，9或10的方法，其中所述給藥途徑為口腔。
21.權(quán)利要求1，2，9或10的方法，其中所述給藥途徑為胃腸外。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述給藥途徑為靜脈。
23.一種用于治療HIV感染的藥學(xué)上可接受的組合物，它包括有效量的DP-178或其一種藥學(xué)上可接受的衍生物，一種有效量的其它治療劑和一種藥學(xué)上可接受的載體。
24.一種用于治療HIV感染的藥用組合物，它包括有效量的DP-107或一種藥學(xué)上可接受的衍生物，有效量的另一種治療劑和一種藥學(xué)上可接受的載體。
25.權(quán)利要求23或24的藥用組合物，其中所述治療劑為抗病毒劑。
26.權(quán)利要求25的藥用組合物，其中所述抗病毒劑為核苷類似物。
27.權(quán)利要求26的藥用組合物，其中所述核苷類似物為AZT、ddI、ddC、ddA、或3TC。
28.一種治療受試者HIV感染的方法，包括(a)給予有效量的DP-107，DP-178或其一種藥學(xué)上可接受的衍生物；(b)給予有效量的另一種抗病毒劑；和(c)給予DP-107，DP-178或其一種藥學(xué)上可接受的衍生物。
29.權(quán)利要求28的方法，其中所述DP-107或其一種藥學(xué)上可接受的衍生物，有效量的另一種治療劑和一種藥學(xué)上可接受的載體按步驟(a)給藥，DP-178或其一種藥學(xué)可接受的衍生物按步驟(c)給藥。
30.權(quán)利要求29的方法，其中重復(fù)(a)至(c)的步驟，直至疾病癥狀減輕。
31.一種治療受試者HIV感染的方法，包括給予有效量的DP-178-類肽或其一種藥學(xué)上可接受的衍生物和有效量的至少一種治療劑。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述DP-178類肽是從猴免疫缺陷病毒衍化而來。
33.權(quán)利要求32的方法，其中所述DP-178類肽選自含T-391，T-392，T-393，T-394，T-395，T-394，T-395，T-396，T-397，T-398，T-399或T-400的組中。
全文摘要
本發(fā)明公開了治療或預(yù)防病毒性感染,特別是HIV感染的新的抗病毒的聯(lián)合療法。這種新的抗病毒療法將DP－178或DP－107(病毒融合抑制劑)與至少一種其它的抗病毒治療劑合并使用。本發(fā)明的聯(lián)合療法比單用一種藥物效果好,在某些情況下可產(chǎn)生協(xié)同作用。DP－178或DP－107與另一種抗病毒劑聯(lián)合使用是一種理想的療法,它以全新的機(jī)理,既阻斷了HIV的傳播,又消除了治療劑的毒性。
文檔編號A61K38/00GK1192688SQ96196051
公開日1998年9月9日 申請日期1996年6月6日 優(yōu)先權(quán)日1995年6月7日
發(fā)明者R·M·約翰森, D·M·蘭伯特 申請人:特萊默里斯公司