專利名稱：：聚氧烴基相關(guān)產(chǎn)物和熒光測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及分析領(lǐng)域，特別是熒光免疫測定，受體測定和雜交測定。
背景技術(shù)：
：物質(zhì)的存在或其量的測定通常采用免疫測定法進(jìn)行。免疫測定技術(shù)基于受測抗原物質(zhì)(“靶分析物”)與靶分析物的受體結(jié)合。術(shù)語“分析物”或“靶分析物”是指測定中的待測定化合物，它們可以是天然存在的受體或可制備的任何化合物，它們?yōu)閱我换蚨啾砦?，抗原或半抗原，單個(gè)或多個(gè)化合物共有至少一個(gè)共同表位部位或受體。免疫測定法適用于多種不同的生物活性物質(zhì)的測定。這些物質(zhì)包括半抗原，激素，γ-球蛋白，變應(yīng)原，病毒，病毒亞基，細(xì)菌，毒素如與破傷風(fēng)和動物毒液有關(guān)的毒素，以及眾多藥物。類似技術(shù)可用于帶有例如特異性結(jié)合蛋白的非免疫系統(tǒng)。已知本領(lǐng)域有多種不同類型的免疫測定方法，包括競爭性抑制測定法，順序加入測定法，直接“三明治”測定法，放射變應(yīng)原吸附測定法，放射免疫吸附測定法和酶聯(lián)免疫吸附測定法。大多數(shù)免疫測定所進(jìn)行的基本反應(yīng)是通過特性蛋白(受體)結(jié)合某些稱作“配體”或“分析物”的物質(zhì)以形成大分子復(fù)合物。這些結(jié)合過程是可逆反應(yīng)，而且對于特定濃度的分析物和受體，復(fù)合物形成的程度受質(zhì)量作用定律的平衡常數(shù)控制。因此，在平衡情況下，一些分析物常常處于未結(jié)合(游離)狀態(tài)。生物液體(如血清，血漿和全血)中的靶分析物的測量需要特異性的而且靈敏的免疫測定法。免疫測定的特異性和靈敏度取決于所涉及的靶分析物和受體之間的相互結(jié)合的特性。例如，反應(yīng)對于待測量的分析物必須是特異性的，而且所用受體不應(yīng)當(dāng)與任何其它結(jié)構(gòu)相關(guān)的化合物結(jié)合。此外，通過選擇對靶分析物具有高親和性的受體，可以增加靈敏度。用于監(jiān)測測定反應(yīng)的標(biāo)記物也影響免疫測定的靈敏度。無論是靶分析物還是受體都可被標(biāo)記以進(jìn)行檢測。通常用于免疫測定生物液體中靶分析物的標(biāo)記物包括放射性同位素(放射免疫測定，RIA)，酶(酶免疫測定，EIA)，熒光標(biāo)記物(熒光免疫測定，F(xiàn)IA)，和化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物(化學(xué)發(fā)光免疫測定，CIA)。從理論上來講，熒光測定法可能是所有分析方法中最靈敏的方法之一，這是由于該方法能檢測單光子事件。FIA使用熒光分子作為標(biāo)記物，而且可以是異質(zhì)或均一的。熒光分子(熒光團(tuán))是能在某一波長下吸收光并在另一波長處發(fā)射光的分子。參見P.Moyer等人的“應(yīng)用治療藥物檢測”(AppliedTherapeuticDrugMonitoring)中的“熒光測定——治療藥物測量應(yīng)用”(Burd，J.F.，“Fluoroimmunoassay--ApplicationtoTherapeuticDrugMeasurement”)一文，美國臨床化學(xué)協(xié)會(AmericanAssociationofClincalChemistry)(1984)。一般地，將激發(fā)脈沖導(dǎo)向樣品其上或其內(nèi)，接著產(chǎn)生樣品熒光，并檢測熒光輻射。熒光是某些物質(zhì)所顯示的一種現(xiàn)象，當(dāng)用其它光源照射時(shí)，這些物質(zhì)會發(fā)射通常位于可見光范圍內(nèi)的光線。這種現(xiàn)象不屬于反射，而是產(chǎn)生新光線。目前商品化的測定方法均使用熒光素，當(dāng)用含藍(lán)光的光源輻射時(shí)，這類物質(zhì)能發(fā)射綠光。除熒光外，熒光素(以及其它熒光團(tuán))還發(fā)射偏振光。也就是說，如果熒光素分子保持其躍遷距與激發(fā)電場平行，則發(fā)射光具有和入射偏振光相同的偏振方向。在競爭性結(jié)合免疫測定中使用熒光偏振探針，可以提供一種稱為熒光偏振免疫測定(FPIA)的FIA。在這種測定中，分子越小，其旋轉(zhuǎn)弛豫時(shí)間就越短，旋轉(zhuǎn)得越快。一般地，抗體分子要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于藥物或藥物一探針分子。偏振技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)之一是消除了分離未結(jié)合探針的步驟。盡管在FPIA中未結(jié)合痕量物實(shí)際上不能物理地從樣品中除去，但其作用很容易通過偏振化確定。FPIA技術(shù)的另一優(yōu)點(diǎn)是無強(qiáng)度依賴性。大多數(shù)利用光測量的測定中，光的強(qiáng)度與藥物濃度相關(guān)(因此，光源強(qiáng)度的任何變化都將直接影響測定的靈敏度)，但FPIA法則與上述這些方法不同，該方法的靈敏度與強(qiáng)度變化無關(guān)。常規(guī)的FPIA法需要分別測量空白對照和樣品。困擾熒光免疫測定的難題是從背景輻射中辨別出有用的熒光信號。背景輻射的信號強(qiáng)度可以比有用的熒光信號的強(qiáng)度大10,000倍。背景檢測的困難在生物樣品測定中特別明顯。目前多種熒光測定方法中均使用熒光素這種熒光分子。熒光素具有最大493nm的激發(fā)波長，而生物液體中有許多物質(zhì)具有與熒光素類似的重疊激發(fā)和發(fā)射波長。例如，在測定血漿時(shí)，天然熒光物質(zhì)膽綠素的存在能造成顯著的背景輻射。這類化合物是高熒光性的并產(chǎn)生明顯的能干擾標(biāo)記物信號的背景信號，從而限制了采用熒光素標(biāo)記物的測定靈敏度。通常認(rèn)為與難以處理的背景輻射有關(guān)并起作用的兩種因素包括(1)溶劑敏感性和(2)非特異性結(jié)合。溶劑敏感性是指溶劑影響染料的熒光信號的傾向性。例如，在有機(jī)溶劑中發(fā)熒光的幾種染料往往在水溶液中會發(fā)生聚集，因而顯示出猝滅熒光。非特異性結(jié)合是指樣品組分干擾染料熒光信號的傾向。例如，血清組分如HSA往往與常規(guī)熒光染料結(jié)合，并猝滅或增強(qiáng)對熒光信號的干擾?，F(xiàn)已認(rèn)識到，對于生物液體的分析，最好使用能在大于背景輻射的波長輻射下激發(fā)的染料或標(biāo)記物。然而，即使在大約600nm波長時(shí)血清的背景熒光下降，在直至650nm或更長的波長下仍存在有明顯干擾。因此，先前試圖尋求這種波長的染料的嘗試都是不成功的。例如，參見，Rotenberg，H.和Margarfit，R.，生化雜志(Biochem.Journal)，229197(1985)；和D.J.R..Laurence，生化雜志(Biochem.Journal)，51168(1952)。具有能減少背景熒光干擾的發(fā)射波長的熒光染料包括花青染料，卟啉染料和氮雜卟啉染料。然而，現(xiàn)已分析，這些標(biāo)記物在熒光測定中的使用受下列因素限制溶劑敏感性(與二甲基甲酰胺相比，熒光強(qiáng)度在水基測定溶液中明顯降低)和對生物物質(zhì)的非特異性結(jié)合(與含血清組分如HSA的樣品相比，熒光強(qiáng)度在純化或分離樣品中明顯降低)。使用具有較長衰變期的熒光團(tuán)在例如瞬態(tài)測定的應(yīng)用中尤為重要，這些測定需要能在長至大約20納秒的時(shí)間內(nèi)測量其發(fā)射的熒光團(tuán)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，熒光團(tuán)的天然壽命和消光系數(shù)呈相反比例變化(即當(dāng)一種參數(shù)增大時(shí)，另一參數(shù)降低；不過它們不必要以彼此相反的速率變化)。同樣，具有較長熒光壽命的熒光團(tuán)更易于被減活。因此，具有增大的衰變時(shí)間(即具有接近其天然壽命的衰變時(shí)間)的熒光團(tuán)能提供較大的量子產(chǎn)率，因而靈敏度也更高。早期所進(jìn)行的克服背景輻射難題的嘗試包括(1)使用濾光片濾除所限定的窄波長帶之外的所有檢測輻射；(2)將熒光探針與大分子載體結(jié)合，從而使血清蛋白的作用減至最低，以能夠檢測與靶分析物的結(jié)合，(參見，U.S.P.4,615,986,1986年10月7日授權(quán))；和(3)使用用于改進(jìn)染料的官能特性的化學(xué)基團(tuán)(參見Mujumdar等人，生物共軛化學(xué)(BioconjugateChemistry)4105-110，1993)。Arnost等人在USP4,886,744(1989年12月12日授權(quán))(“Arnost”)中描述了具有下述不對稱花青染料結(jié)構(gòu)的熒光標(biāo)記物R基團(tuán)中的一些可以是“親水基”。親水基定義為用于降低聚集和非特異性結(jié)合的各種可能基團(tuán)，包括聚醚。據(jù)認(rèn)為，Arnost所提供的數(shù)據(jù)表明，一些“親水基”能在一定程度上減少非特異性結(jié)合，并將結(jié)合常數(shù)從7E5降到1.5E4，倍數(shù)小于50。Arnost等人的組分一般具有小于500nm的最大激發(fā)波長。發(fā)明概述本發(fā)明涉及標(biāo)志組分、熒光探針、低聚核苷酸、雜交測定和使用這類產(chǎn)物的免疫測定以及制備這類產(chǎn)物的方法。根據(jù)本發(fā)明，提供了被可檢測標(biāo)記的標(biāo)志組分，該組分包括偶聯(lián)有一個(gè)或多個(gè)聚氧烴基部分的熒光團(tuán)部分。聚氧烴基部分能有利地減輕或消除溶劑敏感性和非特異性結(jié)合的難題。在免疫測定中使用這類可檢測的標(biāo)記物或標(biāo)志組分是有利的，因?yàn)檫@些標(biāo)記物在有或無生物液體如血清存在下，具有基本上與瞬態(tài)熒光發(fā)射的平行和正交組分相同的強(qiáng)度。因此，采用這些標(biāo)記物的測定方法能夠檢測生物液體中的低濃度靶分析物。這些標(biāo)志組分可用作標(biāo)記分析物、抗原、抗體或其它分子的標(biāo)記物。這些標(biāo)志組分可任選地官能化以包含連接臂，這種連接臂使得標(biāo)志組分能與分析物、抗原、抗體或其它分子連接。文獻(xiàn)中已描述了適合于此目的的各種連接臂。Kricka，J.J.；配體一結(jié)合物測定；標(biāo)記物和分析策略(Ligand-BinderAssays；LabelsandAnalyticalStrategies)；15-51頁；MarcelDekker，Inc.，NewYork，NY(1985)。采用常規(guī)技術(shù)使標(biāo)志組分與分析物、抗原、抗體或其它分子連接。本發(fā)明一方面提供了被可檢測標(biāo)記的標(biāo)志組分，該組分包括(1)熒光團(tuán)部分，該熒光團(tuán)部分包括能發(fā)光的基本上為平面的分子結(jié)構(gòu)，發(fā)射波長至少約500nm，和(2)與熒光團(tuán)偶聯(lián)的一個(gè)或多個(gè)聚氧烴基部分。本文詳細(xì)描述了優(yōu)選的熒光團(tuán)、聚氧烴基部分和這兩者之間的連接基的實(shí)例。此外，所提供的證據(jù)還表明了這些標(biāo)志組分在降低溶劑敏感性和減少非特異性結(jié)合方面的效果。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的標(biāo)志組分可用于制備探針[見我們1993年4月21日遞交的美國專利申請08/051,446中的一般性描述]，并可用于免疫測定[見我們1993年3月23日遞交的美國專利申請08/035,633中的一般描述]。這兩篇文獻(xiàn)的全部內(nèi)容(包括附圖)在此引入本文用作參考。附圖簡述圖1為雙活性CY5.5和PEG-胺在0.1M，pH9.3碳酸鹽緩沖液中進(jìn)行的反應(yīng)的RPHPLC洗脫曲線。其中峰9和10中無非特異性結(jié)合。圖2類似于圖1，只是反應(yīng)是在無水條件下于DMF和NMP中進(jìn)行。峰a，b和c均顯示出較強(qiáng)的非特異性結(jié)合，而峰1和2中則無非特異性結(jié)合。圖3為與圖2中所述相同的反應(yīng)混合物在經(jīng)過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去DMF和NMP和真空干燥之后的RPHPLC洗脫曲線。圖4為用BiogelP-6分離時(shí)快速移動峰的RPHPLC洗脫曲線。圖5類似于圖4，只是為P-6分離時(shí)的慢移動峰的RPLHLC流出曲線。圖6說明了在用一組血清組分進(jìn)行試驗(yàn)以揭示非特異性結(jié)合時(shí)，反應(yīng)混合物199-146A(在DMF+NMP中的反應(yīng))的RPHPLC餾分的情況。瞬態(tài)熒光的偏振可作為非特異性結(jié)合的指數(shù)。作為參考，還說明了本發(fā)明特別優(yōu)選的染料LaJolla藍(lán)的數(shù)據(jù)。每組中的第一條給出了染料或僅在緩沖液(TDX緩沖液)中所觀測到的餾分的偏振。數(shù)據(jù)表明，在采用試驗(yàn)盤進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，峰A，B和C(分別對應(yīng)于圖2中的a，b和c)強(qiáng)烈結(jié)合，而當(dāng)用LaJolla藍(lán)時(shí)，峰1(圖2)和峰2(圖2)則顯示出可忽略的結(jié)合。LaJolla藍(lán)(197239B)，在緩沖液中峰1和峰2的偏振之間的差異僅反映了不同染料結(jié)構(gòu)的光物理性質(zhì)的差異，而與聚集或是否存在非特異性結(jié)合無關(guān)。因此，可以看出，CY5.5在與PEG一胺反應(yīng)之后實(shí)質(zhì)上無非特異性結(jié)合，而且峰a，b和c對應(yīng)無屏蔽、無保護(hù)染料的各種形式，而峰1和2是與PEG偶聯(lián)。圖7說明了可用于本發(fā)明的其它染料的實(shí)例?；衔锞幪枌?yīng)于有機(jī)著色劑(Okawara等，1986)中所用的那些編號，此文獻(xiàn)的全部內(nèi)容(包括附圖)在此引入本文用作參考。發(fā)明詳述下面描述中包括實(shí)施本發(fā)明的優(yōu)選方式，只是用于說明本發(fā)明的一般原理，而不以任何方式限制本發(fā)明。I.優(yōu)選的標(biāo)志組分A.優(yōu)選的熒光團(tuán)部分一般來講，優(yōu)選的熒光團(tuán)部分為使用波長約200至約1000納米，優(yōu)選使用波長約600至約800納米，更優(yōu)選大于650nm的光激發(fā)時(shí)能有效產(chǎn)生熒光的熒光團(tuán)。合適的熒光團(tuán)包括下述熒光團(tuán)，它們應(yīng)能在不同于其它溶液組分(如樣品中存在的蛋白質(zhì))的最大激發(fā)和發(fā)射波長下吸收和/或輻射，以使背景熒光降到最低程度。由于這些標(biāo)志組分特別適用于生物液體的測定，因此，在此應(yīng)用中，優(yōu)選具有至少約500納米激發(fā)和/或發(fā)射波長的熒光團(tuán)，此波長能夠減少其它樣品組分的環(huán)境熒光干擾。當(dāng)使用小于500nm的波長激發(fā)時(shí)，某些樣品，如血清可能會顯示出來自黃素、黃蛋白、NADH等的明顯干擾背景熒光。對于某些應(yīng)用，如熒光偏振免疫測定，當(dāng)結(jié)合時(shí)，優(yōu)選的熒光團(tuán)還可以顯示出高熒光偏振程度和低熒光偏振程度，對于某些如熒光瞬態(tài)測定的應(yīng)用，優(yōu)選的熒光團(tuán)的特征還在于具有約1納秒至約50納秒，優(yōu)選約5至約20納秒可測熒光衰變時(shí)間。對于其它應(yīng)用，如磷光標(biāo)記，可使用具有更長衰變時(shí)間的熒光團(tuán)。術(shù)語“衰變時(shí)間”是指使激發(fā)態(tài)分子的濃度從其最初濃度降低至該濃度的1/e所必須經(jīng)過的時(shí)間。因此，優(yōu)選能有效產(chǎn)生熒光的熒光團(tuán)，即其特征為在適當(dāng)波長下具有高吸收能力和高熒光量子產(chǎn)率的熒光團(tuán)。對于某些應(yīng)用，優(yōu)選的熒光團(tuán)具有至少2納秒級的可測熒光衰變時(shí)間，并顯示出高熒光偏振程度。適宜的熒光團(tuán)部分包括能發(fā)光的基本上為平面的分子結(jié)構(gòu)。其中一類熒光團(tuán)部分的能發(fā)光基本平面分子結(jié)構(gòu)包括基本平面的大環(huán)多齒配體，這類配體能配位中心原子，其中的中心原子還可以配位有兩個(gè)軸向配體，大環(huán)配體的每一面(即具有反向取向)各有一個(gè)。術(shù)語“軸向配體”是指能與大環(huán)配體和中心原子一同形成配合物的取代基。軸向配體與大環(huán)配體所述的平面成正交關(guān)系。優(yōu)選的中心原子為可以形成八面體配合物的元素，該配合物包含有兩個(gè)位于大環(huán)配體平面兩側(cè)并與平面正交的反式或軸向取向的配體。對于在某些應(yīng)用中作為熒光標(biāo)志組分的使用來說，中心原子不應(yīng)當(dāng)具有過高的原子序數(shù)(約30或更低)，以致通過躍遷到三重態(tài)而損失大部分熒光。對于如體內(nèi)治療腫瘤的應(yīng)用，可使用具有較高原子量的原子，或者對于分離型測定或?qū)τ诹坠鈽?biāo)記來講也是如此。對于在熒光免疫測定中作為標(biāo)志組分的應(yīng)用，合適的中心原子為以下原子，它們可配位有兩個(gè)軸向配體，而且不為高原子序數(shù)的原子，以免通過躍遷到三重態(tài)而引起熒光大規(guī)模猝滅。優(yōu)選的中心原子的元素包括硅，鍺，磷和錫，尤為優(yōu)選硅和鍺。優(yōu)選的多齒配體包括具有pi-電子共軛環(huán)系的含氮大環(huán)。這些大環(huán)可被任選地取代，包括在橋碳或氮上的取代。適宜的大環(huán)包括卟啉衍生物、氮雜卟啉、可啉、sapphyrin和porphycene以及其它類似的具有共軛π-電子環(huán)系的大環(huán)。鑒于它們結(jié)合有眾多上述特性，因此一類特別優(yōu)選的大環(huán)包括卟啉衍生物和氮雜卟啉衍生物(其中至少一個(gè)橋碳被氮原子取代的卟啉衍生物)。氮雜卟啉衍生物包括單一，二—和三—氮雜卟啉和金屬卟啉(porphyrazine)衍生物。這些大環(huán)可任選地具有稠合的芳環(huán)。這些氮雜卟啉衍生物包括酞菁，苯并三氮雜卟啉和紫菜嗪和它們的衍生物。這些化合物中許多化合物的制備和熒光性質(zhì)是已知的，而且其中一些可從市場上購得。Moser，F(xiàn).；酞菁化合物(PhthalocyanineCompounds)；ReinholdPublishingCo.，紐約(1963)；Wilkinson，G.(編者)；綜合配位化學(xué)(ComprehensiveCoordinationChemistry)；卷2，第813-898頁；PergamonPress，紐約(1987)；Hanack，M.等人；“一類新的單向?qū)w的合成和性質(zhì)”(SynthesisandPropertiesofaNewKindofOne-DimensionalConductor)，有機(jī)金屬化學(xué)雜志(JournalofOrganometallicChemistry)204315-325(1981)；和Lezhoff，C.C.和Lever，A.S.P.(編者)；酞菁性質(zhì)和用途(PhthalocyaninesPropertiesandApplications)；VCHPublishers，Inc.，NewYork(1989)。根據(jù)本發(fā)明，連接有一個(gè)或多個(gè)聚氧烴基的其它種類熒光團(tuán)見下文實(shí)施例和圖7中所述。對于某些應(yīng)用如熒光偏振測定，優(yōu)選的大環(huán)為顯示出高偏振度的氮雜卟啉衍生物，即能發(fā)射出強(qiáng)偏振光的化合物。對于這些應(yīng)用，優(yōu)選具有較低對稱度(優(yōu)選具有低于D4h的對稱度)的大環(huán)。優(yōu)選的一組包括具有至少一個(gè)稠合芳環(huán)或外部取代基的大環(huán)。因此，優(yōu)選的大環(huán)包括在能導(dǎo)致對稱性降低的位置上具有稠合芳環(huán)的氮雜卟啉衍生物。優(yōu)選的氮雜卟啉衍生物的種類包括具有低于D4h對稱性的單氮雜卟啉、二氮雜卟啉、和三氮雜卟啉衍生物。優(yōu)選的熒光團(tuán)包括(1)多甲川染料；(2)醌型染料；(3)陰丹士林染料；(4)靛屬染料；(5)吖嗪，如尼羅藍(lán)A和激光染料；(6)芳基甲烷染料及雜環(huán)類似物；(7)吡喃鎓，硫代吡喃鎓和squarylium染料；(8)醌的甲基化物；(9)共軛甜菜堿染料(N-環(huán)戊二烯酐吡啶鎓衍生物)(derivativesofpyridiniumN-cyclopentadienide)；和(10)大環(huán)如卟啉，氫化卟啉(hydroporphyrin)，氮雜卟啉包括酞菁、corroles、可啉和五吡咯并大環(huán)如sapphyrins。這類染料的實(shí)例見下文所述。多甲川染料包括對稱或不對稱花青，它們可以是陽離子型，陰離子型或中性花青(份菁)。端接在多甲川鏈上的基團(tuán)的結(jié)構(gòu)決定了具體花青在上述種類中的歸屬。最長的吸收波長不僅取決于端基，而且還取決于多甲川鏈中的-CH＝CH-基團(tuán)的數(shù)量。多甲川鏈上的取代基能夠引起紅移或藍(lán)移，這取決于取代基的結(jié)構(gòu)和它們在鏈中的位置。其它結(jié)構(gòu)修飾可通過環(huán)合或同偶聯(lián)結(jié)構(gòu)完成。因此，可以理解，可能的花青的數(shù)量變化很大。為尋求更好的照相增感劑，已經(jīng)合成了上千種這類化合物。特別優(yōu)選的熒光團(tuán)包括(1)芳基終止的多甲川染料，如三甲川，五甲川和七甲川；(2)醌型染料，如1-氨基-2-苯甲?；?4-(芳基氨基)蒽醌，6-(芳基氨基)萘并[2，3，c]-9，10-二氫化吖啶-5，8，14-三酮；(3)陰丹士林染料；(4)1，4-二氨基蒽醌-2，3-二甲酰胺；(5)四氨基蒽醌；(6)吖嗪染料；(7)吡喃鎓，硫代吡喃鎓和squarylium染料；(8)蒽醌的甲基化物。B.優(yōu)選的聚氧烴基部分優(yōu)選的加溶聚氧烴基部分包括水溶性糖類如葡萄糖，蔗糖，麥芽三糖等；水溶性糖衍生物如葡糖酸和甘露糖醇，以及低聚糖；多肽如polysine和天然存在的蛋白質(zhì)；以及水溶性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮，聚乙烯醇，聚乙烯亞胺，聚丙烯酸，聚丙烯酰胺，環(huán)氧乙烷共聚物如PluronicTM(聚醚)和TetronicTM(BASF)，多元醇類表面活性劑，以及特別是聚醚如包括聚乙二醇的其它聚氧化烯，或其它水溶性混合氧化烯聚合物等。特別優(yōu)選的一類加溶聚氧烴基部分包括聚乙二醇(PEG)和聚乙二醇衍生物，如聚乙二醇單甲醚。其它合適的PEG衍生物包括PEG-硅衍生醚類。這些聚合物中的許多可從市場上以不同分子量形式購得。其它則可以方便地由市售原料制備，如通過將氨基-PEG偶聯(lián)到鹵代烷基甲硅烷基或硅烷部分上制備。當(dāng)連結(jié)有熒光團(tuán)部分時(shí)，這些聚氧烴基部分在水溶液中能賦予特別優(yōu)越的溶解特性，進(jìn)而改進(jìn)可測熒光衰變時(shí)間和熒光強(qiáng)度。此外，所產(chǎn)生的標(biāo)志組分為水溶性的，并顯示出減弱的非特異性結(jié)合，尤其降低了與血清白蛋白的結(jié)合，而這對于某些熒光團(tuán)來講迄今仍為一難題，特別是對于卟啉或酞菁染料，這些染料現(xiàn)已用如磺酸鹽之類的基團(tuán)官能化，以賦予分子提高的水溶性。熒光團(tuán)或標(biāo)志組分的非特異性結(jié)合降低免疫測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。這些包括連結(jié)有PEG的熒光團(tuán)的標(biāo)志組分在水溶液中還顯示出改善的熒光強(qiáng)度，而且熒光猝滅減少。合適的PEG的分子量可以在約200至約20,000或更大之間變化，較優(yōu)選為2,000至20,000，更優(yōu)選為4,000至15,000，最優(yōu)選8,000至10,000。特定分子量的選擇取決于所選擇的特定熒光團(tuán)及其分子量和疏水程度，以及所使用熒光團(tuán)-PEG復(fù)合物的特定應(yīng)用。C.優(yōu)選標(biāo)志組分的吸收和偏振行為無溶劑敏感性和對HSA及血清組分的非特異性結(jié)合能夠通過測定吸收光譜和瞬態(tài)熒光發(fā)射證實(shí)。包括中心原子(例如硅)的標(biāo)志組分能夠通過測定瞬態(tài)熒光靈敏地表征。其中中心原子上偶聯(lián)有一個(gè)或多個(gè)聚氧烴基部分如PEG。在這種測定中，在相當(dāng)于約3倍標(biāo)志組分衰變時(shí)間的時(shí)間周期內(nèi)監(jiān)測平行或正交于激發(fā)脈沖偏振方向的偏振的兩種組分的強(qiáng)度。這種曲線反映了消光系數(shù)，量子產(chǎn)率，衰變時(shí)間和偏振狀態(tài)的情況，并提供了對標(biāo)志組分的化學(xué)和物理?xiàng)l件的靈敏指數(shù)。例如，倘如激發(fā)態(tài)被減活化或者轉(zhuǎn)化成三重態(tài)，總強(qiáng)度則被降低，而且衰變時(shí)間也縮短。如果分子的轉(zhuǎn)動布朗運(yùn)動通過增加粘度或通過結(jié)合到大分子上被改變，則平行組分與正交組分的強(qiáng)度比將增大。術(shù)語“結(jié)合”是指其中分子和其特異性結(jié)合配對物(partner)之間形成相互結(jié)合的狀態(tài)。本發(fā)明的某些標(biāo)志組分在DMF(一種有機(jī)溶劑)中顯示出和在SAP(疊氮化物磷酸鹽鹽水，中性緩沖水溶液)中相同的強(qiáng)度、衰變時(shí)間和偏振情況(在約5％實(shí)驗(yàn)誤差之內(nèi))。在某種程度上，其它標(biāo)志組分制品都共有這些特性。本發(fā)明標(biāo)志組分的特殊和重要性質(zhì)是對血清組分的不敏感性(和不與這些組分結(jié)合)，這可以通過血清對熒光的強(qiáng)度，衰變時(shí)間或偏振組分的相對強(qiáng)度無任何可測作用證實(shí)。對于可用于如采用生物物質(zhì)的測定的應(yīng)用的標(biāo)志組分來講，這種特性是十分重要的。含平均分子量350的PEG單甲基醚的羥基硅酞菁產(chǎn)物在可見光和近紅外區(qū)的吸收光譜表明，最大吸收的位置和高度在DMF(一種有機(jī)溶劑)和在SAP(疊氮化物磷酸鹽鹽水，一種中性水緩沖液)中幾乎相同。相反，未被加溶性聚氧烴基軸向配體取代的硅酞菁幾乎不溶于這些溶劑中，并且在DMF中僅顯示出非常低的吸收水平，而在SAP中實(shí)際上無吸收。對于與上所述相同的PEG-取代硅酞菁，其瞬態(tài)熒光發(fā)射表明，向SAP中的樣品內(nèi)加入人血清，實(shí)際上不影響發(fā)射。通過用磺酸鹽衍生酞菁大環(huán)加溶的硅酞菁(不含PEG配體)顯示出，當(dāng)加入血清后，不僅熒光強(qiáng)度發(fā)生變化，而且偏振化作用也發(fā)生變化。用PEG軸向配體取代羥基，則能消除這些變化。對于PEG取代的硅酞菁(其中酞菁大環(huán)被磺化)，瞬態(tài)熒光發(fā)射證明在HSA和HSA+血清存在下的瞬態(tài)發(fā)射與僅在緩沖液(SAP)中的發(fā)射相同。大環(huán)的磺化不影響軸向加溶聚氧烴基部分防止標(biāo)志組分非特異性結(jié)合HSA或血清組分的能力。對于中心硅原子上不連結(jié)有任何加溶聚氧烴基部分的磺化硅酞菁，在DMF中的瞬態(tài)熒光發(fā)射表明，相對于激發(fā)脈沖偏振方向的平行或正交偏振的兩種組分大約等同。相同濃度的同樣物質(zhì)在SAP中的瞬態(tài)熒光是溶劑敏感的，而且其熒光在SAP中有大約40％被猝滅。向溶液中加入血清產(chǎn)生增強(qiáng)的熒光并誘導(dǎo)此類染料的發(fā)射偏振，從而導(dǎo)致平行和正交組分的強(qiáng)度實(shí)際上大不相同。這說明磺化硅酞菁與血清組分能夠顯著結(jié)合。加入血清后的強(qiáng)度變化也是結(jié)合血清組分的標(biāo)志?；腔杼荚贒MF中的可見光和近紅外吸收分別在673nm(0.634)和603nm(0.107)顯示出最大吸收波長和吸光度。相同濃度的磺化硅酞菁在SAP中的吸收光譜分別在678nm(0.509)和606nm(0.092)顯示出最大吸收波長和吸光度。II.優(yōu)選標(biāo)志組分的制備制備本發(fā)明優(yōu)選標(biāo)志組分的一種方法是按照下列一般反應(yīng)式使合適的含羥基或鹵化物基團(tuán)作為軸向配體的熒光團(tuán)部分與活化形式的加溶聚氧烴基部分進(jìn)行配體交換反應(yīng)Mcl-CA-(X)2+2(SM)＿M(jìn)cl-CA-(SM)2+2X其中Mcl表示大環(huán)配體，CA表示中心原子，X表示置換配體以及SM表示加溶部分。此反應(yīng)可以在無溶劑存在下進(jìn)行或者，如果需要的話，在溶劑中進(jìn)行。適宜的溶劑包括喹啉，THF，DMF，咪唑等。適宜的反應(yīng)溫度是可變的，這取決于大環(huán)原料和加溶部分的性質(zhì)。反應(yīng)一般在大約2分鐘至大約24小時(shí)內(nèi)完成。反應(yīng)混合物可以方便地通過回流或借助如沙浴等方式加熱。為方便起見，反應(yīng)可以在環(huán)境壓力下進(jìn)行。據(jù)信，此反應(yīng)分兩步進(jìn)行，每一次配位一個(gè)聚氧烴基作為軸向配體。聚氧烴基部分與配位有大環(huán)配體的中心原子的反應(yīng)可分階段進(jìn)行?？捎^測到PEG與二羥基硅酞菁(PcSi(OH)2)的反應(yīng)產(chǎn)物。在第一階段(“早藍(lán)階段”(EarlyBlueStage))中，熒光團(tuán)部分(SiPc)[使它們在DMF和SAP(疊氮化物磷酸鹽鹽水緩沖液)均變?yōu)榭扇艿腯對溶劑明顯敏感，并且大約85％被猝滅。相反，后一階段的反應(yīng)產(chǎn)物(“藍(lán)綠產(chǎn)物”(BlueGreenProduct))對溶劑完全不敏感，并在兩種溶劑中顯示出相同的發(fā)射強(qiáng)度和衰變時(shí)間。優(yōu)選的合成方法見我們所擁有的USP5,403,928(1995年4月4日授權(quán))中的實(shí)施例5所述。III.實(shí)用性本發(fā)明的標(biāo)志組分可用作熒光探針的熒光標(biāo)記物，和用于熒光免疫測定，以及在體內(nèi)成像和體內(nèi)腫瘤治療方面用作標(biāo)記物。這些標(biāo)志組分優(yōu)選用作常規(guī)熒光免疫測定(包括熒光偏振免疫測定)中的熒光標(biāo)記物。當(dāng)如此使用時(shí)，這些標(biāo)志組分可以連結(jié)特異性結(jié)合對(“標(biāo)記的結(jié)合配對物”)中的一個(gè)或其類似物。標(biāo)志組分可直接與此部分連結(jié)或共軛，或者經(jīng)連結(jié)臂連結(jié)或共軛。術(shù)語“特異性結(jié)合對”是指兩種不同的分子(或組分)，其中一個(gè)分子在其表面或空腔中具有這樣區(qū)域，該區(qū)域能夠準(zhǔn)確地識別分子或包括其它分子的分子配合物的特定空間和極性組織并與之連結(jié)。術(shù)語“結(jié)合配對物”是指這樣的分子或分子復(fù)合物，它們能夠準(zhǔn)確識別或準(zhǔn)確識別特定的分子或分子復(fù)合物或被特定的分子或分子復(fù)合物所識別。這些標(biāo)記結(jié)合配對物可用于各種形式的測定中，如涉及競爭分析物或分析物結(jié)合配對物(如果使用標(biāo)記分析物或分析物類似物的話)的測定，并可用于均一或異質(zhì)測定中。鑒于它們在水溶液中不聚集和對溶劑的不敏感性(說明無可檢測的聚集)以及它們對血清組分和其它生物大分子無非特異性結(jié)合的優(yōu)點(diǎn)，這些標(biāo)志物特別適合于在檢測含生物液體如血清的樣品中的分析物的測定中應(yīng)用。因此，這些標(biāo)志組分可用作檢測溶液中分析物的熒光探針的標(biāo)記物，其中血清組分的非特異性結(jié)合會嚴(yán)重?fù)p害測定的靈敏度，影響測定的準(zhǔn)確度和精度。另一方面，這些標(biāo)志組分可用作體內(nèi)成像物質(zhì)。當(dāng)用作體內(nèi)成像物質(zhì)時(shí)，這些標(biāo)志組分與特異性結(jié)合對中的一員共軛產(chǎn)生標(biāo)記結(jié)合配對物。將標(biāo)記結(jié)合配對物導(dǎo)入到動物體內(nèi)。如果存在特異性結(jié)合對的另一成員，標(biāo)記結(jié)合配對物將與其結(jié)合，隨后可以測量由標(biāo)志組分所產(chǎn)生的信號，并進(jìn)而確定其位置。這些標(biāo)志組分還可以用于體內(nèi)腫瘤治療。例如，光動力學(xué)療法包括使用標(biāo)志組分作為光敏劑。標(biāo)志組分(熒光標(biāo)記物)與結(jié)合配對物共軛，此結(jié)合配對物能夠特異性地識別腫瘤細(xì)胞組分并與之結(jié)合。光激發(fā)之后，結(jié)合標(biāo)志組分共軛物的定域三重態(tài)發(fā)射會引起化學(xué)反應(yīng)，并選擇性損傷和/或破壞腫瘤細(xì)胞。為了有助于理解本發(fā)明，本文還包括用于說明一系列實(shí)驗(yàn)結(jié)果的下列實(shí)施例。當(dāng)然，本發(fā)明的下述實(shí)施例不應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是對本發(fā)明的具體限制，在本領(lǐng)域技術(shù)人員的專業(yè)知識范圍內(nèi)，他們目前和將來都可以對本發(fā)明作出各種改進(jìn)，而且所有這些改進(jìn)均落在前面所述的說明書和后面附加的權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。實(shí)施例酞菁、卟啉和花青或多甲川類染料偶聯(lián)有一個(gè)或多個(gè)聚氧烴基，如PEG(聚乙二醇)。在各種情況下，一個(gè)或多個(gè)聚氧烴基的存在導(dǎo)致聚集傾向明顯降低，更為重要的是與生物物質(zhì)(在實(shí)際實(shí)驗(yàn)中為人血清或人血清成分)非特異性結(jié)合的傾向也明顯降低。在血清或全血存在下對異羥基洋地黃毒苷原進(jìn)行混合—讀出(mix-and-read)測定，比較自身未保護(hù)的染料和連結(jié)有聚氧烴基的染料。在該測定中，對于進(jìn)行異羥基洋地黃毒苷原治療的患者來講，為獲得監(jiān)測其體內(nèi)異羥基洋地黃毒苷原水平所必需的靈敏度，熒光標(biāo)記物(酞菁)的保護(hù)是絕對必需的。對于任何實(shí)際應(yīng)用來講，用自身未保護(hù)形式的酞菁制備的探針是無用的。治療藥物測定領(lǐng)域目前主要使用的異羥基洋地黃毒苷原測定法在探針中采用無保護(hù)染料(熒光團(tuán))。然而，為進(jìn)行此測定，必須首先進(jìn)行分離，離線沉淀和離心以變性和除去血清成分，否則它們會使測定不可能進(jìn)行。我們概述了各種IR/近IR染料的制備方法，這些染料具有據(jù)此認(rèn)為它們可用作熒光探針的光物理參數(shù)。下文所示的反應(yīng)說明了如何制備用于消除聚集和非特異性結(jié)合的染料?？梢杂妙愃频牧鞒陶f明如何通過連結(jié)合適的半抗原，抗體或其它生物分子將這類制備的染料轉(zhuǎn)化成有用的探針。實(shí)施例1芳端化多甲川染料可與一個(gè)或多個(gè)聚氧烴基部分連結(jié)的芳端化多甲川染料包括下述文獻(xiàn)中所述的那些W.BTuemmler，B.S.Wildi，有機(jī)化學(xué)雜志(J.Org.Chem.)，1958，80，3772-3777；R.Wizinger，G.Renckhoff，雜環(huán)化學(xué)學(xué)報(bào)(Helv.Chim.Acta)1941，24，369E-388E；和H.Lorenz，R.Wizinger，雜環(huán)化學(xué)學(xué)報(bào)(Hely.Chim.Acta)1945，28，600-612，上述各文獻(xiàn)的全部內(nèi)容(包括附圖)在此均引入本文用作參考?？膳c一個(gè)或多個(gè)聚氧烴基部分偶聯(lián)的芳端化多甲川染料優(yōu)選具有下述結(jié)構(gòu)其中n為0，1，或2，且R為H，Cl，或N(CH3)2。具上述結(jié)構(gòu)的芳端化多甲川染料具有下述光譜特性</tables>具上述結(jié)構(gòu)的芳端基多甲川染料可用W.BTuemmler，B.S.Wildi在有機(jī)化學(xué)雜志(J.Org.Chem.)1958，80，3772-3777中所述的方法合成。例如，三甲川(n＝0)可按下述合成其中在n為0且R1和R2為H、Cl或N(CH3)2時(shí)，得到39-56％收率。類似地，五甲川染料(n＝1)可按下所述合成其中在n為1且R1和R2為H、Cl或N(CH3)2時(shí)，得到50-99％收率。七甲川染料(n＝2)可按下述合成其中在n為2且R為H、Cl或N(CH3)2時(shí)，得到37-96％收率。芳端基多甲川染料的聚乙二醇(PEG)共軛物包括其中n為0、1或2，且R包括但不限于H、Cl、Br、I、N(CH3)2、連接基和O-PEG-OCH3。這些含PEG的染料可按下述合成此產(chǎn)物是進(jìn)行上面Teummler和Wildi所述合成的關(guān)鍵中間體，并按下所述得到多甲川染料PEG三甲川染料n＝0，R1＝H；R2＝O-PEG-OCH3n＝0，R1＝Cl，Br，I，F(xiàn)；R2＝O-PEG-OCH3n＝0，R1＝連接基R2＝O-PEG-OCH3n＝0，R1＝R2＝O-PEG-OCH3n＝0，R1＝O-PEG-OCH3；R2＝Hn＝0，R1＝O-PEG-OCH3；R2＝Cl，Br，I，F(xiàn)n＝0，R1＝O-PEG-OCH3；R2＝連接基PEG五甲川染料和PEG七甲川染料其中n為1或2，且R為O-PEG-OCH3。實(shí)施例2醌型染料醌型染料可以偶聯(lián)有一個(gè)或多個(gè)聚氧烴基部分。這些染料包括1-氨基-2-苯甲?；?4-(芳氨基)蒽醌類化合物，如L.Boguslavskaya，V.I.Gudzenko在Z.Organ.Khim.1968，4，101-104中所述的化合物[此文獻(xiàn)的全部內(nèi)容(包括附圖)在此并入本文用作參考]，而且它們優(yōu)選具有下述結(jié)構(gòu)Z＝p-OCH3p-OC2H5，p-OH，p-Cl，p-NO2，m-Cl，M-CF3，H，m-NO2這些化合物具有下述光譜特性λmax范圍為約670-720nm，ε范圍為約100,000-200,000。這類化合物中的含PEG共軛物可按下述合成可用于本發(fā)明的其它醌型染料包括6-(芳氨基)萘并[2，3，c]吖啶-5，8，14-三酮類化合物[如L.Boguslavskaya，V.I.Gudzenko在Z.Organ.Khim.1968，4，101-104中所述]，并優(yōu)選具有下述結(jié)構(gòu)這類化合物具有下述光譜特性λmax＝732nm。含PEG共軛物可按下述合成實(shí)施例3陰丹士林染料陰丹士林染料也可以與聚氧烴基偶聯(lián)，而且包括A.Tundo在Ann.Chim.(Rome)1957，47，291-298中所述的那些染料[此文獻(xiàn)的全部內(nèi)容(包括附圖)在此并入本文用作參考]。這類化合物優(yōu)選具有下述通式結(jié)構(gòu)這類化合物具有下述光譜特性λmax范圍為約715nm-790nm，logε范圍為約4.0-4.6。含PEG的共軛物可按下文所述合成采用此途徑，也可以進(jìn)行在位置“a”和位置“b”上分別連結(jié)上單個(gè)PEG殘基和合適的官能化芳基的混合縮合反應(yīng)。實(shí)施例41，4-二氨基萘醌-2，3-二甲酰胺(dicarboxamide)染料也可以使用1，4-二氨基萘醌，這些萘醌包括下述文獻(xiàn)中所述的那些化學(xué)文摘1984，100，193530n[該文獻(xiàn)的全部內(nèi)容(包括附圖)在此并入本文用作參考]。這類化合物優(yōu)選具有下述結(jié)構(gòu)X＝O，S，NH，NR′2這類化合物具有下述光譜特性對于R＝n-C6H13的化合物，λmax＝763(液晶相)。PEG共軛物可按下文所述合成實(shí)施例5四氨基蒽醌類染料也可使用四氨基蒽醌類化合物，這些蒽醌包括T.Ohyamata，K.Takuma；S.Kuroda，H.Aiga.在歐洲專利申請EP323,184(1989年7月5日)所述的那些[此文獻(xiàn)內(nèi)容在此全部并入本文用作參考]。這類化合物優(yōu)選具有下述結(jié)構(gòu)這類化合物具有下述光譜特性對于R＝烷基的化合物，λmax＝741(EtOH)。PEG共軛物可按下文所述合成實(shí)施例6吖嗪染料吖嗪染料也可被使用，并優(yōu)選它們具有下述結(jié)構(gòu)Y＝O，SX＝ClO4-，Cl-更優(yōu)選的染料為高氯酸尼羅藍(lán)A，其結(jié)構(gòu)如下這類化合物具有下列光譜特性</tables>※引自“激光染料”(“LaserDyes”)，MitsuoMaeda。對于星號標(biāo)記的欄目，Abs.λmax是指紅寶石脈沖激光的最大吸收波長，熒光λmax是指激發(fā)波長。PEG共軛物可按下所述采用染料化學(xué)進(jìn)展(ProcessesofDyeChemistry)(Interscience，NewYork)1949中所闡述的技術(shù)合成。實(shí)施例7吡喃鎓和硫代吡喃鎓型染料吡喃鎓和硫代吡喃鎓染料也可被使用，并優(yōu)選它們具有下述結(jié)構(gòu)X＝O，SR，R′，R″＝烷基，芳基或烯醇醚這類化合物可按下所述并采用下述文獻(xiàn)中所描述的技術(shù)合成A.T.Balaban，W.Schroth，G.W.Fischer，高級雜環(huán)化學(xué)(Adv.HeterocyclicChem.)1969，10，241；和A.T.Balaban，A.Dinculescu，G.N.Dorofeenko，G.W.Fischer，A.V.Koblik，V.V.Meqheritskii，W.Schroth“PyryliumSalts.Syntheses，ReactionsandPhysicalProperties”，Adv.HetercyclicChem.，Suppl.2，Ed.A.R.Katritsky編輯，AcademicPress，紐約，1982，這兩篇文獻(xiàn)的全部內(nèi)容(包括附圖)在此并入本文用作參考。硫代吡喃鎓類似物可通過用硫化鈉處理吡喃鎓鹽制備。這類化合物具有下述性質(zhì)</tables>a在二氯甲烷中測得的光譜b在乙酸中測得的光譜實(shí)施例8萘醌甲基化物染料本發(fā)明還可使用萘醌甲基化物染料，并優(yōu)選具有下述結(jié)構(gòu)這類化合物可按下文所述采用下述文獻(xiàn)中所述的方法合成TheChemistryoftheQuinoidCompounds，ed.S.Patai.，Y.Kubo，F(xiàn).Mori，K.Yoshida，ChemistryLetters，1987，1761-1762，此文獻(xiàn)的全部內(nèi)容(包括附圖)在此并入本文用作參考。這類化合物具有下列性質(zhì)a在氯仿中測得的光譜PEG共軛物可按照上述途徑合成，其中R或′R＝PEG。實(shí)施例9咔嗪(carbazines)(也稱作9，10-二氫化吖啶)本發(fā)明還可使用咔嗪染料，它們包括下述文獻(xiàn)中所描述的那些HeterocyclicCompoundsVol.9“Acridines，”Ed.R.M.Acheson，JohnWileyandSons，Inc.，紐約，1973[該文獻(xiàn)的全部內(nèi)容(包括附圖)在此并入本文用作參考]。這類化合物優(yōu)選具有下述結(jié)構(gòu)這類化合物可按下所述合成在這些反應(yīng)中，一個(gè)或多個(gè)R基團(tuán)可以為PEG。實(shí)施例10非特異性結(jié)合試驗(yàn)長期以來，菁染料一直在照相法中用作增感劑。最近，含化學(xué)活性基團(tuán)的水溶性菁染料可以從市場上購得用作熒光標(biāo)記物。這些染料化合物之一，即Cy5.5在大約680nm處具有最大吸收，而其發(fā)射波長稍大于700nm。將1.7微摩爾濃度的Cy5.5樣品在異羥基洋地黃毒苷原探針稀釋物中保持72小時(shí)。經(jīng)過這段時(shí)間后，起始活性酯應(yīng)當(dāng)轉(zhuǎn)化成游離羧基形式。利用標(biāo)準(zhǔn)血清組樣品進(jìn)行非特異性結(jié)合試驗(yàn)，結(jié)果表明血清或血清成分對強(qiáng)度和偏振化作用具有顯著作用。這些作用表明，強(qiáng)度與濃度的關(guān)系為非線性函數(shù)關(guān)系(表I和II)，強(qiáng)度隨血清組分的種類和濃度的變化也為非線性函數(shù)關(guān)系(表III)，并且通過非特異性結(jié)合能夠提高偏振化作用。表I-Cy5.5/異羥基洋地黃毒苷原稀釋物濃度nM熒光強(qiáng)度毫偏振單位17041627982.817580613超出可讀度1.7150069129.00.1738842122.6表II-Cy5.5/TDX緩沖液1701074511-34.2171338283超出可讀度1.7150069129.00.1722280130.2表III-1.7nMCy5.5+添加劑添加劑強(qiáng)度毫偏振單位0.5％BSA665960285.55％Bov.Ser.555277260.10.25％BGG326543191.25％PHS608260282.95％PHS383004231.9雙活性酯可以與二異丙胺偶聯(lián)，而且這種形式可與受測血清結(jié)合。此試驗(yàn)應(yīng)當(dāng)表現(xiàn)出所期望的由Cy5.5制備的生物-探針的行為。異羥基洋地黃毒苷原探針可通過使雙-官能染料和過量3-氨基-3-脫氧洋地黃毒苷(DIG)反應(yīng)制備，結(jié)果每分子染料將結(jié)合兩分子洋地黃毒苷。然后對血清組樣品和抗異羥基洋地黃毒苷原進(jìn)行探針測試，以確定其作為異羥基洋地黃毒苷原探針的性質(zhì)。為抑制非特異性結(jié)合，正如在有關(guān)酞菁(如制備LaJolla藍(lán)中所用的那些酞菁)時(shí)我們通常所進(jìn)行的那樣，可以使Cy5.5偶聯(lián)聚乙二醇單甲醚(PEG)。如果使用這種雙活性形式，結(jié)果則是每分子染料可偶聯(lián)兩分子PEG。如果使用單活性形式染料，則僅能偶聯(lián)一個(gè)PEG，因此能夠獲得達(dá)到所需抑制程度所必需的PEG的量的技術(shù)情報(bào)。含有一分子洋地黃毒苷和一分子PEG的混雜分子可以按下所述制備首先使雙活性染料與限定量DIG反應(yīng)，得到一些單取代物，隨后再與過量PEG反應(yīng)，并通過高效液相色譜(HPLC)純化。實(shí)施例11非特異性結(jié)合與溶解性之間的關(guān)系非特異性結(jié)合和水溶性之間不一定存在并行關(guān)系，但代替的染料在水溶液中可以為單體形式，而且還顯示出強(qiáng)有力的非特異性結(jié)合。作為我們工作的實(shí)例，可以在pH8.0的磷酸鉀緩沖液中，測量加入不同濃度HSA時(shí)的瞬態(tài)熒光，據(jù)此可以計(jì)算出結(jié)構(gòu)如下式A所示的酞菁和人血清白蛋白(HSA)的結(jié)合常數(shù)。式A(未修飾的二羧基硅酞菁)在相同的緩沖液中，利用相同儀器對經(jīng)過化學(xué)修飾的式A染料進(jìn)行類似測量，其中對式A的修飾是在每一硅醇的OH基團(tuán)上連結(jié)聚乙二醇分子，從而得到LaJolla藍(lán)染料。測量結(jié)果見下表IV中所示。表IV在加或不加HSA條件下對式A染料和LaJolla藍(lán)進(jìn)行瞬態(tài)熒光強(qiáng)度和偏振化作用測定。在這兩種情況中，染料濃度為3.1E-10M.式A染料％HSA強(qiáng)度偏振化(mP)01646962.40.00210508063.50.0267714153.90.263672192.82.078321191.74.081328201.1LaJlooa藍(lán)0857431.30.002848874.80.028271818.10.28107320.82.05608535.84.07157371.8表IV中的數(shù)據(jù)可用于確定其中的染料為半游離和半結(jié)合狀態(tài)時(shí)HSA的濃度。對于未修飾染料和LaJolla藍(lán)，HSA的濃度分別為3.2E-7M和5.0E-4M，計(jì)算得到的結(jié)合常數(shù)分別為3E6和2E3M-1。也就是講，導(dǎo)入分子量為2000的PEG分子能夠降低非特異性結(jié)合常數(shù)1000倍。權(quán)利要求1.一種被可檢測標(biāo)記的標(biāo)志組分，該標(biāo)志組分包括(a)熒光團(tuán)部分，該熒光團(tuán)包括能發(fā)光的基本上為平面的分子結(jié)構(gòu)，并具有至少約500納米的激發(fā)波長；該熒光團(tuán)偶聯(lián)于(b)一個(gè)或多個(gè)聚氧烴基部分，與未與一個(gè)或多個(gè)聚氧烴基部分偶聯(lián)的未修飾熒光團(tuán)部分相比，其中所述標(biāo)志組分與血清組分的非特異性結(jié)合減少。2.根據(jù)權(quán)利要求1的標(biāo)志組分，其中所述熒光團(tuán)部分具有大約600至800納米的激發(fā)波長。3.根據(jù)權(quán)利要求2的標(biāo)志組分，其中所述熒光團(tuán)部分具有至少650納米的激發(fā)波長。4.根據(jù)權(quán)利要求1的標(biāo)志組分，其中所述標(biāo)志組分在有或無血清存在時(shí)具有與基本類似的強(qiáng)度、衰變時(shí)間和偏振組分相對強(qiáng)度。5.根據(jù)權(quán)利要求1的標(biāo)志組分，其中所述熒光團(tuán)部分本身的結(jié)合常數(shù)比完整標(biāo)志組分的至少大50倍。6.根據(jù)權(quán)利要求5的標(biāo)志組分，其中所述熒光團(tuán)部分本身的結(jié)合常數(shù)比完整標(biāo)志組分的至少大100倍。7.根據(jù)權(quán)利要求6的標(biāo)志組分，其中所述熒光團(tuán)部分本身的結(jié)合常數(shù)比完整標(biāo)志組分的至少大500倍。8.根據(jù)權(quán)利要求7的標(biāo)志組分，其中所述熒光團(tuán)部分本身的結(jié)合常數(shù)比完整標(biāo)志組分的至少大1000倍。9.根據(jù)權(quán)利要求1的標(biāo)志組分，其中所述熒光團(tuán)選自(1)芳端化多甲川染料；(2)醌型染料；(3)陰丹士林染料；(4)1，4-二氨基蒽醌-2，3-二甲酰胺類化合物；(5)四氨基蒽醌類化合物；(6)吖嗪染料；(7)吡喃鎓或硫代吡喃鎓染料；和(8)萘醌甲基化物。10.根據(jù)權(quán)利要求1的標(biāo)志組分，其中所述聚氧烴基部分選自聚醚、多元醇、水溶性糖類、水溶性糖類衍生物和水溶性聚合物。11.根據(jù)權(quán)利要求10的標(biāo)志組分，其中所述聚氧烴基部分包括聚乙二醇或聚乙二醇衍生物。12.根據(jù)權(quán)利要求11的標(biāo)志組分，其中各個(gè)所述聚氧烴基部分的分子量為大約200至大約20,000。13.根據(jù)權(quán)利要求12的標(biāo)志組分，其中各個(gè)所述聚氧烴基部分的分子量為2,000-20,000。14.根據(jù)權(quán)利要求13的標(biāo)志組分，其中各個(gè)所述聚氧烴基部分的分子量為4,000-15,000。15.根據(jù)權(quán)利要求14的標(biāo)志組分，其中各個(gè)所述聚氧烴基部分的分子量為8,000-10,000。16.根據(jù)權(quán)利要求1的標(biāo)志組分，該標(biāo)志組分在血清組分存在下在水溶液中的特征在于具有基本上與無血清情況下相同強(qiáng)度的平行和正交組分的瞬態(tài)熒光發(fā)射。17.根據(jù)權(quán)利要求9的標(biāo)志組分，其中所述熒光團(tuán)部分為芳端化多甲川染料。18.根據(jù)權(quán)利要求17的標(biāo)志組分，其中所述芳端化多甲川染料為三甲川染料。19.根據(jù)權(quán)利要求17的標(biāo)志組分，其中所述芳端化多甲川染料為五甲川染料。20.根據(jù)權(quán)利要求17的標(biāo)志組分，其中所述芳端化多甲川染料為七甲川染料。21.根據(jù)權(quán)利要求9的標(biāo)志組分，其中所述熒光團(tuán)部分為醌型染料。22.根據(jù)權(quán)利要求21的標(biāo)志組分，其中所述醌型染料為1-氨基-2-苯甲?；?4-(芳基氨基)蒽醌。23.根據(jù)權(quán)利要求9的標(biāo)志組分，其中所述醌型染料為6-(芳基氨基)萘并[2，3，c]-9，10-二氫化吖啶-5，8，14-三酮。24.根據(jù)權(quán)利要求9的標(biāo)志組分，其中所述熒光團(tuán)部分為陰丹士林染料。25.根據(jù)權(quán)利要求9的標(biāo)志組分，其中所述熒光團(tuán)部分為1，4-二氨基蒽醌-2，3-二甲酰胺。26.根據(jù)權(quán)利要求9的標(biāo)志組分，其中所述熒光團(tuán)部分為四氨基蒽醌。27.根據(jù)權(quán)利要求9的標(biāo)志組分，其中所述熒光團(tuán)部分為吖嗪染料。28.根據(jù)權(quán)利要求9的標(biāo)志組分，其中所述熒光團(tuán)部分為吡喃鎓或硫代吡喃鎓染料。29.根據(jù)權(quán)利要求9的標(biāo)志組分，其中所述熒光團(tuán)部分為萘醌甲基化物。30.根據(jù)權(quán)利要求9的標(biāo)志組分，其中所述熒光團(tuán)部分為咔嗪。31.根據(jù)權(quán)利要求1的標(biāo)志組分，其中所述熒光團(tuán)選自化合物(1)32221；(2)32222；(3)32223；(4)32224；和(5)32225。32.根據(jù)權(quán)利要求1的標(biāo)志組分，其中所述熒光團(tuán)選自化合物(1)35512；(2)35513；(3)35514；(4)35517；(5)35518；和(6)33519。33.根據(jù)權(quán)利要求1的標(biāo)志組分，其中所述熒光團(tuán)選自化合物(1)35523；(2)35524；(3)35525；(4)35526；(5)35527；(6)35528；(7)35529；和(8)35530。34.根據(jù)權(quán)利要求1的標(biāo)志組分，其中所述熒光團(tuán)選自化合物(1)35533；(2)35535；(3)35536；和(4)35538。35.根據(jù)權(quán)利要求1的標(biāo)志組分，其中所述熒光團(tuán)選自化合物(1)50024；(2)50025；和(3)50032。36.根據(jù)權(quán)利要求1的標(biāo)志組分，其中所述熒光團(tuán)選自化合物(1)62303；(2)62401；(3)62403a；(6)62403b；(5)62402；和(6)62411。37.根據(jù)權(quán)利要求1的標(biāo)志組分，其中所述熒光團(tuán)選自化合物(1)64102；(2)64104；(3)64106；(4)64303a；(5)64304；(6)64311；(7)64311；(8)64312；和(9)65212。38.根據(jù)權(quán)利要求1的標(biāo)志組分，其中所述熒光團(tuán)選自化合物(1)66001；(2)66002；(3)66004；(4)66005；(5)66008；(6)66009；(7)66013；(8)66014；(9)66015；和(10)66204。39.根據(jù)權(quán)利要求1的標(biāo)志組分，其中所述熒光團(tuán)選自化合物(1)66206；(2)66210；(3)67102；(4)67422；和(5)91002。全文摘要本發(fā)明提供了不聚集和不與血清結(jié)合的熒光染料。這些染料適合用于如熒光免疫測定,體內(nèi)成像和體內(nèi)腫瘤治療。本發(fā)明提供了熒光免疫測定方法,該方法使用不聚焦和不與血清結(jié)合的熒光染料。因而這類熒光免疫測定法特別適合于測定生物液體,如血清、血漿、全血和尿。本發(fā)明涉及含有連結(jié)有可檢測的標(biāo)記標(biāo)志組分的低聚核苷酸的組合物,其中標(biāo)記標(biāo)志組分包括熒光團(tuán)部分,該熒光團(tuán)部分則包括與中心原子配位的基本上為平面的大環(huán)多齒配體(該中心原子還能夠與兩個(gè)軸向配體配位)和兩個(gè)聚氧烴基部分,這兩個(gè)聚氧烴基部分連結(jié)在中心原子上作為軸向配體。本發(fā)明還涉及采用這類組合物進(jìn)行核酸雜化和擴(kuò)增的方法。文檔編號A61K47/48GK1198816SQ96196037公開日1998年11月11日申請日期1996年6月4日優(yōu)先權(quán)日1995年6月6日發(fā)明者W·B·丹德利凱爾,R·F·德夫林,P·O·G·阿爾亨尤斯,徐茂麟申請人:海珀里昂有限公司