本發(fā)明涉及益生菌，具體涉及一種治療陰道炎的益生菌組合物及其制備方法。

背景技術(shù)：

1、陰道感染是育齡期女性最常見的婦科感染性疾病，約占婦科門診患者50％，主要包括細菌性陰道炎(bacterial?vaginosis，bv)，外陰陰道假絲酵母菌病(vulvovaginalcandidiasis，vvc)，滴蟲陰道炎(trichomonal?vaginitis，tv)和需氧菌性陰道炎(aerobicvaginitis，av)。bv是由陰道內(nèi)優(yōu)勢乳桿菌減少或缺乏，厭氧菌(如陰道加德納菌、動彎桿菌、普雷沃菌及類桿菌等)及人型支原體等致病菌過度增殖所致的陰道感染，可通過性傳播，感染率在15％-30％，占陰道感染的40％-50％，是最常見的陰道炎。陰道加德納菌(gardnerellavaginalis)是公認的bv核心病原菌，能在95％-100％患者陰道中檢測到。bv患者的典型臨床癥狀包括陰道分泌物稀薄且有惡臭或魚腥味，外陰局部有瘙癢和灼熱感，陰道液ph高于4.5并出現(xiàn)大量線索細胞。與細菌性陰道炎相關(guān)的致病菌包括加德納氏菌、阿托波氏菌、普雷沃特氏菌、消化鏈球菌、移動桿菌等，無論它們是單獨作用還是相互作用，都與bv發(fā)展過程有關(guān)。

2、臨床上治療陰道炎主要以陰道灌洗和抗菌藥物應用結(jié)合治療為主，多采用咪唑類、鹽酸克林霉素和復方制劑等，但是，上述藥物會出現(xiàn)諸多的不良反應，導致病原菌耐藥性逐漸增強，具有復發(fā)率較高、內(nèi)環(huán)境微生態(tài)失衡和治療不徹底等缺點。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提出一種治療陰道炎的益生菌組合物及其制備方法，治療效果好，儲存穩(wěn)定性佳，具有較好的耐溫、耐濕性能，使用安全，無副作用，生物相容性好，不會產(chǎn)生耐藥性，有利于治療和預防陰道炎復發(fā)，具有廣闊的應用前景。

2、本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實現(xiàn)的：

3、本發(fā)明提供一種治療陰道炎的益生菌組合物的制備方法，將黃柏、金銀花、側(cè)柏葉水提取得到提取物，藥渣接種益生菌發(fā)酵，分離獲得抗菌肽、菌泥和發(fā)酵產(chǎn)物，抗菌肽制備抗菌肽-多糖復合物，菌泥通過酸溶殼層包埋制得酸溶載菌微膠囊，與抗菌肽-多糖復合物、提取物、益生元混合加入水凝膠中，制得治療陰道炎的益生菌組合物。

4、作為本發(fā)明的進一步改進，包括以下步驟：

5、s1.中藥提?。簩ⅫS柏、金銀花、側(cè)柏葉洗凈，加入水中，加熱沸騰提取，過濾，得到中藥渣，濾液干燥，得到提取物；

6、s2.培養(yǎng)基的制備：將步驟s1中制得的中藥渣、脫鹽乳清粉、葡萄糖、酵母浸粉加入水中，滅菌，制得培養(yǎng)基；

7、s3.益生菌的活化：將鼠李糖乳桿菌lryzu021、羅伊氏乳桿菌fphc2951、卷曲乳桿菌lcp051、格氏乳桿菌lg019分別接種至mrs肉湯培養(yǎng)基中，活化培養(yǎng)，制得菌種種子液；

8、s4.發(fā)酵：將步驟s3制得的鼠李糖乳桿菌lryzu021、羅伊氏乳桿菌fphc2951、卷曲乳桿菌lcp051、格氏乳桿菌lg019菌種種子液接種至步驟s2制得的培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)，過濾，收集菌泥，濾液超濾收集分子量在2-10kda的溶液，冷凍干燥，制得抗菌肽，剩余液體加入乙醇沉淀，過濾，洗滌，干燥，獲得復合多糖，濾液回收乙醇，冷凍干燥，制得發(fā)酵產(chǎn)物；

9、s5.抗菌肽-多糖復合物的制備：將步驟s4制得的抗菌肽溶于水中，加入n-羥基琥珀酰亞胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺，活化反應，加入步驟s4制得的復合多糖，加熱攪拌反應，透析，干燥，制得抗菌肽-多糖復合物；

10、s6.酸溶載菌微膠囊的制備：將羧甲基殼聚糖、明膠加入水中，加熱溶解，加入單寧酸、卵磷脂和步驟s4制得的菌泥，分散均勻，滴加入魚油中，乳化，調(diào)節(jié)溶液ph值，攪拌反應，冷凍干燥，制得酸溶載菌微膠囊；

11、s7.治療陰道炎的益生菌組合物的制備：將海藻酸鈉、菊粉、阿拉伯糖加入水中，加入檸檬酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺和n-羥基琥珀酰亞胺，攪拌反應，加入絲素蛋白肽，加熱攪拌反應，然后加入步驟s1制得的提取物、步驟s4制得的發(fā)酵產(chǎn)物、步驟s5制得的抗菌肽-多糖復合物、步驟s6制得的酸溶載菌微膠囊，攪拌混合均勻，制得治療陰道炎的益生菌組合物。

12、作為本發(fā)明的進一步改進，步驟s1中所述黃柏、金銀花、側(cè)柏葉的質(zhì)量比為5-7:1-2:4-6，所述加熱沸騰提取的時間為3-5h；步驟s2中所述中藥渣、脫鹽乳清粉、葡萄糖、酵母浸粉、水的質(zhì)量比為15-20:5-7:10-12:3-5:200-300。

13、作為本發(fā)明的進一步改進，步驟s3中所述活化培養(yǎng)的條件為無氧條件下，36-38℃，100-200r/min，培養(yǎng)18-24h，所述菌種種子液的含菌量為108-109cfu/ml。

14、作為本發(fā)明的進一步改進，步驟s4中所述鼠李糖乳桿菌lryzu021、羅伊氏乳桿菌fphc2951、卷曲乳桿菌lcp051、格氏乳桿菌lg019菌種種子液的接種量分別為1-2v/v％、2-4v/v％、2-3v/v％、2-3v/v％，所述發(fā)酵培養(yǎng)的條件為無氧條件下，36-38℃，100-200r/min，發(fā)酵培養(yǎng)50-56h。

15、作為本發(fā)明的進一步改進，步驟s5中所述抗菌肽、n-羥基琥珀酰亞胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺和復合多糖的質(zhì)量比為10-12:4-7:5-8:12-15，所述活化反應的溫度為0-4℃，時間為30-40min，所述加熱攪拌反應的溫度為50-60℃，時間為4-6h。

16、作為本發(fā)明的進一步改進，步驟s6中所述羧甲基殼聚糖、明膠、單寧酸、卵磷脂、菌泥、水、魚油的質(zhì)量比為12-15:7-10:4-6:0.5-1:20-25:200-250:500，所述調(diào)節(jié)溶液ph值為8.4-8.6，所述攪拌反應的時間為30-60min。

17、作為本發(fā)明的進一步改進，步驟s7中所述海藻酸鈉、菊粉、阿拉伯糖、檸檬酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺、n-羥基琥珀酰亞胺、絲素蛋白肽、提取物、發(fā)酵產(chǎn)物、抗菌肽-多糖復合物、酸溶載菌微膠囊的質(zhì)量比為15-20:3-5:2-3:3-4:4-6:4-6:6-9:4-6:5-7:2-3:7-10，所述加熱攪拌反應的溫度為70-80℃，時間為4-5h。

18、作為本發(fā)明的進一步改進，具體包括以下步驟：

19、s1.中藥提?。簩?-7重量份黃柏、1-2重量份金銀花、4-6重量份側(cè)柏葉洗凈，加入100重量份水中，加熱沸騰提取3-5h，過濾，得到中藥渣，濾液干燥，得到提取物；

20、s2.培養(yǎng)基的制備：將15-20重量份步驟s1中制得的中藥渣、5-7重量份脫鹽乳清粉、10-12重量份葡萄糖、3-5重量份酵母浸粉加入200-300重量份水中，滅菌，制得培養(yǎng)基；

21、s3.益生菌的活化：將鼠李糖乳桿菌lryzu021、羅伊氏乳桿菌fphc2951、卷曲乳桿菌lcp051、格氏乳桿菌lg019分別接種至mrs肉湯培養(yǎng)基中，無氧條件下，36-38℃，活化培養(yǎng)18-24h，制得含菌量為108-109cfu/ml的菌種種子液；

22、s4.發(fā)酵：將步驟s3制得的鼠李糖乳桿菌lryzu021、羅伊氏乳桿菌fphc2951、卷曲乳桿菌lcp051、格氏乳桿菌lg019菌種種子液接種至步驟s2制得的培養(yǎng)基中，接種量分別為1-2v/v％、2-4v/v％、2-3v/v％、2-3v/v％，無氧條件下，36-38℃，100-200r/min，發(fā)酵培養(yǎng)50-56h，過濾，收集菌泥，濾液超濾收集分子量在2-10kda的溶液，冷凍干燥，制得抗菌肽，剩余液體加入乙醇至體系乙醇含量為80-85wt％，沉淀1-2h，過濾，洗滌，干燥，獲得復合多糖，濾液回收乙醇，冷凍干燥，制得發(fā)酵產(chǎn)物；

23、s5.抗菌肽-多糖復合物的制備：將10-12重量份步驟s4制得的抗菌肽溶于200重量份水中，加入4-7重量份n-羥基琥珀酰亞胺和5-8重量份1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺，活化反應，加入12-15重量份步驟s4制得的復合多糖，加熱至50-60℃，攪拌反應4-6h，透析，干燥，制得抗菌肽-多糖復合物；

24、s6.酸溶載菌微膠囊的制備：將12-15重量份羧甲基殼聚糖、7-10重量份明膠加入200-250重量份水中，加熱至50-60℃，攪拌溶解，加入4-6重量份單寧酸、0.5-1重量份卵磷脂和20-25重量份步驟s4制得的菌泥，分散均勻，滴加入500重量份魚油中，乳化，調(diào)節(jié)溶液ph值為8.4-8.6，攪拌反應30-60min，冷凍干燥，制得酸溶載菌微膠囊；

25、s7.治療陰道炎的益生菌組合物的制備：將15-20重量份海藻酸鈉、3-5重量份菊粉、2-3重量份阿拉伯糖加入200重量份水中，加入3-4重量份檸檬酸、4-6重量份1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺和4-6重量份n-羥基琥珀酰亞胺，0-4℃攪拌反應20-40min，加入6-9重量份絲素蛋白肽，加熱至70-80℃，攪拌反應4-5h，然后加入4-6重量份步驟s1制得的提取物、5-7重量份步驟s4制得的發(fā)酵產(chǎn)物、2-3重量份步驟s5制得的抗菌肽-多糖復合物、7-10重量份步驟s6制得的酸溶載菌微膠囊，攪拌混合均勻，冷凍干燥，制得治療陰道炎的益生菌組合物。

26、本發(fā)明進一步保護一種上述的制備方法制得的治療陰道炎的益生菌組合物。

27、本發(fā)明具有如下有益效果：

28、乳桿菌是陰道中的優(yōu)勢菌，可以通過競爭黏附，降低陰道ph值，產(chǎn)生過氧化氫、細菌素和表面活性劑等抑制劑以及刺激局部免疫系統(tǒng)等多種機制來維持陰道微生態(tài)平衡，從而有利于乳桿菌的生長，抑制病原體的生長。

29、本發(fā)明添加的益生菌組合物直接作用于陰道，發(fā)揮保護機制。

30、其中，鼠李糖乳桿菌lryzu021通過將糖原代謝為乳酸，降低陰道ph值。正常情況下陰道內(nèi)ph值低于或等于4.5，陰道的低ph能保護其免受病原體侵襲。

31、羅伊氏乳桿菌fphc2951產(chǎn)生包括過氧化氫和細菌素在內(nèi)的抗菌因子，對過氧化氫酶陰性的細菌(如大多數(shù)厭氧微生物)具有毒性，細菌素形成細胞質(zhì)膜孔、干擾細胞酶反應(如細胞壁合成)和核酸酶活性，并能抑制金黃色葡萄球菌、克雷伯菌和大腸埃希菌等病原體的生長。

32、卷曲乳桿菌lcp051能夠產(chǎn)生表面活性物質(zhì)，包括肽聚糖、磷脂酸、細菌性多糖和生物表面活性劑等，直接黏附于上皮細胞和黏膜層的模式識別受體來介導宿主的生理反應，通過抗生物膜、抗氧化、抗病毒、抑制病原體和免疫調(diào)節(jié)作用對病原菌的黏附和定植產(chǎn)生抑制作用。

33、格氏乳桿菌lg019及其代謝產(chǎn)物刺激陰道上皮細胞的免疫功能，通過產(chǎn)生黏蛋白、免疫球蛋白(分泌性iga和igg)、分泌型白細胞蛋白酶抑制劑、中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)沉積蛋白、白介素-1受體拮抗劑、β-防御素和其他抗菌蛋白，抑制促炎介質(zhì)如il-6、il-8和腫瘤壞死因子α來抑制致病菌的生長和繁殖。多種乳桿菌能夠黏附和競爭陰道上皮黏附位點的能力，參與抑制病原體的定植，通過占據(jù)或掩蓋(通過空間阻礙)其在黏膜上的潛在結(jié)合位點，阻礙病原菌在黏膜上的定植，從而起到治療陰道炎、改善陰道炎的癥狀的效果。

34、不同乳桿菌的黏膜定植或拮抗微生物能力不同，本發(fā)明四中乳桿菌協(xié)同作用，能黏附于人類上皮細胞，產(chǎn)生過氧化氫，對陰道加德納菌和外陰陰道假絲酵母具有抗菌活性以及與病原體的共聚集。

35、黃柏、金銀花、側(cè)柏葉中含有很好的抗菌類黃酮、三萜等成分，大大提高了對細菌引起的陰道炎的治療效果。進一步經(jīng)過將中藥渣進行發(fā)酵，促進益生菌增殖，并獲得了含有更多抗菌活性物質(zhì)的發(fā)酵產(chǎn)物。

36、經(jīng)過超濾分離了分子量在2-10kda的抗菌肽，剩余活性產(chǎn)物分離復合多糖，濾液冷凍干燥得到發(fā)酵產(chǎn)物，同樣也具有很好的抗菌活性，抗菌肽經(jīng)過活化與復合多糖偶聯(lián)，制得了抗菌肽-多糖復合物，抗菌性、抗病毒性顯著提高，能夠催化病毒發(fā)生氧化應激反應，導致病毒死亡，對陰道滴蟲也有很好的殺死效果。

37、本發(fā)明將羧甲基殼聚糖、明膠與單寧酸反應，單寧酸具有獨特的多酚羥基結(jié)構(gòu)，明膠分子鏈上具有豐富的氨基酸殘基，兩種分子之間能夠形成多點氫鍵；同時，單寧酸上的酚羥基容易被氧化成醌類化合物，能夠與明膠鏈段的氨基形成席夫堿鍵，由于形成的席夫堿鍵是動態(tài)共價鍵，具有ph響應性，使得該微膠囊在中性環(huán)境中能夠貯藏完好，提高益生菌的存活率。該微膠囊加入凝膠體結(jié)構(gòu)中，凝膠的結(jié)構(gòu)能夠保護微膠囊通過胃部環(huán)境，使得微膠囊能在陰道的酸性環(huán)境中破裂，達到控制釋放益生菌的目的。將益生元加入凝膠原料中，一方面能促進凝膠的形成，另一方面益生元也能夠為益生菌提供原料，促進益生菌的增殖生長，有助于在陰道環(huán)境中發(fā)揮抑制致病菌的作用，更好的起到治療陰道炎的效果。

38、本發(fā)明制得的治療陰道炎的益生菌組合物治療效果好，儲存穩(wěn)定性佳，具有較好的耐溫、耐濕性能，使用安全，無副作用，生物相容性好，不會產(chǎn)生耐藥性，有利于治療和預防陰道炎復發(fā)，具有廣闊的應用前景。