本發(fā)明涉及d-色氨酸在抑制銅綠假單胞菌生物被膜形成中的應(yīng)用，屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

d-色氨酸(d-tryptophan，d-trp)是一種淺褐色的晶體，分子式是c11h12n2o2，分子量204.23g/mol，熔點(diǎn)是282-285℃。d-色氨酸的分子結(jié)構(gòu)圖如圖1所示。有研究證明d-色氨酸一定程度能分散多種細(xì)菌，包括枯草芽孢桿菌，金黃色葡萄球菌等細(xì)菌的生物被膜。

銅綠假單胞菌(pseudomonasaeruginosa，pa)是臨床常見的多重耐藥菌，生物被膜(biofilm,bf)的形成是主要的耐藥機(jī)制之一，延緩及抑制生物被膜的形成的我們亟待解決的問題。細(xì)菌生物被膜是指細(xì)菌附著在物體的表面，隨后分泌胞外多糖，蛋白質(zhì)，脂質(zhì)，胞外dna等組成胞外聚合物，將自身微菌落包裹其中形成的細(xì)菌聚集體膜狀物。

銅綠假單胞菌生物被膜的形成是一個(gè)由多系統(tǒng)參與的復(fù)雜的過程，其中群體感應(yīng)系統(tǒng)占主導(dǎo)地位。las系統(tǒng)和rhl系統(tǒng)是主要的群體感應(yīng)系統(tǒng)，主要成分分別由rhli、rhlr和lasi、lasr編碼產(chǎn)生。大致形成過程如下:起初，細(xì)菌的粘附是可逆的(0-2h)，隨著越來(lái)越多的細(xì)菌粘附在物體表面，可逆性粘附逐漸轉(zhuǎn)變成不可逆粘附(2-8h)，細(xì)菌不斷分泌蛋白質(zhì)，脂質(zhì)、胞外多糖、edna，逐漸從微菌落的聚集演變形成一個(gè)成熟的三維蘑菇狀bf結(jié)構(gòu)(5days)。

自然界和醫(yī)療設(shè)備中普遍存在著細(xì)菌生物被膜，銅綠假單胞菌有極強(qiáng)的生物被膜形成能力，生物被膜的產(chǎn)生可引起致病菌耐藥性的增加，與浮游菌相比，產(chǎn)生物被膜的細(xì)菌耐藥力可提高10-1000倍。生物被膜產(chǎn)生耐藥的機(jī)制主要包括滲透限制、營(yíng)養(yǎng)限制、特定耐藥基因的表達(dá)、外排泵激活、耐藥株細(xì)胞的產(chǎn)生等。同時(shí)生物被膜可使細(xì)菌產(chǎn)生免疫逃避，常規(guī)的治療難以根除細(xì)菌生物被膜，繼而導(dǎo)致慢性感染及耐藥菌的產(chǎn)生。其中銅綠假單胞菌生物被膜相關(guān)的感染有導(dǎo)管相關(guān)性感染(包括導(dǎo)尿管、氣管插管、深靜脈置管等)、囊性纖維化肺部感染、隱形眼鏡相關(guān)角膜炎、創(chuàng)面慢性感染等，為臨床治療帶來(lái)了極大困擾。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一，是提供d-色氨酸在抑制銅綠假單胞菌早期生物被膜形成中的應(yīng)用。d-色氨酸可有效抑制銅綠假單胞菌早期生物被膜的形成，且d-色氨酸的起效濃度低，毒副作用小，這將為臨床上治療銅綠假單胞菌感染性疾病提供新的有效途徑，爭(zhēng)取更多的治療時(shí)間。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下：d-色氨酸在抑制銅綠假單胞菌生物被膜形成中的應(yīng)用。

本發(fā)明的申請(qǐng)人經(jīng)過d-色氨酸作用銅綠假單胞菌24小時(shí)內(nèi)的抗菌效果試驗(yàn)、d-色氨酸對(duì)銅綠假單胞菌生物被膜形成早期細(xì)菌的不可逆粘附的影響試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，d-色氨酸對(duì)銅綠假單胞菌生物被膜形成早期的細(xì)菌粘附抑制率：d-色氨酸濃度為5mm時(shí)的抑制率>35％，d-色氨酸濃度為10mm時(shí)的抑制率>65％。由此可見，d-色氨酸可有效抑制銅綠假單胞菌生物被膜的形成，這將為臨床上治療銅綠假單胞菌感染性疾病提供新的有效途徑，爭(zhēng)取更多的治療時(shí)間銅綠假單胞菌的感染。

本發(fā)明的目的之二，是提供一種輔助抗銅綠假單胞菌的藥物。d-色氨酸可用于輔助抗銅綠假單胞菌的藥物中，可以廣泛應(yīng)用于創(chuàng)傷、燒傷、供皮區(qū)以及其它的銅綠假單胞菌感染治療，且安全性高，應(yīng)用人群廣。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下：一種輔助抗銅綠假單胞菌的藥物，所述藥物中含有d-色氨酸。

在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本發(fā)明還可以做如下改進(jìn)。

進(jìn)一步，所述藥物的劑型為乳劑、膏劑或溶液劑。

采用上述進(jìn)一步的有益效果是：將d-色氨酸制成更多劑型，并應(yīng)用在醫(yī)用材料上，能更廣泛的發(fā)揮d-色氨酸抑制銅綠假單胞菌早期生物被膜的抑制作用，尤其是配伍臨床抗生素使用，對(duì)銅綠假單胞菌感染有更優(yōu)選的治療。

本發(fā)明的有益效果是：

1.d-色氨酸可有效抑制銅綠假單胞菌早期生物被膜的形成，這將為臨床上治療銅綠假單胞菌感染性疾病提供新的有效途徑。

2.d-色氨酸可以有效減少銅綠假單胞菌感染后細(xì)菌的早期粘附，延緩生物被膜的形成，為臨床爭(zhēng)取更多的最佳用藥時(shí)間。

3.d-色氨酸對(duì)銅綠假單胞菌生物被膜形成早期的細(xì)菌粘附抑制率：d-色氨酸濃度為5mm時(shí)的抑制率>35％，d-色氨酸濃度為10mm時(shí)的抑制率>65％。

4.d-色氨酸可用于輔助抗銅綠假單胞菌的藥物中，可以廣泛應(yīng)用于創(chuàng)傷、燒傷、供皮區(qū)以及其它的銅綠假單胞菌感染治療，且起效劑量小，安全性高，應(yīng)用人群廣。

附圖說明

圖1是本發(fā)明d-色氨酸的分子結(jié)構(gòu)圖。

圖2是本發(fā)明d-色氨酸對(duì)銅綠假單胞菌pao1生物被膜形成早期的抑制作用。

圖3是本發(fā)明d-色氨酸作用銅綠假單胞菌pao124小時(shí)內(nèi)的抗菌效果。

圖4是本發(fā)明d-色氨酸對(duì)銅綠假單胞菌pao1中rhli、rhlr、lasi、lasr基因表達(dá)的影響。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合具體附圖對(duì)本發(fā)明的原理和特征進(jìn)行描述，所舉實(shí)例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1：d-色氨酸作用銅綠假單胞菌24小時(shí)內(nèi)的抗菌效果

本發(fā)明用研究常用的銅綠假單胞菌pao1為實(shí)驗(yàn)菌株，首先測(cè)定0-10mmd-色氨酸作用pao124小時(shí)內(nèi)的抗菌效果。先將pao1菌種保存管從-80℃取出，接種至lb固體培養(yǎng)基(氯化鈉10g、蛋白胨10g、酵母提取物5g、瓊脂粉15g，加超純水定容至1000ml，經(jīng)121℃高壓滅菌30min)，37℃培養(yǎng)24h，將菌株復(fù)蘇；挑取1mm²大小的單克隆菌落至含有4mllb液體培養(yǎng)基，放在恒溫培養(yǎng)箱，37℃，200rpm培養(yǎng)6-8h至細(xì)菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；各取含0、0.1、1、10mmd-色氨酸的lb液體培養(yǎng)基100ml于干凈的250ml錐形瓶，加入對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)期的pao1菌液，調(diào)節(jié)至0.05麥?zhǔn)蠞岫?；將錐形瓶放在37℃恒溫培養(yǎng)箱，150rpm培養(yǎng)24h，每2h用移液器吸取1ml菌液于1.5mlep管中，1000rpm離心5min后棄液用1ml無(wú)菌生理鹽水重懸，取200μl洗滌去除培養(yǎng)基后的菌液于96孔板中；酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)600nm處的吸光值，記錄od600，結(jié)果見圖3，發(fā)現(xiàn)24小時(shí)內(nèi)，10mm以下的d-色氨酸對(duì)pao1無(wú)明顯抗菌效果。

實(shí)施例2：d-色氨酸對(duì)銅綠假單胞菌生物被膜形成早期細(xì)菌的不可逆粘附的影響

2-1取-80℃保存的銅綠假單胞菌pao1，接種于lb固體培養(yǎng)基，37℃倒置過夜培養(yǎng)；次日挑取單菌落至含4mllb液體培養(yǎng)基的試管中，37℃，200rpm振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期(5-7h)；用新鮮配制的20％lb液體培養(yǎng)基將細(xì)菌調(diào)至0.5麥?zhǔn)蠞岫?；用新鮮配制的20％lb液體培養(yǎng)基溶d-色氨酸分別至0.1、1、5、10mm，過濾備用；在96孔板中建立體外生物被膜，在對(duì)照孔及中加入180μl20％lb，實(shí)驗(yàn)孔中加入180μl含0.1、1、5、10mmd-色氨酸的20％lb液體培養(yǎng)，每組3個(gè)復(fù)孔，將96孔板靜置放于恒溫培養(yǎng)箱，37℃培養(yǎng)6h；棄去各孔培養(yǎng)基后，用超純水洗滌96孔板洗去游離菌，洗3遍，自然風(fēng)干；每孔加150μl0.1％結(jié)晶紫染液，15min后吸去染液，用超純水洗滌3遍洗去未結(jié)合的結(jié)晶紫，自然風(fēng)干；每孔加200μl95％乙醇脫色30min；脫色完全后，用酶標(biāo)儀檢測(cè)od590。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。生物被膜培養(yǎng)6小時(shí)為生物被膜形成早期的細(xì)菌不可以粘附階段，d-色氨酸對(duì)銅綠假單胞菌pao1該階段的細(xì)菌粘附有抑制作用，而且隨著d-色氨酸濃度的的增加，抑制作用也隨之增高，d-色氨酸濃度為5mm時(shí)的抑制率>35％，10mm時(shí)的抑制率>65％。

2-2將銅綠假單胞菌pao1按2-1中步驟培養(yǎng)6小時(shí)后，收集各組菌液后離心。所得沉淀按照rneasyminikit提取試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)操作流程提取各組的rna，測(cè)定各組rna濃度后，按體系配比(20μl體系：primescriptrtmastermix4μl、cdna1μg、超純水添至20μl)進(jìn)行cdna逆轉(zhuǎn)錄。經(jīng)普通pcr驗(yàn)證cdna能擴(kuò)增生物被膜形成相關(guān)基因lasi、lasr、rhli、rhlr(具體引物序列見表1)，下一步進(jìn)行熒光定量pcr。配制20μl體系包括：premixextorqⅱ10μl，上下游引物各0.8μl，cdna稀釋10倍后取2μl，超純水6.4μl。反應(yīng)條件為：95℃5s，(95℃5s，61℃30s，72℃20s)×40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物用管家基因rpsl的量歸一化后再進(jìn)行比較，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。結(jié)果見圖3。lasi、lasr、rhli、rhlr這四個(gè)基因是銅綠假單胞菌形成生物被膜的主要調(diào)控基因，如圖4所示，不同濃度的d-色氨酸對(duì)這4個(gè)基因的表達(dá)均有一定的抑制作用，與2-1中結(jié)果相一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了d-色氨酸對(duì)銅綠及單胞菌生物被膜形成早期的抑制作用。

表1pcr相關(guān)引物匯總表

由此可見，d-色氨酸可有效抑制銅綠假單胞菌早期生物被膜的形成。

實(shí)施例3

一種輔助抗銅綠假單胞菌的藥物，所述藥物中含有d-色氨酸。

所述藥物的劑型為乳劑、膏劑或溶液劑。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。