本發(fā)明屬于藥物制劑
技術(shù)領(lǐng)域：
：，具體涉及一種定向酶促反應(yīng)系統(tǒng)及其在制備小分子水凝膠遞藥系統(tǒng)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：：基于小分子模塊自組裝的水凝膠因其優(yōu)異的生物相容性、可降解性、低毒性以及較低的臨界成膠濃度（約0.01%~1%），作為一種新型納米軟材料，在組織工程、再生醫(yī)學(xué)以及藥物緩控釋系統(tǒng)等方面均有廣闊的應(yīng)用前景[1,2]。小分子水凝膠是由水凝膠因子（分子量<2000）的親水基團(tuán)和疏水基團(tuán)通過非共價相互作用發(fā)生有序排列，自發(fā)聚集形成特定結(jié)構(gòu)的聚集體。與聚合物凝膠不同，小分子水凝膠中線型、纖維狀、帶狀三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的纖維間和纖維內(nèi)部均靠非共價鍵連接，因而小分子水凝膠具有可注射性，在體外條件下即可制備并同時實(shí)現(xiàn)對藥物的包載，從而有效降低原位凝膠在體內(nèi)成膠過程中的藥物突釋[3,4]。以蛋白的基本組成單位、生物小分子氨基酸及其衍生物作為凝膠因子形成的寡肽小分子水凝膠為生物大分子蛋白藥物提供了理想的載體平臺。這種全部由生物分子構(gòu)成的遞藥系統(tǒng)具有優(yōu)異的生物相容性和生物降解性，安全、無毒。而且寡肽小分子水凝膠包載蛋白是基于生物小分子與生物大分子之間的作用，因而具有很好的相容性，可實(shí)現(xiàn)蛋白的高包載量，具有提高蛋白穩(wěn)定性的特點(diǎn)，并可降低藥物的突釋效應(yīng)，維持更長的治療效果。利用酶的催化反應(yīng)使水凝膠前體轉(zhuǎn)變成能夠自組裝的水凝膠因子，啟動自組裝形成水凝膠[5]。相對于ph和溫度觸發(fā)的膠體反應(yīng)條件劇烈、對蛋白藥物生物活性的影響較大[6]，酶促法更加溫和，能更好的保持蛋白藥物的活性[7,8]。并且酶促自組裝具有更好的生物相容性與時空可控性。酶催化水凝膠前體形成水凝膠因子的方式可分為兩類，如圖1所示：①酰胺鍵合成：通過酶催化鍵的形成，從而偶聯(lián)兩個水凝膠前體形成具有自組裝能力的水凝膠因子[7]；②酰胺鍵斷裂：在水凝膠因子上連接親水基團(tuán)形成水溶性佳的水凝膠前體，通過酶催化去除親水基團(tuán)后前體分子從而轉(zhuǎn)為水凝膠因子[9]。參考文獻(xiàn)：[1]silvaga,czeislerc,niecekl,beniashe,harringtonda,kesslerja,etal.selectivedifferentiationofneuralprogenitorcellsbyhigh-epitopedensitynanofibers.science2004;303:1352-1355.[2]tianr,chenj,niur.thedevelopmentoflow-molecularweighthydrogelsforapplicationsincancertherapy.nanoscale2014;6:3474-3482.[3]brancomc,pochandj,wagnernj,schneiderjp.theeffectofproteinstructureontheircontrolledreleasefromaninjectablepeptidehydrogel.biomaterials2010;31:9527-9534.[4]yangzm,wangl,gaop,wangjy,xub.introductionofphenylgrouponnanofibersconferssupramolecularhydrogelswithhighelasticityandrapidrecoveryproperties.j.mater.chem.2010;20:2128-2132.[5]yangz,liangg,xub.enzymatichydrogelationofsmallmolecules.acc.chem.res.2008;41:315-326.[6]mengerfm,carankl.anatomyofagel.aminoacidderivativesthatrigidifywateratsubmillimolarconcentrations.j.am.chem.soc.2000;122:11679-11691.[7]williamsrj,smitham,collinsr,hodsonn,dasak,ulijnrv.enzyme-assistedself-assemblyunderthermodynamiccontrol.nat.nanotechnol.2009;4:19-24.[8]williamsrj,hallte,glattauerv,whitej,pasicpj,sorensenab,etal.theinvivoperformanceofanenzyme-assistedself-assembledpeptide/proteinhydrogel.biomaterials2011;32:5304-5310.[9]yangzm,guhw,fudg,gaop,lamk,andxub.enzymaticformationofsupramolecularhydrogels.advmater.2004;16:1440.技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：解決的技術(shù)問題：本發(fā)明的目的是解決蛋白酶在催化氨基酸類水凝膠前體偶聯(lián)或斷鍵轉(zhuǎn)變成水凝膠因子從而啟動自組裝形成小分子水凝膠過程中會導(dǎo)致蛋白藥物發(fā)生降解的技術(shù)問題，提供一種定向酶促反應(yīng)系統(tǒng)及其應(yīng)用，該定向酶促反應(yīng)系統(tǒng)不僅保留了觸發(fā)小分子水凝膠合成的能力，同時形成空間位阻避免了對蛋白藥物的降解。技術(shù)方案：定向酶促反應(yīng)系統(tǒng)，由酶和包載在酶外部的包載材料制成，所述包載材料在所述酶外部形成納米網(wǎng)殼，該納米網(wǎng)殼只允許水凝膠前體與水凝膠因子自由出入。進(jìn)一步地，所述酶和所述包載材料的重量比為1:10-10:1。進(jìn)一步地，所述酶為作用于酰胺鍵的蛋白酶，可以促進(jìn)酰胺鍵的形成或斷鍵使不具有自組裝能力的水凝膠前體轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂凶越M裝成水凝膠能力的水凝膠因子。進(jìn)一步地，所述包載材料為可發(fā)生自由基聚合反應(yīng)的單體材料或可發(fā)生自由基聚合反應(yīng)的聚合物衍生物。上述定向酶促反應(yīng)系統(tǒng)的制備方法，先將酶溶解在緩沖液中，再加入包載材料，通過引發(fā)劑觸發(fā)自由基聚合反應(yīng)，得到定向酶促反應(yīng)系統(tǒng)。上述定向酶促反應(yīng)系統(tǒng)在制備小分子水凝膠中的應(yīng)用。小分子水凝膠遞藥系統(tǒng)，其特征在于：由權(quán)利要求1所述的定向酶促反應(yīng)系統(tǒng)、水凝膠前體和蛋白藥物制成。進(jìn)一步地，所述水凝膠前體通過酶促反應(yīng)生成凝膠因子，水凝膠因子為具有親水基團(tuán)或疏水基團(tuán)、能通過非共價相互作用發(fā)生有序排列自發(fā)聚集形成聚集體的寡肽或寡肽衍生物。進(jìn)一步地，所述蛋白藥物選自多肽、蛋白、酶、激素、疫苗、細(xì)胞生長因子或單克隆抗體中的一種。有益效果：本發(fā)明的定向酶促反應(yīng)系統(tǒng)保留了觸發(fā)小分子水凝膠合成的能力，只允許水凝膠前體與水凝膠因子自由出入酶口袋，并同時提供空間位阻，阻止大分子蛋白藥物靠近酶口袋，從而避免被降解。附圖說明圖1為酶催化水凝膠前體形成水凝膠因子的作用機(jī)制示意圖；圖2為本發(fā)明的定向酶促反應(yīng)系統(tǒng)的作用機(jī)制示意圖；圖3為實(shí)施例1的定向酶促反應(yīng)系統(tǒng)的透射電鏡圖；圖4為實(shí)施例1中trail的生物活性統(tǒng)計(jì)圖；圖5為實(shí)施例1的小分子水凝膠掃描電鏡圖；圖6為實(shí)施例1的小分子水凝膠透射電鏡圖；圖7為實(shí)施例1的載藥小分子水凝膠的體外釋放結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖。具體實(shí)施方式以下實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改和替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。蛋白酶作為一類作用于肽鍵的酶，既能催化蛋白的水解反應(yīng)，也能催化其逆反應(yīng)—肽鍵的合成反應(yīng)，并且具備高效的催化活性和高度專一性。一些蛋白酶已被證明可以催化特定的水凝膠前體偶聯(lián)[7]或脫去親水基團(tuán)[9]轉(zhuǎn)變?yōu)樗z因子，進(jìn)而形成小分子水凝膠。相對于物理化學(xué)刺激如ph和溫度等觸發(fā)的膠體反應(yīng)條件劇烈、對蛋白藥物生物活性影響較大，酶促法更加溫和，能更好的保持蛋白藥物的活性。鑒于水凝膠前體和蛋白藥物分子量之間的巨大差異，本發(fā)明設(shè)計(jì)在蛋白酶的表面修飾納米網(wǎng)殼，構(gòu)成定向酶促反應(yīng)系統(tǒng)；該納米網(wǎng)殼只允許小分子的水凝膠前體與水凝膠因子自由出入蛋白酶口袋，并同時提供空間位阻，阻止大分子的蛋白藥物靠近蛋白酶口袋，從而避免被降解。如圖2所示，本發(fā)明提供的定向酶促反應(yīng)系統(tǒng)，由酶及將酶包載在所述定向酶促反應(yīng)系統(tǒng)中的包載材料制成，具體地，先將酶溶解在緩沖液中，再加入包載材料，通過引發(fā)劑觸發(fā)自由基聚合反應(yīng)，得到定向酶促反應(yīng)系統(tǒng)，所述酶和包載材料的重量比為1:10-10:1。作為上述的蛋白酶，只要能夠發(fā)揮催化水凝膠前體偶聯(lián)或脫去親水基團(tuán)后形成水凝膠因子的目的即可，沒有特別限定，可以舉出：嗜熱蛋白酶、wq9-2、基質(zhì)金屬蛋白酶、磷酸酯酶等。作為上述的包載材料，可以為自由基聚合可反應(yīng)性的單體材料，具體為丙烯酰胺、n-（3-氨基丙基）甲基丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺等，或可發(fā)生自由基聚合反應(yīng)的聚合物衍生物，聚合物可以為天然聚合物、半合成聚合物或合成聚合物，具體為透明質(zhì)酸、殼聚糖、右旋糖苷、海藻酸鈉、聚乙二醇、聚乙二醇-聚乳酸聚合物等。本發(fā)明還提供了一種小分子水凝膠載藥系統(tǒng)，由定向酶促反應(yīng)系統(tǒng)和水凝膠前體制成。所述的水凝膠前體通過酶促反應(yīng)生成水凝膠因子，水凝膠因子為具有親水基團(tuán)和疏水基團(tuán)、可通過非共價相互作用發(fā)生有序排列從而自發(fā)聚集形成特定結(jié)構(gòu)的聚集體的寡肽（2-20個氨基酸）或寡肽衍生物，如fmoc、nap、boc、cap等氨基酸保護(hù)基團(tuán)、人工氨基酸、維生素、抗氧化劑、抗生素、抗瘤劑、抗真菌劑、抗寄生物分子等修飾的寡肽衍生物。上述小分子水凝膠載藥系統(tǒng)可以遞送蛋白藥物，包括多肽、蛋白、酶、激素、疫苗、細(xì)胞生長因子及單克隆抗體等，具體可選自腫瘤壞死因子、腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體、貝伐單抗、曲妥珠單抗、胰島素、生長激素等。在前期的研究中，發(fā)明人已篩選出菌株bacilluscereuswq9-2（cn102021125a），所產(chǎn)蛋白wq9-2具有催化合成水凝膠因子的性能。wq9-2作為酶促開關(guān)，通過催化苯丙氨酸氨基供體與非極性氨基酸羧基供體形成水凝膠因子，進(jìn)而自組裝為小分子水凝膠。但是酶和蛋白可能存在相互作用，wq9-2在具有催化合成短肽能力的同時可能降解被包載的蛋白藥物。具體地，本發(fā)明提供了一種以wq9-2作為酶促開關(guān)、采用丙烯酰胺、n-（3-氨基丙基）甲基丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺作包載材料的定向酶促反應(yīng)系統(tǒng)，該定向酶促反應(yīng)系統(tǒng)可以促進(jìn)水凝膠前體（芴甲氧羰基-苯丙氨酸和苯丙氨酸-苯丙氨酸-二羥苯丙氨酸）包載trail（腫瘤壞死因子凋亡誘導(dǎo)配體），制成小分子水凝膠。實(shí)施例1定向酶促反應(yīng)系統(tǒng)的制備：溶解20000uwq9-2于2ml的碳酸氫鈉緩沖液（ph8.5,50mm），加入丙烯酰胺、n-（3-氨基丙基）甲基丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺（三者摩爾比5:5:1）。4℃攪拌0.5小時，加入30μl過硫酸銨(100mg/ml)水溶液及3μl四甲基乙二胺觸發(fā)自由基聚合反應(yīng)，通氮?dú)獗Ｗo(hù)反應(yīng)2小時。4000rpm超濾管超濾15min，重復(fù)3次除去未反應(yīng)的單體和引發(fā)劑。通過透射電鏡觀察wq9-2定向酶促反應(yīng)系統(tǒng)的形態(tài)成均一圓球型，粒徑大小約為10-20nm，如圖3所示。未修飾的wq9-2與trail共孵5分鐘后，采用酶聯(lián)免疫吸附測定trail的生物活性。如圖4所示，trail與未修飾的wq9-2（wq9-2）共孵5min后，生物活性下降至原有的30%；而trail與修飾后的wq9-2定向酶促反應(yīng)系統(tǒng)（nwq9-2）共孵后活性保持在90%以上，證明wq9-2與trail存在相互作用，而定向酶促反應(yīng)系統(tǒng)通過形成空間位阻阻礙了wq9-2與trail間的作用。水凝膠的制備：10mm芴甲氧羰基-苯丙氨酸和20mm苯丙氨酸-苯丙氨酸-二羥苯丙氨酸作為凝膠前體，溶于2ml的雙蒸水，調(diào)節(jié)ph至7.4。加入2000uwq9-2定向酶促反應(yīng)系統(tǒng)觸發(fā)水凝膠因子形成，37℃孵育4小時后，形成小分子水凝膠。掃描電鏡和透射電鏡觀察形態(tài)。掃描電鏡樣品準(zhǔn)備流程：將小分子水凝膠低溫真空干燥后固定于樣品臺上，進(jìn)行噴鍍金處理，鍍金厚度為10nm的均勻薄膜；隨后將小分子水凝膠切取少量置于掃描電鏡的載物臺上，在加速電壓為15kv的條件下，對水凝膠微觀結(jié)構(gòu)的進(jìn)行觀察。透射電鏡樣品準(zhǔn)備流程：將鍍碳的銅格網(wǎng)垂直置于小分子水凝膠中5-10秒后輕輕取出，置于干燥箱中過夜，采用透射電鏡在加速電壓為80kv的條件下進(jìn)行觀察。掃描電鏡觀察顯示小分子水凝膠為枝狀管網(wǎng)的多孔結(jié)構(gòu)，密集的孔狀結(jié)構(gòu)為小分子水凝膠提供了充足與堅(jiān)實(shí)的三維支架結(jié)構(gòu)，如圖5所示。透射電鏡觀察顯示小分子水凝膠為具有自組裝能力的10nm寬的納米纖維狀結(jié)構(gòu)，如圖6所示。trail的釋放檢測10mm芴甲氧羰基-苯丙氨酸、20mm苯丙氨酸-苯丙氨酸-二羥苯丙氨酸作為水凝膠前體，溶于1ml的雙蒸水，調(diào)節(jié)ph至7.4后與1ml的trail水溶液混合。加入200μlwq9-2定向酶促反應(yīng)系統(tǒng)觸發(fā)凝膠因子形成，37℃孵育4小時后，置于恒溫震蕩儀中，分別在1h、2h、4h、8h、12h、1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d取樣，檢測trail的釋放。如圖7所示，載藥小分子水凝膠的體外釋放實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，小分子水凝膠的7天累計(jì)釋放量為40%，為trail的緩控釋載體。當(dāng)前第1頁12當(dāng)前第1頁12