專利名稱：低分子肝素鈉(鈣)及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開了一種名為低分子肝素鈉(鈣)(LMWH)的生物制品及其制備方法。本制備方法屬于一種生物藥品的制備方法。
人們已知肝素(SH)是一種粘多糖類藥物，應(yīng)用已有半個多世紀了，隨著研究的深入發(fā)展，發(fā)現(xiàn)肝素(SH)不僅具有抗凝，抗血栓作用，還具有獨特的抗炎、抗過敏、抗病毒和降血脂作用，然而肝素在應(yīng)用中有比較嚴重的出血副作用。這種副作用高達35％，這樣在相當(dāng)程度上限制了肝素(SH)的使用。多年來醫(yī)學(xué)界一直在尋找一種抗凝作用低、抗血栓作用強的肝素類制品。
近年來，美國和歐洲醫(yī)學(xué)界成功地從普通SH中分離出了較小SH片斷(LMWH)具有與SH同樣的抗Xa因子作用。而活化凝血活酶時間(APTT)縮短。LMWH體現(xiàn)出比SH生物利用率高，血漿半衰期長的優(yōu)點。然而國外的LMWH的工業(yè)化生產(chǎn)一般采用化學(xué)解聚技術(shù)，如亞硝酸鈉工藝等方法，產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定，成本高，且產(chǎn)生較大的三廢。
本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的。本發(fā)明對肝素(SH)進行二次內(nèi)切酶裂解，二次超濾技術(shù)，然后加熱70℃-80℃除菌濾后，真空干燥或冷凍干燥制得低分子肝素精品。
(一)、工藝路線(見附圖
)(二)、工藝過程(按以下次序進行)1.將精品肝素(無熱原、無菌)按重量的10倍量加入無熱原1％的氯化鈉(氯化鈣)溶液中，不斷攪拌使其全部溶解，再繼續(xù)攪拌1小時。(“無熱原”名詞它是醫(yī)藥產(chǎn)品的專用名詞，熱原意思即是致熱物質(zhì)，動物體內(nèi)的細菌內(nèi)毒素。)2.溶液用1N NaOH(Ca(OH)2)調(diào)PH8.5-9.0，然后在不斷攪拌中加入Elastase酶[按肝素鈉活力單位的3.5％計(即每1000萬單位肝素加入35萬單位)]緩緩升溫至35℃-40℃，保溫22小時。
3.次入用布氏漏斗過濾清液體后，調(diào)PH11.5-11.7升溫至90℃±5℃，保溫30分鐘，然后迅速冷卻到25℃±調(diào)PH6.5±0.1。
4.用中空纖維超濾器，分子量6000膜，進行循環(huán)超濾，收集外透液。
5.超至濃縮液的原體積的1/10量，再補充無熱原的含1％氯化鈉(氯化鈣)溶液到原體積。
6.含1％氯化鈉溶液用1N NaOH(Ca(OH)2)調(diào)PH8.5-9.0，然后在不斷攪拌中加入Elastase酶，加酶量是第一次的1/3，緩緩升溫至35℃-40℃，保溫18小時。
7.次日用布氏漏斗過濾清液體后，調(diào)PH至11.5-11.7升溫90℃±5℃保溫30分鐘，然后冷卻到25℃±，調(diào)整PH6.5±0.1。
8.用中空纖維超濾器分子量6000膜，進行循環(huán)超濾超至原體積十分之一以后，收集外透液(濃縮液作為下批投料回收用)。
9.合并④與⑧的二次超濾外濾透液用HCL(HAC)調(diào)PH6.0-6.5，用0.2M無菌膜及板框壓濾后(直接凍干)。
10.加入等倍量無熱原酒精攪拌20分鐘后靜置在5℃-10℃冷室過夜。
11.次日虹吸出上清廢乙醇(可回收)，沉淀物用無水乙醇(或丙酮)、攪拌、洗滌2-3次后，離心、收集沉淀物。
12.沉淀物放在無菌無熱原盤中，進入真空干燥箱用五氧化二磷，真空干燥36小時以上。
13.干燥品裝袋，稱重后抽樣，按EP2000版進行全項化驗。
本發(fā)明能夠工業(yè)化生產(chǎn)中運用二次，Elastase酶，在堿性條件下水解肝素精制品，然而用中空纖維超濾膜超濾所得的低分子肝素成品。經(jīng)過藥品測試所得測定LMWH的溶血栓(Fxa)因子活力單位穩(wěn)定在100-125國際單位/毫克。抗凝血(FIIa)的活力單位，則控制在每毫克25-35國際單位。產(chǎn)品的平均分子量3500-5500范圍內(nèi)，此種分子量占產(chǎn)品的68-88％之間。本發(fā)明的產(chǎn)品Fxa與FIIa的比值一般在3.3-5.3之間。大多可達到3.3-5.3之間；本發(fā)明的操作過程(不受外因干擾)產(chǎn)品全部達到無菌無熱原。本發(fā)明產(chǎn)品仍可保持肝素精品所具有的一些理化指標。溶解度、澄清度，均達國內(nèi)外優(yōu)級產(chǎn)品指標，在波長280nm、吸收度(OD值)規(guī)定為0.20以下，而本發(fā)明產(chǎn)品在0.060-0.080，在波長260nm、OD值規(guī)定為0.15以下，而本發(fā)明產(chǎn)品在0.040-0.050。本發(fā)明因為用生物酶作為解聚技術(shù)制造LMWH。因此在產(chǎn)品制造過程中不含有害于人體的亞硝酸鹽及硼類物質(zhì)。
本申請人在2000年9月7日申請了名為一種肝素及其制備方法的發(fā)明專利，專利號為00125093.0，它的主要核心技術(shù)是從哺乳動物的腸粘膜中提取并純化出一種名叫做肝素鈉的生物制品，這種物質(zhì)的純品對人體有抗凝血的作用，臨床上有廣泛用途。
而本發(fā)明是用上述純品再進行進一步的生物化學(xué)裂解，使它產(chǎn)生一種小分子的片斷，它的生物特性發(fā)生了質(zhì)的變化，即原來抗凝血效價明顯減少，而出現(xiàn)了一種在血漿中溶解血栓特殊效價，臨床醫(yī)學(xué)用途可作為深部靜脈血栓(DVT)的預(yù)防，急性心肌梗塞和不穩(wěn)定性心絞痛的治療。
本發(fā)明與上述專利不同點在于以下幾個方面1、本發(fā)明起始原料為專利申請?zhí)?0125093.0中陳述的成品(精制品)進行分解的起始原料為從哺乳動物腸粘膜中提取和提純的一種物質(zhì)。
2、本專利發(fā)明的低分子肝素(伊諾肝素)與普通肝素(原專利)從分子結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)都存在明顯區(qū)別，歐洲藥典及英國藥典已經(jīng)分別收載了不同類型的低分子量肝素及普通肝素，中國藥典目前僅僅記載了普通肝素藥品。
3、本發(fā)明在說明書中發(fā)表了一種E酶(內(nèi)切水解酶)方法來裂解普通肝素的鏈，這與專利號00125093.0中陳述用酶水解普通肝素有根本的區(qū)別，內(nèi)切水解酶是用來切斷普通肝素的長鏈，使其成分子片斷，而00125093.0專利號中水解蛋白酶是用來消化雜蛋白雜質(zhì)，從而純化肝素的目的。
4、本發(fā)明在說明書中陳述LMWH最終產(chǎn)品的單位效價(活力單位)與00125093.0專利號中每毫克170國際單位完全不一樣，LMWH的活力單位表現(xiàn)在Fxa因子活力單位，而SH(普通肝素)為抗凝血活力，同時提及在波長280nm及260nm波長時，這是分別指二個不同性質(zhì)產(chǎn)品在相同波長上檢驗其所夾帶的雜蛋白及不明核酸物質(zhì)吸收度。
5、本發(fā)明是專利號00125093.0發(fā)明的肝素的衍生物，一種用生物技術(shù)重新裂解制造的新藥品，其在用途及性質(zhì)上已與肝素有很大的區(qū)別，詳見情況表。
附表普通肝素與LMWH的比較普通肝素 LMWH分子量 10000～56000 3000～7000抗Fxa活性++ ++++抗FIIa活性 ++++ ++作用持續(xù)時間4～5h＞24h與血小板結(jié)合能力++++ +與內(nèi)皮細胞結(jié)合能力 ++++ +被清除率 +++ +活化纖溶作用 + +++對PF4、HRGP作用 +++ +對魚精蛋白作用 ++++ +ATII結(jié)合力 +++ ++++延長APTT++++ ++出血傾向++++ +致血小板減少 +++ +
本發(fā)明研制出了一種稱為低分子肝素的物質(zhì)及為一種獨特的酶解超濾工藝的生產(chǎn)技術(shù)。本發(fā)明所獲得的低分子肝素，質(zhì)量達到了溶血栓活力高，抗凝血活力低的無菌、無熱原、無雜質(zhì)，透光率均達到國際領(lǐng)先水平，且操作簡便，并適合于工業(yè)化生產(chǎn)的一種新穎技術(shù)。
權(quán)利要求
1.一種低分子肝素鈉(鈣)的制備方法，包括將精品肝素裂解、加熱、除菌濾、干燥，其特征在于精品肝素裂解技術(shù)不用化學(xué)裂解技術(shù)，而用生物酶解聚及超濾手段，對精品肝素進行二次Elastase酶裂解、二次超濾即采用中空纖維超濾器進行循環(huán)超濾，然后加熱70℃～80℃除菌濾后，真空干燥或冷凍干燥制得低分子肝素鈉(鈣)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的低分子肝素鈉(鈣)的制備方法，其特征在于所述的中空纖維超濾器，分子量6000膜。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的低分子肝素鈉(鈣)的制備方法，其特征在于所述真空干燥箱用五氧化二磷，真空干燥時間≥36小時。
4.一種由上述權(quán)利要求制備方法所獲得低分子肝素鈉(鈣)，其特征在于低分子肝素鈉(鈣)溶血栓活力單位在100～125國際單位/毫克；抗凝血活力單位在25～35國際單位/毫克；產(chǎn)品平均分子量在3500～5500；成品溶液的吸收度在波長280nm處為0.060～0.080、波長260nm處為0.040～0.050。
全文摘要
本發(fā)明為一種低分子肝素鈉(鈣)及其制備方法，特征是將精品肝素裂解技術(shù)不用化學(xué)裂解技術(shù)，而用生物酶解聚及超濾手段，對精品肝素進行二次Elastase酶裂解、二次超濾即采用中空纖維超濾器進行循環(huán)超濾，然后加熱70℃～80℃除菌濾后，真空干燥或冷凍干燥制得低分子肝素鈉(鈣)，由本方法獲得的低分子肝素鈉(鈣)溶血栓活力單位在100～125國際單位/毫克；抗凝血活力單位在25～35國際單位/毫克；產(chǎn)品平均分子量在3500～5500；成品溶液的吸收度在波長280nm處為0.060～0.080、波長260nm處為0.040～0.050，本發(fā)明的方法反應(yīng)溫和，天然物質(zhì)純度高，操作簡便，無三廢污染，適于工業(yè)化生產(chǎn)的一種新技術(shù)，產(chǎn)品溶血栓活力高、抗凝血活力低的無菌、無熱源、無雜質(zhì)，透光率均達到國際領(lǐng)先水平。
文檔編號A61K31/726GK1421464SQ0215087
公開日2003年6月4日 申請日期2002年11月29日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月29日
發(fā)明者沙龍華, 金武 申請人:上?；莺Ｉ破窂S