一種聚合物、含有該聚合物的水凝膠及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種聚合物、含有該聚合物的水凝膠及其應(yīng)用。本發(fā)明聚合物的結(jié)構(gòu)如式(Ⅰ)所示，其中，m與n的比值為6：2.4；本發(fā)明的水凝膠含有本發(fā)明的聚合物。本發(fā)明的水凝膠表面呈現(xiàn)疏松多孔結(jié)構(gòu)，孔隙較為均勻且相互連通，滿足支架材料的生物學(xué)要求；另外，本發(fā)明的水凝膠具有良好的生物相容性、安全、方便，可負(fù)載神經(jīng)干細(xì)胞，用來修復(fù)脊髓損傷。
【專利說明】
一種聚合物、含有該聚合物的水凝膠及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種聚合物、含有該聚合物的水凝膠及其應(yīng)用，具體涉及一種可負(fù)載 神經(jīng)干細(xì)胞修復(fù)脊髓損傷的聚合物、含有該聚合物的水凝膠及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是一種嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)損傷性疾病，以高致 殘率(美國全癱占67%)、高耗費(fèi)(美國為5~7萬美元/患者/年）、低死亡率(〈5%)為特點(diǎn)，嚴(yán) 重威脅人類健康，給社會(huì)和家庭帶來了沉重的負(fù)擔(dān) [1]。目前針對(duì)SCI的治療手段主要是激素 和手術(shù)，這些療法對(duì)SCI所引起的多種神經(jīng)功能障礙無明顯效果。因此，針對(duì)SCI的預(yù)防、治 療和康復(fù)仍是當(dāng)今醫(yī)學(xué)界的一大難題，許多研究都在該領(lǐng)域進(jìn)行了不懈的探索。
[0003] 干細(xì)胞治療脊髓損傷曾一度取得了可喜成績。相關(guān)研究已經(jīng)證實(shí)，神經(jīng)干細(xì)胞 (NSCs)、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)、雪旺式細(xì)胞(Schwann cells)、嗅鞘膠質(zhì)細(xì)胞(OECs)、 胚胎干細(xì)胞(ESCs)等均可作為種子細(xì)胞治療脊髓損傷。其中，NSCs作為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì) 細(xì)胞的共同前體細(xì)胞，是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的基礎(chǔ)，理論上是最理想的治療脊髓損傷的種子細(xì) 胞。但是應(yīng)用不論哪類干細(xì)胞移植修復(fù)SCI的治療策略，雖然在一定程度上能夠修復(fù)SCI，但 臨床實(shí)際應(yīng)用的效果卻并不顯著。究其原因，主要是由于SCI后，一連串的病理生理過程"瀑 布"樣爆發(fā)，包括血管崩解、水腫、免疫細(xì)胞的滲透、炎癥介質(zhì)的參與、髓鞘抑制因子的釋放、 膠質(zhì)疤痕的產(chǎn)生等，形成了損傷局部復(fù)雜惡劣的微環(huán)境。再者，損傷可持續(xù)激活免疫細(xì)胞， 包括小膠質(zhì)細(xì)胞，淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等，繼而產(chǎn)生次級(jí)損害。以上因素，均會(huì)對(duì)移植進(jìn)入 的干細(xì)胞的存活造成不利影響，進(jìn)而影響SCI的修復(fù)。因此，改變損傷周圍的微環(huán)境(細(xì)胞外 基質(zhì)成分），使干細(xì)胞更易于存活以及向神經(jīng)元方向分化，將是SCI治療中的新策略。
[0004] 近年來，隨著醫(yī)學(xué)、材料科學(xué)、組織工程學(xué)的發(fā)展，以生物材料、種子細(xì)胞和生長因 子為基本要素的神經(jīng)組織工程策略，將有望克服單純干細(xì)胞移植方法的缺點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)真正意 義上的脊髓損傷修復(fù)與重建，是SCI治療研究中的最新熱點(diǎn)，而水凝膠就是其中的典型代 表。水凝膠作為一種生物材料，其合成原料主要有兩類:一類是天然來源，比如蠶絲蛋白、殼 聚糖等，具有來源廣泛、成本低、良好的生物相容性并富含生物活性靶點(diǎn)，但是由于其力學(xué) 性能差、生物降解速率快以及潛在的免疫原性等缺陷，限制其廣泛使用；另一類為化學(xué)合成 的水凝膠，由于是人工合成，所以可以根據(jù)移植的靶器官的力學(xué)性能，很方便的對(duì)合成的各 個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行調(diào)控，直到其與靶器官的機(jī)械性能完全適配?；瘜W(xué)合成的材料最大的缺點(diǎn)是毒 性比較大，植入人體會(huì)產(chǎn)生一些毒性作用，但就這一點(diǎn)，就會(huì)使得其所有的優(yōu)點(diǎn)黯然失色。 我們的主要研究目的，是嘗試尋找一種水凝膠，使它既具有天然原材料的生物相容性，又具 有合成材料的機(jī)械性能，使之優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)。PEG材料的水凝膠因其優(yōu)異的生物相容性、力學(xué)性 能與微觀形貌可控性而被廣泛研究。不過，由于PEG是一種相對(duì)惰性的聚合物材料，細(xì)胞不 能黏附，不能發(fā)揮細(xì)胞與材料之間的相互作用，必須對(duì)PEG材料進(jìn)行改性后才能有效利用。 對(duì)PEG的改性多是共價(jià)結(jié)合一些生物活性分子包括短肽、細(xì)胞外基質(zhì)來源的蛋白等。
[0005] 本課題前期研究，單純應(yīng)用干細(xì)胞移植及將PF-127水凝膠作為慢病毒載體治療脊 髓損傷受到了一定效果。但是該水凝膠僅僅負(fù)載病毒，不能負(fù)載細(xì)胞。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足之處而提供一種聚合物和具有良好 生物相容性、安全、方便的含有該聚合物的水凝膠。
[0007] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種含有上述聚合物的水凝膠的應(yīng)用。
[0008] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為:一種聚合物，其結(jié)構(gòu)如式(I)所示：
[0011]其中，m與η的比值為6 :2.4。式（I)所示聚合物的制備方法為:將三亞甲基碳酸酯 (TMC)、丙烯酰氯(Ac)和聚乙二醇(PEG)加入二氯甲烷溶劑中，以高活性的強(qiáng)堿一 1，8_二氮 雜二環(huán)十一碳-7-烯(DBU)為催化劑，于28°C的溫度下反應(yīng)10h。本制備方法以大分子引發(fā) 劑一聚乙二醇引發(fā)三亞甲基碳酸酯和丙烯酰氯發(fā)生開環(huán)聚合反應(yīng)，同時(shí)該方法采用了強(qiáng)堿 性催化劑DBU。該制備方法以二氯甲烷作為溶劑，可防止丙烯酰氯單體中的雙鍵在聚合過程 中發(fā)生交聯(lián)。在所述條件下，聚合反應(yīng)具有可控性，制得的共聚物具有比較窄的分子量分布 系數(shù)(約為1.24)。優(yōu)選地，所述聚乙二醇為PEG 10K。
[0012] 本發(fā)明的聚合物表面呈現(xiàn)疏松多孔結(jié)構(gòu)，孔隙較為均勻且相互連通，滿足支架材 料的生物學(xué)要求。
[0013] 作為本發(fā)明所述聚合物的優(yōu)選實(shí)施方式，所述聚合物的分子量為12000~13000。 分子量即指相對(duì)分子質(zhì)量。
[0014] 另外，本發(fā)明還提供了一種含有上述聚合物的水凝膠。
[0015] 作為本發(fā)明所述水凝膠的優(yōu)選實(shí)施方式，所述水凝膠還含有短肽，所述短肽與所 述聚合物中全部雙鍵的摩爾比為（10~30): 100。研究表明，用短肽進(jìn)行修飾時(shí)，隨著水凝膠 中短肽濃度的增高，神經(jīng)干細(xì)胞黏附的數(shù)目也逐漸增多，但是，水凝膠的黏彈力相對(duì)比較低 (這可通過水凝膠的黏彈力測(cè)試證實(shí)），故細(xì)胞培養(yǎng)液中的營養(yǎng)成分在短肽含量較高的水凝 膠中不能很好的流通，細(xì)胞代謝廢物也不能很好的排出，故細(xì)胞在該水凝膠孔隙中的新陳 代謝會(huì)受到一些不良影響，結(jié)果就會(huì)導(dǎo)致一些活力比較差的細(xì)胞出現(xiàn)死亡。綜合考慮細(xì)胞 粘附量與細(xì)胞存活率，我們將短肽與聚合物中全部雙鍵的摩爾比選擇為(10~30): 100。
[0016] 上述含有短肽的水凝膠的制備方法為：（1)將聚合物溶解于1 X roS(PH = 7.4)中， 配置成5%的聚合物溶液；（2)加入短肽，攪拌均勻，反應(yīng)30min，紫外光照消毒30min; (3)加 入經(jīng)過濾物理方法除菌消毒后的DTT。
[0017] 作為本發(fā)明所述水凝膠的更優(yōu)選實(shí)施方式，所述短肽為RGD肽。RGD肽是一類廣泛 存在于生物體內(nèi)的含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp)的短肽，它可以作為整合 素與其配體相互作用的識(shí)別位點(diǎn)來介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)以及細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作 用，同時(shí)還具有信號(hào)傳導(dǎo)功能。RGD肽兼有神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化的起點(diǎn)的角色，是當(dāng)前促進(jìn) 細(xì)胞黏附最有效的多肽序列。
[0018] 作為本發(fā)明所述水凝膠的優(yōu)選實(shí)施方式，所述短肽與所述聚合物中全部雙鍵的摩 爾比為30:100。神經(jīng)干細(xì)胞在所述水凝膠中的黏付數(shù)量較高。
[0019] 作為本發(fā)明所述水凝膠的優(yōu)選實(shí)施方式，所述水凝膠還含有透明質(zhì)酸，且所述水 凝膠中，聚合物、短肽的質(zhì)量之和與透明質(zhì)酸質(zhì)量的比為1:1~2:1。小分子的透明質(zhì)酸(Η A) 作為細(xì)胞外基質(zhì)的主要組分之一，其參與細(xì)胞內(nèi)外電解質(zhì)的調(diào)控，發(fā)揮著物理和分子信息 過濾器的作用;并且，透明質(zhì)酸對(duì)細(xì)胞迀移、增殖、分化及吞噬功能有一定的促進(jìn)作用。本發(fā) 明的水凝膠由于含有透明質(zhì)酸，其使神經(jīng)干細(xì)胞的存活率得到提高。但由于透明質(zhì)酸是帶 負(fù)電荷的，這與正常情況下細(xì)胞膜表面的電荷相斥，所以水凝膠含有透明質(zhì)酸后會(huì)導(dǎo)致細(xì) 胞黏附數(shù)量減少。當(dāng)聚合物、短肽、透明質(zhì)酸選擇所述特定的質(zhì)量比時(shí)，神經(jīng)干細(xì)胞在水凝 膠中的黏附數(shù)量稍微減少，但是存活率提高的比例程度更高，故在水凝膠中真正存活的能 用于分化的有效細(xì)胞數(shù)還是增多的。
[0020] 上述含有透明質(zhì)酸的水凝膠的制備方法為:按照所述質(zhì)量比，將透明脂酸加入含 有短肽和聚合物的水凝膠中，混勻。
[0021] 作為本發(fā)明所述水凝膠的優(yōu)選實(shí)施方式，所述水凝膠中，短肽與聚合物中全部雙 鍵的摩爾比為30:100,且聚合物、短肽的質(zhì)量之和與透明質(zhì)酸質(zhì)量的比為2:1。大量研究表 明，在所述特定含量的水凝膠中，神經(jīng)干細(xì)胞的黏付量多、細(xì)胞存活率高；該特定含量的水 凝膠更有利于神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元方向分化且其毒性低。
[0022] 作為本發(fā)明所述水凝膠的優(yōu)選實(shí)施方式，所述水凝膠中，短肽與聚合物中全部雙 鍵的摩爾比為30:100,且聚合物、短肽的質(zhì)量之和與透明質(zhì)酸質(zhì)量的比為1: 1。
[0023] 最后，本發(fā)明還提供了上述水凝膠在制備用于治療脊髓損傷的藥物中的應(yīng)用。本 發(fā)明的水凝膠可負(fù)載神經(jīng)干細(xì)胞，用于修復(fù)脊髓損傷。
[0024] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為:本發(fā)明的水凝膠表面呈現(xiàn)疏松多孔結(jié)構(gòu)， 孔隙較為均勻且相互連通，滿足支架材料的生物學(xué)要求。另外，本發(fā)明的水凝膠具有良好的 生物相容性、安全、方便，可負(fù)載神經(jīng)干細(xì)胞，用來修復(fù)脊髓損傷。
【附圖說明】
[0025] 圖1為本發(fā)明采用核磁共振波普表征實(shí)施例1所述聚合物的結(jié)果圖；
[0026] 圖2為本發(fā)明采用凝膠滲透色譜分析實(shí)施例1所述聚合物的結(jié)果圖；
[0027] 圖3為本發(fā)明水凝膠的掃描電子顯微鏡圖；
[0028] 圖4為本發(fā)明采用掃描電子顯微鏡觀察水凝膠的數(shù)據(jù)結(jié)果圖；
[0029]圖5為本發(fā)明神經(jīng)干細(xì)胞黏付在不同水凝膠上的顯微鏡圖；
[0030] 圖6為本發(fā)明每單位面積水凝膠上黏付的神經(jīng)干細(xì)胞的計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖；
[0031] 圖7為本發(fā)明大鼠神經(jīng)干細(xì)胞在不同水凝膠上活死染色的熒光顯微鏡圖；
[0032] 圖8為本發(fā)明大鼠神經(jīng)干細(xì)胞在不同水凝膠上活死比例圖；
[0033] 圖9為本發(fā)明大鼠神經(jīng)干細(xì)胞在水凝膠中的的活力檢測(cè)結(jié)果；
[0034] 圖10為本發(fā)明大鼠神經(jīng)干細(xì)胞在不同水凝膠表面分化的熒光顯微鏡圖；
[0035] 圖11為本發(fā)明大鼠神經(jīng)干細(xì)胞在不同水凝膠表面的分化比例圖；
[0036]圖12為本發(fā)明大鼠神經(jīng)干細(xì)胞在不同時(shí)間取出的Gel 1浸提液中成球的顯微鏡 圖；
[0037] 圖13為本發(fā)明在不同時(shí)間取出的Gel 1浸提液中每10000個(gè)細(xì)胞所形成的細(xì)胞球 數(shù)量的計(jì)數(shù)圖；
[0038] 圖14為本發(fā)明實(shí)施例14所述斑馬魚胚胎的照片圖；
[0039] 圖15為本發(fā)明實(shí)施例14所述對(duì)斑馬魚的胚胎進(jìn)行拍照后的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果圖；
[0040] 圖16為本發(fā)明實(shí)施例16所述HE染色后鏡下觀察大鼠的肝腎的結(jié)構(gòu)圖；
[0041 ] 圖17為本發(fā)明實(shí)施例16所述用Luxol Fast Blue對(duì)實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行染色并且用HE和曙 紅復(fù)染的顯微鏡圖；
[0042]圖18為本發(fā)明應(yīng)用神經(jīng)軸突的特異性染色marker NF200對(duì)脊髓切片進(jìn)行染色觀 察的照片圖；
[0043]圖19為本發(fā)明應(yīng)用神經(jīng)軸突的特異性染色marker NF200對(duì)脊髓切片進(jìn)行染色觀 察的結(jié)果圖；
[0044] 圖20為本發(fā)明用TUNEL法檢測(cè)凋亡細(xì)胞的結(jié)果圖；
[0045] 圖21為本發(fā)明凋亡細(xì)胞的計(jì)數(shù)結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0046] 為更好地說明本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)，下面將結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì) 本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
[0047]實(shí)施例中，所用到的材料如下：
[0048] 聚乙二醇（PEG10000):AR，F(xiàn)luka，使用前120°C，真空脫水2h;三亞甲基碳酸酯 (TMC，分子量為102):廣東惠州華陽醫(yī)療器械有限公司，使用前乙酸乙酯重結(jié)晶；1，8_二氮 雜二環(huán)^^一碳-7-烯(DBU，99%，分子量152.2)、1，1，1_三羥甲基乙烷(97%，分子量120)、丙 烯酰氯(96%，分子量90.5)、二硫蘇糖醇(DTT，99%，分子量154.2)，上海晶純實(shí)業(yè)有限公 司；氯甲酸乙酯(98%，分子量108.5)，上海安耐吉試劑公司；考馬斯亮藍(lán)(G-250)，百靈威科 技有限公司；絲裂霉素 C(MMC，德國羅氏診斷有限公司）；牛血清蛋白（BSA);嗜熱絲孢菌脂肪 酶（hermomyces lanuginosus lipase，10萬U/g，降解液濃度3· 3萬U/g)，sigma; 2-羥基-4'-(2-羥乙氧基)-2-甲基苯丙酮，商品名IrgAcure 2959(12959，純度99.9% )，巴斯夫中國有 限公司；透明質(zhì)酸（山東福瑞達(dá)醫(yī)藥集團(tuán)公司）。
[0049] 實(shí)施例中，TMC表示三亞甲基碳酸酯、Ac表示丙烯酰氯，PEG表示聚乙二醇，DBU表示 1，8-二氮雜二環(huán)十一碳-7-烯，HA表示透明質(zhì)酸，NSCs表示神經(jīng)干細(xì)胞
[0050] 實(shí)施例1
[0051] 本發(fā)明實(shí)施例的一種聚合物，本實(shí)施例所述聚合物的結(jié)構(gòu)式為：
[0053] 其中，m與η的比值為6:2.4,聚合物的分子量為12000~13000。
[0054]本實(shí)施例所述聚合物的制備方法為:將三亞甲基碳酸酯(TMC)、丙烯酰氯(Ac)和聚 乙二醇(PEG10K)加入二氯甲烷中，以高活性的強(qiáng)堿一 1，8_二氮雜二環(huán)十一碳-7-烯(DBU)為 催化劑，于28°C的溫度下反應(yīng)10h。
[0055]我們采用核磁共振波普和凝膠滲透色譜表征了上述聚合物的結(jié)構(gòu)，聚合物在 CDC13中的1H NMR譜如圖1所示，聚合物的凝膠滲透色譜分析（以THF作為洗脫液)結(jié)果如圖2 所示，圖2中，a表示本實(shí)施例的聚合物，b表示PEG 10Κ。
[0050]圖1中的a~f與上述結(jié)構(gòu)式中的a~f相對(duì)應(yīng)，對(duì)圖1氫譜進(jìn)行質(zhì)子峰歸屬分析的結(jié) 果為:化學(xué)位移在5.2~6.5ppm(a峰，m)歸屬于Ac鏈段側(cè)基雙鍵質(zhì)子峰;化學(xué)位移在4. lppm 左右(c峰，s)歸屬于Ac鏈段上6個(gè)亞甲基質(zhì)子峰;化學(xué)位移位移在1. lppm左右(f峰，s)歸屬 于Ac鏈段側(cè)甲基質(zhì)子峰;化學(xué)位移在4.3ppm左右(b峰，t)歸屬于TMC上直接與酯基相連的亞 甲基質(zhì)子峰;化學(xué)位移值在2.0~2.2ppm(e峰，m)歸屬于TMC鏈段中-CH 2CH2CH2-亞甲基質(zhì)子 峰;化學(xué)位移在3.65ppm左右(d峰，s)歸屬于PEG中亞甲基質(zhì)子峰。核磁共振波普進(jìn)一步證明 了在DBU催化下，大分子引發(fā)劑PEG成功地引發(fā)單體TMC和Ac開環(huán)聚合。通過譜圖中各特征峰 的積分面積可計(jì)算共聚物的數(shù)均分子量和聚合物中各單元摩爾比，計(jì)算可知聚合物的結(jié)構(gòu) 式中m與η的比值為6:2.4。
[0057]圖2的凝膠滲透色譜分析結(jié)果表明，本實(shí)施例聚合物的流出時(shí)間比PEG10K短，表明 其分子量比PEG10K明顯增大，且為單峰，分子量分布窄，表明在DBU催化下，PEG10K成功引發(fā) 了 TMC和Ac開環(huán)聚合。
[0058] 實(shí)施例2
[0059] 本發(fā)明水凝膠的一種實(shí)施例，本實(shí)施例所述水凝膠為實(shí)施例1所述聚合物。
[0060] 實(shí)施例3
[0061]本發(fā)明水凝膠的一種實(shí)施例，本實(shí)施例所述水凝膠含有實(shí)施例1所述聚合物和短 肽，所述短肽為RGD肽，短肽與所述聚合物中全部雙鍵的摩爾比為10% (即10:100)。
[0062]本實(shí)施例所述水凝膠的制備方法為：（1)將聚合物溶解于1XPBS(PH = 7.4)中，配 置成5 %的聚合物溶液；（2)加入短肽，攪拌均勻，反應(yīng)30min，紫外光照消毒30min; (3)加入 經(jīng)過濾物理方法除菌消毒后的DTT。
[0063] 實(shí)施例4
[0064] 本發(fā)明水凝膠的一種實(shí)施例，本實(shí)施例所述水凝膠含有實(shí)施例1所述聚合物和短 肽，所述短肽為R⑶肽，短肽與所述聚合物中全部雙鍵的摩爾比為20 % (即20:100)。
[0065] 本實(shí)施例所述水凝膠的制備方法同實(shí)施例3。
[0066] 實(shí)施例5
[0067] 本發(fā)明水凝膠的一種實(shí)施例，本實(shí)施例所述水凝膠含有實(shí)施例1所述聚合物和短 肽，所述短肽為R⑶肽，短肽與所述聚合物中全部雙鍵的摩爾比為30 % (即30:100)。
[0068] 本實(shí)施例所述水凝膠的制備方法同實(shí)施例3。
[0069] 實(shí)施例6
[0070]本發(fā)明水凝膠的一種實(shí)施例，本實(shí)施例所述水凝膠含有實(shí)施例1所述聚合物、短肽 和透明質(zhì)酸，所述短肽為RGD肽，短肽與所述聚合物中全部雙鍵的摩爾比為30 % (即30: 100)，聚合物、短肽的質(zhì)量之和與透明質(zhì)酸質(zhì)量的比為2:1。
[0071]本實(shí)施例所述水凝膠的制備方法為：按照所述質(zhì)量比，將透明質(zhì)酸加入含有短肽 和聚合物的水凝膠中，混勻;其中含有短肽和聚合物的水凝膠的制備方法同實(shí)施例3.
[0072] 實(shí)施例7
[0073] 本發(fā)明水凝膠的一種實(shí)施例，本實(shí)施例所述水凝膠含有實(shí)施例1所述聚合物、短肽 和透明質(zhì)酸，所述短肽為RGD肽，短肽與所述聚合物中全部雙鍵的摩爾比為30 % (即30: 100)，聚合物、短肽的質(zhì)量之和與透明質(zhì)酸質(zhì)量的比為1:1。
[0074] 本實(shí)施例所述水凝膠的制備方法同實(shí)施例6。
[0075] 實(shí)施例8
[0076] 本發(fā)明水凝膠的一種實(shí)施例，本實(shí)施例所述水凝膠含有實(shí)施例1所述聚合物、短肽 和透明質(zhì)酸，所述短肽為RGD肽，短肽與所述聚合物中全部雙鍵的摩爾比為30 % (即30: 100)，聚合物、短肽的質(zhì)量之和與透明質(zhì)酸質(zhì)量的比為1.5:1。
[0077] 本實(shí)施例所述水凝膠的制備方法同實(shí)施例6。
[0078]實(shí)施例9六種水凝膠的微觀形貌
[0079]我們采用掃描電子顯微鏡考察了實(shí)施例2~實(shí)施例7所述6六種水凝膠的微觀形 貌，考察結(jié)果如圖3~4所示。從圖中可以看出水凝膠表面呈現(xiàn)疏松多孔結(jié)構(gòu)，孔隙較為均勻 且相互連通。由此結(jié)果表明，利用DTT交聯(lián)機(jī)理制備的本發(fā)明的水凝膠具有較為均勻的多孔 結(jié)構(gòu)，滿足支架材料的生物學(xué)要求。
[0080] 圖3和圖4中，A表示實(shí)施例2所述水凝膠;B表示實(shí)施例3所述水凝膠;C表示實(shí)施例4 所述水凝膠;D表示實(shí)施例5所述水凝膠;E表示實(shí)施例6所述水凝膠;F表示實(shí)施例7所述水凝 膠。
[0081] 實(shí)施例10大鼠 NSCs在不同水凝膠上的黏附
[0082] a.大鼠 NSCs的培養(yǎng):實(shí)驗(yàn)前一天準(zhǔn)備高壓好無菌手術(shù)器械(手術(shù)彎盤兩個(gè)，顯微剪 1把、眼科剪2把、止血鉗4把、手術(shù)剪3把、200目濾網(wǎng)一個(gè)），60度烤箱烤干備用，高壓消毒好 PBS。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）。孕14天的SD大鼠，10%水合氯醛麻醉 后75%的酒精浸泡除菌，生物安全柜內(nèi)操作剪開腹部皮膚及肌肉，取出胚胎置入1XPBS液 體中。取出胚胎腦組織在PBS中漂洗，剝離腦膜及血管，剪碎成約0.2mmX0.2mm大小的碎片， 200 目銅網(wǎng)過濾，以 1 OOOrpm離心5min，棄上清。加入DMEM/F12 (1:1)、B27 (1:50)、bFGF(20ng/ ml)的無血清培養(yǎng)基，反復(fù)輕柔吹打多次成單細(xì)胞懸液，接種于25cm培養(yǎng)瓶中后放入37°C、 5 % C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3~4d半量加液1次，1周左右時(shí)間傳代，常規(guī)倒置顯微鏡觀察細(xì)胞 的生長狀態(tài)。
[0083] b.大鼠 NSCs的鑒定：
[0084] (1)實(shí)驗(yàn)前一天，用75%酒精處理玻片，之后放入12孔板中，并用多聚賴氨酸包被。
[0085] (2)取P2代的培養(yǎng)3天的神經(jīng)球，接種在多聚賴氨酸預(yù)處理的玻片上。
[0086] (3)4小時(shí)后，加入新鮮配置的4%多聚甲醛固定細(xì)胞10min，PBS洗片5minX3次，棄 去 PBS。
[0087] (4)加入0·3%的Triton X-100對(duì)細(xì)胞進(jìn)行透化處理20min，PBS洗片5minX3次，棄 去 PBS。
[0088] (5)應(yīng)用 5% 的BSA 封閉30min，PBS 洗片5minX3次，棄去PBS。
[0089] (6)稀釋一抗Nestin(巢蛋白）（1:300鼠來源），滴到玻片上，4°C冰箱濕盒內(nèi)孵育過 夜。
[0090] (7)PBS 洗片 3 次，每次 5min，棄去 PBS。
[0091 ] (8)加入焚光二抗（1:500goat anti mouse)，PBS洗片5minX 3次。
[0092] (9)加入 lμg/ml 的 DAPI 染核 15min，lXPBS 洗片 3 次，每次 5min。
[0093] (10)避光晾干玻片，滴加抗淬滅熒光封片劑封片。
[0094] (11)熒光顯微鏡下觀察，拍照。
[0095] c.大鼠 NSCs在不同水凝膠上的黏附、增殖：
[0096]因?yàn)榧?xì)胞黏附是細(xì)胞生長的最基本的前提，為了讓細(xì)胞在水凝膠中更好的生長， 所以我們首先研究NSCs在哪中水凝膠上黏附的數(shù)量較多?？疾齑笫?NSCs在不同水凝膠上的 黏附的步驟為：
[0097] (1)取P2代的NSCs，制成單細(xì)胞懸液。
[0098] (2)應(yīng)用活死染色試劑將細(xì)胞染成綠色（具體步驟見活死染色實(shí)驗(yàn)步驟），以106/ ml的細(xì)胞密度接種到六種水凝膠的表面。
[0099] (3)4h后用PBS將凝膠表面的細(xì)胞沖洗一遍，未黏附的細(xì)胞被沖洗下來。
[0100] (4)顯微鏡下觀察凝膠上細(xì)胞的黏附數(shù)量，隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行拍照。
[0? 01 ] (5)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)，以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差(Mean 土 SD)表示。
[0102] 將NSCs接種在實(shí)施例2~實(shí)施例7所述6種不同的水凝膠表面，其中，實(shí)施例2所述 水凝膠表示為單純PTAE組、實(shí)施例3所述水凝膠表示為
[0103] PTAE+10%Peptide組、實(shí)施例4所述水凝膠表示為PTAE+20%Peptide組、實(shí)施例5 所述水凝膠表示為PTAE+30%Peptide組、實(shí)施例6所述水凝膠表示為Gel 1組、實(shí)施例7所述 水凝膠表示為Gel 2組。
[0104] 上述步驟(4)顯微鏡下觀察的結(jié)果如圖5所示（圖5中A表示實(shí)施例2所述水凝膠;B 表示實(shí)施例3所述水凝膠;C表示實(shí)施例4所述水凝膠;D表示實(shí)施例5所述水凝膠;E表示實(shí)施 例6所述水凝膠;F表示實(shí)施例7所述水凝膠），上述步驟(5)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)的結(jié)果如圖6 (比例尺為50μπι)所示。
[0105]結(jié)果顯示，NSCs在實(shí)施例2~實(shí)施例7所述6種不同的水凝膠中的黏附數(shù)量依次為 2003 ±165/cm2,4001 ± 173/cm2,6000 ±140/cm2,8120 ±124/cm2,7649 ±185/cm2,7536 土 179/cm2,結(jié)果表明神經(jīng)干細(xì)胞在實(shí)施例5所述水凝膠(PTAE+30%Peptide組）中黏附數(shù)量比 實(shí)施例2所述水凝膠(單純PTAE組）、實(shí)施例3所述水凝膠(PTAE+10%Peptide組）、實(shí)施例4所 述水凝膠(PTAE+20%P印tide組)增高(P〈0.01) ;PTAE+30%Peptide組的水凝膠組細(xì)胞的黏 附數(shù)量與實(shí)施例6所述水凝膠(Gel 1組）、實(shí)施例7所述水凝膠(Gel 2組)相比稍微增多(P〈 0.05)，Gel l、Gel 2組間比較并沒有明顯的差異(P>0.05)。
[0106] 實(shí)施例11大鼠 NSCs在水凝膠中的活死染色實(shí)驗(yàn)
[0107] 在水凝膠細(xì)胞黏附結(jié)果的基礎(chǔ)之上，實(shí)驗(yàn)選定黏附細(xì)胞數(shù)量比較高的三組水凝膠 (實(shí)施例10所述PTAE+30%Peptide組、Gel 1組和Gel 2組)進(jìn)行了細(xì)胞的活死染色檢測(cè)，大 鼠 NSCs在水凝膠中的活死染色步驟如下：
[0108] (1)取定量聚合物溶于1 X PBS(PH=7.4)中，配置成5%的聚合物溶液；
[0109] (2)加入定量短肽（RGDC/IKVAVC= 1:1，[peptide]: [Ac] =30 :100，短肽的最終濃 度為5.89mmol/L)，攪拌均勾，反應(yīng)30min，紫外光照消毒30min;
[0110] (3)加入定量的過濾物理方法除菌消毒后的DTT([DTT]:[Ac]=70:100);
[0111] (4)取300μ1的聚合物溶液放入48孔板中，同時(shí)加入500μ1的106/ml的細(xì)胞懸液，37 °(：無菌環(huán)境下反應(yīng)30min，形成水凝膠3D負(fù)載NSCs的狀態(tài)；
[0112] (5)將實(shí)施例2所述水凝膠設(shè)置為對(duì)照組；
[0113] (6)細(xì)胞在水凝膠中存活72h之后，換液，加入活死染色試劑，熒光顯微鏡下進(jìn)行細(xì) 胞活死情況的觀察；
[0114] (7)熒光顯微鏡分別在372nm激發(fā)光(藍(lán)色通道）、488nm激發(fā)光(綠色通道)和550nm 激發(fā)光(紅色通道)三個(gè)模式下進(jìn)行拍照，然后用顯微鏡自帶的軟件將對(duì)應(yīng)通道圖片進(jìn)行疊 加；
[0115] (8)對(duì)于活死細(xì)胞染色，圖片上如果顯示綠色的話表示細(xì)胞存活，如果顯示紅色的 話則表示細(xì)胞死亡。我們對(duì)活細(xì)胞和死細(xì)胞分別進(jìn)行計(jì)數(shù)，然后計(jì)算出細(xì)胞存活率，其計(jì)算 公式為:細(xì)胞存活率=活細(xì)胞個(gè)數(shù)/總的細(xì)胞個(gè)數(shù)X 100%?；蛘哂?jì)算活死比例。細(xì)胞活死比 =活細(xì)胞個(gè)數(shù)(綠)/死的細(xì)胞個(gè)數(shù)(紅）X100%。
[0116] 大鼠神經(jīng)干細(xì)胞在不同水凝膠上活死染色的熒光顯微鏡圖見圖7;在不同水凝膠 上大鼠神經(jīng)干細(xì)胞活死比例見圖8。
[0117] 在細(xì)胞在水凝膠中生存72h之后，熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察，活細(xì)胞被成功染成了綠 色，紅細(xì)胞被染成紅色。統(tǒng)計(jì)分析顯示:在Ge 1 1中，NSCs的活死存活率93 ± 0.23 %，含30 % Peptide的水凝膠和Gel 2中NSCs的存活率分別為77±0.21%，和83±0.33%在Gel 1中 NSCs的活細(xì)胞的比例最高(P〈0.05)。
[0118] 實(shí)施例12大鼠 NSCs在水凝膠中的的活力檢測(cè)
[0119] 大鼠 NSCs在水凝膠中的的活力檢測(cè)的步驟如下：
[0120] (1)將細(xì)胞接種在實(shí)施例2~實(shí)施例7所述6種不同的水凝膠中；
[0121] (2)細(xì)胞在水凝膠中存活24h、48h、72h后應(yīng)用PBS將細(xì)胞沖洗出來，收集含有細(xì)胞 的 PBS;
[0122] (3)將收集的含有細(xì)胞的roS離心，用完全培養(yǎng)基重懸后接種在96孔板上，每孔90μ L的細(xì)胞懸液;并設(shè)置空白對(duì)照孔（只含有培養(yǎng)基和CCK-8試劑而沒有細(xì)胞)和0加藥對(duì)照孔 (只有正常細(xì)胞和CCK8溶液）。
[0123] (4)在96孔板中每孔加入1 OyL的CCK-8試劑;37度培養(yǎng)箱中孵育4h;
[0124] (5)將96孔板置于酶標(biāo)儀內(nèi)，450nm處檢測(cè)細(xì)胞的吸光度值；
[0125] (6)按照CCK-8試劑盒的檢測(cè)說明書進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
[0126] 細(xì)胞活力（％ ) = [A(加藥)_A(空白）]/[A(0加藥)-A(空白）]X 100% ;
[0127] A(加藥）：具有水凝膠中生長的細(xì)胞、CCK8溶液的孔的吸光度；
[0128] A(空白）：具有培養(yǎng)基和CCK8溶液而沒有細(xì)胞的孔的吸光度；
[0129] A(0加藥）：具有CCK8溶液、正常細(xì)胞的孔的吸光度。
[0130]大鼠 NSCs在水凝膠中的的活力檢測(cè)結(jié)果如圖9所示（圖9中A表示實(shí)施例2所述水凝 膠;B表示實(shí)施例3所述水凝膠;C表示實(shí)施例4所述水凝膠;D表示實(shí)施例5所述水凝膠;E表示 實(shí)施例6所述水凝膠;F表示實(shí)施例7所述水凝膠），由圖可見，在實(shí)施例2~實(shí)施例7所述6種 不同的水凝膠的檢測(cè)結(jié)果較空白對(duì)照具有統(tǒng)計(jì)顯著性。
[0131] 實(shí)施例13大鼠 NSCs在水凝膠表面的分化實(shí)驗(yàn)
[0132] 水凝膠中NSCs活死染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)之上，為了進(jìn)一步研究存活細(xì)胞的分化方 向，本課題設(shè)計(jì)進(jìn)行不同水凝膠上NSCs的分化實(shí)驗(yàn)。
[0133] (1)將大鼠的NSCs制成105/ml的單細(xì)胞懸液，平均接種在3種水凝膠表面；
[0134] (2)細(xì)胞黏附后在水凝膠表面生長，每3天更換一次分化培養(yǎng)基，代細(xì)胞長到低14 天時(shí)進(jìn)行免疫熒光染色；
[0135] (3)免疫熒光的染色應(yīng)用的抗體一抗i33-tublin(標(biāo)記神經(jīng)元)和GFAP(標(biāo)記星型膠 質(zhì)細(xì)胞）。
[0136] (4)熒光顯微鏡下拍照，ImageJ圖片分析軟件進(jìn)行圖片分析。
[0137] 大鼠神經(jīng)干細(xì)胞在不同水凝膠表面分化的熒光顯微鏡圖如圖10所示;大鼠神經(jīng)干 細(xì)胞在不同水凝膠表面的分化比例圖如圖11 (*表示P〈〇. 05，比例尺:25mm)所示。
[0138] 研究結(jié)果表明：標(biāo)記神經(jīng)元的03-Tublin在PTAE+30%Peptide組、Gel 1組和Gel 2 組三種水凝膠上的分化比例分別為22.38%±0.21、43.74%±0.42、26.85%±0.30，而標(biāo) 記星膠質(zhì)細(xì)胞的GFAP在PTAE+30%Peptide組、Gel 1組和Gel 2組三種水凝膠上的分化比例 分別為：71.56%±0.51、56.42%±0.86、63%±0.45。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：&-1\1131111在6611上 表達(dá)比在PTAE+30%Peptide的水凝膠和Gel 2上的表達(dá)高(P〈0.05)，相應(yīng)的GFAP在Gel 1上 表達(dá)就比在含PTAE+30%Peptide的水凝膠和Gel 2上的表達(dá)低(P〈0.05)。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果證 明水凝膠在含PTAE+30%Peptide水凝膠、Gell和Gel2三種水凝膠上均可以分化，但是向 神經(jīng)元以及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化的比例不同，Gel 1是最利于NSCs向神經(jīng)元方向分化的水凝 膠。由于神經(jīng)元是脊髓損傷治療中需要補(bǔ)充的細(xì)胞，而新型膠質(zhì)細(xì)胞主要形成膠質(zhì)疤痕，應(yīng) 該越少越好，這些結(jié)果證明:Gel 1是治療脊髓損傷的理想水凝膠。
[0139] 實(shí)施例14 Gel 1(實(shí)施例6所述水凝膠)對(duì)NSCs的成球能力檢測(cè)
[0140] (a)Gel 1浸提液的提取
[0141] (1)將實(shí)施例6所述水凝膠5mL置于無菌的45個(gè)離心管內(nèi)，分為Id組，7d組，14d組， 28d組，100d組，其中每組9只；
[0142] (2)每個(gè)離心管用75%的酒精5ml浸泡30minX 5次，然后在每個(gè)含有水凝膠的離心 管內(nèi)加入無菌的人工腦脊液(ACSF)5ml，無菌封口膜密封離心管后，置于37°C恒溫箱中；
[0143] (3)對(duì)照組設(shè)為DMS0;
[0144] (4)分別在接下來第1天，7天，14天，28天和100天數(shù)取出對(duì)應(yīng)離心管中的浸提液， 每個(gè)離心管取出2mL;
[0145] (5)為了消除組內(nèi)降解液之間的差異，將組內(nèi)各管中的浸提液混勻之后放在一個(gè) 離心管中，并做好標(biāo)記。
[0146] (b)Gel 1浸提液對(duì)NSCs的成球能力檢測(cè)
[0147] (1)將P2代的NSCs重懸之后，細(xì)胞計(jì)數(shù)板下計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度均勻一致；
[0148] (2)將細(xì)胞接種在12孔板內(nèi)，每孔lmL，接種24h后在每孔中加入0.2mL的浸提液，觀 察24h、48h、72h后NSC的成球情況；
[0149] (3)顯微鏡下計(jì)數(shù)任意5個(gè)視野下的細(xì)胞球數(shù)量，計(jì)數(shù)每10000個(gè)細(xì)胞所形成的細(xì) 胞球的數(shù)量。
[0150] 觀察72小時(shí)后，NSCs在不同時(shí)間取出的Ge 1 1浸提液中成球的顯微鏡圖見圖12，在 不同時(shí)間取出的Ge 1 1浸提液中每10000個(gè)細(xì)胞所形成的細(xì)胞球的數(shù)量如圖13所示。圖12和 圖13中，A表示對(duì)照組，B表示第1天取出浸提液，C表示第7天取出浸提液，D表示第14天取出 浸提液，E表示第28天取出浸提液，F(xiàn)表示第100天取出浸提液。
[0151 ] Gel 1的浸提液對(duì)NSCs成球能力檢測(cè)結(jié)果為:水凝膠的浸提液加入NSC的培養(yǎng)基之 后，各組NSC細(xì)胞均生長狀態(tài)良好，細(xì)胞與對(duì)照組相比，均有一定的成球生長趨勢(shì)，而且隨著 時(shí)間點(diǎn)的推遲，神經(jīng)球的體積不斷增大，24h、48h、72h顯微鏡下計(jì)數(shù)，任意5個(gè)視野下的細(xì)胞 球數(shù)量與對(duì)照組相比統(tǒng)計(jì)無明顯差異。
[0152] 實(shí)施例15 Gel 1(實(shí)施例6所述水凝膠)浸提液對(duì)斑馬魚胚胎形成的作用研究
[0153] (1)將實(shí)施例6所述水凝膠(Gel 1)分別置于PBS中，浸泡1天、7天、14天、28天和100 天，得到5份Gel 1浸提液；
[0154] (2)配置5組分別含上述5份Gel 1浸提液的斑馬魚營養(yǎng)水，每組營養(yǎng)水中浸提液的 含量分別為10%，20%，30%，同時(shí)將DMS0作為陽性對(duì)照；
[0155] (3)每組挑選30個(gè)斑馬魚卵，將斑馬魚卵置于各組斑馬魚營養(yǎng)水中，同時(shí)將斑馬魚 卵置于PEG提取物中，以作對(duì)比；
[0156] (4)分別在斑馬魚胚胎形成后(1^〇241^^，481^^，721^^和961^^對(duì)斑馬魚胚胎進(jìn) 行拍照后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
[0157] 分別在241^^，481^^，721^^和961^^對(duì)斑馬魚的胚胎進(jìn)行觀察，斑馬魚胚胎在5組 含Gel 1浸提液的營養(yǎng)水和PEG提取物中拍照?qǐng)D片如圖14所示，對(duì)斑馬魚的胚胎進(jìn)行拍照后 的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果如圖15所示。圖14和圖15中，A表示浸泡1天所得浸提液，B表示浸泡7天所得 浸提液，C表示浸泡14天所得浸提液，D表示浸泡28天所得浸提液，E表示浸泡100天所得浸提 液;圖14中F表示PEG提取物。
[0158] 由圖可見，Gel 1的浸提液的三個(gè)濃度組隊(duì)斑馬魚的胚胎形成幾乎沒有影響，各組 當(dāng)中斑馬魚死亡數(shù)量為0-1個(gè)，甚至到其胚胎形成時(shí)（96hpf)，各組的死亡數(shù)均不超過3個(gè)； 而在陽性對(duì)照組，斑馬魚的胚胎卻在形成早期就出現(xiàn)了畸形不生長。到96hpf時(shí)，30個(gè)胚胎 幾乎全部死亡。由圖14中F可知，PEG提取物導(dǎo)致斑馬魚的胚胎死亡，這種材料存在毒性。
[0159] 實(shí)施例16 Gel 1植入脊髓損傷的大鼠體內(nèi)之后對(duì)大鼠的肝、腎毒性的作用研究
[0160] (1)首先制作大鼠脊髓損傷模型，將水凝膠負(fù)載神經(jīng)干細(xì)胞聯(lián)合移植至脊髓損傷 模型動(dòng)物體內(nèi)，具體方法為:購買雌性SD大鼠（中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），體重180g-220g，施 行T9-10脊髓全橫斷手術(shù)。大鼠隨機(jī)分組，每組12只：對(duì)照組(PBS對(duì)照組）；單純NSC組;單純 水凝膠(Gel)組;Gel+NSC組(Gel 1+NSC或Gel 2+NSC)。動(dòng)物手術(shù)前用10%水合氯醛(3.5mg/ kg)腹腔進(jìn)行麻醉，無菌條件下一次切開皮膚，皮下組織，分離肌肉，解剖顯微鏡下切除錐 板，打開硬脊膜，暴露T9-10脊髓，以T10為中心，頭向及尾向均切除1mm脊髓組織，使脊髓縱 向形成約2mm長的損傷裂隙。用無菌棉球充分止血，在脊髓裂隙中用微量注射器分別植入 PBS、NSC、Gel 1+NSC或Gel 2+NSC，各組移植總量均為20yL。植入后解剖顯微鏡下依次縫合 硬脊膜，肌肉和皮膚，無菌敷料包扎切口。術(shù)后一日兩次人工協(xié)助膀胱排尿排便，直至大鼠 的膀胱自主排尿功能恢復(fù)。其他照常規(guī)喂飼。
[0161] (2)移植后1周、4周、8周取大鼠腹腔靜脈血，檢測(cè)動(dòng)物的肝腎功能；
[0162] (3)對(duì)大鼠肝腎進(jìn)行取材后進(jìn)行切片的HE常規(guī)染色，觀察動(dòng)物肝及腎的結(jié)構(gòu)，HE染 色的步驟為:取致死劑量的水合氯醛麻醉動(dòng)物;快速打開胸腔，暴露心臟，剪去右心耳，采取 左心室至升主動(dòng)脈灌注;先快速灌注37°C生理鹽水100mL;繼續(xù)灌注4°C保存的含4%多聚甲 醛300ml，先快后慢，共約lh;取大鼠脊髓，4%多聚甲醛后固定過夜;30%高糖溶液脫水冷藏 保存;組織用0CT包埋，冰凍切片機(jī)切取ΙΟμπι縱切或橫切標(biāo)本。所有標(biāo)本凍存于-20°C直至使 用。（體內(nèi)試驗(yàn)時(shí)用)各組的脊髓節(jié)段標(biāo)本進(jìn)行常規(guī)HE染色，標(biāo)本在光學(xué)顯微鏡下觀察?？v切 矢狀面的脊髓標(biāo)本應(yīng)用尼氏染色進(jìn)行神經(jīng)元計(jì)數(shù)，每只大鼠隨機(jī)取8-10張切片行細(xì)胞計(jì) 數(shù)。
[0163] 上述步驟(3)中對(duì)大鼠進(jìn)行多聚甲醛灌注后，肝腎進(jìn)行取材后行切片的HE染色，鏡 下觀察Gel+NSC組大鼠的肝(A-C)腎(D-F)結(jié)構(gòu)如圖16所示。研究發(fā)現(xiàn)大鼠的肝腎功能的化 驗(yàn)指標(biāo)均在正常的范圍之內(nèi)，大鼠的肝臟可以看見完整的肝小葉，腎小球的結(jié)構(gòu)也比較完 整。說明移植該水凝膠之后再至少8W內(nèi)沒有對(duì)大鼠的肝腎功能有不良的影響。
[0164] 聯(lián)合移植減小脊髓損傷面積的研究：聯(lián)合移植8W后處死動(dòng)物，取出脊髓進(jìn)行HE切 片染色，四組大鼠的脊髓損傷部位均有不同程度的恢復(fù)。用Luxol Fast Blue對(duì)實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行 染色并且用HE和曙紅復(fù)染的顯微鏡圖如圖17(比例尺為200mm)所示。其中，A表示對(duì)照組，B 表示單純NSCs組，C表示Gel 1+NSCs組;D表示Gel 2+NSCs組。對(duì)脊髓中央空洞的面積進(jìn)行測(cè) 量后，發(fā)現(xiàn)Gel 1+NSCs組脊髓損傷斷面處的空洞面積最小，平均為223336.96 ± 123μπι2(Ρ〈 0.05)，Gel 2+NSCs組脊髓損傷斷面處的空洞面積243653.47±146μπι2,單純NSCs組大鼠 236843.87 ± 184μπι2，較Gel 2聯(lián)合NSCs組還更好(P〈0.05)。對(duì)照組脊髓損傷斷面處的空洞 面積最大為249589.52±198以1112(?〈0.05)，由上述數(shù)據(jù)可以得知，6611聯(lián)合吣〇8(6611 + NSCs組)移植對(duì)脊髓損傷的修復(fù)效果最好。
[0165] 聯(lián)合移植促進(jìn)神經(jīng)纖維的貫通(NF200)的研究：由于脊髓損傷功能的恢復(fù)的一個(gè) 有力的證據(jù)就是神經(jīng)軸突的恢復(fù)生長，為了進(jìn)一步觀察脊髓損傷端段周圍神經(jīng)軸突是否恢 復(fù)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)應(yīng)用神經(jīng)軸突的特異性染色marker NF200對(duì)脊髓切片進(jìn)行染色觀察，NF200的 免疫熒光結(jié)果如圖18和圖19所示。圖18和圖19中，control表示對(duì)照組。四組(對(duì)照組、單純 NSC組、單純水凝膠組；Gel+NSC組）中NF200的陽性細(xì)胞數(shù)目分別為38.8±3.2%; 43.3土 5.3%;70.3±2.5% ;57.8±4.5%。四組之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)均有差異(卩〈0.05)。此實(shí)驗(yàn)說明，聯(lián) 合移植治療脊髓損傷的策略能使脊髓損傷局部的神經(jīng)軸突的結(jié)構(gòu)恢復(fù)。
[0166] 聯(lián)合移植減少損傷部位細(xì)胞的凋亡的研究:我們?cè)O(shè)計(jì)了將不同組的水凝膠移植進(jìn) 入大鼠脊髓損傷的模型，結(jié)果表明SCI大鼠的結(jié)構(gòu)和功能均得到了好的修復(fù)。為了進(jìn)一步闡 明SCI移植后的修復(fù)機(jī)制，我們對(duì)不同處理組的SCI大鼠8W后的脊髓切片進(jìn)行了凋亡檢測(cè)。 脊髓的凋亡細(xì)胞采用Promega Dead End Tunel System試劑盒進(jìn)行分析與計(jì)數(shù)。用TUNEL法 檢測(cè)的冰凍脊髓切片均是在脊髓損傷5天后取材的，具體按照按說明書的步驟進(jìn)行，在熒光 顯微鏡觀察，觀察的結(jié)果如圖20 JUNEL陽性細(xì)胞的計(jì)數(shù)比照尼氏染色法中涉及到的方法進(jìn) 行。凋亡細(xì)胞的計(jì)數(shù)結(jié)果如圖21所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn):對(duì)照組（圖中用contol表示）、單純NSC組、 Gel 1+NSCs組、Gel2+NSCs組脊髓切片細(xì)胞的凋亡率分別為：11 % ±0 · 041;5 · 2% ±0 · 032; 2.5%±0.014;3%±0.023。其中，對(duì)照組與其他三組相比凋亡率最高(？〈0.01)，單純吧(：組 與Gel l+NSCs、Gel 2+NSCs組比較凋亡率增高(P〈0.05)，而Gel 1+NSCs組、Gel 2+NSCs組的 凋亡率并沒有明顯的差異(P>〇.〇5)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：移植NSCs、Gel l+NSCs、Gel 2+NSCs 均能減少SCI區(qū)域的細(xì)胞凋亡數(shù)，均對(duì)SCI具有一定的修復(fù)效果，以水凝膠Gel 1+NSCs移植 效果最為顯著。
[0167] 實(shí)施例17 BBB評(píng)分及電生理檢測(cè)
[0168] (a)BBB評(píng)分:大鼠脊髓橫斷模型制作成功后，按照BBB評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)大鼠肢體功能恢 復(fù)情況進(jìn)行評(píng)估。記錄時(shí)要將大鼠置于開放區(qū)域、容許大鼠自行活動(dòng)，尋找2名完全不知情 實(shí)驗(yàn)分組的人員觀察大鼠的軀干、尾巴及后肢的行為表現(xiàn)進(jìn)行打分，自手術(shù)第二天開始記 錄，以lw為周期，連續(xù)觀察8w。
[0169] (b)脊髓誘發(fā)電位(SCEP)
[0170] (1)采集SCEP信號(hào)時(shí)的參數(shù)設(shè)置為：電刺激器輸出刺激脈沖間隙50ys，頻率為5HZ， 電流為10mA。
[0171] (2)脊髓全橫斷3w后，用10%水合氯醛（3.5ml/kg)麻醉大鼠，立體定位儀進(jìn)行固 定。完全暴露T1-L1椎體，將刺激電極插入到T6-7的棘間韌帶，引導(dǎo)電極插入到T12-L1的棘 間韌帶，參比電極置于皮下。每只大鼠取1 〇〇次SCEP反應(yīng)的平均值。
[0172] (3)按以上設(shè)置的參數(shù)用AD-board(PCI-6221)對(duì)SCEP負(fù)波的幅度進(jìn)行檢測(cè)和記 錄。
[0173]聯(lián)合移植促進(jìn)大鼠的功能恢復(fù)和電生理指標(biāo)進(jìn)一步證明聯(lián)合移植治療脊髓損傷 的策略不僅能使脊髓損傷局部的神經(jīng)軸突的結(jié)構(gòu)恢復(fù)，功能也有一定的恢復(fù)。
[0174]最后所應(yīng)當(dāng)說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對(duì)本發(fā)明保 護(hù)范圍的限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng) 理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì) 和范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種聚合物，其特征在于:所述聚合物的結(jié)構(gòu)如式(I)所示：其中，m與n的比值為6:2.4。2. 如權(quán)利要求1所述的聚合物，其特征在于:所述聚合物的分子量為12000~13000。3. -種含有如權(quán)利要求1或2所述聚合物的水凝膠。4. 如權(quán)利要求3所述的水凝膠，其特征在于:所述水凝膠還含有短肽，所述短肽與所述 聚合物中全部雙鍵的摩爾比為（10~30): 100。5. 如權(quán)利要求4所述的水凝膠，其特征在于:所述短肽為RGD肽。6. 如權(quán)利要求4或5所述的水凝膠，其特征在于:所述短肽與所述聚合物中全部雙鍵的 摩爾比為30:100。7. 如權(quán)利要求4所述的水凝膠，其特征在于:所述水凝膠還含有透明質(zhì)酸，且所述水凝 膠中，聚合物、短肽的質(zhì)量之和與透明質(zhì)酸質(zhì)量的比為1:1~2:1。8. 如權(quán)利要求7所述的水凝膠，其特征在于:所述水凝膠中，短肽與聚合物中全部雙鍵 的摩爾比為30:100,且聚合物、短肽的質(zhì)量之和與透明質(zhì)酸質(zhì)量的比為2:1。9. 如權(quán)利要求7所述的水凝膠，其特征在于:所述水凝膠中，短肽與聚合物中全部雙鍵 的摩爾比為30:100,且聚合物、短肽的質(zhì)量之和與透明質(zhì)酸質(zhì)量的比為1: 1。10. 如權(quán)利要求3~9任一項(xiàng)所述的水凝膠在制備用于治療脊髓損傷的藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C08J3/075GK106046340SQ201610382673
【公開日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年5月31日
【發(fā)明人】鄧宇斌, 全大萍, 楊瑞瑞
【申請(qǐng)人】中山大學(xué)附屬第醫(yī)院, 中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院