發(fā)明領(lǐng)域

本公開涉及基于細(xì)胞的免疫治療和藥物相關(guān)的組合物和方法。本公開尤其涉及用于治療癌癥的治療法。

背景

基于細(xì)胞的免疫治療對(duì)于癌癥治療有很大的希望。然而，很難獲得大量可以有效靶向腫瘤細(xì)胞的抗腫瘤特異性效應(yīng)物免疫細(xì)胞。細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(即cik)是細(xì)胞毒性免疫效應(yīng)細(xì)胞，由于cik具有抗腫瘤細(xì)胞毒性和多樣的t細(xì)胞受體特異性而成為新一代抗腫瘤免疫細(xì)胞治療的強(qiáng)有力的候選物。

cik是來(lái)自離體或者體外擴(kuò)增細(xì)胞的異質(zhì)細(xì)胞群體。cik可以在可溶性因子，例如抗cd3抗體、ifn-γ和il-2的存在下在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下產(chǎn)生。cik細(xì)胞可以同時(shí)表達(dá)t細(xì)胞標(biāo)志物cd3和自然殺傷細(xì)胞(即nk)標(biāo)志物cd56，并且具有t和/或nk細(xì)胞表型?；赾ik的治療成為有希望的癌癥治療方法，主要因?yàn)閏ik擴(kuò)增相對(duì)容易，并且cik具有不受主要組織相容性復(fù)合物(即mhc)限制的t和nk細(xì)胞的抗腫瘤活性。

然而，對(duì)于基于細(xì)胞的免疫治療存在已知的挑戰(zhàn)?；诩?xì)胞的免疫治療通常是劑量限制性的、時(shí)間限制性的、昂貴的、勞動(dòng)密集型的，并且尚未轉(zhuǎn)化為常規(guī)的臨床應(yīng)用。

因此，需要改進(jìn)目前基于細(xì)胞的免疫治療以提供更有效率和效果的癌癥治療方法，該治療方法更容易制備、具有更好的臨床穩(wěn)定性和功效以及降低的系統(tǒng)毒性。本公開通過提供顯著改善癌癥患者的治療和管理的新型組合物和方法解決了改進(jìn)基于細(xì)胞的免疫治療的需要。

概述

本技術(shù)涉及一種組合物，其包含msbody和細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞，其中所述msbody包含：a)對(duì)腫瘤抗原具有特異性的第一抗原結(jié)合部分，和b)與所述免疫細(xì)胞結(jié)合的第二抗原結(jié)合部分。

在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞是細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷(cik)細(xì)胞、t細(xì)胞、自然殺傷(nk)細(xì)胞、自然殺傷t細(xì)胞或者淋巴因子激活的殺傷(lak)細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是所述細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷(cik)細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述msbody與所述細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷(cik)細(xì)胞的細(xì)胞表面或者膜蛋白結(jié)合。

在一些實(shí)施方案中，所述蛋白質(zhì)是cd3或者fc受體。在一些實(shí)施方案中，所述腫瘤抗原選自所述組，該組由egfr、her2、ep-cam、cd20、cd30、cd33、cd47、cd52、cd133、cea、gpa33、粘蛋白、tag-72，cix、psma、葉酸結(jié)合蛋白、gd2、gd3、gm2、vegf、vegfr、整聯(lián)蛋白αvβ3、整聯(lián)蛋白α5β1、erbb2、erbb3、met、igf1r、epha3、trailr1、trailr2、rankl、fap和生腱蛋白組成。

在一些實(shí)施方案中，所述cik細(xì)胞包含異質(zhì)細(xì)胞群體。在一些實(shí)施方案中，所述異質(zhì)細(xì)胞群體包含至少兩個(gè)細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述cik細(xì)胞是dc3+cd56+細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述cik細(xì)胞針對(duì)腫瘤細(xì)胞具有非mhc限制性細(xì)胞溶解活性。

在一個(gè)方面，本技術(shù)還提供了一種用于制備包含msbody和細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞的組合物的方法。

在另一個(gè)方面，本技術(shù)進(jìn)一步提供了一種治療包括癌癥患者的患者的方法，包括：a)從所述患者獲得外周血淋巴細(xì)胞(pbl)樣品；b)用抗cd3抗體、ifn-γ和il-2孵育pbl以獲得cik細(xì)胞；c)用雙特異性抗體武裝所述cik細(xì)胞，其中每個(gè)msbody包含對(duì)腫瘤抗原具有抗原結(jié)合特異性的第一抗原結(jié)合部分，和與所述cik細(xì)胞結(jié)合的第二抗原結(jié)合部分，和d)施用所述具有結(jié)合的雙特異性抗體武裝的cik細(xì)胞到有需要的患者。

在一個(gè)方面，本技術(shù)提供了一種包含組合物的試劑盒，所述組合物包含msbody和細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞，其中所述msbody包含：a)對(duì)腫瘤抗原具有特異性的第一抗原結(jié)合部分，和b)與所述細(xì)胞結(jié)合的第二抗原結(jié)合部分，以及使用說明書。

附圖簡(jiǎn)述

作為本公開的實(shí)施方案，提供的是僅通過示例而非限制說明的附圖，其中：

圖1描繪了雙特異性抗體(msbody)可以武裝在cik細(xì)胞上并且裂解腫瘤細(xì)胞?？筩d3特異性單鏈抗體可以由多種msbody抗體共享。靶抗原特異性單體抗體對(duì)于每一種msbody抗體是不同的，并且可以識(shí)別靶標(biāo)，例如her2或者ep-cam。所有msbody可以在表達(dá)cd3的活化cik細(xì)胞的表面上武裝，以形成武裝活化cik細(xì)胞(acc)。如右圖所示，msbody抗體可以通過同時(shí)結(jié)合cd3和靶抗原來(lái)瞬時(shí)連接cik細(xì)胞和癌細(xì)胞，同時(shí)，抗體的fc部分可以結(jié)合免疫輔助細(xì)胞的fc受體。這觸發(fā)cik細(xì)胞和免疫輔助細(xì)胞活化，包括細(xì)胞毒性顆粒融合、瞬時(shí)細(xì)胞因子釋放和/或增殖。附著癌細(xì)胞的重定向裂解涉及穿孔素的膜穿孔以及由顆粒酶誘導(dǎo)的繼發(fā)性程序性細(xì)胞死亡。

圖2描述了1％瓊脂糖凝膠電泳。a.泳道m(xù)：dl2000標(biāo)志物；泳道1：抗-ep-camhc；泳道2：抗ep-camlc；b.泳道m(xù)：dl10000標(biāo)志物；泳道1：赫賽汀hc；泳道2：l2k-scfv；泳道3：赫賽汀lc。

圖3描述了考馬斯藍(lán)染色的sds-page凝膠和通過hplc-sec檢測(cè)的雙特異性抗體的純度。a.考馬斯藍(lán)染色的還原的8％sds-page凝膠。b.考馬斯藍(lán)染色的未還原的6％sds-page凝膠(泳道m(xù)：蛋白標(biāo)志物，泳道1.her2xcd3msbody，泳道2.ep-camxcd3msbody)；c.純化的her2xcd3msbody；d.純化的ep-camxcd3msbody。

圖4描述了her2×cd3msbody與sk-br-3細(xì)胞(a)和jurkat(b)細(xì)胞表面結(jié)合的流式細(xì)胞分析；黑色實(shí)線：msbody和黑色虛線：赫賽汀或者l2k單克隆抗體。

圖5描述了ep-camxcd3msbody與sw480細(xì)胞(a)和jurkat(b)細(xì)胞表面結(jié)合的流式細(xì)胞分析；黑色實(shí)線：msbody和黑色虛線：抗-ep-cam單克隆抗體或者l2k單克隆抗體。

圖6是通過抗-cd45/cd3/cd56抗體的facs檢測(cè)cik細(xì)胞的表型。a.cd45陽(yáng)性對(duì)照；b.cd3和cd56陰性對(duì)照；c.cd45陽(yáng)性人群；d.右上象限顯示cd3和cd56雙陽(yáng)性。

圖7描述了msbody分子介導(dǎo)的共結(jié)合分析。a.未經(jīng)cfse或pkh26染色的sk-br-3和cik共結(jié)合陰性對(duì)照；b.經(jīng)cfse和pkh26染色的sk-br-3和cik共結(jié)合對(duì)照，分別不加msbody；c.右上象限顯示與msbody共結(jié)合的兩種細(xì)胞。

圖8描述了msbody武裝活化cik細(xì)胞(acc)的特異性。通過流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定具有從100nm至0.78nm一系列濃度的her2×cd3msbody武裝活化的cik細(xì)胞，pe標(biāo)記的抗人iggfc。

圖9描述了武裝活化cik細(xì)胞(acc)裂解sk-br-3乳腺癌細(xì)胞。(■)her2×cd3msbody的系列稀釋液或者(●)100nmhigg。acc與sk-br-3靶細(xì)胞以e:t＝5:1比例孵育，24小時(shí)后通過使用熒光染料cfse和pi的基于流式細(xì)胞檢測(cè)來(lái)測(cè)定細(xì)胞裂解。圖示來(lái)自一式三份測(cè)定的平均值。

圖10描述了her2×cd3msbody誘導(dǎo)的針對(duì)sk-br-3細(xì)胞的細(xì)胞毒性。24小時(shí)(a)或48小時(shí)(b)后測(cè)定細(xì)胞裂解，使用her2×cd3msbody(●)赫賽汀(■)higg(▼)的系列稀釋液引入細(xì)胞裂解，并且使用graphpadprism軟件測(cè)定ec50值和最大裂解。

圖11描述了ep-cam×cd3msbody誘導(dǎo)的針對(duì)sw480細(xì)胞的細(xì)胞毒性結(jié)果。24小時(shí)(a)或48小時(shí)(b)后測(cè)定細(xì)胞裂解，使用ep-cam×cd3msbody(■)抗-ep-cam單克隆抗體(▼)higg(○)的系列稀釋液引入細(xì)胞裂解，使用graphpadprism軟件測(cè)定ec50值和最大裂解。

圖12描述了武裝活化cik細(xì)胞(acc)可以抑制腫瘤生長(zhǎng)，(●)無(wú)cik細(xì)胞和msbody(■)注射未武裝的cik細(xì)胞(▲)注射用her2×cd3msbody武裝的cik細(xì)胞。

附圖的部分或所有是用于示例的示意性表示；因此，它們不必描述所示元件的實(shí)際相對(duì)尺寸或者位置。提供附圖是出于說明一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例的目的，明確理解它們將不用于限制以下權(quán)利要求的范圍或含義。

詳述

貫穿本公開，本文涉及本發(fā)明營(yíng)養(yǎng)物、組合物和方法的多種實(shí)施方案。多種實(shí)施方案的描述旨在提供各種說明性示例而不應(yīng)解釋為對(duì)替代物的描述。相反，應(yīng)當(dāng)注意，本文提供的多種實(shí)施方案的描述可以具有重疊的范圍。本文討論的實(shí)施方案僅僅是說明性的，并且不意味著限制本公開的范圍。

同樣貫穿本公開，多種出版物、專利和公開的專利說明書通過識(shí)別引文來(lái)引用。這些出版物、專利和公開的專利說明書公開的內(nèi)容在此通過引用并入本公開中，以更全面地描述本公開所述領(lǐng)域的狀態(tài)。

定義

如在說明書和權(quán)利要求書中所用，單數(shù)形式“一”，“一個(gè)”和“所述”包括復(fù)數(shù)指代，除非上下文另有明確規(guī)定。例如，術(shù)語(yǔ)“電極”包括多個(gè)電極，包括其混合物。

如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“包含”旨在表示裝置和方法包括的組件或步驟，但不排除其他?！盎旧嫌伞M成”當(dāng)用于限定裝置和方法時(shí)，應(yīng)當(dāng)意味著排除對(duì)該組合具有任何實(shí)質(zhì)意義的其它組件或步驟?！坝伞M成”應(yīng)當(dāng)意味著排除其它組件或步驟。這些過渡術(shù)語(yǔ)中的每一個(gè)所限定的實(shí)施方案在本公開的范圍內(nèi)。

所有數(shù)字名稱，例如距離、尺寸、溫度、時(shí)間、電壓和濃度，包括范圍，是以±0.1的增量變化的近似值。應(yīng)當(dāng)理解是，盡管不總是明確地指出，所有的數(shù)字標(biāo)號(hào)前都有術(shù)語(yǔ)“約”。還應(yīng)當(dāng)理解是，盡管不總是明確說明，本文所描述的組件僅僅是示例性的并且這些組件的等效物在本領(lǐng)域是已知的。

“腫瘤抗原”是在腫瘤細(xì)胞中產(chǎn)生的抗原物質(zhì)，即它在宿主中觸發(fā)免疫應(yīng)答。腫瘤抗原可用于鑒定腫瘤細(xì)胞并且對(duì)用于癌癥治療是潛在的候選物。機(jī)體中的正常蛋白質(zhì)不是抗原性的。然而，在腫瘤發(fā)生過程中，某些蛋白質(zhì)產(chǎn)生或者過表達(dá)并因此對(duì)機(jī)體顯示“外源”。這可能包括與免疫系統(tǒng)良好隔離的正常蛋白質(zhì)、通常以極小量產(chǎn)生的蛋白質(zhì)、通常僅在某些發(fā)育階段產(chǎn)生的蛋白質(zhì)或者其結(jié)構(gòu)由于突變而修飾的蛋白質(zhì)。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞”是指當(dāng)用本公開的雙特異性抗體激活和武裝時(shí)，靶向并殺死腫瘤細(xì)胞或細(xì)胞系或被病原體感染的細(xì)胞的免疫系統(tǒng)的細(xì)胞。示例的細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞包括但不限于cik細(xì)胞、t細(xì)胞、cd8+t細(xì)胞、活化的t細(xì)胞、單核細(xì)胞、自然殺傷(nk)細(xì)胞、nkt細(xì)胞、淋巴因子激活的殺傷(lak)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“多肽”意在包括單個(gè)“多肽”以及多個(gè)“多肽”，并且是指由通過酰胺鍵(也稱為肽鍵)線性連接的單體(氨基酸)組成的分子。術(shù)語(yǔ)“多肽”是指兩個(gè)或者更多個(gè)氨基酸的任一條或多條鏈，而不是指特定長(zhǎng)度的產(chǎn)物。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白質(zhì)”、“氨基酸鏈”或用于指兩個(gè)或者更多個(gè)氨基酸的一條或多條鏈的任何其他術(shù)語(yǔ)包括在“多肽”的定義中，并且術(shù)語(yǔ)“多肽”可被這些術(shù)語(yǔ)的任一個(gè)替代或互換。術(shù)語(yǔ)“多肽”也意指多肽的表達(dá)后修飾的產(chǎn)物，包括但不限于糖基化、乙?；⒘姿峄?、酰胺化、通過已知的保護(hù)/封閉基團(tuán)的衍生化、蛋白水解切割或者通過非天然發(fā)生的氨基酸產(chǎn)生的修飾。多肽可來(lái)自天然生物源或者通過重組技術(shù)產(chǎn)生，但不必從指定的核酸序列翻譯而來(lái)。其可以以任何方式產(chǎn)生，包括通過化學(xué)合成。

“同源性”或者“同一性”或者“相似性”是指兩個(gè)肽之間或兩個(gè)核酸分子之間的序列相似性。同源性可以通過比較每個(gè)序列中為了比較目的而可以比對(duì)的位置來(lái)確定。當(dāng)比較序列中的位置被相同的堿基或氨基酸占據(jù)時(shí)，則分子在該位置是同源的。序列之間的同源性程度是由序列共享的匹配或者同源位置的數(shù)量的函數(shù)。盡管優(yōu)選小于25％的同一性，“不相關(guān)”或者“非同源”序列與本公開的序列之一仍共享小于40％的同一性，。

多核苷酸或者多核苷酸區(qū)域(或者多肽或者多肽區(qū)域)與另一個(gè)序列的“序列同一性”具有一定百分比(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或者99％)，是指當(dāng)比對(duì)時(shí)，在比較兩個(gè)序列時(shí)堿基(或者氨基酸)的百分比是相同的。這種比對(duì)和百分比同源性或者序列同一性可以使用本領(lǐng)域已知的軟件程序來(lái)測(cè)定，例如ausubel等，eds.(2007)currentprotocolsinmolecularbiology。生物等效多核苷酸是那些具有上述指定的百分比同源性和編碼具有相同或者相似生物活性的多肽。

術(shù)語(yǔ)“等效核酸或多核苷酸”是指與核酸或其互補(bǔ)序列的核苷酸序列具有一定程度的同源性或者序列同一性的核苷酸序列的核酸。雙鏈核酸的同源物意在包括與或者與其互補(bǔ)序列具有一定程度同源性的核苷酸序列的核酸。在一個(gè)方面，核酸的同源物能夠與核酸或其互補(bǔ)序列雜交。同樣，“等效多肽”是指與參考多肽的氨基酸序列具有一定程度同源性或者序列同一性的多肽。在一些方面，所述序列同一性是至少約70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％。在一些方面，所述等效序列保留參考序列的活性(例如表位結(jié)合)或者結(jié)構(gòu)(例如鹽橋)。

雜交反應(yīng)可以在不同“嚴(yán)格性”的條件下進(jìn)行。一般，低嚴(yán)格雜交反應(yīng)在約10×ssc，40℃下或者等效離子強(qiáng)度/溫度的溶液中進(jìn)行。中嚴(yán)格雜交通常在約6×ssc，50℃下進(jìn)行，以及高嚴(yán)格雜交反應(yīng)一般在約1×ssc，60℃下進(jìn)行。雜交反應(yīng)還可以在本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的“生理?xiàng)l件”下進(jìn)行。生理?xiàng)l件的非限制性實(shí)例是通常在細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的溫度、離子強(qiáng)度、ph和mg²⁺的濃度。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“可檢測(cè)標(biāo)記”意指直接或者間接地與待檢測(cè)組合物(例如多核苷酸或者蛋白質(zhì)例如抗體)直接或者間接綴合的可檢測(cè)的化合物或者組合物，以產(chǎn)生“標(biāo)記的”組合物。該術(shù)語(yǔ)還包括與多核苷酸綴合的序列，其將在插入序列表達(dá)時(shí)提供信號(hào)，例如綠色熒光蛋白(gfp)等。所述標(biāo)記可以由自身檢測(cè)(例如放射性同位素標(biāo)記或者熒光標(biāo)記)或者在酶標(biāo)記的情況下，可以催化可檢測(cè)的底物化合物或者組合物的化學(xué)變化。這些標(biāo)記可以適合于小規(guī)模檢測(cè)或者更適合于高通量篩選。因此，合適的標(biāo)記包括但不限于放射性同位素、熒光染料、化學(xué)發(fā)光化合物、染料和蛋白質(zhì)，包括酶。所述標(biāo)記可以簡(jiǎn)單地檢測(cè)或者可以定量。簡(jiǎn)單地檢測(cè)的響應(yīng)一般包括其存在僅被證實(shí)的響應(yīng)，而被量化的響應(yīng)一般包括具有可量化(例如可報(bào)告的數(shù)字)值(例如強(qiáng)度、極化和/或其它性質(zhì))的響應(yīng)。在發(fā)光或者熒光測(cè)定中，可檢測(cè)的響應(yīng)可能由直接使用與實(shí)際參與結(jié)合的測(cè)定組分相關(guān)聯(lián)的發(fā)光體或熒光團(tuán)，或者間接使用與另一個(gè)(例如報(bào)道分子或指示劑)組分相關(guān)聯(lián)的發(fā)光體或者熒光團(tuán)產(chǎn)生。

如本文所用，“抗體”或者“抗原結(jié)合多肽”是指特異性識(shí)別并結(jié)合抗原的多肽或者多肽復(fù)合物。抗體可以是一個(gè)完整抗體和任何抗原結(jié)合片段或者其單鏈。因此，術(shù)語(yǔ)“抗體”包括含有分子的任何蛋白質(zhì)或肽，所述分子包含結(jié)合抗原具有生物活性的免疫球蛋白分子的至少一部分。這樣的實(shí)例包括但不限于重鏈或輕鏈的互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)或者其配體結(jié)合部分、重鏈或者輕鏈可變區(qū)、重鏈或者輕鏈恒定區(qū)、框架(fr)區(qū)或者其任何部分、或者結(jié)合蛋白的至少一部分。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“抗體片段”或者“抗原結(jié)合片段”是抗體的一部分，例如f(ab')2、f(ab)2、fab'、fab、fv、scfv等。不管結(jié)構(gòu)如何，抗體片段與被完整抗體識(shí)別的相同抗原結(jié)合。術(shù)語(yǔ)“抗體片段”包括適體、鏡像異構(gòu)體和雙抗體。術(shù)語(yǔ)“抗體片段”還包括通過結(jié)合特異性抗原形成復(fù)合物而起抗體作用的任何合成或者基因工程蛋白。

“單鏈可變片段”或者“scfv”是指免疫球蛋白的重鏈(vh)和輕鏈(vl)可變區(qū)的融合蛋白。在一些方面，所述區(qū)域與10至約25個(gè)氨基酸的短接頭肽連接。所述接頭可富含靈活性的甘氨酸以及溶解性的絲氨酸或蘇氨酸，并且可以將vh的n-末端與vl的c-末端連接，或反之亦然。盡管去除了恒定區(qū)并且引入了接頭，該蛋白質(zhì)還是保留了原始免疫球蛋白的特異性。scfv分子是本領(lǐng)域已知的并且描述于例如美國(guó)專利no：5,892,019中。

術(shù)語(yǔ)“抗體”包括可以在生物化學(xué)上區(qū)分的多種類型廣泛的多肽。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道重鏈分為γ、μ、α、δ或者ε，其中有一些亞類。該鏈的性質(zhì)將抗體的“類別”分別確定為igg、igm、igaigg或ige。免疫球蛋白亞類(同種型)，例如igg1、igg2、igg3、igg4、igg5等，是經(jīng)過充分表征的并且已知其賦予了功能特異性。根據(jù)本公開，這些類別和同種型的抗體中的每個(gè)的修飾形式對(duì)于技術(shù)人員而言都是易于辨別的，因此它們都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。所有免疫球蛋白類型清楚地在本公開的范圍內(nèi)，以下討論總體上針對(duì)免疫球蛋白分子的igg類別。關(guān)于igg，其是標(biāo)準(zhǔn)免疫球蛋白分子，包含兩條相同的分子量約23,000道爾頓的輕鏈多肽和兩條相同的分子量為53,000-70,000的重鏈多肽。四條鏈通常通過二硫鍵以“y”構(gòu)型連接，其中輕鏈在"y"的開口處開始括住重鏈并延續(xù)至整個(gè)可變區(qū)。

本公開的抗體、抗原結(jié)合多肽、變體或者其衍生物包括但不限于多克隆、單克隆、多特異性、人、人源化、靈長(zhǎng)類化或者嵌合抗體；單鏈抗體；表位結(jié)合片段，例如fab、fab'和f(ab')2、fd、fvs、單鏈fvs(scfv)、單鏈抗體、二硫鍵連接的fv(sdfv)、包含vl或vh結(jié)構(gòu)域的片段、通過fab表達(dá)文庫(kù)產(chǎn)生的片段；以及抗獨(dú)特型(抗-id)抗體(包括例如本文公開的light抗體的抗-id抗體)。本公開的免疫球蛋白或者抗體分子可以是任何類型(例如igg、ige、igm、igd、iga和igy)、類別(例如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2)或者亞類的免疫球蛋白分子。

輕鏈分為kappa或lambda(κ，λ)。每種重鏈類可與κ或者λ輕鏈結(jié)合。一般地，當(dāng)免疫球蛋白由雜交瘤、b細(xì)胞或者遺傳改造的宿主細(xì)胞產(chǎn)生時(shí)，輕鏈和重鏈彼此共價(jià)鍵合，并且兩條重鏈的“尾”部通過共價(jià)二硫鍵或者非共價(jià)鍵相互結(jié)合。在重鏈中，氨基酸序列是由位于y構(gòu)型的叉狀末端的n末端開始直至位于各條鏈底端的c末端。

輕鏈和重鏈均被分成結(jié)構(gòu)和功能同源性區(qū)域。術(shù)語(yǔ)“恒定的”和“可變的”作為功能使用。在這方面，應(yīng)當(dāng)理解，輕(vl)鏈和重(vh)鏈部分的可變結(jié)構(gòu)域決定抗原識(shí)別和特異性。相反，輕鏈(cl)和重鏈(ch1、ch2或ch3)的恒定結(jié)構(gòu)域賦予重要的生物學(xué)性質(zhì)，例如分泌、經(jīng)胎盤運(yùn)動(dòng)性、fc受體結(jié)合、補(bǔ)體結(jié)合等。按照慣例，隨著恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域與抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)或氨基末端的距離越遠(yuǎn)，該結(jié)構(gòu)域的數(shù)量增加。n-末端部分是可變區(qū)并且在c-末端部分是恒定區(qū)，所述ch3和cl結(jié)構(gòu)域?qū)嶋H上分別包含重鏈和輕鏈的羧基末端。

如上所述，可變區(qū)允許抗體選擇性地識(shí)別并且特異性結(jié)合抗原上的表位。換言之，抗體的vl結(jié)構(gòu)域和vh結(jié)構(gòu)域、或者互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)的亞區(qū)相結(jié)合，形成了定義為三維抗原結(jié)合位點(diǎn)的可變區(qū)。這種四元抗體結(jié)構(gòu)在y的各個(gè)臂末端處形成了抗原結(jié)合位點(diǎn)。更具體地，抗原結(jié)合位點(diǎn)是由每個(gè)vh和vl鏈的三個(gè)cdr來(lái)定義的(即cdr-h1、cdr-h2、cdr-h3、cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3)。在一些情況下，例如衍生自駱駝科物種或者基于駱駝科動(dòng)物免疫球蛋白改造的某些免疫球蛋白分子，完整的免疫球蛋白分子可以僅由重鏈構(gòu)成而不具有輕鏈。例如參見hamers-casterman等，nature363:446-448(1993)。

在天然抗體中，存在于各個(gè)抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的6個(gè)“互補(bǔ)決定區(qū)”或者“cdr”是短的、非連續(xù)的氨基酸序列，當(dāng)所述的抗體在水性環(huán)境中呈現(xiàn)其三維構(gòu)型時(shí)，所述的氨基酸序列特異性地定位，從而形成抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域?？乖Y(jié)合結(jié)構(gòu)域中的其余氨基酸稱為“框架”區(qū)，其顯示低的分子內(nèi)可變性?？蚣軈^(qū)主要采用β-片構(gòu)型而cdrs形成連接β-片結(jié)構(gòu)的環(huán)，并且在某些情況下所述的環(huán)形成了β-片結(jié)構(gòu)的一部分。因此，框架區(qū)起到了形成支架的作用，其中所述的支架使得cdr通過鏈內(nèi)非共價(jià)作用以正確的方向定位。由定位的cdr形成的抗原結(jié)合位點(diǎn)定義了與位于免疫反應(yīng)性抗原上的表位互補(bǔ)的表面。這種互補(bǔ)的表面促進(jìn)了抗體與其同源的表位的非共價(jià)結(jié)合。對(duì)于任何給定的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，本領(lǐng)域的任何普通技術(shù)人員都可以容易地分別鑒定含cdr區(qū)域和框架區(qū)的氨基酸，這是因?yàn)檫@些氨基酸已經(jīng)被精確地定義(參見“sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,”kabat,e.等，u.s.departmentofhealthandhumanservices,(1983)；以及chothiaandlesk,j.mol.biol.,196:901-917(1987)，其整體通過引用并入本文)。

在本領(lǐng)域中使用和/或接受的術(shù)語(yǔ)具有兩個(gè)或者多個(gè)定義的情況下，本文所使用的術(shù)語(yǔ)的定義意在包括所有這樣的含義，除非明確地做出了相反的說明。具體實(shí)例為術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)決定區(qū)”(“cdr”)的使用，該術(shù)語(yǔ)描述的是在重鏈和輕鏈多肽的可變區(qū)內(nèi)發(fā)現(xiàn)的非連續(xù)的抗原結(jié)合位點(diǎn)。該特定區(qū)域已由kabat等，u.s.dept.ofhealthandhumanservices,“sequencesofproteinsofimmunologicalinterest”(1983)和由chothia等，j.mol.biol.196:901-917(1987)描述，其整體通過引用并入本文。根據(jù)kabat和chothia，在將該cdr彼此對(duì)比時(shí)，其定義包括氨基酸殘基的重疊或亞區(qū)。然而，關(guān)于抗體或其變體的cdr的定義應(yīng)用均在本文所定義和使用的術(shù)語(yǔ)的范圍內(nèi)。包含了特定cdr的確切殘基數(shù)將隨著cdr的序列和大小的變化而變化。根據(jù)抗體的可變區(qū)的氨基酸序列，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以通過常規(guī)方式確定哪些殘基包含特定的cdr。

本文公開的抗體可來(lái)自任何動(dòng)物來(lái)源，包括鳥類和哺乳動(dòng)物。優(yōu)選地，所述抗體是人、鼠、驢、兔、山羊、豚鼠、駱駝、美洲駝、馬或者雞抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述變區(qū)在來(lái)源中可以是condricthoid(例如來(lái)自鯊魚)。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“重鏈恒定區(qū)”包括衍生自免疫球蛋白重鏈的氨基酸序列。包含重鏈恒定區(qū)多肽包含以下中的至少一種ch1結(jié)構(gòu)域、鉸鏈(例如上游鉸鏈區(qū)，中游鉸鏈區(qū)和/或下游鉸鏈區(qū))結(jié)構(gòu)域、ch2結(jié)構(gòu)域、ch3結(jié)構(gòu)域或者其變體或片段。例如，用于本公開的結(jié)合多肽可以包括：包含ch1結(jié)構(gòu)域的多肽鏈；包含ch1結(jié)構(gòu)域，鉸鏈結(jié)構(gòu)域的至少一部分和ch2結(jié)構(gòu)域的多肽鏈；包含ch1結(jié)構(gòu)域和ch3結(jié)構(gòu)域的多肽鏈；包含ch1結(jié)構(gòu)域、鉸鏈結(jié)構(gòu)域的至少一部分和ch3結(jié)構(gòu)域的多肽鏈，或者包含ch1結(jié)構(gòu)域、鉸鏈結(jié)構(gòu)域、ch2結(jié)構(gòu)域和ch3結(jié)構(gòu)域的至少一部分的多肽鏈。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本公開的多肽包括包含ch3結(jié)構(gòu)域的多肽鏈。此外，用于本公開的結(jié)合多肽可以缺乏ch2結(jié)構(gòu)域的至少一部分(例如ch2結(jié)構(gòu)域的全部或部分)。如上所述，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解所述重鏈恒定區(qū)可以被修飾，使得它們?cè)诎被嵝蛄猩吓c天然存在的免疫球蛋白分子不同。

本文公開的抗體的重鏈恒定區(qū)可以衍生自不同的免疫球蛋白分子。例如多肽的重鏈恒定區(qū)可以包含衍生自igg1分子的ch1結(jié)構(gòu)域和衍生自igg3分子的鉸鏈區(qū)。在另一個(gè)實(shí)例中，重鏈恒定區(qū)可以包含部分衍生自igg1分子和部分衍生自igg3分子的鉸鏈區(qū)。在另一個(gè)實(shí)例中，重鏈部分可以包含部分地衍生自igg1分子和部分衍生自igg4分子的嵌合鉸鏈。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“輕鏈恒定區(qū)”包括衍生自抗體輕鏈的氨基酸序列。優(yōu)選地，輕鏈恒定區(qū)包含恒定kappa(κ)結(jié)構(gòu)域或者恒定lambda(λ)結(jié)構(gòu)域中的至少一個(gè)。

“輕鏈-重鏈對(duì)”是指可以通過輕鏈的cl結(jié)構(gòu)域和重鏈的ch1結(jié)構(gòu)域之間的二硫鍵形成二聚體的輕鏈和重鏈的集合。

如前所述，多種免疫球蛋白類別的恒定區(qū)的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型是熟知的。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“vh結(jié)構(gòu)域”包括免疫球蛋白重鏈的氨基末端可變結(jié)構(gòu)域并且術(shù)語(yǔ)“ch1結(jié)構(gòu)域”包括免疫球蛋白重鏈的第一(氨基最末端)恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域。ch1結(jié)構(gòu)域與vh結(jié)構(gòu)域相鄰并且是免疫球蛋白重鏈分子的鉸鏈區(qū)的氨基末端。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“ch2結(jié)構(gòu)域”包括例如采用常規(guī)的編號(hào)方案由抗體的約第244個(gè)殘基延伸至第360個(gè)殘基(第244個(gè)殘基至第360個(gè)殘基，kabat編號(hào)系統(tǒng)；第231-340個(gè)殘基，eu編號(hào)系統(tǒng)；參見kabat等，u.s.dept.ofhealthandhumanservices,“sequencesofproteinsofimmunologicalinterest”(1983))。ch2結(jié)構(gòu)域是獨(dú)特的，因?yàn)槠洳慌c另一個(gè)結(jié)構(gòu)域緊密配對(duì)。而是，兩條n連接的支鏈糖鏈插入在完整的天然igg分子的兩個(gè)ch2結(jié)構(gòu)域之間。此外，已經(jīng)充分證明了所述ch3結(jié)構(gòu)域從ch2結(jié)構(gòu)域延伸至igg分子的c末端，并且包含約108個(gè)殘基。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“鉸鏈區(qū)”包括將ch1結(jié)構(gòu)域與ch2結(jié)構(gòu)域連接的重鏈分子的部分。該鉸鏈區(qū)包含大約25個(gè)殘基，并且是柔性的，因此使得兩個(gè)n末端抗原結(jié)合區(qū)可以獨(dú)立地移動(dòng)。鉸鏈區(qū)可以細(xì)分為三個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域：上游，中部和下游鉸鏈結(jié)構(gòu)域(roux等，j.immunol161:4083(1998))。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“二硫鍵”包括在兩個(gè)硫原子之間形成的共價(jià)鍵。氨基酸半胱氨酸包含可以與第二個(gè)巰基形成二硫鍵或橋的巰基。在大部分天然存在的igg分子中，ch1和cl區(qū)通過二硫鍵連接，并且兩個(gè)重鏈在對(duì)應(yīng)于采用kabat標(biāo)號(hào)系統(tǒng)的239和242的位置(采用eu編號(hào)系統(tǒng)的226或229的位置)處通過二硫鍵連接。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“嵌合抗體”被用于指其中免疫反應(yīng)性區(qū)域或位點(diǎn)得自或衍生自第一種物種，而恒定區(qū)(根據(jù)本公開可以是完整的、部分的或者修飾的)得自第二種物種的任何抗體。在某些實(shí)施方案中，靶結(jié)合區(qū)或者位點(diǎn)來(lái)自非人來(lái)源(例如小鼠或靈長(zhǎng)類動(dòng)物)而恒定區(qū)是人的。

通過“特異性結(jié)合”或“對(duì)其具有特異性”，一般是指抗體通過其抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域與表位結(jié)合，并且這種結(jié)合需要抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域與所述表位之間一定的互補(bǔ)性。根據(jù)該定義，當(dāng)抗體通過其抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域比該抗體與隨意的、無(wú)關(guān)的表位結(jié)合得更容易與表位結(jié)合時(shí)，稱其與表位“特異性結(jié)合”。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“特異性”用于對(duì)某種抗體與某種表位結(jié)合的相對(duì)親和力進(jìn)行定性。例如，對(duì)于給定表位，可認(rèn)為抗體“a”比抗體“b”具有更高的特異性，或者與相關(guān)的表位“d”相比，可以認(rèn)為抗體“a”與表位“c”的結(jié)合具有更高的特異性。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“融合的”，“連接的”和“綴合的”是指雙特異性抗體中第一抗原結(jié)合部分和第二抗原結(jié)合部分之間的連接。這種連接可以通過重組(例如重組融合蛋白)或者化學(xué)方法引入。合適的化學(xué)手段的非限制性示例包括共價(jià)鍵、二硫鍵、氫鍵、靜電鍵合和構(gòu)象鍵，并且可涉及同型雙功能或者異型雙功能交聯(lián)劑的使用。合適的交聯(lián)和綴合方法公開于sen等，j.hemato.stemcellres.2001,10:247-260；美國(guó)專利no：us6,642,363和美國(guó)申請(qǐng)no：20060002852。

術(shù)語(yǔ)“同種異體”是指衍生自或者源于不同個(gè)體的樣品。同種異體樣品可以來(lái)自遺傳不同、遺傳相似(例如同胞)的不同個(gè)體。關(guān)于細(xì)胞、血漿或血清，該術(shù)語(yǔ)表示獲得組合物的個(gè)體與將施用組合物的個(gè)體不同。同種異體還可以指從多于一個(gè)非同一個(gè)體(供體)產(chǎn)生的樣品。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“治療”(“treat”或“treatment”)是指治療性治療和預(yù)防性或防護(hù)性措施，其中目的在于預(yù)防或減慢(減輕)不需要的生理變化或紊亂，例如癌癥的進(jìn)展。有益的或者所需要的臨床結(jié)果包括但不限于減輕癥狀、減輕疾病程度、穩(wěn)定(即，不惡化)疾病狀態(tài)、延遲或者減緩疾病進(jìn)展、改善或者減輕疾病狀態(tài)，以及緩解(部分或者全部)，無(wú)論是可檢測(cè)的或者不可檢測(cè)的。與在未接受治療下所期望的存活相比，“治療”還可以指延長(zhǎng)的存活。需要治療的對(duì)象包括已經(jīng)患有癥狀或紊亂的那些、以及傾向于具有癥狀或紊亂的那些或者其中癥狀或紊亂有待預(yù)防的那些。

“受試者”或者“個(gè)體”或者“動(dòng)物”或者“患者”或者“哺乳動(dòng)物”是指需要診斷，預(yù)后或者治療的任何受試者，尤其是哺乳動(dòng)物受試者。哺乳動(dòng)物受試者包括人，家養(yǎng)動(dòng)物，農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物，和動(dòng)物園、競(jìng)技或者寵物動(dòng)物例如狗、貓、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、馬、牛、奶牛等。

如本文所用，短語(yǔ)諸如“對(duì)需要治療的患者”或者短語(yǔ)“需要治療的受試者”包括如下受試者，例如哺乳動(dòng)物受試者，該受試者受益于本發(fā)明所使用的抗體或者組合物的施用，例如用于檢測(cè)、用于診斷程序和/或用于治療。

雙特異性抗體介導(dǎo)的基于細(xì)胞的免疫治療

本公開提供了用于改善治療功效并且減少基于細(xì)胞的免疫治療的不良作用的組合物和方法。通過將對(duì)腫瘤細(xì)胞具有特異性的抗體附著到免疫細(xì)胞(例如細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞)，該抗體可以有效地將免疫細(xì)胞靶向腫瘤(圖1)。出乎意料地，這種靶向?qū)е履[瘤殺傷的增強(qiáng)，表明靶向和細(xì)胞毒性之間的協(xié)同作用。

存在多種將抗體附著到細(xì)胞的方法。在一個(gè)方面，抗體還對(duì)免疫細(xì)胞具有特異性；因此這樣的抗體是具有雙重結(jié)合特異性的雙特異性抗體。通過將這樣的抗體與免疫細(xì)胞孵育，抗體將與免疫細(xì)胞結(jié)合。然后可以將抗體結(jié)合的免疫細(xì)胞施用于癌癥患者，其中該抗體識(shí)別腫瘤細(xì)胞并因此使免疫細(xì)胞接近腫瘤細(xì)胞。

在一些方面，所述免疫細(xì)胞是細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞。示例性細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞包括但不限于cik細(xì)胞、t細(xì)胞、cd8+t細(xì)胞、活化的t細(xì)胞、單核細(xì)胞、自然殺傷(nk)細(xì)胞、nkt細(xì)胞、淋巴因子激活的殺傷(lak)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞。

在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞是cik細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，雙特異性抗體與cik細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的結(jié)合提高了cik介導(dǎo)的針對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性。在一些實(shí)施方案中，這樣的結(jié)合誘導(dǎo)cik細(xì)胞的活化以及cik細(xì)胞針對(duì)腫瘤細(xì)胞或者細(xì)胞系的細(xì)胞毒性。在一些實(shí)施方案中，所述結(jié)合誘導(dǎo)cik細(xì)胞的活化，其可以導(dǎo)致cik細(xì)胞的脫粒。

在一些實(shí)施方案中，所述雙特異性抗體包含對(duì)腫瘤抗原具有特異性的第一抗原結(jié)合部分。腫瘤抗原的非限制性示例包括egfr、her2、ep-cam、cd20、cd30、cd33、cd47、cd52、cd133、cea、gpa33、粘蛋白、tag-72、cix、psma、葉酸結(jié)合蛋白、gd2、gd3、gm2、vegf、vegfr、整聯(lián)蛋白αvβ3、整聯(lián)蛋白α5β1、erbb2、erbb3、met、igf1r、epha3、trailr1、trailr2、rankl、fap和生腱蛋白。在一些實(shí)施方案中，所述第一抗原結(jié)合部分對(duì)與相應(yīng)的非腫瘤細(xì)胞相比在腫瘤細(xì)胞中過表達(dá)蛋白質(zhì)或者肽具有特異性。

在一些實(shí)施方案中，所述雙特異性抗體包含結(jié)合細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞的第二抗原結(jié)合部分。所述第二抗原結(jié)合部分是特異性結(jié)合在細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞(例如cik細(xì)胞)表面上表達(dá)的抗原或者蛋白質(zhì)或者多肽的任何分子。適用于本公開的細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞表面上表達(dá)的示例性非限制性抗原可包括cd2、cd3、cd4、cd5、cd8、cd11a、cd11b、cd14、cd16a、cd27、cd28、cd45、cd45ra、cd56、cd62l、fc受體、lfa、lfa-1、tcrαβ、ccr7、巨噬細(xì)胞炎癥蛋白1a、穿孔素和fas配體。在一些實(shí)施方案中，所述第二抗原結(jié)合部分結(jié)合細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞(例如cik細(xì)胞)的cd3。在一些實(shí)施方案中，所述第二抗原結(jié)合部分結(jié)合細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞的cd56。在一些實(shí)施方案中，所述第二抗原結(jié)合部分結(jié)合細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞的fc受體。在一些實(shí)施方案中，所述雙特異性抗體的fc區(qū)結(jié)合細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞的fc受體。

在一些實(shí)施方案中，所述雙特異性抗體對(duì)腫瘤抗原和cik細(xì)胞具有特異性，其使表達(dá)腫瘤抗原的腫瘤細(xì)胞接近c(diǎn)ik細(xì)胞，導(dǎo)致通過cik細(xì)胞的抗腫瘤細(xì)胞毒性消除腫瘤細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述雙特異性抗體對(duì)腫瘤抗原具有特異性，但對(duì)cik細(xì)胞不具有特異性，然而，所述雙特異性抗體的fc區(qū)可以結(jié)合cik細(xì)胞的fc受體，其進(jìn)而使腫瘤細(xì)胞緊密接近c(diǎn)ik細(xì)胞，導(dǎo)致通過cik細(xì)胞的抗腫瘤細(xì)胞毒性消除腫瘤細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述雙特異性抗體對(duì)cik細(xì)胞具有特異性，但對(duì)腫瘤細(xì)胞不具有特異性，然而，所述雙特異性抗體的fc區(qū)可以結(jié)合腫瘤細(xì)胞的fc受體，其進(jìn)而使所述腫瘤細(xì)胞緊密接近c(diǎn)ik細(xì)胞，導(dǎo)致通過cik細(xì)胞的抗腫瘤細(xì)胞毒性消除腫瘤細(xì)胞。

在一些實(shí)施方案中，不對(duì)稱雙特異性抗體的單價(jià)單元對(duì)腫瘤抗原具有特異性，并且所述雙特異性抗體的單鏈單元對(duì)cik細(xì)胞具有特異性。在一些實(shí)施方案中，不對(duì)稱雙特異性抗體的單價(jià)單元對(duì)cik細(xì)胞具有特異性，并且所述雙特異性抗體的單鏈單元對(duì)腫瘤抗原具有特異性。另一種雙特異性抗體具有兩個(gè)單鏈單元，其中一個(gè)對(duì)腫瘤抗原具有特異性并且另一個(gè)對(duì)cik細(xì)胞具有特異性。這些雙特異性抗體可以使細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞(例如cik細(xì)胞)接近腫瘤細(xì)胞，導(dǎo)致通過細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞的抗腫瘤細(xì)胞毒性消除腫瘤細(xì)胞。

在一些實(shí)施方案中，本公開提供了通過從患者獲得pbl或者pbmc樣品來(lái)治療患者(包括癌癥患者)的方法；用抗cd3抗體，ifn-γ和il-2孵育所述pbl或者pbmc以獲得cik細(xì)胞；用雙特異性抗體武裝所述cik細(xì)胞，其中每個(gè)雙特異性抗體包含對(duì)腫瘤抗原具有抗原結(jié)合特異性的第一抗原結(jié)合部分，和與所述cik細(xì)胞結(jié)合的第二抗原結(jié)合部分，并且施用所述具有結(jié)合的雙特異性抗體武裝的cik細(xì)胞到有需要的患者。本公開的抗原結(jié)合多肽、變體或者衍生物可用于與癌癥或者傳染病相關(guān)的某些治療和診斷方法。當(dāng)施用于患者時(shí)，所述雙特異性抗體武裝的細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞將靶向和消除病原體感染的腫瘤細(xì)胞或者細(xì)胞。

本文公開的所述組合物和方法為腫瘤或者癌癥或者感染病原體的患者提供了意想不到的和令人驚訝的有效治療，因?yàn)槲溲b所述細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞以實(shí)現(xiàn)理想的治療效果所需的雙特異性抗體的濃度低。本公開的雙特異性抗體能夠使所述細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞接近腫瘤細(xì)胞或感染的細(xì)胞以使所述細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞裂解它們。

在一些實(shí)施方案中，為了實(shí)現(xiàn)相同的期望效果，武裝所述細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞所需的所述雙特異性抗體的濃度比本領(lǐng)域中其他組合物至少低一個(gè)數(shù)量級(jí)。在一些實(shí)施方案中，用每10⁶個(gè)細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞0.001ng至50ng的所述雙特異性抗體的量武裝所述細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，用每10⁶個(gè)細(xì)胞0.01ng至5ng的所述雙特異性抗體的量武裝所述細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，用每10⁶個(gè)細(xì)胞0.1至1ng的所述雙特異性抗體的量武裝所述細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，用每10⁶個(gè)細(xì)胞1ng的所述雙特異性抗體的量武裝所述細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，用于武裝所述細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞的所述雙特異性抗體的濃度為100ng、50ng、40ng、30ng、20ng、15ng、10ng、5ng、4ng、3ng、2ng、1ng、0.5ng、0.1ng、0.05ng、0.01ng、0.005ng和0.001ng每10⁶個(gè)細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞。

細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷(cik)細(xì)胞

本公開的所述組合物包含雙特異性抗體和細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞，其中所述雙特異性抗體包含對(duì)腫瘤抗原具有特異性的第一抗原結(jié)合部分，和與所述細(xì)胞結(jié)合的第二抗原結(jié)合部分。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞是細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷(cik)細(xì)胞、t細(xì)胞、自然殺傷(nk)細(xì)胞、自然殺傷t細(xì)胞或者淋巴因子激活的殺傷(lak)細(xì)胞。

cik細(xì)胞是來(lái)自初始體細(xì)胞，例如t細(xì)胞或者外周血淋巴細(xì)胞(pbl)的離體或者體外擴(kuò)增細(xì)胞的異質(zhì)群體。cik具有混合的t和nk細(xì)胞表型，并且能夠同時(shí)表達(dá)t細(xì)胞標(biāo)記物cd3和nk細(xì)胞標(biāo)記物cd56。在一些實(shí)施方案中，cik細(xì)胞的異質(zhì)群體包含至少兩個(gè)細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述cik細(xì)胞是cd3+cd56+細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述cik細(xì)胞是cd3+cd56-細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述cik細(xì)胞是cd3-cd56+細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述cik細(xì)胞針對(duì)腫瘤細(xì)胞或者細(xì)胞系具有非mhc限制性細(xì)胞溶解活性。在一些實(shí)施方案中，所述cik細(xì)胞具有抗腫瘤活性而不受tcr和mhc相互作用的限制。在一些實(shí)施方案中，所述cik細(xì)胞是具有不同tcr特異性的效應(yīng)cd8t細(xì)胞，并且可以以非mhc限制性方式溶解腫瘤細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，cik細(xì)胞的mhc非限制性腫瘤殺傷主要基于存在于cik細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞或者細(xì)胞系上的各種分子之間的相互作用。

cik細(xì)胞可以從具有初始cd4-cd8-表型的cd3+t淋巴細(xì)胞產(chǎn)生。cik細(xì)胞還可以由外周血單核細(xì)胞(即，pbmc)、外周血淋巴細(xì)胞(即，pbl)、以及骨髓細(xì)胞、臍帶血細(xì)胞或者能夠產(chǎn)生cik細(xì)胞的任何細(xì)胞類型產(chǎn)生。

用于擴(kuò)增cik細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易理解的，例如如lu等所述(anovelpopulationofexpandedhumancd3+cd56+cellsderivedfromtcellswithpotentinvivoantitumoractivityinmicewithseverecombinedimmunodeficiency,j.immunol.,1994,153(4):1687-1696)，其需要添加可溶性因子，例如ifn-γ、il-2和抗cd3抗體幾天至數(shù)周。不受理論的約束，加入ifn-γ以激活單核細(xì)胞并提供引起cik細(xì)胞的細(xì)胞毒性發(fā)展的信號(hào)?？筩d3抗體用于激活t細(xì)胞并提供促有絲分裂信號(hào)以誘導(dǎo)t細(xì)胞增殖，而il-2的添加隨后維持所述t細(xì)胞增殖。il-1、il-7和胸腺球蛋白的添加也已顯示有利于增加cik細(xì)胞的細(xì)胞毒性潛力(jiangj等，cytokine-inducedkillercellspromotingantitumorimmunity,j.translationalmed,2013,11:83；zollb等，generationofcytokine-inducedkillercellsusingexogenousinterleukin-2,-7or-12,cancerimmunolimmunother,1998,47(4):221-6)。

在一些實(shí)施方案中，同時(shí)表達(dá)t細(xì)胞標(biāo)志物cd3和自然殺傷(即，nk)細(xì)胞標(biāo)志物cd56(即，cd3+cd56+細(xì)胞)的擴(kuò)增的cik細(xì)胞，具有針對(duì)腫瘤細(xì)胞或細(xì)胞系的細(xì)胞毒性，也具有初始靜息和記憶t細(xì)胞的表型。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)在用于擴(kuò)增cik細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)約21天時(shí)，超過90％的擴(kuò)增細(xì)胞為cd3+細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，cd3+cd56+細(xì)胞的百分比在培養(yǎng)幾天至數(shù)周后還增加。在一些實(shí)施方案中，cd3+cd56+cik細(xì)胞還共表達(dá)cd2、tcrαβ和cd8。在一些實(shí)施方案中，cd3+cd56+cik細(xì)胞不表達(dá)nk細(xì)胞的標(biāo)志物cd16。

在一些實(shí)施方案中，cd3+cd56+細(xì)胞針對(duì)腫瘤細(xì)胞和細(xì)胞系介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用不依賴于mhc。在一些實(shí)施方案中，cik不介導(dǎo)抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(adcc)。在一些實(shí)施方案中，在所述培養(yǎng)條件下擴(kuò)增的cik來(lái)源于t細(xì)胞而不來(lái)自nk細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，表達(dá)cd8t細(xì)胞標(biāo)志物的cik比表達(dá)cd4t細(xì)胞標(biāo)志物的cik具有更高的cd56表達(dá)水平。在一些實(shí)施方案中，cik細(xì)胞表達(dá)cd45ra、ccr7、cd62l、cd11a、cd27、cd28、巨噬細(xì)胞炎性蛋白1a、穿孔素和fas配體。在一些實(shí)施方案中，用于cik細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件產(chǎn)生的cik細(xì)胞的異質(zhì)群體包含具有不同tcr特異性但針對(duì)腫瘤細(xì)胞或細(xì)胞系的非mhc限制性細(xì)胞溶解活性的效應(yīng)cd8t細(xì)胞。

在培養(yǎng)擴(kuò)增后，cik細(xì)胞的產(chǎn)生和擴(kuò)增速率可以從初始批細(xì)胞的幾倍到幾千倍變化。在擴(kuò)增培養(yǎng)期間添加瞬時(shí)的同種異體刺激或者t調(diào)節(jié)細(xì)胞的消耗也可用于產(chǎn)生和擴(kuò)增cik細(xì)胞。在培養(yǎng)擴(kuò)增結(jié)束時(shí)，cik細(xì)胞通常包含分別具有cd3+cd56+和cd3+cd56-細(xì)胞兩個(gè)主要亞型的cd3+t淋巴細(xì)胞的異質(zhì)群體，。在一些實(shí)施方案中，所述cd3+cd56+片段認(rèn)為是主要負(fù)責(zé)cik細(xì)胞的非mhc限制性抗腫瘤活性。在其他實(shí)施方案中，所述cd3+cd56-片段也可以具有非mhc限制性抗腫瘤活性。

在一些實(shí)施方案中，cik細(xì)胞表達(dá)cd8+或者cd4、或兩者或非兩者。在一些實(shí)施方案中，cik細(xì)胞主要是cd4-cd8+細(xì)胞。在其他實(shí)施方案中，cd4+cd8-cik細(xì)胞還可以存在于大量培養(yǎng)物中，而cd4+cd8+或者cd4-cd8-cik細(xì)胞較不頻繁。在一些實(shí)施方案中，在cd3+cd56+cik細(xì)胞中更多的表現(xiàn)出終末分化的晚期效應(yīng)物表型(cd45ro+；cd27低；cd28低；cd62l-；ccr7-)，而cd3+cd56-的對(duì)應(yīng)物表現(xiàn)出更早的記憶特征。

在一些實(shí)施方案中，cik細(xì)胞對(duì)來(lái)自樣品的腫瘤細(xì)胞系或者新鮮分離的腫瘤細(xì)胞具有強(qiáng)效的細(xì)胞毒活性，所述樣品包括急性髓性白血病、慢性髓性白血病、淋巴瘤、造血癌、肝癌、胃癌、肺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、結(jié)腸直腸癌和腎癌、非小細(xì)胞肺癌、肝細(xì)胞癌、復(fù)發(fā)性血液惡性腫瘤、非霍奇金淋巴瘤等。盡管cik細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞或者細(xì)胞系顯示出顯著的特異性，但它們對(duì)正常組織或者細(xì)胞幾乎沒有或者沒有細(xì)胞溶解活性。在一些實(shí)施方案中，cik細(xì)胞可以用作癌癥患者的過繼性細(xì)胞免疫治療。

在一些實(shí)施方案中，cik細(xì)胞的細(xì)胞溶解活性不涉及mhc和t細(xì)胞受體(即，tcr)間相互作用，因?yàn)閏ik細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞觸發(fā)的細(xì)胞溶解活性不能通過中和mhc和tcr相互作用而阻斷，例如抗cd3和抗hla-i類抗體。

在一些實(shí)施方案中，雙特異性抗體與cik細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的結(jié)合是cik介導(dǎo)的針對(duì)腫瘤細(xì)胞或者細(xì)胞系的細(xì)胞毒性所需的。在一些實(shí)施方案中，cik細(xì)胞表達(dá)白細(xì)胞功能相關(guān)的抗原-1(lfa-1)，其可以與由腫瘤細(xì)胞或者細(xì)胞系表達(dá)的配體icam-1、-2和-3結(jié)合。cik細(xì)胞的lfa-1與icam在腫瘤細(xì)胞上的結(jié)合可以參與效應(yīng)物/靶向識(shí)別物以及穩(wěn)定綴合物的形成。在一些實(shí)施方案中，抗lfa-1抗體可以抑制cik雙特異性抗體腫瘤細(xì)胞綴合物的形成以及針對(duì)腫瘤細(xì)胞的cik細(xì)胞的細(xì)胞毒性。

在一些實(shí)施方案中，cik細(xì)胞表達(dá)活化nk受體，包括但不限于nkg2d、dnax輔助分子-1(dnam-1)和nkp30。nk受體(例如nkg2d)的配體，例如mica/b和ulbps，通常在腫瘤細(xì)胞或者細(xì)胞系上表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，nk受體與其配體的連接可以誘導(dǎo)cik細(xì)胞的活化，其可以引起針對(duì)腫瘤細(xì)胞或者細(xì)胞系的脫粒和細(xì)胞毒作用。在一些實(shí)施方案中，通過抗體中和nk受體可以阻斷針對(duì)腫瘤細(xì)胞或細(xì)胞系的cik細(xì)胞毒性。在一些實(shí)施方案中，在cik細(xì)胞上表達(dá)的nk受體參與cik細(xì)胞的tcr非依賴性腫瘤細(xì)胞識(shí)別和腫瘤細(xì)胞的非mhc限制性殺傷。

雙特異性抗體結(jié)合

在一些實(shí)施方案中，所述雙特異性抗體包含對(duì)腫瘤抗原具有特異性的第一抗原結(jié)合部分。在一些實(shí)施方案中，腫瘤抗原選自所述組，該組由egfr、her2、ep-cam、cd20、cd30、cd33、cd47、cd52、cd133、cea、gpa33、粘蛋白、tag-72、cix、psma、結(jié)合蛋白、gd2、gd3、gm2、vegf、vegfr、整聯(lián)蛋白αvβ3、整聯(lián)蛋白α5β1、erbb2、erbb3、met、igf1r、epha3、trailr1、trailr2、rankl、fap和生腱蛋白組成。

第一抗原結(jié)合部分

在一些實(shí)施方案中，本公開的雙特異性抗體的第一抗原結(jié)合部分是任何分子并且對(duì)在腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞表面上表達(dá)的腫瘤抗原具有特異性。

豐富的腫瘤抗原是本領(lǐng)域已知的并且通過篩選可以容易地鑒定新的腫瘤抗原。腫瘤抗原的非限制性實(shí)例包括egfr、her2、ep-cam、cd20、cd30、cd33、cd47、cd52、cd133、cea、gpa33、粘蛋白、tag-72、cix、psma、葉酸結(jié)合蛋白、gd2、gd3、gm2、vegf、vegfr、整聯(lián)蛋白αvβ3、整聯(lián)蛋白α5β1、erbb2、erbb3、met、igf1r、epha3、trailr1、trailr2、rankl、fap和生腱蛋白。

在一些實(shí)施方案中，與相應(yīng)的非腫瘤細(xì)胞相比，所述第一抗原結(jié)合部分對(duì)腫瘤細(xì)胞上過表達(dá)的蛋白質(zhì)具有特異性。如本文所用，“相應(yīng)的非腫瘤細(xì)胞”是指與腫瘤細(xì)胞的起源具有相同細(xì)胞類型的非腫瘤細(xì)胞。注意，這樣的蛋白質(zhì)不必與腫瘤抗原不同。非限制性實(shí)例包括在大多數(shù)結(jié)腸、直腸、乳腺、肺、胰腺和胃腸道癌中過表達(dá)的癌胚抗原(cea)；在乳腺、卵巢、結(jié)腸、肺、前列腺和子宮頸癌中頻繁過表達(dá)的調(diào)蛋白受體(her-2，neu或c-erbb-2)；在包括乳腺、頭和頸、非小細(xì)胞肺和前列腺的實(shí)體瘤的范圍內(nèi)高度表達(dá)的表皮生長(zhǎng)因子受體(egfr)；去唾液酸糖蛋白受體；轉(zhuǎn)鐵蛋白受體；在肝細(xì)胞上表達(dá)的絲氨酸蛋白酶復(fù)合物受體；在胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞上過表達(dá)的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(fgfr)；用于抗血管生成基因治療的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(vegfr)；在90％的非粘液性卵巢癌中選擇性地過表達(dá)的葉酸受體；細(xì)胞表面糖萼；碳水化合物受體和聚合免疫球蛋白受體，其可用于向呼吸道上皮細(xì)胞的基因遞送并且對(duì)治療肺病如囊性纖維化有吸引力。

在一些實(shí)施方案中，所述第一抗原結(jié)合部分是針對(duì)病原體結(jié)合部分的多克隆群體的成員。本公開的組合物可以靶向的示例性非限制性病原體可以包括寄生蟲、細(xì)菌、真菌和病毒病原體。

在一些實(shí)施方案中，所述第一抗原結(jié)合部分對(duì)微生物具有特異性。微生物的非限制性實(shí)例包括微生物表面受體和內(nèi)毒素。內(nèi)毒素的實(shí)例包括但不限于脂多糖(lps)和脂寡糖(los)。

第二抗原結(jié)合部分

在一些實(shí)施方案中，所述雙特異性抗體包含與細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞結(jié)合的第二抗原結(jié)合部分。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷(cik)細(xì)胞、t細(xì)胞、自然殺傷(nk)細(xì)胞、自然殺傷t細(xì)胞或者淋巴因子激活的殺傷(lak)細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述第二抗原結(jié)合部分與所述細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷(cik)細(xì)胞的細(xì)胞表面或者膜蛋白結(jié)合。在一些方面，所述蛋白質(zhì)是cd3或者fc受體。在一些實(shí)施方案中，所述第二抗原結(jié)合部分與所述細(xì)胞的cd3結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，所述第二抗原結(jié)合部分與所述細(xì)胞的cd56結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，所述雙特異性抗體的fc部分與所述細(xì)胞的fc受體結(jié)合。

在一些實(shí)施方案中，第二抗原結(jié)合部分是與細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞(例如cik細(xì)胞)表面上表達(dá)的抗原特異性結(jié)合的任何分子。所述第二抗原結(jié)合部分對(duì)細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞上的抗原是特異性的。示例性細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞包括但不限于cik細(xì)胞、t細(xì)胞、cd8+t細(xì)胞、活化的t細(xì)胞、單核細(xì)胞、自然殺傷(nk)細(xì)胞、nkt細(xì)胞、淋巴因子激活的殺傷(lak)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞。所述第二抗原結(jié)合部分與細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞表面上表達(dá)的抗原特異性結(jié)合。適用于本公開的細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞表面表達(dá)的示例性非限制性抗原可包括cd2、cd3、cd4、cd5、cd8、cd11a、cd11b、cd14、cd16a、cd27、cd28、cd45、cd45ra、cd56、cd62l、fc受體、lfa、lfa-1、tcrαβ，ccr7、巨噬細(xì)胞炎癥蛋白1a、穿孔素和fas配體。在一些實(shí)施方案中，所述第二抗原結(jié)合部分與所述細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞，例如cik細(xì)胞結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，所述第二抗原結(jié)合部分與cd56結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，所述第二抗原結(jié)合部分與lfa-1結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，所述第二抗原結(jié)合部分與fc受體結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，所述msbody的fc區(qū)與所述細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞，例如cik細(xì)胞上的fc受體結(jié)合。

一旦鑒定了所述細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞和所述特異性抗原，可以選擇特異性msbody用作所述第二抗原結(jié)合部分。適合用作第二抗原結(jié)合部分的示例性非限制性分子是本領(lǐng)域熟知的，并且可包括抗體、抗體片段、單鏈可變片段(scfv)和抗體模擬物。適用于本公開的這些抗原結(jié)合組分可以使用本領(lǐng)域熟知的方法產(chǎn)生或者購(gòu)自商業(yè)供應(yīng)商(例如，rdidivisionoffitzgeraldindustriesintl(actonmass.,usa)和ebioscience,(sandiego,calif.usa)、santacruzbiotechnology(santacruz,calif.usa)和abcamintl(cambridge,mass.usa))。在一些實(shí)施方案中，例如，所述抗體的修飾過的，以產(chǎn)生抗體片段(例如fab、f(ab')2、scfv)。在一些實(shí)施方案中，所述結(jié)合部分是非抗體分子，例如抗體模擬物。適用于本公開的非限制性示例性抗體模擬物可包括：anticalins、具有纖連蛋白iii型結(jié)構(gòu)域的多肽、avimers、adnectin以及具有兩個(gè)或者多個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的非糖基化單鏈多肽。

雙特異性抗體

本公開的多核苷酸可以在相同的多核苷酸分子上或者在單獨(dú)的多核苷酸分子上編碼抗原結(jié)合多肽、變體或其衍生物的整個(gè)重鏈和輕鏈可變區(qū)。另外，本公開的多核苷酸可以在相同的多核苷酸分子上或者在單獨(dú)的多核苷酸分子上編碼抗原結(jié)合多肽、變體或其衍生物的重鏈和輕鏈可變區(qū)的部分。

本公開的一個(gè)實(shí)施方案提供了包含兩個(gè)不同的抗原結(jié)合多肽單元的異二聚體抗體。在一些實(shí)施方案中，所述異源二聚體與其相應(yīng)的同源二聚體在大小上不同，并且所述大小差異可以用于促進(jìn)異源和同源二聚體的分離。

在一些實(shí)施方案中，所述兩個(gè)抗原結(jié)合多肽單元之一包含輕鏈-重鏈對(duì)，如野生型抗體。貫穿本公開，該單元還稱為“單價(jià)單元”。在一些方面，另一個(gè)抗原結(jié)合多肽單元包含單鏈可變片段(scfv)。這樣的scfv可以與抗體的恒定片段(fc)融合。貫穿本公開，該融合肽還稱為“單鏈單元”。

本公開證明這樣的不對(duì)稱抗體是穩(wěn)定的并且保持高的抗原結(jié)合率。這是出人意料的，因?yàn)橐呀?jīng)證明即使在生理?xiàng)l件下單鏈抗體的同源二聚體也是不穩(wěn)定的。例如ahma等，“scfvantibody:principlesandclinicalapplication”,clinicalanddevelopmentalimmunology,2012:980250(2012)，證明基于scfv的igg樣抗體是不穩(wěn)定的并且需要進(jìn)一步工程化以減少聚集并提高穩(wěn)定性。

此外，由于不對(duì)稱性，異源二聚體與包含任一個(gè)所述抗原結(jié)合多肽單元的同源二聚體具有不同的分子量?；谒霎愒炊垠w和同源二聚體之間的分子量差異，可以容易地從所述同源二聚體中分離出所需的異源二聚體。

容易地從同源二聚體中分離異源二聚體的能力對(duì)于制備雙特異性抗體是特別有利的，其中所述兩個(gè)抗原結(jié)合多肽中的任一個(gè)對(duì)不同的表位具有特異性。這是因?yàn)閮煞N類型的同源二聚體(即包含單價(jià)單元的同源二聚體或者包含單鏈單元的同源二聚體)都不具有由所述異源二聚體提供的所需的雙特異性。

在一個(gè)實(shí)施方案中，這種雙特異性抗體對(duì)腫瘤抗原具有特異性并對(duì)cik細(xì)胞具有特異性，其使表達(dá)腫瘤抗原的腫瘤細(xì)胞接近c(diǎn)ik細(xì)胞，導(dǎo)致通過cik細(xì)胞的抗腫瘤細(xì)胞毒性消除腫瘤細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，這樣的雙特異性抗體僅對(duì)腫瘤抗原具有特異性而對(duì)cik細(xì)胞不具有特異性，然而，所述雙特異性抗體的fc區(qū)可以與所述cik細(xì)胞的fc受體結(jié)合，其進(jìn)而使表達(dá)腫瘤抗原的腫瘤細(xì)胞接近所述cik細(xì)胞，導(dǎo)致通過cik細(xì)胞的抗腫瘤細(xì)胞毒性消除腫瘤細(xì)胞。

在一些實(shí)施方案中，所述單價(jià)單元對(duì)腫瘤抗原具有特異性，并且所述單鏈單元對(duì)cik細(xì)胞具有特異性。具有這種排列特異性的不對(duì)稱雙特異性抗體還稱為“單價(jià)單鏈雙特異性抗體”或者“msbody”。相反，其中所述單價(jià)單元對(duì)cik細(xì)胞具有特異性并且所述單鏈單元對(duì)腫瘤抗原具有特異性的不對(duì)稱雙特異性抗體稱為“smbody”。另一種雙特異性抗體具有兩個(gè)單鏈單元，其中一個(gè)對(duì)腫瘤抗原具有特異性并且另一個(gè)對(duì)cik細(xì)胞具有特異性，稱為“ssbody”。

因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種抗體，其包含：(a)對(duì)腫瘤抗原具有特異性的輕鏈-重鏈對(duì)和(b)包含單鏈可變片段(scfv)和包含ch2結(jié)構(gòu)域和ch3結(jié)構(gòu)域的fc片段的融合肽，其中所述融合肽對(duì)cik細(xì)胞具有特異性。

上述任何抗體或者多肽可以進(jìn)一步包括另外的多肽，例如指導(dǎo)編碼多肽分泌的信號(hào)肽、如本文所述的抗體恒定區(qū)或者如本文所述的其他異源多肽。

本領(lǐng)域普通技術(shù)人員還將理解，本文公開的抗體可以是修飾的，使得它們?cè)诎被嵝蛄猩喜煌谘苌蕴烊淮嬖诘慕Y(jié)合多肽。例如，衍生自指定蛋白的多肽或者氨基酸序列可以是相似的，例如與起始序列具有一定百分比同一性，如其可以是與起始序列60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或者99％的同一性。

此外，可進(jìn)行導(dǎo)致在“非必需”氨基酸區(qū)域保守取代或者改變的核苷酸或者氨基酸取代、缺失或者插入。例如，除了一個(gè)或多個(gè)個(gè)別氨基酸取代、插入或者缺失，例如一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、六個(gè)、七個(gè)、八個(gè)、九個(gè)、十個(gè)、十五個(gè)、二十個(gè)或更多個(gè)個(gè)別氨基酸取代、插入或者缺失，衍生自指定蛋白的多肽或氨基酸序列可以與起始序列相同。在某些實(shí)施方案中，衍生自指定蛋白的多肽或者氨基酸序列相對(duì)于起始序列具有1至5個(gè)、1至10個(gè)、1至15個(gè)或者1至20個(gè)單個(gè)氨基酸取代、插入或者缺失。

在某些實(shí)施方案中，抗原結(jié)合多肽包含氨基酸序列或者一個(gè)或多個(gè)通常與抗體不相關(guān)的部分。示例性修飾在下面更詳細(xì)地描述。例如，本公開的單鏈fv抗體片段可以包含柔性接頭序列，或者可以被修飾以添加功能部分(例如peg、藥物、毒素或者標(biāo)記)。

本公開的抗體、變體或者其衍生物包括修飾的衍生物，即通過將任何類型的分子共價(jià)連接至所述抗體，這樣的共價(jià)連接不阻止所述抗體與所述表位結(jié)合。所述抗體可以是修飾的，例如但不限制性方式：如通過糖基化、乙?；⒕垡叶蓟?、磷酸化、磷酸化、酰胺化、通過已知的保護(hù)/封閉基團(tuán)的衍生化、蛋白水解切割、與細(xì)胞配體或者其它蛋白質(zhì)的連接等。通過已知技術(shù)可以進(jìn)行任何多種化學(xué)修飾，包括但不限于特異性化學(xué)切割、乙?；?、甲?；⒁旅顾氐拇x合成等。另外，所述抗體可以含有一個(gè)或者多個(gè)非經(jīng)典氨基酸。

在其他實(shí)施方案中，本公開的抗原結(jié)合多肽可以包含保守氨基酸取代。“保守氨基酸取代”是一種具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基取代所述氨基酸殘基的取代。本領(lǐng)域已經(jīng)定義具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族包括堿性側(cè)鏈(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電的極性側(cè)鏈(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側(cè)鏈(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-支鏈側(cè)鏈(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳族側(cè)鏈(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。因此，免疫球蛋白多肽中的非必需氨基酸殘基優(yōu)選地被來(lái)自相同側(cè)鏈家族的另一個(gè)氨基酸殘基替換。在另一個(gè)實(shí)施方案中，氨基酸鏈可以用側(cè)鏈家族成員中次序和/或組成不同但結(jié)構(gòu)相似的鏈替換。

在一些實(shí)施方案中，所述抗體可以與治療劑、前藥、肽、蛋白質(zhì)、酶、病毒、脂質(zhì)、生物反應(yīng)修飾劑、藥物試劑或peg綴合。

所述抗體可以與治療劑綴合或者融合，該治療劑可以包括可檢測(cè)標(biāo)記(例如放射性標(biāo)記)、免疫調(diào)節(jié)劑、激素、酶、寡核苷酸、光活性治療劑或者診斷劑、可以是藥物或者毒素的細(xì)胞毒性劑、超聲增強(qiáng)劑，非放射性標(biāo)記，其組合以及本領(lǐng)域已知的其他此類試劑。

所述抗體可以通過與化學(xué)發(fā)光化合物偶聯(lián)進(jìn)行可檢測(cè)標(biāo)記。然后通過檢測(cè)化學(xué)反應(yīng)過程中出現(xiàn)的發(fā)光的存在來(lái)確定化學(xué)發(fā)光標(biāo)記的抗原結(jié)合多肽的存在。特別有用的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記化合物的實(shí)例是魯米諾、異魯米諾、芳族吖啶酯、咪唑、吖啶鎓鹽和草酸酯。

所述抗體還可以使用熒光發(fā)射金屬如152eu或者其它鑭系元素進(jìn)行可檢測(cè)標(biāo)記。這些金屬可以使用如二亞乙基三胺五乙酸(dtpa)或者乙二胺四乙酸(edta)的金屬螯合基團(tuán)附著到所述抗體上。將多種部分與抗體綴合的技術(shù)是熟知的，例如參見arnon等，“monoclonalantibodiesforimmunotargetingofdrugsincancertherapy”,inmonoclonalantibodiesandcancertherapy；reisfeld等，(eds.),pp.243-56(alanr.liss,inc.(1985)；hellstrom等，“antibodiesfordrugdelivery”,incontrolleddrugdelivery(2nded.)；robinson等，(eds.),marceldekker,inc.,pp.623-53(1987)；thorpe,“antibodycarriersofcytotoxicagentsincancertherapy:areview”,inmonoclonalantibodies'84:biologicalandclinicalapplications,pincheraetal.(eds.),pp.475-506(1985)；“analysis,results,andfutureprospectiveofthetherapeuticuseofradiolabeledantibodyincancertherapy”,inmonoclonalantibodiesforcancerdetectionandtherapy；baldwin等，(eds.),academicpresspp.303-16(1985)和thorpe等，“thepreparationandcytotoxicpropertiesofantibody-toxinconjugates”,immunol.rev.(52:119-58(1982))。

制備方法

在一些實(shí)施方案中，本公開提供了制備一種組合物的方法，所述組合物包含雙特異性抗體(msbody)和細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞。

質(zhì)粒pcho1.0-herceptinhl-kkw和pcho1.0-hygro-l2k-ldy用于表達(dá)her2×cd3msbody，并且質(zhì)粒pcho1.0-抗ep-camhl-kkw和pcho1.0-hygro-l2k-ldy用于表達(dá)ep-cam×cd3(l2k)msbody。根據(jù)制造商的說明書，用maxcytestx(maxcyte)轉(zhuǎn)染cho-s細(xì)胞，并在37℃、含5％(體積/體積)co2的潮濕培養(yǎng)箱中以135rpm培養(yǎng)14天。通過4500×g離心收獲上清液并用0.22μm濾膜滅菌?；谥圃焐痰氖謨?cè)，通過蛋白a親和層析(rproteinaff；gehealthcare)、fabaffinitykbp瓊脂糖高流動(dòng)樹脂(5ml體積，acrobiosystems公司)和sp陽(yáng)離子交換層析柱提純抗體。使用ym-30kd超濾膜替換pbs緩沖洗脫液蛋白質(zhì)。通過在280nm處的uv吸光度測(cè)定純化的igg的濃度(計(jì)算每種蛋白質(zhì)的特異性誘導(dǎo)系數(shù))。

用ficoll-histopaque(histopaque-1077,sigma)分離外周血單核細(xì)胞(pbmc)。第1天，在含1000iu/mlifn-γ和2％自血清的基礎(chǔ)離體培養(yǎng)基中培養(yǎng)cik細(xì)胞。第2天，將2.5ng/ml抗人cd3ε，25iu/mlil-2，0.02ng/mlil-1α加入該培養(yǎng)基中。除非另有說明，否則cik細(xì)胞在離體混合物中刺激14天。

制備抗體的方法是本領(lǐng)域熟知的并且已在本文中描述。在某些實(shí)施方案中，本公開的抗原結(jié)合多肽的可變區(qū)和恒定區(qū)均是完全人的。完全人抗體可以使用本領(lǐng)域描述的和本文描述的技術(shù)制備。例如，針對(duì)特異性抗原的完全人抗體可以通過將所述抗原施用于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物來(lái)制備，該轉(zhuǎn)基因動(dòng)物已經(jīng)過修飾以產(chǎn)生響應(yīng)于抗原攻擊的抗體，但其內(nèi)源基因座已經(jīng)失能?？捎糜谥苽浯祟惪贵w的示例性技術(shù)描述于美國(guó)專利nos：6,150,584、6,458,592、6,420,140，其整體通過引用并入本文。

在某些實(shí)施方案中，所述制備的抗體不會(huì)在待治療動(dòng)物(例如人)中引起有害的免疫應(yīng)答。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用本領(lǐng)域公認(rèn)的技術(shù)修飾本公開的抗原結(jié)合多肽、變體或者其衍生物以降低它們的免疫原性。例如，抗體可以是人源化的、靈長(zhǎng)類化的、去免疫的或者可以制備的嵌合抗體。這些類型的抗體衍生自保留或者基本上保留親本抗體的抗原結(jié)合特性但在人類中具有較低的免疫原性非人抗體，通常為鼠或者靈長(zhǎng)類抗體。這可以通過多種方法實(shí)現(xiàn)，包括(a)將整個(gè)非人可變結(jié)構(gòu)域接枝到人恒定區(qū)以產(chǎn)生嵌合抗體；(b)將一個(gè)或多個(gè)非人互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)的至少一部分接枝到人框架和具有或者不具有關(guān)鍵框架殘基保留的恒定區(qū)；或者(c)移植所述整個(gè)非人可變結(jié)構(gòu)域，但通過表面殘基替換，用人樣區(qū)段“隱藏”它們。這些方法公開于morrison等，proc.natl.acad.sci.usa57:6851-6855(1984)；morrison等，adv.immunol.44:65-92(1988)；verhoeyen等，science239:1534-1536(1988)；padlan,molec.immun.25:489-498(1991)；padlan,molec.immun.31:169-217(1994)及美國(guó)專利nos：5,585,089、5,693,761、5,693,762和6,190,370，其整體通過引用并入本文。

去免疫還可以用于降低抗體的免疫原性。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“去免疫”包括改變抗體以修飾t細(xì)胞表位(例如參見國(guó)際申請(qǐng)公開nos：wo/9852976a1和wo/0034317a2)。例如，分析來(lái)自起始抗體的可變重鏈和可變輕鏈序列以及來(lái)自每個(gè)v區(qū)的人類t細(xì)胞表位“圖譜”顯示：創(chuàng)建與互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)和其他關(guān)鍵殘基在序列上相關(guān)的表位的位置。分析來(lái)自所述t細(xì)胞表位圖譜的單個(gè)t細(xì)胞表位，以鑒定具有改變終抗體活性的低風(fēng)險(xiǎn)的替代性氨基酸取代。設(shè)計(jì)一系列包含氨基酸取代的組合的可變重鏈和可變輕鏈序列并且這些序列隨后并入一系列結(jié)合多肽中。通常，產(chǎn)生12至24個(gè)變體抗體并測(cè)試其結(jié)合和/或功能。然后將包含修飾的可變區(qū)和人恒定區(qū)的完整的重鏈和輕鏈基因克隆到表達(dá)載體中，并且隨后將該質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)胞系以產(chǎn)生完整抗體。然后在合適的生物化學(xué)和生物測(cè)定中比較該抗體，并且鑒定最佳變體。

本公開的抗原結(jié)合多肽的結(jié)合特異性可以通過體外測(cè)定法，例如免疫沉淀、放射免疫測(cè)定(ria)或酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(elisa)來(lái)確定。

或者，描述用于生產(chǎn)單鏈單元的技術(shù)(美國(guó)專利no：4,694,778；bird,science242:423-442(1988)；huston等，proc.natl.acad.sci.usa55:5879-5883(1988)以及ward等，nature334:544-554(1989))可適于產(chǎn)生本公開的單鏈單元。通過氨基酸橋連接重鏈和輕鏈片段的fv區(qū)形成單鏈單元，產(chǎn)生單鏈融合肽。還可以使用在大腸桿菌中組裝功能性fv片段的技術(shù)(skerra等，science242:1038-1041(1988))。

可用于產(chǎn)生單鏈fvs(scfvs)和抗體的技術(shù)實(shí)例包括那些描述于：美國(guó)專利nos：4,946,778和5,258,498；huston等，methodsinenzymology203:46-88(1991)；shu等，proc.natl.sci.usa90:1995-1999(1993)和skerra等，science240:1038-1040(1988)。對(duì)于一些用途，包括人體內(nèi)抗體的體內(nèi)使用和體外檢測(cè)測(cè)定，可優(yōu)選使用嵌合抗體、人源化抗體或者人抗體。嵌合抗體是其中抗體的不同部分衍生自不同動(dòng)物物種的分子，例如具有衍生自鼠單克隆抗體的可變區(qū)和人免疫球蛋白恒定區(qū)的抗體。用于產(chǎn)生嵌合抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。例如參見，morrison,science229:1202(1985)；oi等，biotechniques4:214(1986)；gillies等，j.immunol.methods125:191-202(1989)；美國(guó)專利nos：5,807,715、4,816,567和4,816397，其整體通過引用并入本文。

人源化抗體是來(lái)源于非人物種抗體的抗體分子，其與具有來(lái)自非人物種的一個(gè)或多個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)和來(lái)自人免疫球蛋白分子的框架區(qū)所需的抗原結(jié)合。通常，來(lái)自cdr供體抗體的相應(yīng)殘基將取代人框架區(qū)中的框架殘基以改變、優(yōu)選改善抗原結(jié)合性。這些框架取代通過本領(lǐng)域熟知的方法鑒定，例如通過模擬cdr和框架殘基間的相互作用以鑒定對(duì)抗原結(jié)合重要的框架殘基和通過序列比較以鑒定在特定位置不尋常的框架殘基。(例如參見，queen等，美國(guó)專利no：5,585,089；riechmann等，nature332:323(1988)，其整體通過引用并入本文。)抗體可以使用本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)來(lái)人源化，例如cdr移植(ep239,400；pct公布：wo91/09967；美國(guó)專利nos：5,225,539、5,530,101和5,585,089)、鑲飾或表面重修(ep592,106；ep519,596；padlan,molecularimmunology28(4/5):489-498(1991)；studnicka等，proteinengineering7(6):805-814(1994)；roguska.等，proc.natl.sci.usa91:969-973(1994))和鏈改組(美國(guó)專利no：5,565,332，其整體通過引用并入本文)。

完全人抗體特別適用于人類患者的治療性治療。人抗體可以通過本領(lǐng)域已知的多種方法制備，包括使用來(lái)源于人免疫球蛋白序列的抗體文庫(kù)的噬菌體展示方法。也參見美國(guó)專利nos：4,444,887和4,716,111和pct公開：wo98/46645、wo98/50433、wo98/24893、wo98/16654、wo96/34096、wo96/33735和wo91/10741，其各自全部?jī)?nèi)容通過引用并入本文。

還可以使用不能表達(dá)功能性內(nèi)源免疫球蛋白但可表達(dá)人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生人抗體。例如人重鏈和輕鏈免疫球蛋白基因復(fù)合物可以隨機(jī)引入或通過同源重組引入小鼠胚胎干細(xì)胞?；蛘?，除了人重鏈和輕鏈基因外，可以將人可變區(qū)/恒定區(qū)和多樣性區(qū)引入小鼠胚胎干細(xì)胞。小鼠重鏈和輕鏈免疫球蛋白基因可以與通過同源重組引入的人免疫球蛋白基因座分開或者同時(shí)呈現(xiàn)非功能性。特別地，jh區(qū)的純合缺失防止內(nèi)源性抗體的產(chǎn)生。擴(kuò)增所述修飾的胚胎干細(xì)胞并且顯微注射到胚泡中以產(chǎn)生嵌合體小鼠。然后將所述嵌合小鼠繁殖以產(chǎn)生表達(dá)人抗體的純合后代。以正常方式用選定的抗原(例如所需目標(biāo)多肽的所有或者一部分)免疫轉(zhuǎn)基因小鼠。針對(duì)抗原的單克隆抗體可以使用常規(guī)雜交瘤技術(shù)從免疫的、轉(zhuǎn)基因的小鼠獲得。由所述轉(zhuǎn)基因小鼠攜帶的人免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因在b細(xì)胞分化期間重排，并且隨后經(jīng)歷類別轉(zhuǎn)換和體細(xì)胞突變。因此，使用這種技術(shù)產(chǎn)生治療上有用的igg，iga，igm和ige抗體是可能的。關(guān)于這種用于產(chǎn)生人抗體的技術(shù)的概述，參見lonbergandhuszarint.rev.immunol.73:65-93(1995)。關(guān)于這種用于產(chǎn)生人抗體和人單克隆抗體的技術(shù)的詳細(xì)討論和用于產(chǎn)生此類抗體的方案，例如參見，pct公開：wo98/24893、wo96/34096、wo96/33735；美國(guó)專利nos：5,413,923、5,625,126、5,633,425、5,569,825、5,661,016、5,545,806、5,814,318和5,939,598，其整體通過引用并入本文。此外，可以使用諸如abgenix,inc.(freemont,calif.)和genpharm(sanjose,calif.)公司來(lái)提供針對(duì)選定抗原的人抗體，所述人抗體使用與上述技術(shù)類似的技術(shù)。

識(shí)別選定表位的完全人抗體還可以使用稱為“引導(dǎo)選擇”(guidedselection)的技術(shù)產(chǎn)生。在該方法中，使用選定的非人單克隆抗體(例如，小鼠抗體)來(lái)指導(dǎo)完全人類抗體識(shí)別相同表位的選擇性。(jespersetal.,bio/technology72:899-903(1988)。還參見美國(guó)專利no：5,565,332，其整體通過引用并入本文)。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用常規(guī)程序(例如通過使用能夠特異性結(jié)合編碼鼠抗體的重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)可以容易地分離和測(cè)序編碼所需單克隆抗體的dna。所述分離的和亞克隆的雜交瘤細(xì)胞作為這種dna的優(yōu)選來(lái)源。一旦分離，該dna可以置于表達(dá)載體中，然后將其轉(zhuǎn)染到原核或者真核宿主細(xì)胞中，例如不另外產(chǎn)生免疫球蛋白的大腸桿菌細(xì)胞、猿cos細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(cho)細(xì)胞或者骨髓瘤細(xì)胞。更具體地，所述分離的dna(其可以如本文所述合成)可用于克隆用于制造抗體的恒定區(qū)和可變區(qū)的序列，如newman等，1995年1月25日提交的美國(guó)專利no：5,658,570中描述，其通過引用并入本文。基本上，這需要從選定的細(xì)胞中提取rna，轉(zhuǎn)化為cdna，并且使用ig特異性引物通過pcr來(lái)擴(kuò)增。適用于該目的的引物還描述于美國(guó)專利no：5,658,570。如下面更詳細(xì)討論的，表達(dá)所需抗體的轉(zhuǎn)化細(xì)胞可相對(duì)大量生長(zhǎng)以提供免疫球蛋白的臨床和商業(yè)供應(yīng)。

另外，使用常規(guī)重組dna技術(shù)，本公開的抗原結(jié)合多肽的一個(gè)或者多個(gè)cdr可以插入框架區(qū)內(nèi)，例如插入人框架區(qū)中以人源化非人抗體。所述框架區(qū)可以是天然存在的或者共有框架區(qū)，并且優(yōu)選人框架區(qū)(例如參見，chothia等，j.mol.biol.278：457-479(1998)，關(guān)于人框架區(qū)的列表)。優(yōu)選地，通過框架區(qū)和cdr的組合產(chǎn)生的多核苷酸編碼與所需多肽(例如light)的至少一個(gè)表位特異性結(jié)合的抗體。優(yōu)選地，可以在框架區(qū)內(nèi)進(jìn)行一個(gè)或者多個(gè)氨基酸取代，并且優(yōu)選地，所述氨基酸取代增強(qiáng)了抗體與其抗原的結(jié)合。另外，此類方法可用于使參與鏈內(nèi)二硫鍵的一個(gè)或多個(gè)可變區(qū)半胱氨酸殘基發(fā)生氨基酸取代或者缺失，以產(chǎn)生缺乏一個(gè)或者多個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵的抗體分子。所述多核苷酸的其他改變包括在本公開內(nèi)容和本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)。

此外，可使用通過剪接來(lái)自具有適當(dāng)抗原特異性的小鼠抗體分子的基因以及來(lái)自具有適當(dāng)生物學(xué)活性的人抗體分子的基因來(lái)開發(fā)用于產(chǎn)生“嵌合抗體”的技術(shù)(morrison等，proc.natl.acad.sci.usa:851-855(1984)；neuberger等，nature372:604-608(1984)；takeda等，nature314:452-454(1985))。如本文所用，嵌合抗體是其中不同部分衍生自不同動(dòng)物物種的分子，例如具有衍生自鼠單克隆抗體的可變區(qū)和人免疫球蛋白恒定區(qū)的那些。

另一種用于產(chǎn)生重組抗體的高效方法由newman,biotechnology10:1455-1460(1992)公開。具體地，該技術(shù)導(dǎo)致包含猴可變結(jié)構(gòu)域和人恒定序列的靈長(zhǎng)類化抗體的產(chǎn)生。該參考文獻(xiàn)其整體通過引用并入本文。此外，該技術(shù)還描述于共同轉(zhuǎn)讓的美國(guó)專利nos：5,658,570、5,693,780和5,756,096，其各自通過引用并入本文。

或者，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)選擇和培養(yǎng)產(chǎn)生抗體的細(xì)胞系。這樣的技術(shù)描述于各種實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)和主要出版物中。在這方面，currentprotocolsinimmunology,coligan等，eds.,greenpublishingassociatesandwiley-interscience,johnwileyandsons,newyork(1991)中描述了適用于本公開如下所述的技術(shù)，其整體包括補(bǔ)充通過引用并入本文。

另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可用于在編碼本公開的抗體的核苷酸序列中引入突變，包括但不限于定點(diǎn)誘變和pcr介導(dǎo)的導(dǎo)致氨基酸取代的誘變。優(yōu)選地，相對(duì)于參考的可變重鏈區(qū)cdr-h1、cdr-h2、cdr-h3和可變輕鏈區(qū)cdr-l1、cdr-l2或者cdr-l3，所述變體(包括衍生物)編碼少于50個(gè)氨基酸取代、少于40個(gè)氨基酸取代、少于30個(gè)氨基酸取代、少于25個(gè)氨基酸取代、少于20個(gè)氨基酸取代、少于15個(gè)氨基酸取代、少于10個(gè)氨基酸取代、少于5個(gè)氨基酸取代、少于4個(gè)氨基酸取代、少于3個(gè)氨基酸取代或者少于2個(gè)氨基酸取代?；蛘撸梢匝刂幋a序列的全部或部分隨機(jī)引入突變，例如通過飽和誘變，并且可以篩選所得突變體的生物活性以鑒定保留活性的突變體。

在一些實(shí)施方案中，抗體模擬物用作抗原結(jié)合部分?？贵w模擬物使用非免疫球蛋白蛋白支架作為抗體可變區(qū)的替代蛋白質(zhì)框架。如本文所定義，抗體模擬物是包含適于特異性或隨機(jī)序列變異的一個(gè)或者多個(gè)區(qū)域(即，環(huán)區(qū)域)的多肽，使得所述抗體模擬物與目的抗原特異性結(jié)合(例如在細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞表面上表達(dá)的抗原，例如cd2、cd3、cd4、cd5、cd8、cd11b、cd14、cd16a、cd45、cd56)。非限制性示例性抗體模擬物可以包括基于脂籠蛋白(lipocalins)的anticalins并且描述于weissandlowman,chembiol.,7(8):177-184(2000)；skerra,j.biotechnol.74(4):257-275和wo99/16873；具有纖連蛋白iii型結(jié)構(gòu)域和至少一個(gè)隨機(jī)化環(huán)的多肽描述于例如wo01/64942和美國(guó)專利no：6,818,418；具有p-夾心結(jié)構(gòu)的多肽描述于wo00/60070；以及由兩個(gè)或者更多個(gè)單體結(jié)構(gòu)域組成的非糖基化單鏈多肽，其可以分別結(jié)合包括通過接頭連接的蛋白質(zhì)的任何類型的靶分子，描述于美國(guó)申請(qǐng)系列nos：10/133,128和10/871,602。

在美國(guó)申請(qǐng)系列nos.10/133,128和no.10/871,602中描述的具有非糖基化單鏈多肽的單體結(jié)構(gòu)域的抗體模擬物與抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)不同。與抗體不同，所述抗體模擬多肽能夠獨(dú)立折疊、形成熱穩(wěn)定性的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。例如，所述多肽在95℃下穩(wěn)定至少10分鐘，而結(jié)合親和力沒有明顯的損失。所述單體結(jié)構(gòu)域的其他特征包括低免疫原性、低毒性、足以穿透皮膚或其它組織的小尺寸以及一系列體內(nèi)半衰期和穩(wěn)定性。

可以產(chǎn)生針對(duì)由本文所述的第二抗原結(jié)合部分結(jié)合的抗原的抗體模擬物。例如，可以使用本領(lǐng)域已知的方法分析與細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞表面上的抗原結(jié)合的抗體，例如抗體-抗原相互作用的三維晶體結(jié)構(gòu)分析，以鑒定對(duì)抗原結(jié)合至關(guān)重要的特異性殘基。一旦鑒定了這些殘基，可對(duì)所述抗體模擬物的環(huán)區(qū)進(jìn)行定點(diǎn)誘變，使得該環(huán)形成所述第二抗原結(jié)合部分的結(jié)合口袋。這樣的修飾描述于例如，vogtandskerra,chembiochem.5(2):191-9(2004)。

lipovsek等(美國(guó)專利nos.6,818,418和7,115,396)公開了特征為纖連蛋白或者纖連蛋白樣支架和至少一個(gè)可變環(huán)的抗體模擬物，稱為adnectin。這些基于纖連蛋白的抗體模擬物顯示出許多天然或工程抗體的相同的期望特征，包括對(duì)靶向配體的高親和力和特異性。此外，這些基于纖連蛋白的抗體模擬物相對(duì)于抗體和抗體片段顯示出某些益處。例如，這些抗體模擬物因天然的可折疊性和穩(wěn)定性而不依賴于二硫鍵，并且因此在通常會(huì)分解抗體的條件下是穩(wěn)定的。

beste等(proc.natl.acad.sci.u.s.a.(1999)96(5):1898-1903)公開了基于脂籠蛋白支架(anticalin^tm)的抗體模擬物。脂籠蛋白由在蛋白質(zhì)的末端具有四個(gè)高變環(huán)的β-桶組成。beste等對(duì)所述環(huán)進(jìn)行隨機(jī)誘變并且選擇與，例如熒光素結(jié)合。三個(gè)變體顯示與熒光素的特異性結(jié)合，以及一個(gè)變體顯示出與抗熒光素抗體的結(jié)合相似性。進(jìn)一步的分析顯示：所有的隨機(jī)位置是可變的，這表明anticalin^tm將適合用作抗體的替代物。anticalin^tm是通常長(zhǎng)度為160至180個(gè)殘基的小的單鏈多肽，這提供了若干個(gè)優(yōu)于抗體的優(yōu)點(diǎn)，包括降低生產(chǎn)成本、提高儲(chǔ)存期間的穩(wěn)定性和降低免疫反應(yīng)。

hamilton等(美國(guó)專利no：5,770,380)公開了合成的抗體模擬物，該模擬物使用杯芳烴的剛性、非肽有機(jī)支架連接多個(gè)可變肽環(huán)作為結(jié)合位點(diǎn)。所述肽環(huán)相對(duì)于彼此幾乎從杯所述芳烴的同一側(cè)突出。由于這種幾何確認(rèn)，所有所述環(huán)都可用于結(jié)合從而增加與配體的結(jié)合親和力。然而，與其他抗體模擬物相比，所述基于杯芳烴的抗體模擬物不僅僅由多肽組成，并因此不易受到蛋白酶的攻擊，并且在極端環(huán)境條件下相對(duì)穩(wěn)定和具有長(zhǎng)的壽命。此外，由于所述抗體模擬物的相對(duì)小的尺寸，其不太可能產(chǎn)生免疫原性應(yīng)答。

murali等(cell.mol.biol.(2003)49(2):209-216)公開了將抗體還原成更小的肽模擬物的方法，稱為“抗體樣結(jié)合肽模擬物”，其還可以用作具有本公開的抗體的替代物。silverman等(nat.biotechnol.(2005)23:1556-1561)公開了融合蛋白，其是包含稱為“avimers”的多個(gè)結(jié)構(gòu)域的單鏈多肽。通過體外外顯子改組和噬菌體展示從人細(xì)胞外受體結(jié)構(gòu)域發(fā)育，所述avimer是一類結(jié)合蛋白，對(duì)于靶分子，其親和性和特異性與抗體有些相似。與單個(gè)表位結(jié)合蛋白相比，這些所得的多結(jié)構(gòu)域蛋白可以表現(xiàn)出增強(qiáng)的親和力(在一些情況下亞納摩爾(sub-nm))和特異性。關(guān)于avimers的構(gòu)建和使用的其他細(xì)節(jié)可發(fā)現(xiàn)于美國(guó)專利公開nos.2004/0175756、2005/0048512、2005/0053973、2005/0089932和2005/0221384。

除了非免疫球蛋白框架外，在包含rna分子和非天然寡聚體(例如蛋白酶抑制劑、苯并二氮雜類、嘌呤衍生物和bb-轉(zhuǎn)角模擬物)的化合物中也已經(jīng)模擬了抗體性質(zhì)，作為抗原結(jié)合部分，所有這些化合物都適用于本發(fā)明。

治療方法

如本文所述，本公開提供了治療包括癌癥患者的患者的方法，通過：從所述患者獲得外周血淋巴細(xì)胞(pbl)樣品；用抗cd3抗體，ifn-γ和il-2孵育所述pbl以獲得cik細(xì)胞；用雙特異性抗體武裝cik細(xì)胞，其中每個(gè)雙特異性抗體包含對(duì)腫瘤抗原具有抗原結(jié)合特異性的第一抗原結(jié)合部分和與所述cik細(xì)胞結(jié)合的第二抗原結(jié)合部分，并且施用所述具有結(jié)合的雙特異性抗體武裝的cik細(xì)胞到有需要的患者。本公開的所述抗原結(jié)合多肽、變體或者衍生物可以用于與癌癥或者傳染病相關(guān)的某些治療和診斷方法中。

本公開進(jìn)一步涉及基于msbody和基于細(xì)胞的療法，其涉及向患者(例如動(dòng)物、哺乳動(dòng)物和人)施用本公開的所述雙特異性抗體和所述細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞的所述組合物，用于治療一種或多種本文所述的病癥或者疾病。本公開的治療性化合物，包括但不限于本公開的抗體(包括如本文所述的變體及其衍生物)和編碼本公開的抗體(包括如本文所述的變體及其衍生物)的核酸或者多核苷酸。

本公開的所述雙特異性抗體和所述細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞的所述組合物還可以用于治療、抑制或者預(yù)防包括惡性疾病、紊亂或與這樣的疾病或紊亂相關(guān)的癥狀，例如與增加的細(xì)胞存活或者細(xì)胞凋亡的抑制相關(guān)的疾病，例如癌癥(例如濾泡淋巴瘤，具有p53突變的癌癥和激素依賴性腫瘤包括但不限于結(jié)腸癌、心臟腫瘤、胰腺癌、黑素瘤、成視網(wǎng)膜細(xì)胞、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、肺癌、腸癌、睪丸癌、胃癌、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、粘液瘤，肌瘤、淋巴瘤、內(nèi)皮瘤、成骨細(xì)胞瘤、破骨細(xì)胞瘤、骨肉瘤、軟骨肉瘤，腺瘤、乳腺癌、前列腺癌、卡波西肉瘤和卵巢癌)；自身免疫性疾病(例如多發(fā)性硬化、斯耶格倫綜合征、格雷夫斯病、橋本甲狀腺炎、自身免疫性糖尿病、膽汁性肝硬化、貝切特病、克羅恩病、多發(fā)性肌炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和免疫相關(guān)性腎小球腎炎、自身免疫性胃炎、自身免疫性血小板減少性紫癜和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎)和病毒感染(例如皰疹病毒、痘病毒和腺病毒)；炎癥；移植物抗宿主病(急性和/或慢性)；急性移植排斥和慢性移植排斥。本公開的抗原結(jié)合多肽、變體或其衍生物用于抑制癌癥的生長(zhǎng)、進(jìn)展和/或轉(zhuǎn)移，特別是上文或下文段落中列出的那些。

可以用本公開的所述抗體或者變體或者其衍生物治療、預(yù)防、診斷和/或預(yù)后的與增加的細(xì)胞存活相關(guān)的其它疾病或癥狀，包括但不限于惡性腫瘤的進(jìn)展和/或轉(zhuǎn)移和相關(guān)病癥，例如白血病(包括急性白血病(例如急性淋巴細(xì)胞性白血病、急性骨髓性白血病(包括成髓細(xì)胞、早幼粒細(xì)胞、骨髓單核細(xì)胞、單核細(xì)胞和紅白血病))和慢性白血病(例如慢性骨髓性)；真性紅細(xì)胞增多癥；淋巴瘤(例如霍奇金病和非霍奇金病)；多發(fā)性骨髓瘤；瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血癥；重鏈病和實(shí)體瘤，包括但不限于肉瘤和癌如纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內(nèi)皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結(jié)腸癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細(xì)胞癌、肝細(xì)胞瘤、膽管癌、絨毛膜癌、精原細(xì)胞瘤、胚胎癌、wilm's腫瘤、宮頸癌、睪丸腫瘤、肺癌、小細(xì)胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、星形細(xì)胞瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、成血管細(xì)胞瘤、聽神經(jīng)瘤、少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤、腎母細(xì)胞瘤、黑素瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤。

本公開的所述抗體還可以用于通過靶向微生物和免疫細(xì)胞以實(shí)現(xiàn)微生物的消除來(lái)治療由微生物引起的感染性疾病或者殺死微生物。在一個(gè)方面，所述微生物是包括rna和dna病毒的病毒、革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌、革蘭氏陰性細(xì)菌、原生動(dòng)物或者真菌。

本公開的所述組合物可以用于通過用所述雙特異性抗體武裝激活的細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞(例如cik細(xì)胞)來(lái)治療感染病原體的患者的方法。當(dāng)施用于患者時(shí)，所述武裝的細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞將靶向并消除病原體感染的細(xì)胞。示例性的細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞包括但不限于cik細(xì)胞、t細(xì)胞、cd8+t細(xì)胞、活化的t細(xì)胞、單核細(xì)胞、nk細(xì)胞、nkt細(xì)胞、lak細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞?？梢杂帽竟_的組合物治療的非限制性示例性病原體感染包括病毒、細(xì)菌、真菌和寄生病原體。

在一些實(shí)施方案中，所述病原體是病毒?？梢杂帽竟_的所述組合物治療的示例性非限制性病毒感染，包括巨細(xì)胞病毒(cmv)、eb病毒(ebv)、i型單純皰疹病毒(hsv-1)、ii型單純皰疹病毒(hsv-ii)、bk病毒(bkv)、甲型肝炎病毒(hsv-a)、乙型肝炎病毒(hsv-b)、丙型肝炎病毒(hsv-c)、流感病毒、水痘、腺病毒、牛瘟、鼻病毒、艾柯病毒、輪狀病毒、呼吸道合胞病毒、乳頭瘤病毒、乳多泡病毒、皰疹病毒、蟲媒病毒、漢坦病毒、柯薩基病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、風(fēng)疹病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、i型人免疫缺陷病毒(hiv-1)和ii型人類免疫缺陷病毒、任何小核糖核酸病毒、腸道病毒、杯狀病毒科病毒、諾沃克病毒組的任何病毒、披膜病毒、例如登革熱病毒、甲病毒、黃病毒、冠狀病毒、狂犬病病毒、馬爾堡病毒、埃博拉病毒、副流感病毒、正粘病毒、布尼亞病毒、沙粒病毒、呼腸孤病毒、輪狀病毒、皰疹病毒、人t細(xì)胞白血病病毒i型、人t細(xì)胞白血病病毒ii型、猴免疫缺陷病毒、慢病毒、多瘤病毒、細(xì)小病毒、人類皰疹病毒-6、cercophehebine皰疹病毒1(b病毒)和痘病毒。

可以通過使用本公開的所述組合物治療或者預(yù)防的細(xì)菌性疾病或病癥，包括但不限于由分枝桿菌立克次氏體、支原體、奈瑟氏菌屬(例如腦膜炎奈瑟氏球菌和淋病奈瑟氏球菌)、軍團(tuán)菌、霍亂弧菌、鏈球菌、例如肺炎鏈球菌、白喉棒狀桿菌、破傷風(fēng)桿菌、百日咳桿菌、嗜血桿菌(例如流感嗜血桿菌)、衣原體屬、腸毒性大腸桿菌和炭疽芽孢桿菌(炭疽)引起的那些。

可以通過使用本公開的所述組合物治療或預(yù)防的真菌疾病或病癥，包括但不限于卡氏肺孢子蟲或者曲霉菌。

可以通過使用本公開的所述組合物治療或預(yù)防的原生動(dòng)物疾病或病癥，包括但不限于瘧原蟲、艾美球蟲、利什曼原蟲和錐蟲。

任何特定患者的具體劑量和治療方案將取決于多種因素，包括所用的特定抗原結(jié)合多肽、變體或其衍生物、所述患者的年齡、體重、一般健康狀況、性別和飲食，以及施用時(shí)間、排泄速率、藥物組合以及所治療的特定疾病的嚴(yán)重性。醫(yī)療護(hù)理人員對(duì)這些因素的判斷在本領(lǐng)域的普通技術(shù)范圍內(nèi)。該量還將取決于待治療的個(gè)體患者、施用途徑、制劑類型、所使用的化合物的特性、疾病的嚴(yán)重性和期望的效果。使用的量可以通過本領(lǐng)域公知的藥理學(xué)和藥代動(dòng)力學(xué)原理確定。

施用本公開的所述雙特異性抗體和所述細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞的所述組合物的方法，包括但不限于真皮內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)、硬膜外和口服途徑。所述組合物可以通過任何方便的途徑施用，例如通過輸注或者彈丸注射、通過上皮或者粘膜皮膚內(nèi)層(例如口腔粘膜、直腸和腸粘膜等)的吸收并且可以與其它生物活性劑一起施用。因此，本公開的所述組合物可以口服、直腸、胃腸外、腦池內(nèi)、陰道內(nèi)、腹膜內(nèi)、局部(如通過粉末、軟膏、滴劑或透皮貼劑)、口腔、或口服或鼻腔噴霧施用。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“腸胃外”是指包括靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、胸骨內(nèi)、皮下和關(guān)節(jié)內(nèi)注射和輸注的給藥模式。

給藥可以是全身或者局部的。此外，可能需要通過任何合適的途徑將本公開的所述組合物引入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，包括心室內(nèi)和鞘內(nèi)注射；心室內(nèi)注射可以通過例如連接到儲(chǔ)器(例如ommaya儲(chǔ)器)的心室內(nèi)導(dǎo)管來(lái)促進(jìn)。還可以使用肺部給藥，例如通過使用吸入器或者霧化器以及具有霧化劑的制劑。

可能需要將本公開的所述組合物局部施用于需要治療的區(qū)域，這可以通過例如但不限于手術(shù)期間的局部輸注、局部施用(例如與手術(shù)后的傷口敷料結(jié)合)、通過注射、通過導(dǎo)管、通過栓劑的方式實(shí)現(xiàn)，或者通過植入物，所述植入物是多孔、無(wú)孔或凝膠狀材料，包括膜，例如硅橡膠膜或纖維。優(yōu)選地，當(dāng)施用本公開的蛋白質(zhì)(包括抗體)時(shí)，必須謹(jǐn)慎使用蛋白質(zhì)不吸收的材料。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本公開的所述雙特異性抗體和所述細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞的所述組合物可以在囊泡，特別是脂質(zhì)體中遞送(參見langer,1990,science249:1527-1533；treat等，inliposomesinthetherapyofinfectiousdiseaseandcancer,lopez-beresteinandfidler(eds.),liss,newyork,pp.353-365(1989)；lopez-berestein,ibid.,pp.317-327；參見同上)。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本公開的所述組合物可以在控釋系統(tǒng)中遞送。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用泵(參見sefton,1987,crccrit.ref.biomed.eng.14:201；buchwald等，1980,surgery88:507；saudek等，1989,n.engl.j.med.321:574)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用聚合物材料(參見medicalapplicationsofcontrolledrelease,langerandwise(eds.),crcpres.,bocaraton,fla.(1974)；controlleddrugbioavailability,drugproductdesignandperformance,smolenandball(eds.),wiley,newyork(1984)；rangerandpeppas,j.,1983,macromol.sci.rev.macromol.chem.23:61；還參見levyetal.,1985,science228:190；during等，1989,ann.neurol.25:351；howard等，1989,j.neurosurg.71:105)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，控釋系統(tǒng)可以放置在治療靶(即腦)附近，因此僅需要全身劑量的一部分(參見例如goodson,inmedicalapplicationsofcontrolledrelease,supra,vol.2,pp.115-138(1984))。其他控釋系統(tǒng)在langer的綜述(1990,science249:1527-1533)中討論。

可以通過標(biāo)準(zhǔn)臨床技術(shù)確定在治療、抑制和預(yù)防炎性、免疫或惡性疾病、病癥或癥狀中有效的本公開的所述雙特異性抗體和所述細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞的組合物的量。此外，可以任選地使用體外測(cè)定以幫助鑒定最佳劑量范圍。在制劑中使用的精確劑量還將取決于施用途徑和疾病、病癥或癥狀的嚴(yán)重性，并且應(yīng)當(dāng)根據(jù)從業(yè)者的判斷和每個(gè)患者的情況來(lái)決定。有效劑量可以從源于體外或動(dòng)物模型測(cè)試系統(tǒng)的劑量-反應(yīng)曲線推測(cè)。

用于治療感染性或惡性疾病、癥狀或病癥的方法包括施用本公開的所述雙特異性抗體和所述細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞的組合物，通常在可接受的動(dòng)物模型中測(cè)試，用于所需的治療或者預(yù)防活性，然后用于人類。合適的動(dòng)物模型包括轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的。例如，證明本文所述的抗原結(jié)合多肽的治療效用的體外測(cè)定法包括抗原結(jié)合多肽對(duì)細(xì)胞系或患者組織樣品的作用。所述抗原結(jié)合多肽對(duì)細(xì)胞系和/或組織樣品的作用可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)(例如本文別處公開的測(cè)定法)來(lái)測(cè)定。根據(jù)本公開，可用于確定是否指示施用特異性抗原結(jié)合多肽的體外測(cè)定包括體外細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定，其中患者組織樣品在培養(yǎng)物中生長(zhǎng)，并暴露于或以其它方式施用化合物，并且觀察這種化合物對(duì)組織樣品的影響。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本公開的所述組合物與抗腫瘤劑、抗病毒劑、抗細(xì)菌劑或者抗生素劑或者抗真菌劑組合施用。本領(lǐng)域已知的任何這些試劑可以在本公開的所述組合物中施用。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本公開的組合物與化療劑組合施用?？梢耘c本公開的所述組合物一起施用的化療劑包括但不限于抗生素衍生物(例如多柔比星、博來(lái)霉素、柔紅霉素和更生霉素)；抗雌激素(例如他莫昔芬)；抗代謝藥(例如氟尿嘧啶、5-fu、甲氨蝶呤、氟尿苷、干擾素α-2b、谷氨酸、普卡霉素、巰嘌呤和6-硫鳥嘌呤)；細(xì)胞毒素劑(例如卡莫司汀、bcnu、洛莫司汀、ccnu、阿糖胞苷、環(huán)磷酰胺、雌莫司汀、羥基脲、丙卡巴肼、絲裂霉素、白消安、順鉑和硫酸長(zhǎng)春新堿)；激素(例如甲羥孕酮、雌莫司汀磷酸鈉、乙炔雌二醇、雌二醇、醋酸甲地孕酮、甲基睪酮、己烯雌酚二磷酸酯，氯苯亞甲基和睪內(nèi)酯)；氮芥衍生物(例如美法侖、苯丁酸氮芥，氮芥(氮芥)和噻替派)；類固醇和組合(例如倍他米松磷酸鈉)和其他(例如二碳嗪、天冬酰胺酶、米托坦、硫酸長(zhǎng)春新堿、硫酸長(zhǎng)春堿和依托泊苷)。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本公開的所述組合物與細(xì)胞因子組合施用?？梢耘c本公開的所述組合物一起施用的細(xì)胞因子，包括但不限于il-2、il-3、il-4、il-5、il-6、il-7、il-10、il-12、il-13、il-15、抗-cd40、cd40l和tnf。

在另外的實(shí)施方案中，本公開的所述組合物與其它治療或預(yù)防方案(例如放射療法)組合施用。

組合物

本公開還提供藥物組合物。這樣的組合物包含有效量的雙特異性抗體(例如msbody)、cik細(xì)胞和可接受的載體。在具體實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的”是指由聯(lián)邦或者州政府的管理機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)的或在美國(guó)藥典或其它公認(rèn)的藥典中列出的用于動(dòng)物，更特別是用于人的。此外，“藥學(xué)上可接受的載體”通常是任何類型的無(wú)毒固體、半固體或者液體填充劑、稀釋劑、包封材料或者制劑助劑。

分離細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞

根據(jù)本公開，治療患有腫瘤或者感染病原體的患者的一個(gè)步驟是需要分離細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，從包含可用雙特異性抗體的多克隆群體武裝的外周血單核細(xì)胞(即pbmc)或者外周血淋巴細(xì)胞(即pbl)的血液樣品中分離所述細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述血液樣品獲自自體供體。在一些實(shí)施方案中，所述血液樣品獲自同系供體。在其它實(shí)施方案中，所述血液樣品獲自同種異體供體或者同種異體供體池。

一旦獲得所述血液樣品，將用雙特異性抗體武裝所述細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞。從pbmc或者pml中分開和分離特定細(xì)胞類型的方法是本領(lǐng)域熟知的。細(xì)胞分離的合適方法包括使用percoll^tm梯度或者ficoll-hypaque的密度梯度離心?？梢赃M(jìn)一步純化細(xì)胞或者可以使用本領(lǐng)域熟知的陽(yáng)性/陰性選擇技術(shù)選擇細(xì)胞亞群，例如使用負(fù)磁性免疫粘附，其使用針對(duì)存在于陰性選擇的細(xì)胞上的細(xì)胞表面標(biāo)記物的單克隆抗體的混合物。根據(jù)抗體的選擇，可以使用該方法正向選擇所需的細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，使用熒光激活細(xì)胞分選(即facs)分離所需細(xì)胞群體。細(xì)胞分開和分離的其他方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。在一些實(shí)施方案中，洗滌所述分離的細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞，并在合適的培養(yǎng)基中冷凍保存以備將來(lái)使用。

在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞可能需要在用雙特異性抗體武裝前被激活(例如t細(xì)胞)并且離體擴(kuò)增。在離體或者體外活化和擴(kuò)增細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域熟知的。下面描述了適用于本公開的產(chǎn)生和擴(kuò)增cik細(xì)胞和激活t細(xì)胞的方法。

產(chǎn)生和擴(kuò)增cik細(xì)胞

cik細(xì)胞的產(chǎn)生和擴(kuò)增是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的，例如如lu等所述(anovelpopulationofexpandedhumancd3+cd56+cellsderivedfromtcellswithpotentinvivoantitumoractivityinmicewithseverecombinedimmunodeficiency,j.immunol,1994,153(4):1687-1696)，其需要幾天至幾周(例如21天)定時(shí)加入可溶性因子，例如ifn-γ、il-2和抗cd3抗體。

在一些實(shí)施方案中，所述抗cd3抗體是可從ortho-biotech(raritan,n.j.)獲得的okt3(莫羅單抗-cd3)或者可從bristol-meyerssquibb獲得的單克隆抗體g19-4。適用于本公開的離體激活t細(xì)胞的另外的抗體是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。

il-1，il-7和胸腺球蛋白的添加也已顯示有利于增加cik細(xì)胞的細(xì)胞毒性潛力(jiangj等，cytokine-inducedkillercellspromoteantitumorimmunity,j.translationalmed,2013,11:83；zollb等，generationofcytokine-inducedkillercellsusingexogenousinterleukin-2,-7or-12,cancerimmunolimmunother,1998,47(4):221-6)。在一些實(shí)施方案中，將所述擴(kuò)增的cik細(xì)胞用10％胎牛血清和10％dmso翅片液氮冷凍保存，然后根據(jù)需要用于雙特異性抗體武裝的來(lái)解凍。

激活t細(xì)胞

在一些實(shí)施方案中，分離的t細(xì)胞通過用可溶性或者固定化的抗cd3抗體離體激活，描述于美國(guó)專利no：6,352,694和美國(guó)專利no：2003/0185823。然后在不存在外源性生長(zhǎng)因子或者輔助細(xì)胞的情況下，通過用低劑量的il-2或il-7和il-15離體培養(yǎng)擴(kuò)增所述分離的細(xì)胞。參見美國(guó)專利no：2003/0185823。

可以通過與固定在固體/不溶性支持物(1-5μg/ml)上的可溶性抗cd3抗體(約10-20ng/ml)或者抗cd3抗體離體接觸來(lái)激活t細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述抗cd3抗體是可從ortho-biotech(raritan,n.j.)獲得的okt3(莫羅單抗-cd3)或者可從bristol-meyerssquibb獲得的單克隆抗體g19-4。適用于本公開的離體激活t細(xì)胞的另外的抗體是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。

在一些實(shí)施方案中，通過用抗cd3抗體和抗cd28抗體共刺激t細(xì)胞進(jìn)行其激活。適用于本發(fā)明的抗cd28抗體是murm9.3(abbott-biotech)。適用于本發(fā)明的另外的抗cd28抗體將是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的并且可以從許多商業(yè)來(lái)源購(gòu)買，包括rdidivisionoffitzgeraldindustriesintl.(actonmass.usa)和ebioscience(sandiegocalif.usa)。在一些實(shí)施方案中，使用與共固定在固體支持物上的具有1:1化學(xué)計(jì)量的抗cd3抗體(例如okt3)和抗cd28抗體(例如murm9.3)的共刺激來(lái)激活t細(xì)胞。

在通過用抗cd3刺激或者用抗cd3和抗cd28共刺激激活t細(xì)胞后，該細(xì)胞在低劑量il-2(10iu/ml至約500iu/ml)存在下擴(kuò)增約14天。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞在低劑量il-7(25-100ng/ml)，任選在il-15(25-100ng/ml)存在下擴(kuò)增。所述細(xì)胞可以在il-2、il-7和/或il-15的任何組合，以及起到擴(kuò)增活化的t細(xì)胞作用的重組細(xì)胞因子和非天然存在的重組細(xì)胞因子中擴(kuò)增。例如，il-2可以單獨(dú)使用，或者與il-7和/或il-15組合使用。類似地，il-7可以單獨(dú)使用，或者與il-2和/或il-15組合使用。技術(shù)人員將理解，活化的t細(xì)胞可以在多種條件下擴(kuò)增(參見例如fernandez-botran,advancedmethodsincellularimmunology(crcpress2000)。重組il-2(proleukinil-2)可以從chiron(emeryville,calif.)購(gòu)買。il-7和il-15可以從prospec-tanytechnogeneltd.(rehovotisrael)購(gòu)買。適用于本發(fā)明的白介素的其它來(lái)源是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。在一些實(shí)施方案中，將所述活化的和擴(kuò)增的t細(xì)胞用10％胎牛血清和10％dmso翅片液氮冷凍保存，然后根據(jù)需要用于雙特異性抗體武裝的來(lái)解凍。

用雙特異性抗體武裝cik細(xì)胞

本文公開的所述組合物和方法提供對(duì)患有腫瘤或癌癥或感染病原體的患者的令人驚訝的有效治療，因?yàn)槲溲b所述細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞以實(shí)現(xiàn)理想的治療效果所需的雙特異性抗體的濃度低。此外，本公開的所述雙特異性抗體能夠使所述細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞接近腫瘤細(xì)胞或感染的細(xì)胞以使所述細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞裂解腫瘤或感染的細(xì)胞。

在一些實(shí)施方案中，為了實(shí)現(xiàn)相同的期望效果，武裝所述細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞所需的雙特異性抗體的濃度比本領(lǐng)域中其他組合物至少低一個(gè)數(shù)量級(jí)。在一些實(shí)施方案中，用每10⁶個(gè)細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞0.001ng至100ng的所述雙特異性抗體(例如msbody)的量武裝所述細(xì)胞(例如cik)。在一些實(shí)施方案中，用每10⁶個(gè)細(xì)胞0.01ng至10ng的所述雙特異性抗體的量武裝所述細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，用每10⁶個(gè)細(xì)胞0.1至1ng的所述雙特異性抗體的量武裝所述細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，用每10⁶個(gè)細(xì)胞1ng的所述雙特異性抗體的量武裝所述細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，用于武裝所述細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞的所述雙特異性抗體的濃度為100ng、50ng、40ng、30ng、20ng、15ng、10ng、5ng、4ng、3ng、2ng、1ng、0.5ng、0.1ng、0.05ng,0.01ng、0.005ng和0.001ng每10⁶個(gè)細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞。

在一些實(shí)施方案中，用0.001nm至1000nm的所述雙特異性抗體(例如msbody)武裝所述cik細(xì)胞以形成武裝活化cik細(xì)胞(acc)。在一些實(shí)施方案中，用0.01nm至100nm的所述雙特異性抗體(例如msbody)武裝所述cik細(xì)胞以形成acc。在一些實(shí)施方案中，用0.1nm至100nm的所述雙特異性抗體(例如msbody)武裝所述cik細(xì)胞以形成acc。在一些實(shí)施方案中，用1nm至100nm的所述雙特異性抗體(例如msbody)武裝所述cik細(xì)胞以形成acc。在一些實(shí)施方案中，用10nm至100nm的所述雙特異性抗體(例如msbody)武裝所述cik細(xì)胞以形成acc。在一些實(shí)施方案中，用50nm至100nm的所述雙特異性抗體(例如msbody)武裝所述cik細(xì)胞以形成acc。在一些實(shí)施方案中，用于形成acc的所述雙特異性抗體的濃度為1000nm、100nm、90nm、80nm、70nm、60nm、50nm、40nm、30nm、20nm、10nm、1nm、0.01nm和0.001nm。

所述細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞(例如cik細(xì)胞)的武裝可以使用本領(lǐng)域已知的任何合適的方法進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，例如，可以洗滌所述細(xì)胞并在理想的濃度重重懸浮，然后與特定濃度的雙特異性抗體一起孵育。經(jīng)過一段時(shí)間合適的孵育，所述雙特異性抗體可與所述細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞(例如cik細(xì)胞)結(jié)合，洗滌該細(xì)胞以除去任何未結(jié)合的結(jié)合分子。在一些實(shí)施方案中，將所述武裝的細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞儲(chǔ)存在液氮中以備將來(lái)使用。參見，uberti等，clin.immunol.andimmunopath.(1994)；ueda等，transplantation(1993)。在一些實(shí)施方案中，將所述武裝的細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞以理想的濃度重懸于合適的培養(yǎng)基中并施用于有需要的患者。

在一些實(shí)施方案中，根據(jù)常規(guī)程序用藥物載體配制所述組合物。術(shù)語(yǔ)“載體”是指與治療劑一起施用的稀釋劑、佐劑、賦形劑或緩沖劑。這樣的藥物載體可以是無(wú)菌液體例如水和油，包括石油；動(dòng)物；植物或合成來(lái)源的，例如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。當(dāng)靜脈內(nèi)施用所述藥物組合物時(shí)，水是優(yōu)選的載體。鹽溶液和葡萄糖水溶液和甘油溶液也可以用作液體載體，特別是用于可注射溶液。合適的藥物賦形劑包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、大米、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化鈉、脫脂乳、甘油、丙二醇等。如果需要，所述組合物還可以含有少量的潤(rùn)濕劑或乳化劑，或ph緩沖劑例如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽。抗菌劑如芐醇或?qū)αu基苯甲酸甲酯；抗氧化劑如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑如乙二胺四乙酸；還設(shè)想用于調(diào)節(jié)張力的試劑，例如氯化鈉或葡萄糖。這些組合物可以采取溶液、懸浮液、乳液、片劑、丸劑、膠囊、粉末、持續(xù)釋放制劑等形式。所述組合物可以使用傳統(tǒng)的粘合劑和載體例如甘油三酯配制成栓劑?？诜苿┛梢园?biāo)準(zhǔn)載體例如藥物級(jí)甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。合適的藥物載體的實(shí)例描述于e.w.martin的remington'spharmaceuticalsciences中，其通過引用并入本文。這樣的組合物將含有一定治療有效量的、優(yōu)選以純化形式的抗原結(jié)合多肽，與合適量的載體一起，以提供用于對(duì)患者適當(dāng)施用的形式。制劑應(yīng)適合施用方式。親本制劑可以包封在安瓿、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多劑量小瓶中。

在一些實(shí)施方案中，根據(jù)常規(guī)方法將所述組合物配制為適合于靜脈內(nèi)施用于人的藥物組合物。通常，用于靜脈內(nèi)施用的組合物是在無(wú)菌等滲水性緩沖液中的溶液。如果需要，所述組合物還可以包括增溶劑和局部麻醉劑例如利多卡因，以減輕注射部位的疼痛。一般地，該成分以單位劑量形式單獨(dú)或混合在一起供應(yīng)，例如作為干燥的凍干粉末或無(wú)水濃縮物在密封容器例如指示活性劑的量的安瓿或小袋中。當(dāng)所述組合物通過輸注施用時(shí)，其可以用含有無(wú)菌藥物級(jí)水或鹽水的輸注瓶分配。當(dāng)所述組合物通過注射施用時(shí)，可以提供含注射用無(wú)菌水或鹽水的安瓿，以便可以在施用之前混合成分。

藥學(xué)上可接受的鹽包括與陰離子如衍生自鹽酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的陰離子形成的鹽，以及與陽(yáng)離子形成的鹽，例如衍生自鈉、鉀、銨、鈣、氫氧化鐵、異丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因等。

在一些實(shí)施方案中，本公開提供了包含所述組合物和使用說明書的試劑盒。

實(shí)施例

應(yīng)當(dāng)理解，雖然已經(jīng)結(jié)合上述實(shí)施例描述了本公開，但是前面的描述和示例旨在說明而不是限制本公開的范圍。在本公開的范圍內(nèi)的其他方面、優(yōu)點(diǎn)和修改對(duì)于本公開所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將是顯而易見的。

本公開不限于所描述的具體實(shí)施方案的范圍，其旨在作為本公開的各個(gè)方面的單一說明，并且功能上等同的任何組合物或方法在本公開的范圍內(nèi)。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，在不脫離本公開的精神或范圍的情況下，可以對(duì)本公開的方法和組合物進(jìn)行各種修改和改變。因此，本公開旨在覆蓋本公開的修改和變化，只要它們落入所附權(quán)利要求及其等同物的范圍內(nèi)。

本說明書中提及的所有出版物和專利申請(qǐng)通過引用并入本文，其程度如同每個(gè)單獨(dú)的出版物或?qū)＠暾?qǐng)被具體和單獨(dú)地指示通過引用并入。

實(shí)施例1.制備msbody

1.1構(gòu)建表達(dá)載體

選擇pcho1.0作為克隆赫賽汀重鏈和輕鏈的表達(dá)載體。選擇pcho1.0-潮霉素，并用潮霉素標(biāo)志物替換puriycin標(biāo)志物作為表達(dá)載體構(gòu)建l2k的單鏈抗體。如表1所示設(shè)計(jì)的引物與根據(jù)如表2所示的lc、hc、scfv-fc、migk前導(dǎo)序列的基因序列和載體的多克隆位點(diǎn)有適當(dāng)?shù)闹丿B。在之前的實(shí)驗(yàn)中(參見pct/cn2012/08498，其整體通過引用并入本文)合成基因模板并亞克隆于pcdna3.1中。使用重疊pcr、用高保真dna聚合酶擴(kuò)增片段lc、hc、scfv-fc。vl、cl、vh和ch1的pcr擴(kuò)增條件包括在95℃下孵育5分鐘、隨后是在95℃下退化30秒的25個(gè)循環(huán)、在56℃下退火30秒、在72℃下延伸1分鐘、在72℃閉合延伸3分鐘。圖2描繪了顯示pcr產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠。

表1.pcr引物序列

通過avrii/bstz17i或ecorv/paci的限制性消化制備線性化載體，通過瓊脂糖凝膠電泳來(lái)確認(rèn)消化并通過nanodrop^tm儀器或其它方法測(cè)定濃度。將所述片段和線性化載體加入gibsonmastermix中并在50℃孵育15至60分鐘，這取決于正被裝配的片段的數(shù)量。將所述混合物轉(zhuǎn)化入neb5-α感受態(tài)大腸桿菌(由neb公司提供)中。通過分別將片段插入pcho1.0載體構(gòu)建pcho1.0-赫賽汀hl-kkw和pcho1.0-抗-ep-camhl-kkw。同樣，將l2k的scfv-fc片段插入pcho1.0-潮霉素載體中以構(gòu)建pcho1.0-潮霉素-l2kscfv-fc-ldy。

表2msbody的多肽和核酸序列

l2k-scfv單鏈融合肽(seqidno:1)

qvqlqqsgaelarpgasvkmsckasgytftrytmhwvkqrpgqglewigy

inpsrgytnynqkfkdkatlttdkssstaymqlssltsedsavyycaryy

ddhycldywgqgttltvssggggsggggsggggsqivltqspaimsaspg

ekvtmtcsasssvsymnwyqqksgtspkrwiydtsklasgvpahfrgsgs

gtsysltisgmeaedaatyycqqwssnpftfgsgtkleinrgaaaepksc

dkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshed

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l2k-scfv單鏈融合肽核酸序列(seqidno:2)

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單價(jià)單元的赫賽汀重鏈(seqidno:3)

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單價(jià)單元的赫賽汀重鏈，核酸序列(seqidno:4)

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單價(jià)單元的赫賽汀輕鏈(seqidno:5)

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單價(jià)單元的赫賽汀輕鏈，核酸(seqidno:6)

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單價(jià)單元的ep-cam重鏈(seqidno:7)

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單價(jià)單元的ep-cam重鏈，核酸(seqidno:8)

gaggtgcagctgctcgagcagtctggagctgagctggtaaggcctgggacttcagtgaagatatcctgcaaggcttctggatacgccttcactaactactggctaggttgggtaaagcagaggcctggacatggacttgagtggattggagatattttccctggaagtggtaatatccactacaatgagaagttcaagggcaaagccacactgactgcagacaaatcttcgagcacagcctatatgcagctcagtagcctgacatttgaggactctgctgtctatttctgtgcaagactgaggaactgggacgagcctatggactactggggccaagggaccacggtcaccgtctcctccgcgtcgaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtctacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgtggtgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacgataccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcgatctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga

單價(jià)單元的赫賽汀輕鏈(seqidno:9)

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單價(jià)單元的赫賽汀輕鏈，核酸(seqidno:10)

gagctcgtgatgacacagtctccatcctccctgactgtgacagcaggagagaaggtcactatgagctgcaagtccagtcagagtctgttaaacagtggaaatcaaaagaactacttgacctggtaccagcagaaaccagggcagcctcctaaactgttgatctactgggcatccactagggaatctggggtccctgatcgcttcacaggcagtggatctggaacagatttcactctcaccatcagcagtgtgcaggctgaagacctggcagtttattactgtcagaatgattatagttatccgctcacgttcggtgctgggaccaagcttgagatcaaacgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgttag

1.2表達(dá)和純化

根據(jù)手冊(cè)，用endofreeplasmidgigakit(qiagen,12391)制備用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒。使用質(zhì)粒pcho1.0-赫賽汀hl-kkw和pcho1.0-潮霉素-l2kscfv-fc-ldy表達(dá)her2×cd3msbody。使用質(zhì)粒pcho1.0-抗-ep-camhl-kkw和pcho1.0-潮霉素-l2kscfv-fc-ldy表達(dá)ep-camxcd3msbody。根據(jù)制造商的說明書，用maxcytestx(maxcyte)轉(zhuǎn)染cho-s細(xì)胞。將轉(zhuǎn)染的cho-s細(xì)胞在37℃、5％(vol/vol)co2潮濕培養(yǎng)箱中以135rpm培養(yǎng)14天。通過2000*g離心收獲上清液并用0.22μm濾膜滅菌。通過蛋白a親和層析(rproteinaff；gehealthcare)，fabaffinitykbpagarosehighflowresin(acrobiosystems公司，5ml體積)和sp陽(yáng)離子交換層析柱(gehealthcare，10ml)純化抗體。使用ym-30kd超濾膜、用pbs緩沖液代替蛋白質(zhì)的洗脫。通過在280nm處的uv吸光度測(cè)定純化的igg的濃度(計(jì)算每種蛋白質(zhì)的特異性誘導(dǎo)系數(shù))。

通過sds/page分析純化的蛋白質(zhì)(圖3.a和b)，分子量為約125kd。通過高性能尺寸排阻色譜法(hp-sec)測(cè)試批次的igg并顯示為至少95％單體(圖3.c和d)，在體內(nèi)使用的批次的內(nèi)毒素水平為＜1.1內(nèi)毒素單位/mgigg。

1.3msbody的結(jié)合活性分析

使用sk-br-3和jurkat細(xì)胞測(cè)試her2×cd3msbody的cd3與her2的結(jié)合能力。收集3×10⁵sk-br-3或jurkat細(xì)胞并與50μlpbs或160nm的赫賽汀或msbody的兩倍系列稀釋液一起孵育。約30分鐘后，用1％fbs/pbs洗滌細(xì)胞兩次，然后與2.5μlpe標(biāo)記的抗人iggfc混合。將混合物在室溫下孵育30分鐘，再次用1％fbs/pbs洗滌細(xì)胞。然后在facs設(shè)備上對(duì)樣品進(jìn)行檢查。如圖4a所示，赫賽汀(黑色虛線)和her2×cd3msbody(黑色實(shí)線)都與乳腺癌細(xì)胞sk-br-3結(jié)合。該結(jié)果表明msbody可以有效地結(jié)合表達(dá)her2的癌細(xì)胞。收集jurkat細(xì)胞，并與50μlpbs或160nml2k單克隆抗體或msbody的兩倍系列稀釋液一起孵育。由雙特異性配體(黑色實(shí)線)結(jié)合的jurkat細(xì)胞的豐度與l2k的(黑色虛線)一樣高(圖4b)。

收集3×10⁵sw480或jurkat細(xì)胞以測(cè)試ep-cam×cd3msbody的結(jié)合活性。如圖5a所示，抗ep-cam單克隆抗體(黑色虛線)和ep-cam×cd3msbody(黑色實(shí)線)都與結(jié)腸癌細(xì)胞sw480結(jié)合。如圖5b所示，l2k單克隆抗體(黑色虛線)和ep-cam×cd3msbody(黑色實(shí)線)都與jurkat細(xì)胞結(jié)合。

實(shí)施例2.cik細(xì)胞培養(yǎng)以及細(xì)胞與細(xì)胞締合測(cè)定

收集來(lái)自健康供體的血液以分離外周血單核細(xì)胞(pbmc)和自身血清。所述血液在700g、室溫下離心20分鐘，收集上清液作為自血清，其余的是血沉棕黃層。通過ficoll-histopaque(來(lái)自sigma的histopaque-1077)從血沉棕黃層中分離pbmc。第1天，在含750iu/mlifn-γ和2％自血清的基礎(chǔ)離體培養(yǎng)基中培養(yǎng)cik細(xì)胞，第2天，將2.5ng/ml抗人cd3ε、25iu/mlil-2、0.02ng/mlil-1α加入該培養(yǎng)基中。除非另有說明，否則cik細(xì)胞在離體混合物中刺激生長(zhǎng)14天。計(jì)數(shù)細(xì)胞并保持在1×10⁶個(gè)細(xì)胞/ml。通過臺(tái)盼藍(lán)排除法(trypanblueexclusion)測(cè)定細(xì)胞的存活力。cik細(xì)胞與fitcmouseanti-humancd45(bd,bd555482)、ucht1peanti-humancd3(biolengend，300408)和cd56((pe/cy7anti-humancd56,biolegend318318)孵育(“武裝”)。使用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量細(xì)胞表型，并將其定量為與fl2相比，fl1的右上象限中陽(yáng)性細(xì)胞的百分比?？?cè)后w具有43.0％cd3和cd56雙陽(yáng)性(圖6)，其是具有高殺傷效率的nkt細(xì)胞組。

對(duì)于msbody分子介導(dǎo)的共結(jié)合測(cè)定，用celltracecfse(sigma)標(biāo)記sk-br-3細(xì)胞(her2陽(yáng)性)。通過細(xì)胞膜標(biāo)記試劑盒(sigma)用pkh26標(biāo)記cik細(xì)胞(cd3陽(yáng)性)。將細(xì)胞(3×10⁵個(gè)細(xì)胞/ml)重懸于pbs中，并在不同量的msbody分子存在下以1:1的比例在室溫下混合30分鐘。通過流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量共結(jié)合并且定量為與fl2相比，fl1的右上象限中陽(yáng)性細(xì)胞的百分比，代表cfse和pkh26雙陽(yáng)性群體(圖7)，約27.5％的細(xì)胞是由msbody共結(jié)合的。

實(shí)施例3.her2×cd3武裝激活的cik細(xì)胞(acc)

在該實(shí)例中的msbody武裝激活的cik細(xì)胞在圖8中示出。收集3×10⁵個(gè)cik細(xì)胞并與50μlpbs或者100nmmsbody的兩倍系列稀釋液一起孵育。約30分鐘后，用1％fbs/pbs洗滌細(xì)胞兩次，然后與2.5μlpe標(biāo)記的抗人iggfc混合。將混合物在室溫下孵育30分鐘，再次用1％fbs/pbs洗滌細(xì)胞。然后在facs設(shè)備上對(duì)樣品進(jìn)行檢查。

首先用5μmcfse對(duì)sk-br-3細(xì)胞(靶細(xì)胞)染色，然后以2×10⁴個(gè)細(xì)胞/孔(100μl)接種在96孔中，然后用her2×cd3msbody武裝活化的cik細(xì)胞或在第2天將來(lái)自100nm的2倍系列稀釋濃度(效應(yīng)細(xì)胞：e-t＝5:1)的陰性對(duì)照higg和100ulacc(1×10⁶acc/ml)加入靶細(xì)胞。24小時(shí)后收集細(xì)胞，用1ug/mlpi染色，然后用流式細(xì)胞術(shù)(fc500，beckmancoulter)計(jì)數(shù)。體外研究表明，her2×cd3msbody武裝的acc在0.01-1.25ug/1×10⁶個(gè)細(xì)胞的濃度下可以充分地裂解乳腺癌細(xì)胞。圖9顯示了通過由her2×cd3武裝的acc介導(dǎo)的用于sk-br-3靶標(biāo)的特異性細(xì)胞毒性的概述。

實(shí)施例4.her2×cd3和ep-cam×cd3acc的細(xì)胞毒性

使用sk-br-3細(xì)胞作為靶細(xì)胞，對(duì)于her2×cd3msbody、赫賽汀和l2k，以人igg作為對(duì)照，測(cè)量抗體誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性。首先用5μmcfse對(duì)sk-br-3細(xì)胞(靶細(xì)胞)染色，然后以2×10⁴個(gè)細(xì)胞/孔接種在96孔中，然后在第2天加入培養(yǎng)的cik(效應(yīng)細(xì)胞：e-t＝5:1)。同時(shí)，將等濃度的赫賽汀、l2k、msbody和人igg加入到細(xì)胞培養(yǎng)物中。24小時(shí)后收集細(xì)胞并用1ug/mlpi染色，然后用流式細(xì)胞術(shù)(fc500，beckmancoulter)計(jì)數(shù)。如果用cfse和pi雙重染色則計(jì)為死細(xì)胞。細(xì)胞死亡率的測(cè)量為死細(xì)胞與總細(xì)胞的比率。細(xì)胞毒性計(jì)算為測(cè)量的細(xì)胞死亡率和自然細(xì)胞死亡率之間的差異。結(jié)果示于圖10，其中與赫賽汀和l2k相比，msbody具有最高的細(xì)胞毒性。

通過使用人cik細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞和ep-cam陽(yáng)性人癌細(xì)胞系sw480作為靶細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量重定向的細(xì)胞毒性。在14天的刺激生長(zhǎng)后，通過在250grt下離心收集cik細(xì)胞。然后將細(xì)胞重懸于rpmi-1640完全培養(yǎng)基中并調(diào)節(jié)至4×10⁶個(gè)細(xì)胞/ml。根據(jù)制造商的說明書(sigma-aldrich)用cfse染料對(duì)靶細(xì)胞染色。將等體積的靶標(biāo)和效應(yīng)細(xì)胞懸浮液混合并將150μl該懸浮液轉(zhuǎn)移到96孔板的每個(gè)孔中。加入50μlep-cam×cd3系列稀釋液或rpmi完全培養(yǎng)基(陰性對(duì)照)。除非另有說明，將板在37℃、5％co2加濕培養(yǎng)箱中孵育24小時(shí)或48小時(shí)。24小時(shí)或48小時(shí)后收集細(xì)胞，并用piat、以1ug/ml的終濃度染色，然后在facsfc500儀器(beckman，德國(guó))上通過流式細(xì)胞術(shù)分析樣品。靶細(xì)胞裂解確定為由cfse和pi染色呈陽(yáng)性的細(xì)胞的百分比。所有樣品重復(fù)進(jìn)行。通過整合到graphpadprismversion5.0(graphpadsoftware,sandiego,ca)中的四級(jí)參數(shù)非線性擬合模型進(jìn)行細(xì)胞毒性測(cè)定的數(shù)據(jù)分析。結(jié)果示于圖8。

實(shí)施例5.采用轉(zhuǎn)移異種移植腫瘤模型

動(dòng)物，六(6)至八(8)周齡的nod-scid小鼠(nod.cb17-prkdcscid/ncr)獲自beijinghfkbioscienceco.ltd并且容納在湖北省食品藥品安全評(píng)價(jià)中心中央實(shí)驗(yàn)室的屏障單元中。將5×10⁶個(gè)nci-n87細(xì)胞、以終體積為0.1ml/小鼠注射到小鼠右脅腹中。在第1、3、6、9天通過靜脈內(nèi)注射武裝活化cik。在研究期間，取出肝素化的血液樣品用于測(cè)定抗體血漿水平，其在預(yù)期范圍內(nèi)。每3天測(cè)量腫瘤體積并由數(shù)字卡尺測(cè)量值計(jì)算為1/2×長(zhǎng)度×寬度²(mm³)。結(jié)果表明武裝的cik細(xì)胞抑制腫瘤生長(zhǎng)(圖11)。

實(shí)施例6.sw480人結(jié)腸癌異種移植模型

人異種移植模型中的所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在來(lái)自beijinghfkbioscienceco.ltd的nod/scid小鼠中進(jìn)行。將小鼠保持在無(wú)菌和標(biāo)準(zhǔn)化環(huán)境條件下(室溫20±1℃、相對(duì)濕度50±10％、12小時(shí)光：12小時(shí)暗節(jié)律)。他們接受高壓滅菌的食物和床上用品并隨意使用酸化(ph4.0)的飲用水。對(duì)它們進(jìn)行滲漏測(cè)試并且僅使用igg水平低于100ng/ml的小鼠。將5×10⁶個(gè)培養(yǎng)的cik細(xì)胞與5×10⁶sw480結(jié)腸癌細(xì)胞混合，得到約1:1的有效e:t比。將cik和sw480混合物，以終體積為0.1ml/小鼠的量皮下注射到右脅腹中。一組動(dòng)物僅注射sw480細(xì)胞以評(píng)估由cik效應(yīng)細(xì)胞誘導(dǎo)的非特異性效應(yīng)。對(duì)于最小殘留疾病模型中的治療組，在指示劑量為0.01、0.1、1mg/小鼠下、經(jīng)sw480/cik接種1小時(shí)后，用msbody雙特異性抗體(epcam×cd3)或緩沖劑(pbs)靜脈內(nèi)處理每組的6只動(dòng)物，并在12天內(nèi)重復(fù)處理4次。在建立的腫瘤模型中，當(dāng)皮下生長(zhǎng)腫瘤達(dá)到50-200mm³時(shí)，在第0天(陽(yáng)性對(duì)照)和sw480接種后的第8天處理每組的8只動(dòng)物并且處理重復(fù)2次。在指定日期用測(cè)徑器以兩個(gè)垂直維度測(cè)量腫瘤尺寸，并根據(jù)1/2×長(zhǎng)度×寬度²(以mm³計(jì))作為功效的相關(guān)性計(jì)算腫瘤體積。

除非另有定義，否則本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。

本文示例性描述的本發(fā)明可以在不存在本文未具體公開的任何一個(gè)或多個(gè)元件，一個(gè)或多個(gè)限制的情況下適當(dāng)?shù)貙?shí)施。因此，例如，術(shù)語(yǔ)“包含”，“包括”，“含有”等應(yīng)當(dāng)被廣泛地且無(wú)限制地理解。另外，本文中采用的術(shù)語(yǔ)和表達(dá)已經(jīng)用作描述性而不是限制性術(shù)語(yǔ)，并且在使用這些術(shù)語(yǔ)和表達(dá)時(shí)并不意在排除所示和所描述的特征或其部分的任何等效物，而是認(rèn)識(shí)到在本發(fā)明所要求保護(hù)的范圍內(nèi)，各種修改是可能的。

因此，應(yīng)當(dāng)理解，本文提供的材料、方法和實(shí)施例是優(yōu)選實(shí)施方案的代表、是示例性的，并且不意圖作為對(duì)本發(fā)明范圍的限制。

本文已廣泛且一般性地描述了本發(fā)明。一般公開內(nèi)容中的每個(gè)較窄種類和亞類群也形成本發(fā)明的一部分。這包括本發(fā)明的一般性描述，不管所排除的材料是否在本文中具體描述，該描述具有從屬中移除任何主題的附帶條件或否定限制。

此外，本發(fā)明的特征或方面是根據(jù)馬庫(kù)什組描述的，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明也因此根據(jù)馬庫(kù)什組的任何單個(gè)成員或亞組成員描述。

本文提及的所有出版物、專利申請(qǐng)、專利和其他參考文獻(xiàn)的整體通過引用明確地并入本文，其程度如同通過引用單獨(dú)地并入本文。在沖突的情況下，本說明書(包括定義)將控制。