本發(fā)明涉及免疫療法。更具體地，本發(fā)明涉及靶向半乳糖凝集素-9以調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答且從而預(yù)防或治療一種或多種疾病、紊亂或病癥。

背景技術(shù)：

pd-1是已知下調(diào)t細(xì)胞功能的分子的大家族的成員。pd-1具有兩個已知的配體pd-l1(b7-h1)(dong等人，1999；freeman等人，2000)和pd-l2(b7-dc)(latchman等人，2001；tseng等人，2001)，它們都屬于b7共信號傳導(dǎo)分子家族?？梢栽趖細(xì)胞、b細(xì)胞、自然殺傷t細(xì)胞、樹突細(xì)胞(dc)和活化的單核細(xì)胞上觀察到pd-1的表達(dá)(keir等人，2008)。pd-1不在靜息t細(xì)胞上表達(dá)，但在活化時可誘導(dǎo)(agata等人，1996)。pd-1連接的功能效應(yīng)可以在t細(xì)胞活化后幾小時內(nèi)觀察到，但pd-1細(xì)胞表面蛋白上調(diào)需要24小時(chemnitz等人，2004)。當(dāng)pd-1同時與t細(xì)胞受體信號結(jié)合時，它可以觸發(fā)抑制性信號，雖然當(dāng)pd-1單獨交聯(lián)時沒有發(fā)生信號傳導(dǎo)(sharpe等人，2007)。一般而言，t細(xì)胞上的pd-1與其配體pd-l1之間的相互作用控制外周t細(xì)胞耐受的誘導(dǎo)和維持，并且在對病原體或癌癥的免疫應(yīng)答期間負(fù)調(diào)節(jié)t細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子產(chǎn)生(sharpe等人，2007)。pd-l2是pd-1的另一種配體，其通常被認(rèn)為與pd-l1競爭結(jié)合pd-1。通常，pd-l2的免疫功能似乎與pd-l1的免疫功能重疊，并且似乎沒有可歸因于pd-l2本身的特定作用或功能。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明至少部分地由于意想不到的發(fā)現(xiàn)半乳糖凝集素-9是pd-l2的受體而產(chǎn)生。因此，pd-l2的至少一些免疫學(xué)效應(yīng)可以通過多聚體pd-l2與半乳糖凝集素-9的結(jié)合而不是通過pd-1來介導(dǎo)。因此，本發(fā)明廣泛地涉及靶向半乳糖凝集素-9，從而調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)。在一個廣義的實施方案中，本發(fā)明涉及通過激活或刺激半乳糖凝集素-9而促進或增強哺乳動物的免疫力。在另一個廣義的實施方案中，本發(fā)明涉及通過抑制或阻斷半乳糖凝集素-9而抑制或阻止哺乳動物的免疫力。

本發(fā)明的一個方面提供了調(diào)節(jié)哺乳動物的免疫力的方法，包括調(diào)節(jié)哺乳動物中半乳糖凝集素-9的活性從而調(diào)節(jié)哺乳動物的免疫力的步驟。

本發(fā)明的一個具體方面提供了促進或增強哺乳動物的免疫力的方法，包括激活或刺激哺乳動物中半乳糖凝集素-9的活性從而刺激或增強哺乳動物的免疫力的步驟。

合適地，該方法包括向哺乳動物施用半乳糖凝集素-9激動劑從而激活或刺激哺乳動物中的半乳糖凝集素-9活性的步驟。

在一個實施方案中，該方法包括向哺乳動物施用可溶性pd-l2或其生物學(xué)活性片段從而激活或刺激哺乳動物中的半乳糖凝集素-9活性的步驟。

合適地，可溶性pd-l2是包含n個單體的多聚體，其中n≥3。

在一個實施方案中，該方法包括向哺乳動物施用結(jié)合半乳糖凝集素-9的激動劑抗體或抗體片段從而激活或刺激哺乳動物中的半乳糖凝集素-9活性的步驟。

合適地，這刺激和/或啟動th1介導(dǎo)的免疫應(yīng)答和/或免疫記憶。

本發(fā)明的另一個具體方面提供了至少部分地抑制或阻止哺乳動物的免疫力的方法，包括至少部分地抑制或阻斷哺乳動物中半乳糖凝集素-9的活性從而抑制或阻止哺乳動物的免疫力的步驟。

合適地，該方法包括向哺乳動物施用半乳糖凝集素-9抑制劑或拮抗劑從而抑制或阻斷哺乳動物中的半乳糖凝集素-9活性的步驟。優(yōu)選地，抑制劑或拮抗劑至少部分地阻止或干擾pd-l2和半乳糖凝集素-9之間的結(jié)合相互作用。

在一個實施方案中，該方法包括向哺乳動物施用可溶性半乳糖凝集素-9或其生物學(xué)活性片段從而抑制或阻斷哺乳動物中的半乳糖凝集素-9活性的步驟。

在一個實施方案中，該方法包括向哺乳動物施用結(jié)合半乳糖凝集素-9的拮抗劑抗體或抗體片段從而抑制或阻斷哺乳動物中的半乳糖凝集素-9活性的步驟。

本發(fā)明的相關(guān)方面提供了治療或預(yù)防哺乳動物的疾病、紊亂或病癥的方法，包括調(diào)節(jié)哺乳動物中半乳糖凝集素-9的活性從而預(yù)防或治療所述疾病或病癥的步驟。

在一個實施方案中，所述疾病、紊亂或病癥對通過激活或刺激哺乳動物中半乳糖凝集素-9的活性促進或增強免疫力有反應(yīng)。優(yōu)選地，該方法包括向哺乳動物施用結(jié)合半乳糖凝集素-9的激動劑抗體或抗體片段從而激活或刺激哺乳動物中的半乳糖凝集素-9活性的步驟。

在另一個實施方案中，所述疾病、紊亂或病癥對通過抑制或阻斷哺乳動物中半乳糖凝集素-9的活性抑制或阻止免疫力有反應(yīng)。在一個具體實施方案中，該方法包括向哺乳動物施用可溶性半乳糖凝集素-9或其生物學(xué)活性片段從而抑制或阻斷哺乳動物中半乳糖凝集素-9的活性的步驟。在另一個具體實施方案中，該方法包括向哺乳動物施用結(jié)合半乳糖凝集素-9的拮抗劑抗體或抗體片段從而抑制或阻斷哺乳動物中的半乳糖凝集素-9活性的步驟。

本發(fā)明的又另一方面提供了包含半乳糖凝集素-9激動劑和免疫原的組合物。合適地，該組合物是引發(fā)對該免疫原的免疫應(yīng)答的免疫原性組合物或疫苗。免疫原可以是病原體(例如滅活病毒或減毒細(xì)菌)或病原體的分子組分。合適地，該組合物包含合適的載體、稀釋劑或賦形劑。

本發(fā)明的另一方面提供了設(shè)計、篩選、工程化或以其他方式產(chǎn)生半乳糖凝集素-9激動劑、抑制劑或拮抗劑的方法，所述方法包括以下步驟：(i)確定候選分子是否為激活或刺激半乳糖凝集素-9活性且從而能夠刺激或增強哺乳動物的免疫力的激動劑；或(ii)確定候選分子是否為阻斷或抑制半乳糖凝集素-9活性且從而能夠至少部分地抑制或阻止哺乳動物的免疫力的拮抗劑或抑制劑。

在一個實施方案中，在步驟(i)中，候選分子模擬半乳糖凝集素-9的pd-l2刺激或激活。

在一個實施方案中，在步驟(ii)中，候選分子阻斷或抑制半乳糖凝集素-9的pd-l2刺激或激活。

本發(fā)明的再另一方面提供根據(jù)前述方面的方法產(chǎn)生的半乳糖凝集素-9激動劑、抑制劑或拮抗劑。

本發(fā)明的再另一方面提供了包含前述方面的半乳糖凝集素-9激動劑、抑制劑或拮抗劑的組合物。合適地，該組合物包含合適的載體、稀釋劑或賦形劑。

在整個本說明書中，除非另外指出，“包括”、“包含”和“含有”是概括地使用而不是排他地使用，使得所陳述的整數(shù)或整數(shù)組可以包括一個或多個其他非陳述的整數(shù)或整數(shù)組。

如本文中所使用的，不定冠詞例如“一”和“一個”并不指代或指定單一或單個元件，而是可以指代或指定一個或多個元件。

附圖說明

圖1：pd-1和pd-l1調(diào)節(jié)針對夏氏瘧原蟲(p.chabaudi)和約氏瘧原蟲ym(p.yoeliiym)瘧疾的保護性免疫。(a)wt小鼠(n≥9)和(b)pd-1ko小鼠群組感染非致死性10⁵夏氏瘧原蟲或致死性10⁴約氏瘧原蟲ymprbc，每1-2天取血涂片以監(jiān)測寄生蟲血癥。40天后，使所有存活的小鼠休息140天，并用相同的寄生蟲(x刻度上的箭頭)再次攻擊。誤差條：±s.e.m。對數(shù)標(biāo)度突出亞臨床感染。所有野生型小鼠在致死攻擊的7天內(nèi)死亡(c)將來自感染約氏瘧原蟲ym的b6wt(·)和pd-l1ko(▲)小鼠的總cd11c⁺dc轉(zhuǎn)移到初始小鼠，其然后感染致死劑量的約氏瘧原蟲ym，并且每1-3天檢查小鼠，進行>60天。(總n＝9)。所有給予wtdc的小鼠至第9天死亡，而給予pd-l1kodc的所有小鼠存活。

圖2：通過對約氏瘧原蟲ym和約氏瘧原蟲17xnl感染后(p.i.)從第7天的總脾臟dc進行實時pcr將pd-l2mrna與3個管家基因的平均值來比較。數(shù)據(jù)顯示為在兩個獨立實驗中使用制備的rna獲得的mrna水平的平均值和范圍。顯著性使用對來自重復(fù)實驗的合并數(shù)據(jù)的非參數(shù)t檢驗進行分析。

圖3：在非致死性感染中阻斷pd-l2會加劇感染。用對照igg(黑色圓圈)或阻斷性抗-pd-l2抗體(白色方形)處理后wt小鼠的平均寄生蟲血癥百分比。數(shù)據(jù)表示wt(總n＝10只小鼠)或pd-1ko(總n＝10)小鼠中2個獨立實驗之一(*p＝0.0048)。

圖4：可溶性合成多聚體pd-l2保護免受致死性瘧疾影響并產(chǎn)生持久的免疫力。用致死性約氏瘧原蟲ym感染b6小鼠群組(n＝12)，并在第3、5和7天給小鼠施用可溶性八聚體pd-l2或人igg(對照ig)。在感染清除和休息3個月后，用致死性約氏瘧原蟲ym感染再次攻擊存活的小鼠(箭頭；沒有額外的spdl2)。

圖5：可溶性合成多聚體pd-l2提供針對腦瘧疾的癥狀的保護并延長存活。用伯氏瘧原蟲(p.berghei)瘧疾感染b6小鼠群組(n＝9)(其至第8天導(dǎo)致腦癥狀)，并且在第3、5和7天給予小鼠可溶性pd-l2或人igg(對照ig)。每天監(jiān)測小鼠的(a)腦癥狀和(b)存活。由于過量的tnf，小鼠最終死于dc功能的缺乏(wykes，2007)。

圖6：cd4⁺和cd8⁺t細(xì)胞耗竭研究顯示這些細(xì)胞在針對嚴(yán)重瘧疾的保護中的作用。(a)用致死性約氏瘧原蟲ym感染并用rig處理(黑色圓圈)或用spd-l2(黑色方塊)處理后具有cd4⁺t細(xì)胞(白色方形)或cd8⁺t細(xì)胞(白色圓圈)耗竭的wt小鼠中小鼠的平均存活百分比。

圖7：通過spd-l2的保護不是通過阻斷pd-l1。用致死性約氏瘧原蟲ym感染并用對照igg或spd-l2處理wt和pd-l1敲除小鼠群組。監(jiān)測小鼠的寄生蟲血癥。

圖8：半乳糖凝集素-9通過固定的pd-l2從t細(xì)胞免疫沉淀。將總小鼠t細(xì)胞群體的裂解物與固定的igg或pd-l2-fc融合蛋白混合。切取條帶并消化用于質(zhì)譜(massspectrophotometer)分析。半乳糖凝集素-9(2)對于與pd-l2的免疫沉淀是獨有的。

圖9：通過固定的pd-l2從t細(xì)胞免疫沉淀的半乳糖凝集素-9的western印跡。將總小鼠t細(xì)胞群體的裂解物與固定的igg或pd-l2-fc融合蛋白混合。將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素，其對于半乳糖凝集素-9是免疫標(biāo)記的。

圖10：spd-l2結(jié)合t細(xì)胞上的半乳糖凝集素-9。從初始小鼠的脾臟分離總t細(xì)胞群體，并用生物素化的spd-l2和apc-鏈霉親和素或pe-抗半乳糖凝集素-9孵育。t細(xì)胞也用未標(biāo)記的抗半乳糖凝集素-9抗體孵育，然后用生物素化的spd-l2和apc-鏈霉親和素標(biāo)記。所有樣品也被標(biāo)記以鑒別cd4⁺和cd8⁺t細(xì)胞。

圖11：可溶性pd-l2增加由半乳糖凝集素-9介導(dǎo)的初始小鼠cd4⁺t細(xì)胞的分化及其tbet水平。初始cd4⁺t細(xì)胞用抗cd3、il-2和圖上顯示的刺激物培養(yǎng)。與大鼠igg處理相比，(a)spd-l2增加表達(dá)tbet的cd4+cd62l^lo細(xì)胞的百分比和(b)細(xì)胞內(nèi)tbet的水平。該作用通過被確定為半乳糖凝集素-9抑制劑的抗半乳糖凝集素-9(克隆108a)抗體阻斷?？寺g9.1也增加了表達(dá)tbet的小鼠cd4+cd62l^lo細(xì)胞的百分比。

圖12：可溶性合成pd-l2和抗半乳糖凝集素-9抗體提供針對致死性瘧疾的癥狀的保護。用致死性約氏瘧原蟲ym感染b6小鼠群組(n＝3)，并在第3、5和7天給小鼠施用可溶性pd-l2、抗半乳糖凝集素-9或人igg(對照ig)。每天監(jiān)測小鼠的疾病癥狀和存活并評分。當(dāng)分?jǐn)?shù)達(dá)到4時，對小鼠實施安樂死。通過被確定為半乳糖凝集素-9刺激劑(激動性抗體)的rg1模擬并改善spdl2對臨床分?jǐn)?shù)的正面效應(yīng)。

圖13：小鼠pd-l2-半乳糖凝集素-9是高度穩(wěn)定的并且涉及半乳糖凝集素-9和pd-l2的多聚化。進行octetred研究以確定半乳糖凝集素-9和pd-l2之間的結(jié)合的生物化學(xué)性質(zhì)。spd-l2與探針結(jié)合，并測量其與spd-1和sgalectin-9的相互作用。pd-l2-pd1結(jié)合曲線顯示pd-l2在小于0.02秒(測定的靈敏度)內(nèi)結(jié)合pd-1，并在小于0.02秒內(nèi)解離。pd-l2-gal-9曲線顯示半乳糖凝集素-9結(jié)合需要299.99秒來締合和614.21秒來解離，表明pd-l2和半乳糖凝集素-9之間非常穩(wěn)定的相互作用。峰的高度顯示半乳糖凝集素-9的大聚集，這對于pd-1中未見到，表明半乳糖凝集素-9和pdl2在結(jié)合期間多聚化。

圖14：由用小鼠spd-l2或抗半乳糖凝集素-9抗體處理的小鼠cd4⁺t細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子。從小鼠脾臟分離cd4⁺t細(xì)胞，并用抗cd3和刺激物培養(yǎng)3天，收集上清液以測量細(xì)胞因子干擾素-γ、il-2和tnf-α。誤差條表示sem，數(shù)據(jù)代表2個實驗中的1個。

圖15：(a)從用人spd-l2處理的人cd4⁺t細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子。cd4⁺t細(xì)胞從人pbmc分離，并用pma和離子霉素培養(yǎng)3天以模擬tcr的活化。然后用spd-l2或?qū)φ张囵B(yǎng)細(xì)胞，并在第3天收集上清液以測量細(xì)胞因子干擾素-γ(ifn-γ)、il-2、tnf-α和il-4。誤差條表示sem，數(shù)據(jù)代表來自2個實驗的合并數(shù)據(jù)。(b)從用抗小鼠半乳糖凝集素-9處理的人cd4⁺t細(xì)胞分泌的ifn-γ。cd4⁺t細(xì)胞從人pbmc分離，并用次優(yōu)濃度的抗cd3培養(yǎng)3天以模擬tcr的活化。然后用人spd-l2或抗小鼠半乳糖凝集素-9培養(yǎng)細(xì)胞，并在第3天收集上清液以測量細(xì)胞因子。誤差條表示sem，數(shù)據(jù)表示1個實驗。

圖16：抗半乳糖凝集素-9激活抗體而不是抗tim3阻斷性抗體保護免受致死性瘧疾的影響。在感染后第3、5和7天，用對照大鼠igg、阻斷性抗tim-3抗體或激活抗半乳糖凝集素-9抗體處理的wt小鼠中約氏瘧原蟲ym瘧疾的典型過程的平均寄生蟲血癥百分比。誤差條表示sem，數(shù)據(jù)代表tim3的2個實驗中的1個和抗半乳糖凝集素-9的3個實驗中的1個。

圖17：抗半乳糖凝集素-9處理降低乳腺癌進展。將小鼠群組用(a)pymt來源的或(b)eo771.lmb乳腺癌異位移植，并用對照igg或抗半乳糖凝集素-9抗體處理。每1-2天監(jiān)測小鼠以監(jiān)測腫瘤進展。qimr-b倫理要求小鼠在移植到乳房中的腫瘤達(dá)到～525mm²時實施安樂死。誤差條表示sem。

圖18：pd-l2的阻斷抑制感染約氏瘧原蟲17xnl的小鼠脾臟中寄生蟲特異性的cd4⁺t細(xì)胞的擴增。分析感染約氏瘧原蟲17xnl并用大鼠igg或抗pd-l2阻斷性抗體處理的wt小鼠中的各種參數(shù)。所有數(shù)據(jù)以散點圖顯示，條形表示中值。(a，b)第7天(n＝4)(a)和第14天(n＝7)(b)每脾中表達(dá)tbet的cd4⁺cd62l^hi和cd4⁺cd62l^lot細(xì)胞的數(shù)量。(c)在存在初始dc的情況下在elispot培養(yǎng)物中響應(yīng)于寄生蟲抗原(msp119)分泌干擾素-γ(ifn-γ)的cd4⁺t細(xì)胞數(shù)(n＝7)。(d，e)血清約氏瘧原蟲17xnl感染的小鼠(n＝7)中的(d)ifn-γ和(e)il-10的水平。(f)每個脾中表達(dá)cd25和foxp3(調(diào)節(jié)性t細(xì)胞)的cd4⁺t細(xì)胞數(shù)(n＝7)。第14天的數(shù)據(jù)表示兩個合并的獨立實驗。使用基于雙側(cè)的非參數(shù)型mann-whitneyu檢驗分析顯著性(*p<0.05；**p<0.005；***p<0.0005)。f檢驗發(fā)現(xiàn)組之間顯著不同的方差。

圖19：pd-l2調(diào)節(jié)約氏瘧原蟲17xnl瘧疾期間的th1免疫力。(a，b)在(a)wt小鼠和pd-l2ko小鼠(n＝4)或(b)用大鼠igg或抗pd-l2阻斷性抗體處理的wt小鼠(n＝5)中約氏瘧原蟲17xnl瘧疾的典型過程中的臨床癥狀分?jǐn)?shù)。(c-f)散點圖顯示用大鼠igg或抗-pd-l2阻斷性抗體處理的wt小鼠或用約氏瘧原蟲17xnl感染14天的pd-l2ko小鼠中的cd4⁺t細(xì)胞的分析。(c)每個脾中表達(dá)tbet的cd4⁺cd62l^hi或cd4⁺cd62l^lot細(xì)胞的平均數(shù)。(d)在存在初始dc的情況下，每個脾中在elispot培養(yǎng)物中響應(yīng)寄生蟲抗原(msp119)分泌ifn-γ的cd4⁺t細(xì)胞的平均數(shù)。(e-f)在存在初始dc的情況下，每個脾中在elispot培養(yǎng)物中響應(yīng)寄生蟲抗原(pb1)分泌ifn-γ的cd8⁺t細(xì)胞的平均數(shù)。(e)約氏瘧原蟲17xnl感染后第14天獲得的細(xì)胞，有和沒有pd-l2阻斷(n＝7)。(f)約氏瘧原蟲17xnl感染后第14天從pd-l2ko小鼠和對照獲得的細(xì)胞。除了pd-l2ko小鼠進行一次外，從2個獨立實驗匯集數(shù)據(jù)。誤差條表示sem(*p<0.05)。使用非參數(shù)型mann-whitneyu檢驗分析顯著性。

圖20：spd-l2通過cd4⁺t細(xì)胞介導(dǎo)保護和存活。在感染約氏瘧原蟲后第3、5和7天，用對照人igg(hig)或spd-l2處理的wt小鼠中的(a)存活曲線和(b-d)平均寄生蟲血癥百分比。然后在感染后第1天開始用(b)大鼠ig、(c)耗竭性抗cd4抗體或(d)耗竭性抗cd8抗體(n＝4)共處理小鼠，每3-4天共處理直到感染后第14-18天。數(shù)據(jù)表示獲得相似結(jié)果的兩個獨立實驗之一。使用對數(shù)秩(mantel-cox)檢驗，基于來自合并試驗的數(shù)據(jù)分析spd-l2⁺大鼠igg處理組和對照組(給予大鼠和人igg)或耗竭cd4⁺t細(xì)胞的spd-l2處理組之間的存活的顯著性。

圖21：spd-l2通過促進th1cd4⁺和cd8⁺t細(xì)胞功能保護小鼠免于致死性瘧疾的影響。分析在感染約氏瘧原蟲ym并在感染后第3、5和7天用對照人igg或spd-l2處理的wt小鼠中的各種參數(shù)(感染后第7天)(n＝8)。所有數(shù)據(jù)以散點圖顯示，條形表示中值。(a)在初始dc存在下，在elispot培養(yǎng)物中響應(yīng)寄生蟲抗原msp119分泌ifn-γ的cd4⁺t細(xì)胞的數(shù)目；(b)通過摻入edu測量的在初始dc存在下在培養(yǎng)物中響應(yīng)寄生蟲抗原msp119增殖的cd4⁺t細(xì)胞的數(shù)目；(c)每個脾中表達(dá)cd25和foxp3的cd4⁺t細(xì)胞的數(shù)目。(d)每個脾中寄生蟲特異性pb1-四聚體⁺cd8⁺t細(xì)胞的數(shù)目，和(e)在初始dc存在下在培養(yǎng)物中響應(yīng)寄生蟲肽pb1分泌ifn-γ的cd8⁺t細(xì)胞的數(shù)目(通過elispot測定)；(f)表達(dá)cd11a和顆粒酶b的cd8⁺t細(xì)胞的數(shù)目，cd11a是當(dāng)前激活的標(biāo)志物。數(shù)據(jù)表示兩個合并的獨立實驗，除了四聚體和顆粒酶b標(biāo)記進行一次外。使用基于雙側(cè)的非參數(shù)型mann-whitneyu檢驗分析顯著性(*p<0.05；**p<0.005)。f檢驗發(fā)現(xiàn)組之間顯著不同的方差。

發(fā)明詳述

pd-l2是程序性死亡受體-1(pd1)和rgmb的配體，并且本文中提出半乳糖凝集素-9(gal-9)是迄今未知的pd-l2的受體。當(dāng)用致死性瘧疾病株攻擊時，可溶性pd-l2處理的小鼠不死亡，并且提示pd-l2通過cd4⁺t細(xì)胞介導(dǎo)保護作用，因為當(dāng)cd4⁺t細(xì)胞耗竭時，pd-l2介導(dǎo)的保護作用喪失。因此，提出給予可溶性pd-l2(spdl2)或激動性抗半乳糖凝集素-9抗體可起到免疫刺激劑的作用和/或啟動th1介導(dǎo)的免疫應(yīng)答和/或免疫記憶。這可能在刺激對癌癥、感染劑和寄生蟲的免疫應(yīng)答中有效，包括產(chǎn)生和維持免疫記憶，特別是針對癌癥。還提出給予半乳糖凝集素-9的阻斷性或拮抗劑抗體可以預(yù)防或抑制對于pd-l2所見的效應(yīng)。結(jié)合pd-l2并阻斷其與半乳糖凝集素-9的相互作用的抗體可以具有與半乳糖凝集素-9拮抗劑抗體類似的效果。這可以有助于抑制免疫，例如可用于治療或預(yù)防自身免疫性疾病、炎癥和/或過敏。

為了本發(fā)明的目的，“分離的”是指已從其天然狀態(tài)移除或以其他方式進行人工操作的材料。分離的材料可以基本上或?qū)嵸|(zhì)上不含在其天然狀態(tài)下通常伴隨的組分，或者可以被操作以便與通常在其天然狀態(tài)下伴隨的組分一起處于人工狀態(tài)。分離的材料可以是天然的、化學(xué)合成的或重組的形式。

“蛋白質(zhì)”是指氨基酸聚合物。氨基酸可以是天然或非天然氨基酸，如本領(lǐng)域熟知的d-或l-氨基酸。

“肽”是具有不超過五十(50)個氨基酸的蛋白質(zhì)。

“多肽”是具有多于五十(50)個氨基酸的蛋白質(zhì)。

如本文所用，“半乳糖凝集素-9”或“gal-9”是指由其對β-半乳糖苷如n-乙酰乳糖胺(galβ1-3glcnac或galβ1-4glcnac)的結(jié)合特異性定義的半乳糖凝集素蛋白家族的蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)由于其在穩(wěn)定性和碳水化合物結(jié)合方面對二硫鍵的依賴性而被稱為s型凝集素。已經(jīng)在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)了由lgals基因編碼的15種半乳糖凝集素，其中已在人類中鑒定了半乳糖凝集素-1、-2、-3、-4、-7、-8、-9、-10、-12和-13。人半乳糖凝集素-9通常包含355個氨基酸的序列(稱為標(biāo)準(zhǔn)或“長形式”序列)，但存在缺少殘基149-180的“短形式”變體。合適的情況下，在本發(fā)明的上下文中，半乳糖凝集素-9由淋巴細(xì)胞或nk細(xì)胞表達(dá)。淋巴細(xì)胞可以是cd4⁺t細(xì)胞、cd8⁺t細(xì)胞或b細(xì)胞。人半乳糖凝集素-9氨基酸序列的非限制性實例可以在uniprotkb登錄號o00182下找到，且小鼠半乳糖凝集素-9氨基酸序列的非限制性實例可在uniprotkb登錄號o08573下找到。

本文所用的“抗體”是或包含免疫球蛋白。術(shù)語“免疫球蛋白”包括哺乳動物免疫球蛋白基因復(fù)合物的任何抗原結(jié)合蛋白產(chǎn)物，包括免疫球蛋白同種型iga、igd、igm、igg和ige及其抗原結(jié)合片段。術(shù)語“免疫球蛋白”中包括嵌合的或人源化的或另外地包含改變的或變體的氨基酸殘基、序列和/或糖基化的免疫球蛋白，無論是天然存在的還是通過人類干預(yù)(例如通過重組dna技術(shù))產(chǎn)生的。

抗體片段包括fab和fab'2片段、雙抗體、三鏈抗體和單鏈抗體片段(例如scv)，但不限于此。通常，抗體包含各自包含cdr1、2和3氨基酸序列的輕鏈和重鏈可變區(qū)。優(yōu)選的抗體片段包含至少一個輕鏈可變區(qū)cdr和/或至少一個重鏈可變區(qū)cdr。

抗體和抗體片段可以是多克隆或優(yōu)選單克隆的。單克隆抗體可以使用例如在和milstein，1975，nature256,495-497的文章中描述的標(biāo)準(zhǔn)方法來產(chǎn)生或通過例如描述在coligan等人的currentprotocolsinimmunology的第2章中的其最近的改進，通過使來自已經(jīng)接種半乳糖凝集素-9或其片段的產(chǎn)生物種的脾或其他抗體產(chǎn)生細(xì)胞永生化來產(chǎn)生。還將理解的是，可以通過在合適的宿主細(xì)胞中表達(dá)編碼抗體或抗體片段的核酸來產(chǎn)生作為重組合成抗體或抗體片段的抗體。重組合成抗體或抗體片段重鏈和輕鏈可以由相同宿主細(xì)胞中的不同表達(dá)載體共表達(dá)或在宿主細(xì)胞中表達(dá)為單鏈抗體。重組抗體表達(dá)和篩選技術(shù)的非限制性實例在coligan等人的currentprotocolsinimmunology的第17章和zuberbuhler等人于2009的proteinengineering，design&selection22169中提供。

在另一物種中產(chǎn)生或源自另一物種的抗體和抗體片段可以被修飾以便可以施用于一個物種而不引起對“外源”抗體的有害免疫應(yīng)答。在人的情況中，這是在另一物種中產(chǎn)生或源自另一物種的抗體的“人源化”。這樣的方法是本領(lǐng)域公知的，并且通常包含將非人抗體互補決定區(qū)(cdr)重組“嫁接”到人抗體支架或骨架上。

在一些實施方案中，標(biāo)記抗體或抗體片段。

標(biāo)記物可以選自包括色原體、催化劑、生物素、地高辛、酶、熒光團、化學(xué)發(fā)光分子、放射性同位素、藥物或其他化療劑、磁珠和/或直接視覺標(biāo)記物的組。

本發(fā)明的一個方面提供了調(diào)節(jié)哺乳動物的免疫力的方法，包括調(diào)節(jié)哺乳動物中的半乳糖凝集素-9活性從而調(diào)節(jié)哺乳動物的免疫力的步驟。

在一個實施方案中，“調(diào)節(jié)免疫力”是指促進或增強哺乳動物的免疫力。在本文中，半乳糖凝集素-9活性例如通過激動劑被刺激或提高。

在另一個實施方案中，“調(diào)節(jié)免疫力”是指至少部分地遏制、抑制或阻止哺乳動物的免疫力。在本文中，半乳糖凝集素-9活性例如通過半乳糖凝集素-9拮抗劑或抑制劑至少部分地被阻斷或抑制。

因此，本發(fā)明的一個具體方面提供了促進或增強哺乳動物的免疫力的方法，包括激活、提高或刺激哺乳動物中的半乳糖凝集素-9活性從而刺激或增強哺乳動物的免疫力的步驟。

合適地，該方法包括向哺乳動物施用半乳糖凝集素-9激動劑從而激活或刺激哺乳動物中的半乳糖凝集素-9活性的步驟。

在本文中，“激動劑”是指至少部分地激活、提高或刺激半乳糖凝集素-9活性的分子。激動劑可以是半乳糖凝集素-9的天然配體如pd-l2或可以模擬天然配體如pd-l2的作用。在一個具體實施方案中，所述方法包括向哺乳動物施用可溶性pd-l2或其生物學(xué)活性片段從而激活或刺激哺乳動物中的半乳糖凝集素-9活性的步驟。合適地，pd-l2是多聚體，優(yōu)選包含n個單體，其中n≥3。優(yōu)選地，多聚體pd-l2包含三個、四個、五個、六個、七個或八個pd-l2單體。在一個具體實施方案中，pd-l2包含八個單體(即n＝8或八聚體)。在這種情況中，多聚體pd-l2可以誘導(dǎo)或共價形成，例如通過單體的化學(xué)交聯(lián)，包括使用接頭氨基酸或肽以促進每個單體的共價偶聯(lián)。在其他實施方案中，多聚體pd-l2的作用可以通過如肽或核酸(例如寡核苷酸)適體的試劑或通過結(jié)合pd-l2和半乳糖凝集素-9兩者的雙特異性抗體來模擬，或通過如肽或核酸(例如寡核苷酸)適體的試劑來模擬。激動劑可以是可結(jié)合半乳糖凝集素-9從而激活或刺激半乳糖凝集素-9活性的任何其他分子，例如激動劑抗體或抗體片段。在一個具體實施方案中，所述方法包括向哺乳動物施用結(jié)合半乳糖凝集素-9的激動劑抗體或抗體片段從而激活或刺激哺乳動物中的半乳糖凝集素-9活性的步驟。

在一些實施方案中，激動劑可以在施用于哺乳動物后刺激或增強免疫應(yīng)答。免疫應(yīng)答可以包括誘導(dǎo)針對癌癥或病原體(例如引起感染和/或寄生蟲病的病原體)的免疫記憶，特別是當(dāng)病原體通過避免、消除或回避免疫記憶而規(guī)避免疫系統(tǒng)時。非限制性實例是瘧疾，其消除免疫記憶從而允許之后的再感染。

在癌癥的情況下，向癌癥患者施用激動劑可產(chǎn)生、誘導(dǎo)和/或維持免疫記憶，使得當(dāng)非自身信號低或缺乏時，腫瘤細(xì)胞被識別為外來的。

在另一個實施方案中，半乳糖凝集素-9激動劑可以作為佐劑與疫苗或其他免疫原性組合物中的免疫原組合施用。這可以提高疫苗或免疫原性組合物的有效性，并且還可以消除或最小化強化免疫接種的需要。在該實施方案的特定形式中，激動劑的施用可以挽救或恢復(fù)未充分刺激免疫原或病原體的免疫記憶的失敗的或次優(yōu)的疫苗或疫苗接種。免疫原可以是病原體的組成分子(例如其細(xì)胞表面蛋白、免疫原性肽或其他組分，例如在“亞單位疫苗”中，包含多個b-和/或t-表位的多表位、vlp、衣殼或殼粒)、滅活的病原體(例如滅活病毒、減毒寄生蟲感染的rbc或減毒細(xì)菌)或能夠引發(fā)對病原體的免疫應(yīng)答的任何其他分子或結(jié)構(gòu)。例如，參考證明了施用pd-l2和抗半乳糖凝集素-9抗體激動劑在改善瘧疾免疫中的功效的實施例。

向哺乳動物施用激動劑可刺激初始t細(xì)胞進行th1譜系選擇和/或定型。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的，th1譜系包括產(chǎn)生和分泌多種因子之一的cd4⁺t細(xì)胞，所述因子包括干擾素(ifn-γ)、il-2和tnf-α，但不限于此。th1細(xì)胞在針對細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌、原生動物寄生蟲和病毒的免疫應(yīng)答中特別重要。th1細(xì)胞由il-12和il-2觸發(fā)，進而刺激免疫效應(yīng)細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞、cd8+t細(xì)胞、表達(dá)igg的b細(xì)胞、樹突細(xì)胞和其他cd4⁺t細(xì)胞。

從上述可以理解，激活或刺激半乳糖凝集素-9(例如通過本文公開的激動劑)可以治療或預(yù)防哺乳動物的疾病、紊亂或病癥。

如本文所用，“治療”是指在疾病、紊亂或病癥的癥狀至少開始發(fā)生后至少改善癥狀的治療性干預(yù)、作用過程或方案。如本文所用，“預(yù)防”是指在疾病、紊亂或病癥的癥狀發(fā)作之前開始的治療性干預(yù)、作用過程或方案，以便阻止、抑制或延遲疾病、紊亂或病癥或癥狀的發(fā)生或進展。這種預(yù)防性治療可以稱為“預(yù)防法”或“預(yù)防性”治療。在具體實施方案中，免疫或疫苗接種是預(yù)防性或預(yù)防的免疫療法。

在廣義的實施方案中，疾病、紊亂或病癥由病原體引起。病原體可以是病毒、細(xì)菌或寄生蟲。寄生蟲的非限制性實例包括原生動物，例如瘧疾寄生蟲，包括瘧原蟲屬(plasmodiumspp)，例如惡性瘧原蟲(p.falciparum)、卵形瘧原蟲(p.ovale)、諾氏瘧原蟲(p.knowlesii)、三日瘧原蟲(p.malariae)和間日瘧原蟲(p.vivax)，但不限于此。其他寄生蟲包括巴貝蟲屬(babesiaspp)、內(nèi)阿米巴屬(entamoeba)、賈第蟲屬(giardiaspp)和錐蟲屬(trypanosomes)，包括利什曼原蟲屬(leishmaniaspp)，但不限于此。

病毒病原體的非限制性實例包括：人免疫缺陷病毒(hiv)、埃博拉病毒、流感病毒、皰疹病毒、乳頭狀瘤病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、乙型肝炎病毒、風(fēng)疹病毒、鼻病毒、黃病毒如丙型肝炎病毒(hcv)、西尼羅病毒、日本腦炎病毒和登革病毒、巨細(xì)胞病毒(cmv)和eb病毒(ebv)，但不限于此。

細(xì)菌病原體的非限制性實例可以是如奈瑟氏球菌屬、博代氏桿菌屬、假單胞菌屬、棒狀桿菌屬、沙門氏菌屬、鏈球菌屬、志賀氏菌、分枝桿菌屬、支原體屬、梭菌屬、螺桿菌屬、包柔氏螺旋體屬、耶爾森菌屬、軍團菌屬、嗜血桿菌屬、立克次體屬、李斯特菌屬、布魯氏菌屬、弧菌屬和密螺旋體屬的屬，包括如金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、幽門螺旋桿菌、炭疽桿菌、百日咳博代氏桿菌、白喉棒狀桿菌、假結(jié)核棒狀桿菌、破傷風(fēng)梭菌、肉毒梭菌、肺炎鏈球菌、變異鏈球菌、口腔鏈球菌、副血鏈球菌、釀膿鏈球菌、草綠色鏈球菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、流感嗜血桿菌、多殺性巴氏桿菌、痢疾桿菌、結(jié)核桿菌、麻風(fēng)桿菌、亞洲結(jié)核桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、肺炎支原體、人型支原體、腦膜炎雙球菌、淋球菌、立氏立克次體、流產(chǎn)布魯氏桿菌、犬布魯氏桿菌、豬布魯氏桿菌、嗜肺軍團桿菌(legionellapneuophila)、肺炎克雷伯氏菌、綠膿桿菌、梅毒螺旋體、密螺旋體(treponemapertanue)、沙眼衣原體、霍亂弧菌、斑點密螺旋體(treponemacarateum)、鼠傷寒沙門氏菌、傷寒桿菌、伯氏疏螺旋體和鼠疫耶爾森氏菌的種，但不限于此。

在另一廣義的實施方案中，所述疾病、紊亂或病癥是癌癥。如本文一般使用的，術(shù)語“癌癥”、“腫瘤”、“惡性腫瘤”和“惡性疾病”是指特征為反?；虍惓５募?xì)胞增殖、分化和/或遷移，通常伴隨反常或異常分子表型的疾病或病癥，或與該疾病或病癥相關(guān)的細(xì)胞或組織，該反常或異常分子表型包括與腫瘤發(fā)生、腫瘤標(biāo)志物的表達(dá)、腫瘤抑制物表達(dá)或活性的喪失和/或反?；虍惓５募?xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)相關(guān)的一種或多種遺傳突變或其他遺傳變化。癌癥和腫瘤的非限制性實例包括肉瘤、癌、腺瘤、白血病和淋巴瘤、肺癌、結(jié)腸癌、肝癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和其他神經(jīng)癌、腦癌、乳腺癌、子宮頸癌、子宮癌、頭頸癌、腎癌、前列腺癌和黑素瘤。合適地，癌癥響應(yīng)于半乳糖凝集素-9的活化或刺激，例如通過本文公開的激動劑。在一些實施方案中，癌癥響應(yīng)于由半乳糖凝集素-9的活化或刺激引起的免疫記憶的誘導(dǎo)或增強。

本發(fā)明的另一個具體方面提供了至少部分地抑制或阻止哺乳動物的免疫力的方法，包括至少部分地抑制或阻斷哺乳動物中的半乳糖凝集素-9活性從而抑制或阻止哺乳動物的免疫力的步驟。

合適地，該方法包括向哺乳動物施用半乳糖凝集素-9抑制劑或拮抗劑從而抑制或阻斷哺乳動物中的半乳糖凝集素-9活性的步驟。優(yōu)選地，抑制劑或拮抗劑至少部分地阻止或干擾pd-l2和半乳糖凝集素-9之間的結(jié)合相互作用。另外地或可選地，半乳糖凝集素-9抑制劑或拮抗劑至少部分地阻止或干擾通常在響應(yīng)pd-l2結(jié)合時發(fā)生的半乳糖凝集素-9信號傳導(dǎo)。在一些實施方案中，半乳糖凝集素-9抑制劑或拮抗劑可以是直接結(jié)合半乳糖凝集素-9的試劑(例如抗半乳糖凝集素-9抗體或抗體片段)，或可以是直接結(jié)合pd-l2(例如抗pd-l2抗體片段)以抑制或阻斷pd-l2多聚化和/或與半乳糖凝集素-9結(jié)合的試劑。在具體的實施方案中，半乳糖凝集素-9抑制劑或拮抗劑可以包括：(i)可溶性半乳糖凝集素-9或其抑制性片段；(ii)結(jié)合半乳糖凝集素-9從而抑制或阻斷pd-l2與半乳糖凝集素-9之間的結(jié)合和/或半乳糖凝集素-9信號傳導(dǎo)的拮抗劑抗體或抗體片段或其他試劑；(iii)抑制或阻斷pd-l2與半乳糖凝集素-9之間的結(jié)合和/或半乳糖凝集素-9信號傳導(dǎo)的單體或二聚體pd-l2；(iv)結(jié)合pd-l2并由此阻止pd-l2結(jié)合半乳糖凝集素-9的抗體或抗體片段或其他試劑；和/或(v)結(jié)合pd-l2以阻止或抑制pd-l2多聚化的抗體或抗體片段或其他試劑。

因此，在一個實施方案中，該方法包括向哺乳動物施用可溶性半乳糖凝集素-9或其抑制性片段從而抑制或阻斷哺乳動物中pd-l2與半乳糖凝集素-9之間的結(jié)合的步驟。在一個實施方案中，所述方法包括向哺乳動物施用結(jié)合半乳糖凝集素-9的拮抗劑抗體或抗體片段從而抑制或阻斷哺乳動物中pd-l2與半乳糖凝集素-9之間的結(jié)合和/或半乳糖凝集素-9信號傳導(dǎo)的步驟。在另一個實施方案中，所述方法包括向哺乳動物施用單體或二聚體pd-l2從而抑制或阻斷哺乳動物中pd-l2與半乳糖凝集素-9之間的結(jié)合和/或半乳糖凝集素-9信號傳導(dǎo)的步驟。在另一個實施方案中，所述方法包括向哺乳動物施用結(jié)合pd-l2的抗體或抗體片段從而阻止pd-l2結(jié)合半乳糖凝集素-9的步驟。在又一個實施方案中，所述方法包括向哺乳動物施用結(jié)合pd-l2的抗體或抗體片段或其他試劑以阻止或抑制哺乳動物中pd-l2多聚化的步驟。

在某些實施方案中，抑制或阻止哺乳動物中的免疫力可促進或輔助疾病、紊亂或病癥的預(yù)防或治療。在具體實施方案中，疾病、紊亂或病癥可以是自身免疫性疾病、紊亂或病癥，炎性疾病、紊亂或病癥，包括過敏性疾病、紊亂或病癥。

應(yīng)當(dāng)理解，由于在導(dǎo)致自身免疫性和/或炎性疾病、紊亂和病癥的潛在免疫機制中的共同性，在自身免疫性和炎性疾病、紊亂和病癥之間可能存在重疊。然而，僅作為實例，自身免疫性疾病、紊亂或病癥包括干燥綜合征、i型糖尿病、強直性脊柱炎、橋本氏甲狀腺炎、克羅恩氏病、肌萎縮性側(cè)索硬化、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、重癥肌無力、多發(fā)性硬化、格雷夫斯病、愛迪生氏病、白塞氏綜合征、vogtkoyanagi-harada(vkh)疾病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和牛皮癬性關(guān)節(jié)炎，但不限于此。炎性疾病、紊亂或病癥的非限制性實例包括炎性腸病、動脈粥樣硬化、骨盆炎性疾病、乳糜瀉、哮喘、慢性阻塞性肺病和過敏，但不限于此。

在一個具體實施方案中，所述疾病、紊亂或病癥響應(yīng)于t-bet或包含t-bet的信號傳導(dǎo)途徑的阻斷或抑制。

盡管不希望受任何特定理論的束縛，t盒轉(zhuǎn)錄因子t-bet是1型樣免疫的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，在t和b淋巴細(xì)胞以及樹突細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞中效應(yīng)細(xì)胞命運的建立和/或維持中起關(guān)鍵作用。t-bet可以在維持th1效應(yīng)子功能和分化中起作用，包括cd4和γδt細(xì)胞中ifn-γ的產(chǎn)生，但不限于此。例如，t-bet缺陷保護免于自身免疫性和/或炎性疾病，而t-bet過表達(dá)促進自身免疫性和/或炎性疾病。如將在實施例中更詳細(xì)描述的，阻斷pd-l2/半乳糖凝集素-9途徑會阻斷t-bet，因此其具有提供治療自身免疫性和/或炎性疾病的新方法的潛力。

可以通過施用包含半乳糖凝集素-9激動劑、拮抗劑和抑制劑以及合適的載體、稀釋劑或賦形劑的藥物組合物來實現(xiàn)如上所述的半乳糖凝集素-9激動劑、拮抗劑和抑制劑的施用。

一般來說，載體、稀釋劑或賦形劑可以是可被安全用于全身給藥的固體或液體填充劑、稀釋劑、緩沖劑、粘合劑或包封物質(zhì)。根據(jù)具體的給藥途徑，可以使用本領(lǐng)域熟知的多種載體、稀釋劑和賦形劑。它們可以選自下組：糖，淀粉，纖維素及其衍生物，麥芽，明膠，滑石，硫酸鈣，植物油，合成油，多元醇，海藻酸，磷酸鹽緩沖溶液，乳化劑，等滲鹽水和鹽如礦物酸鹽，包括鹽酸鹽、溴酸鹽和硫酸鹽，糖，糖醇，有機酸如乙酸、丙酸和丙二酸，和無熱原水。描述藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑和賦形劑的有用參考文獻(xiàn)是remington'spharmaceuticalsciences(mackpublishingco.njusa,1991)。

在一些實施方案中，組合物可以進一步包含一種或多種免疫調(diào)節(jié)劑，包括佐劑和免疫刺激核酸，包括但不限于以下：tlr激動劑，脂多糖及其衍生物如mpl，弗氏完全佐劑或不完全佐劑，十六烷基胺，十八烷基胺，十八烷基氨基酸酯，溶血卵磷脂，二甲基雙十八烷基溴化銨，n,n-雙十八烷基(dicoctadecyl)-n’,n’-雙(2-羥乙基-丙二胺)，甲氧基十六烷基甘油和普朗尼克多元醇；多胺如吡喃，葡聚糖硫酸鹽，聚ic卡波姆，肽如胞壁酰二肽和衍生物，二甲基甘氨酸，特夫素，油乳劑，礦物凝膠如磷酸鋁、氫氧化鋁或明礬，淋巴因子，咪喹莫特，guardiquimod，quila和免疫刺激復(fù)合物(iscoms)。

可以采用任何安全的給藥途徑向受試者提供包含半乳糖凝集素-9激動劑、拮抗劑或抑制劑的組合物。例如，可以采用口服、直腸、胃腸外、舌下、口腔、靜脈內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、肌內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、吸入、眼內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦室內(nèi)、經(jīng)皮等。

待施用于哺乳動物的半乳糖凝集素-9激動劑、拮抗劑或抑制劑的濃度或量可由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定，并且將考慮諸如要治療的疾病、紊亂或病癥的性質(zhì)和/或哺乳動物的體重、年齡、性別和/或一般健康狀況和體質(zhì)的因素。

在一個實施方案中，藥物組合物可以是疫苗或其他免疫原性組合物。合適地，疫苗或免疫原性組合物包含半乳糖凝集素-9激動劑、合適的載體、稀釋劑或賦形劑和能夠在哺乳動物中引發(fā)免疫應(yīng)答的免疫原。優(yōu)選地，免疫應(yīng)答是包括免疫記憶的引發(fā)的保護性免疫應(yīng)答。免疫原可以是病原體的組成分子(例如其細(xì)胞表面蛋白、免疫原性肽或病原體的其他組分，例如在“亞單位疫苗”中，包含多個b-和/或t-表位的多表位，vlp，衣殼或殼粒)、滅活的病原體(例如滅活病毒，減毒寄生蟲感染的rbc或減毒細(xì)菌)或能夠引發(fā)對病原體的免疫應(yīng)答的任何其他分子。例如參考證明了施用pd-l2和抗半乳糖凝集素-9抗體激動劑在改善瘧疾免疫中的功效的實施例。

本發(fā)明的另一方面提供了設(shè)計、篩選、工程化或以其他方式產(chǎn)生半乳糖凝集素-9激動劑、抑制劑和/或拮抗劑的方法，所述方法包括以下步驟：(i)確定候選分子是否為激活或刺激半乳糖凝集素-9的活性且從而能夠刺激或增強哺乳動物的免疫力的激動劑；或(ii)確定候選分子是否為阻斷或抑制半乳糖凝集素-9的活性且從而能夠至少部分地抑制或阻止哺乳動物的免疫力的拮抗劑或抑制劑。

廣義地，如上所述，根據(jù)該方法設(shè)計、篩選、工程化或以其他方式產(chǎn)生的半乳糖凝集素-9激動劑、抑制劑和/或拮抗劑可能能夠刺激或增強哺乳動物的免疫力，或者能夠至少部分地抑制或阻止哺乳動物的免疫力。

在一個具體實施方案中，在步驟(i)中，候選分子模擬半乳糖凝集素-9的pd-l2刺激或激活。

在一個具體實施方案中，在步驟(ii)中，候選分子至少部分地阻斷或抑制半乳糖凝集素-9的pd-l2刺激或活化。

候選分子可以是蛋白質(zhì)，包括肽或多肽諸如如上所述的抗體或抗體片段，小有機分子，碳水化合物如單糖、二糖、三糖或多糖，脂質(zhì)，核酸，適體或包含這些中的一種或多種的任何分子，但不限于此。

適用于設(shè)計和/或篩選候選調(diào)節(jié)劑的技術(shù)的非限制性實例可以使用本領(lǐng)域公知的x射線晶體學(xué)、nmr譜學(xué)、計算機輔助的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫篩選、計算機輔助建模或者檢測分子結(jié)合相互作用的生物化學(xué)或生物物理技術(shù)。

鑒定分子相互作用的生物物理和生物化學(xué)技術(shù)包括競爭性放射性配體結(jié)合測定，共免疫沉淀，基于熒光的測定包括熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fret)結(jié)合測定，電生理學(xué)，分析型超速離心，標(biāo)記轉(zhuǎn)移，化學(xué)交聯(lián)，質(zhì)譜，微量熱法，表面等離子體共振和基于光學(xué)生物傳感器的方法以及諸如在currentprotocolsinproteinscienceeds，coligan等人(johnwiley&sons，1997-2013)的第20章中提供的量子點生物傳感器。生物化學(xué)技術(shù)如雙雜交和噬菌體展示篩選方法在currentprotocolsinproteinscienceeds(coligan等人，johnwiley&sons，1997-2013)的第19章中提供。

因此，所述方法的初始步驟可包括鑒定根據(jù)廣泛的結(jié)構(gòu)和/或功能屬性(例如結(jié)合半乳糖凝集素-9和/或與pd-l2競爭或以其他方式結(jié)合半乳糖凝集素-9以預(yù)防或抑制pd-l2多聚化的能力)選擇的多個候選分子。

該方法可以包括測量或檢測響應(yīng)于候選分子的與半乳糖凝集素-9相關(guān)的一種或多種生物活性的變化的另一步驟。這些可以包括激活或抑制半乳糖凝集素-9細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)、細(xì)胞因子產(chǎn)生、保護免受腫瘤攻擊、增強用病原體或病原體衍生的分子(例如疫苗)的免疫、抑制自身免疫性、炎癥或過敏反應(yīng)、體外或體內(nèi)t細(xì)胞記憶的誘導(dǎo)，但不限于此。用于測量或檢測與半乳糖凝集素-9相關(guān)的一種或多種生物活性的這種變化的方法和方案是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，其中至少一些詳細(xì)提供在下面的實施例中。

應(yīng)當(dāng)理解，根據(jù)上文所述的方法，半乳糖凝集素-9激動劑、拮抗劑和/或抑制劑可以是有用的。

本文公開的本發(fā)明可以在表達(dá)半乳糖凝集素-9或其功能同源物的任何哺乳動物中實施。優(yōu)選地，哺乳動物是人。

參考以下非限制性實施例，以便使本發(fā)明的具體實施方案易于理解并付諸實施。

實施例

pd-l2和半乳糖凝集素-9

科學(xué)共識是spd-l2可能具有有益效果，但這是通過對于pd1的配體競爭：當(dāng)pd-l1結(jié)合pd1時，其關(guān)閉免疫應(yīng)答，而pdl2可通過與pd-l1競爭結(jié)合pd1而具有相反的作用。似乎幾乎沒有pd-l2本身的陽性刺激作用的報道。關(guān)于半乳糖凝集素-9，這被認(rèn)為是tim3的配體，其中tim3是有助于由半乳糖凝集素-9結(jié)合誘導(dǎo)或介導(dǎo)的t細(xì)胞耗竭的免疫調(diào)節(jié)劑。為了避免t細(xì)胞耗竭，許多開發(fā)工作致力于阻斷半乳糖凝集素-9/tim3與抗體的相互作用，從而增強免疫應(yīng)答。這與本發(fā)明略有不同，本發(fā)明試圖激活半乳糖凝集素-9以實現(xiàn)改善的免疫應(yīng)答。然而，最近的論文發(fā)現(xiàn)半乳糖凝集素-9和tim3不相互作用(至少在人類中)，因此共識可能正在改變(leitner等，2013)。gabriel等人在2009年的綜述中，提出了向小鼠、兔子和大鼠施用半乳糖凝集素-9具有與本文所述相反的效果(至少在活化的t細(xì)胞中)，并且預(yù)期在初始t細(xì)胞中也具有相反的作用。此外，gabriel等人推斷，在胸腺微環(huán)境中半乳糖凝集素1、半乳糖凝集素3、半乳糖凝集素8和半乳糖凝集素9誘導(dǎo)雙陰性(cd4^-cd8^-)或雙陽性(cd4⁺cd8⁺)胸腺細(xì)胞凋亡，表明這些半乳糖凝集素可能在調(diào)節(jié)中心耐受中起作用。再次，該觀點與本發(fā)明相反。

瘧疾

幾種疾病如瘧疾、hiv和tb每年導(dǎo)致全球數(shù)百萬人的發(fā)病和死亡。已經(jīng)證明疫苗的開發(fā)是非常具有挑戰(zhàn)性的，因為這些病原體已經(jīng)進化出幾種機制來規(guī)避免疫。程序性細(xì)胞死亡-1(pd-1)途徑參與hiv和瘧原蟲屬(plasmodiumspp)(瘧疾的致病因子)通過其規(guī)避免疫的機制。因此，我們使用瘧疾的小鼠模型來研究該途徑可以如何損害免疫力。

瘧疾每年感染3億至5億人，且殺死數(shù)百萬人。已經(jīng)有瘧疾疫苗的>40個臨床試驗，大多數(shù)基于抗體介導(dǎo)的保護，但只有一個達(dá)到iiib期。甚至終身暴露于瘧疾也可能不會誘導(dǎo)保護性抗體反應(yīng)(egan等人,1995；egan等人,1996)，且感染紅內(nèi)期惡性瘧原蟲(pf)的幼兒發(fā)生預(yù)先存在的抗-瘧疾抗體水平的迅速下降(akpogheneta等人，2008；kinyanjui等人，2007)。使用含有來自220個個體的血漿探測的約23％的惡性瘧原蟲蛋白質(zhì)組的蛋白質(zhì)微陣列的更詳細(xì)研究證實在瘧疾季節(jié)期間抗體對這些蛋白質(zhì)的反應(yīng)性急劇上升，但是是短期的(crompton等人，2010)。測量了來自瘧疾流行地區(qū)兒童的抗原特異性記憶b細(xì)胞(mbc)的以前研究發(fā)現(xiàn)多次暴露于瘧疾并不產(chǎn)生循環(huán)抗原特異性mbc的穩(wěn)定群體(dorfman等人，2005)。此外，縱向研究最近顯示，pf特異性mbc和抗體滴度在急性瘧疾后增加，然后在6個月內(nèi)收縮至略高于感染前水平的點，表明pf特異性mbc和長壽抗體區(qū)室兩者的無效的逐步擴增，這可以解釋為什么兒童免疫力差和需要幾年才能發(fā)育(weiss等人,2010)。與主要基于非洲的這些研究相反，在瘧疾的流行性低得多的泰國，已知過去6年中經(jīng)歷惡性瘧原蟲和/或間日瘧原蟲的臨床攻擊的個體具有抗原特異性抗體和/或抗原特異性mbc的穩(wěn)定頻率(wipasa等人，2010)。

cd4⁺t細(xì)胞由幾種輔助亞型組成，其形成針對特定病原體的免疫應(yīng)答。在瘧疾期間，cd4⁺t細(xì)胞亞群在保護、發(fā)病機理以及免疫應(yīng)答規(guī)避中具有多重作用。已經(jīng)證明cd4⁺t細(xì)胞是小鼠中實驗性瘧疾期間干擾素-γ(ifn-γ)和腫瘤壞死因子α(tnf-α)的主要來源(muxel等人，2011)，其涉及針對這種疾病的保護。在感染夏氏瘧原蟲(p.chabaudi)瘧疾的小鼠中的研究已經(jīng)表明ifn-γ和tnf-α協(xié)同誘導(dǎo)脾中的一氧化氮合酶表達(dá)以控制最高寄生蟲負(fù)荷(jacobs等人，1996)。類似地，在人類中，早期ifn-γ對pf的應(yīng)答與更好的抗寄生蟲免疫力相關(guān)(mccall等人，2010)。ifn-γ有助于形成廣泛的針對瘧疾的保護性反應(yīng)的網(wǎng)絡(luò)(mccall和sauerwein，2010)。特別值得注意的是調(diào)查慢性瘧疾對msp1特異性轉(zhuǎn)基因cd4⁺t細(xì)胞的影響的研究(stephens和langhorne，2010)。將這些寄生蟲特異性t細(xì)胞接種到thy1.1同系小鼠中，然后用10⁵個夏氏瘧原蟲感染的紅細(xì)胞感染。在第30-34天用氯喹處理一半小鼠以清除慢性瘧疾。在60天后，轉(zhuǎn)基因t細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，與已經(jīng)清除感染的藥物處理的小鼠相比，在未處理的小鼠中大約25％的記憶cd44⁺il-7r⁺cd4⁺t細(xì)胞損失(stephens和langhorne，2010)。這項研究強調(diào)，正在進行的感染導(dǎo)致能夠保護免受再感染的一些寄生蟲特異性的記憶t細(xì)胞的損失。

程序性死亡1(pd-1)和瘧疾

pd-1參與瘧疾的病理發(fā)生。為了理解pd-1在針對慢性和致死性瘧疾的免疫以及長期保護免于再感染中的作用，使c57/bl6(wt)小鼠和pd-1基因缺失的c57/bl6小鼠(pd-1ko)群組感染非致死性10⁵夏氏瘧原蟲(慢性瘧疾)或致死性約氏瘧原蟲ym寄生的紅細(xì)胞(prbc)，并且每1-2天檢查血液的寄生蟲血癥。40天后，使所有存活的小鼠休息140天以允許初始免疫細(xì)胞消退，只有記憶細(xì)胞存活。然后在第180天用相應(yīng)的寄生蟲再感染這些小鼠(圖1a和b中的箭頭)。我們發(fā)現(xiàn)感染非致死性夏氏瘧原蟲的所有wt小鼠在約35天內(nèi)清除原發(fā)感染(圖1a)。當(dāng)這些wt小鼠在第180天再感染時，所有小鼠發(fā)展出寄生蟲血癥，盡管比首次感染的水平低得多(圖1a)。相比之下，pd-1ko小鼠在15天內(nèi)清除夏氏瘧原蟲感染，在約第30天時只有20％的小鼠經(jīng)歷低度再發(fā)性感染(圖1b)。在再感染時，9/9個pd-1-ko小鼠沒有顯示寄生蟲血癥(圖1b)，并且當(dāng)血液轉(zhuǎn)移到初始小鼠時具有無蟲免疫(數(shù)據(jù)未顯示)。

當(dāng)用致死性約氏瘧原蟲ym感染wt小鼠時，所有小鼠在感染的7天內(nèi)死亡(圖1a)。相反，10/10個pd-1ko小鼠從致死性約氏瘧原蟲ym感染和180天后的再感染中存活。明顯地，只有40％的再攻擊小鼠經(jīng)歷低水平的寄生蟲血癥(圖1b)。這些研究表明pd-1途徑推進慢性和致死性瘧疾，并阻止針對再感染的最佳的長期保護。

瘧疾期間cd4⁺t細(xì)胞的耗竭

檢查在瘧疾過程中pd-1表達(dá)的最先研究之一使用小鼠模型來顯示表達(dá)il-7r^lo的cd4⁺和cd8⁺t細(xì)胞上的pd-1表達(dá)(chandele等人，2011)。這些pd-1表達(dá)細(xì)胞(特別是cd8⁺t細(xì)胞)在感染后30天內(nèi)幾乎完全喪失(chandele等人，2011)。然而，該研究沒有測量功能性反應(yīng)以確定t細(xì)胞耗竭。類似地，隨后的研究表明，在馬里和肯尼亞pf感染個體的血液中，pd-1也在cd4⁺(butler等人，2012；illingworth等人，2013)和cd8⁺t細(xì)胞(illingworth等人，2013)上表達(dá)，但沒有提供耗竭的功能性證據(jù)。

為了驗證這些觀察結(jié)果，采用紅內(nèi)期瘧疾的鼠模型來研究pd-1和lag-3的表達(dá)增加對cd4⁺t細(xì)胞的影響(butler等，2012)。在小鼠的約氏瘧原蟲和夏氏瘧原蟲瘧疾中，用抗體聯(lián)合阻斷pd-l1和lag-3抑制性分子加速了寄生蟲血癥的清除(butler等，2012)。pd-l1和lag-3的這種雙重阻斷提高了與增強的抗體介導(dǎo)的免疫相關(guān)的cd4⁺濾泡t輔助細(xì)胞(tfh)數(shù)目(butler等，2012)。此外，在感染后第8天和第9天用抗瘧藥物氯喹處理的感染小鼠顯示較低水平的cd4⁺t細(xì)胞功能障礙(butler等，2012)。這些研究表明淋巴細(xì)胞耗竭調(diào)節(jié)針對瘧疾的免疫。

隨后的研究使用pd-1缺失的小鼠(pd-1ko)以最終確定pd-1是否在調(diào)節(jié)免疫中起作用，因為pd-l1可以與b7-1(butte等人，2007)和pd-1(iwai等，2003)兩者特異性地相互作用以抑制t細(xì)胞活化。研究了夏氏瘧原蟲瘧疾，因為這種感染發(fā)展成慢性感染。顯示pd-1介導(dǎo)寄生蟲特異性cd4⁺t細(xì)胞在瘧疾的慢性期(35天)中增殖和分泌ifn-γ和tnf-α的能力的降低，表明這些細(xì)胞的耗竭(horne-debets等人,2013)。然而，與綜合的pd-l1/lag-3阻斷研究相反，未觀察到tfh數(shù)量的變化。這種明顯矛盾的一個可能的解釋是，與wt小鼠相比，pd-1ko小鼠具有顯著更高比例的調(diào)節(jié)性t濾泡細(xì)胞(tfr細(xì)胞)(horne-debets等人，2013)。已知tfr細(xì)胞在體外是抑制性的并且在體內(nèi)限制tfh細(xì)胞和gcb細(xì)胞的數(shù)量(linterman等人，2011)?；蛘?，由于pd-l1也可以與b7-1特異性地相互作用以抑制t細(xì)胞活化(butte等人，2007)，該途徑可以控制pd-1ko小鼠中的tfh數(shù)量。

cd8⁺t細(xì)胞和耗竭

pd-1介導(dǎo)的細(xì)胞耗竭與cd8⁺t細(xì)胞的耗竭最相關(guān)。然而，如前所述，cd8⁺t細(xì)胞在血內(nèi)期瘧疾的清除中的作用沒有被廣泛認(rèn)知，盡管它們在腦型瘧疾的發(fā)病機理和脾臟結(jié)構(gòu)的損害中的作用(beattie等人，2006)是已知的。關(guān)鍵的是，最近顯示pd-1在瘧疾的急性期期間介導(dǎo)寄生蟲特異性cd8⁺t細(xì)胞的數(shù)量和功能能力的95％的損失，這加劇了導(dǎo)致慢性瘧疾的感染(horne-debets等，2013)。該研究檢查了與野生型(wt)相比，pd-1ko小鼠中慢性瘧疾的進展，其中100％的小鼠發(fā)展成慢性感染。有趣的是，<30％的pd-1ko小鼠發(fā)展成慢性感染，并且這些小鼠中的寄生蟲血癥水平比wt小鼠的低>100倍。然而，pd-1ko小鼠中cd8⁺t細(xì)胞的耗竭提高峰值寄生蟲血癥2倍，并且100％的pd-1ko小鼠發(fā)展成慢性瘧疾(horne-debets等人，2013)?？傮w而言，在瘧疾的慢性期期間，pd-1介導(dǎo)的四聚體⁺cd8⁺cd62l^-t細(xì)胞數(shù)量減少80％，cd8⁺細(xì)胞響應(yīng)于寄生蟲增殖的能力降低95％(horne-debets等人,13)。特別值得注意的是，即使pd-1ko小鼠具有比wt小鼠更多的功能性cd4⁺t細(xì)胞和類似的寄生蟲特異性抗體滴度，但如果cd8⁺t細(xì)胞耗竭，它們?nèi)匀话l(fā)展成慢性瘧疾。

最后，pd-1ko小鼠具有比wt小鼠更多的表達(dá)顆粒酶b的cd8⁺t細(xì)胞，表明涉及感染細(xì)胞的細(xì)胞毒性殺傷。這些觀察突出了cd8⁺t細(xì)胞在針對慢性瘧疾的保護中的關(guān)鍵作用。相比之下，以前的研究發(fā)現(xiàn)阻斷pd-l1增強由病原性cd8⁺t細(xì)胞介導(dǎo)的實驗性腦型瘧疾(hafalla等人，2012)，表明該途徑保護免受腦型瘧疾?？夏醽喌难芯客怀隽诉@些發(fā)現(xiàn)的臨床意義，其發(fā)現(xiàn)來自感染瘧疾的個體的人cd8⁺t細(xì)胞表達(dá)pd-1(illingworth等人，2013)。因此，cd8⁺t細(xì)胞的作用需要特別考慮，因為它可以解釋為什么盡管多年暴露于強烈的pf傳播，仍沒有獲得性的無菌免疫的證據(jù)(tran等人，2013)?？赡艿氖强贵w和cd4⁺t細(xì)胞提供針對癥狀性瘧疾(symptomaticmalaria)的保護，但是cd8⁺t細(xì)胞是無菌免疫所需的。因此，在pd-1介導(dǎo)的cd8⁺t細(xì)胞耗竭的情況下，從未獲得無菌免疫，如最近報道的(tran等，2013)。

dc和瘧疾

已經(jīng)確定，在瘧疾期間cd4⁺t細(xì)胞清除主要的峰值寄生蟲血癥，b細(xì)胞清除殘余的寄生蟲。由于t細(xì)胞活化需要dc，我們比較了5種小鼠寄生蟲株中的dc功能，并發(fā)現(xiàn)了致死性和非致死性株與寄生蟲物種之間的表型和dc功能的二分性(wykes等人，2007a；wykes等人，2007b)，且如綜述的(wykes和good，2008)。這些研究還發(fā)現(xiàn)，來自非致死性約氏瘧原蟲17xnl和夏氏瘧原蟲感染的dc是完全功能性的，且特別地分泌大量的il-12(wykes等人，2007a；wykes等人，2007b)。相比之下，來自感染了寄生蟲的三種致死性株(約氏瘧原蟲ym、文氏瘧原蟲和伯氏瘧原蟲)的小鼠的dc缺乏功能性，因為它們不能引發(fā)t細(xì)胞或分泌il-12(wykes等人，2007a；wykes等人，2007b)。當(dāng)來自非致死性約氏瘧原蟲17xnl感染的小鼠的dc轉(zhuǎn)移到初始小鼠時，受體小鼠在致死性感染攻擊下存活，并且該作用由il-12介導(dǎo)(wykes等人，2007a)。此外，其他組還顯示在瘧疾期間dc功能受損(good等人,2005；ocana-morgner等人,2003；urban等人,1999；urban等人,2001)。

已知pd-l2主要由dc表達(dá)，而pd-l1在包括dc的一系列細(xì)胞上表達(dá)。因此，然后檢查來自初始小鼠和感染小鼠的dc的pd-l2表達(dá)。測量來自初始小鼠和非致死性約氏瘧原蟲17xnl或致死性約氏瘧原蟲ym感染的小鼠的dc中的pd-l2mrna水平(圖2)。來自致死性感染的dc顯示pd-l2mrna增加約50％，而來自非致死性感染的dc具有在蛋白質(zhì)表達(dá)中近300％提高的反應(yīng)。這項研究表明較高的pd-l2表達(dá)與較好的瘧疾存率活相關(guān)。

瘧疾中pd-l2的保護作用

為了解決由dc表達(dá)的pd-l2是否是保護性的，wt小鼠用非致死性瘧疾感染，并用pd-l2特異性阻斷抗體處理以抑制該分子的功能。對于該實驗，幾個wt小鼠群組用約氏瘧原蟲17xnl和夏氏瘧原蟲感染，并在感染后1天和每3-4天用抗pd-l2或?qū)φ沾笫骾gg(對照ig)處理直到感染后第14-18天。

接受對照ig的所有wt小鼠(圖3a和b)在30-37天內(nèi)清除明顯的感染。然而，給予約氏瘧原蟲17xnl和pd-l2阻斷抗體的所有小鼠由于嚴(yán)重的癥狀在25天內(nèi)死亡或被安樂死(圖3a)。相反，盡管所有具有慢性夏氏瘧原蟲瘧疾的小鼠在pd-l2阻斷中幸存，但是它們具有比對照小鼠高16％的初級峰寄生蟲血癥(注意對數(shù)標(biāo)度；*表示p＝0.0048)，在感染的慢性期中的更高的寄生蟲血癥水平，并需要4天的更多時間清除感染(圖3b)。

為了確定約氏瘧原蟲ym或伯氏瘧原蟲感染是否因為dc上缺乏或低pd-l2表達(dá)而是致死的，使這些小鼠補充spd-l2(圖4和5)。為此，用約氏瘧原蟲ym或伯氏瘧原蟲感染幾個wt小鼠群組，并且在感染后第3、5和7天給予可溶性重組pd-l2-人-fc合成蛋白。雖然感染約氏瘧原蟲ym和給予對照人igg(對照ig)的所有wt小鼠在11天內(nèi)死亡，但給予多聚體spd-l2的92％的小鼠存活并在25天內(nèi)清除感染，具有顯著較低的峰值寄生蟲血癥(圖4a和b；p<0.001)。然后使所有存活的小鼠休息150天，并用相同劑量的致死性約氏瘧原蟲ym瘧疾(沒有另外的pd-l2；圖4a)再次攻擊。所有小鼠以最小寄生蟲血癥(<1％)存活，而所有新的對照小鼠(對照ig-r)死于感染。有趣的是，二聚體pd-l2具有負(fù)面作用，而更高多聚體(例如八聚體spd-l2)具有強的有益效果。

對具有伯氏瘧原蟲瘧疾的小鼠的分析發(fā)現(xiàn)，所有對照小鼠在8天內(nèi)(圖5a)發(fā)展成腦型瘧疾癥狀(包括褶皺毛皮、痙攣、昏迷)，并在第10天死于感染(圖5b)。相比之下，所有用spd-l2處理的伯氏瘧原蟲感染的小鼠從未發(fā)生腦癥狀，控制感染約15天，但是在第25天全部死于不受控的寄生蟲血癥。未測試其他劑量。

這些研究證實pd-l2表達(dá)是免疫和從瘧疾存活所需的。在表達(dá)該蛋白的小鼠中阻斷pd-l2介導(dǎo)致死性或加重感染。相反，如果小鼠在其dc不表達(dá)pd-l2時補充spd-l2，則它們從致死性感染中存活或保持沒有腦癥狀。

pd-l2通過cd4t細(xì)胞介導(dǎo)保護

為了確定spd-l2是否通過t細(xì)胞提高免疫力，約氏瘧原蟲ym感染的小鼠在沒有或存在cd4⁺或cd8⁺t細(xì)胞的情況下給予spd-l2。對于該實驗，在約氏瘧原蟲ym感染前1天給予wt小鼠cd4⁺或cd8⁺t細(xì)胞耗竭性抗體或用大鼠ig(大鼠ig)處理，并且每3-4天處理直到感染后第14-18天。然后在感染后第3、5和7天給予小鼠spd-l2或?qū)φ杖薸g。

接受對照ig(圖6a)的所有wt小鼠死亡或在第14天必須被安樂死。相比之下，給予spd-l2的約60％的約氏瘧原蟲ym感染的小鼠存活并在30天內(nèi)清除感染。然而，如果感染的wt小鼠給予spd-l2但耗盡cd4⁺t細(xì)胞，所有小鼠死亡或必須被安樂死(圖6a和b)，因為他們發(fā)展成嚴(yán)重的臨床癥狀。相比之下，cd8⁺t細(xì)胞的耗竭不影響通過spd-l2處理從致死性瘧疾存活，但小鼠確實經(jīng)歷更高的寄生蟲血癥(圖6c)。總之，這些觀察結(jié)果證明了spd-l2通過cd4⁺t細(xì)胞介導(dǎo)保護和存活，對cd8⁺t細(xì)胞功能具有一些影響。這些研究在非常年輕的小鼠中進行(由于成熟小鼠的可獲得性不足)，其中spd-l2處理后的中值存活率低于成年小鼠。

通過spd-l2的保護不是通過阻斷pd-l1功能來介導(dǎo)的

鑒于dc上pd-l2的表達(dá)或spd-l2處理可介導(dǎo)保護性免疫，我們假設(shè)pd-l2可通過阻斷pd-l1介導(dǎo)的免疫抑制來介導(dǎo)保護。為了測試該假設(shè)，用約氏瘧原蟲ym感染兩個pd-l1敲除小鼠(pd-l1ko；n＝4)群組，并用三個劑量的pd-l2或?qū)φ読gg處理。所有對照小鼠到第7天死于嚴(yán)重的臨床癥狀和高寄生蟲血癥水平(～78％)(圖7)。相比之下，用pd-l2處理的感染pd-l1ko小鼠控制寄生蟲血癥(24％)但是到第10天死亡。這項研究表明由pd-l2介導(dǎo)的保護獨立于pd-l1。

cd4⁺t細(xì)胞上的半乳糖凝集素-9是pd-l2的新受體

鑒于pd-l2針對瘧疾是保護性的，而獨立于pd-l1，我們假設(shè)它在初始t細(xì)胞上有第二受體。為了測試這個假設(shè)，我們制備了從初始c57bl/6小鼠分離的t細(xì)胞的裂解物，并使用固定的pd-l2或人igg免疫沉淀該受體(圖8)。在3個獨立實驗中對5個可重復(fù)條帶重復(fù)進行免疫沉淀，包括免疫球蛋白重鏈和輕鏈(條帶1和4)、spd-l2(條帶5)和肌動蛋白(條帶3)。半乳糖凝集素-9(條帶2)通過pd-l2免疫沉淀，但在3個獨立實驗中沒有通過人igg免疫沉淀的等同條帶。對照中指定為n2°和n2的條帶是組蛋白。最后，為了證實通過spd-l2免疫沉淀的條帶2是半乳糖凝集素-9，實驗進行重復(fù)，但是將凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素上并用抗半乳糖凝集素-9抗體標(biāo)記western印跡(圖9)。這些研究證實通過從t細(xì)胞免疫沉淀的條帶2的測序發(fā)現(xiàn)的39kd條帶是半乳糖凝集素-9，且潛在地是pd-l2的新結(jié)合伴體。

初始t細(xì)胞上的半乳糖凝集素-9是pd-l2的受體

為了確定spd-l2是否結(jié)合完整t細(xì)胞上的半乳糖凝集素-9，從初始小鼠的脾臟分離總t細(xì)胞群體，并用生物素化的spd-l2和apc-鏈霉親和素或pe-抗半乳糖凝集素-9孵育(圖10)。流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，盡管spd-l2結(jié)合約12.8％的初始cd4⁺t細(xì)胞，但半乳糖凝集素-9僅在約1.9％的這些細(xì)胞上表達(dá)。用過量的未標(biāo)記的抗半乳糖凝集素-9抗體預(yù)處理初始t細(xì)胞減少了spd-l2標(biāo)記約3％，證實spd-l2結(jié)合t細(xì)胞上的半乳糖凝集素-9。先前發(fā)表的研究顯示，從初始小鼠的脾臟獲取的cd4⁺t細(xì)胞的約10-20％表達(dá)可結(jié)合pd-l2的pd-1。最后，在該測定中，spd-l2不結(jié)合大數(shù)量的cd8⁺t細(xì)胞。

spd-l2和抗半乳糖凝集素-9介導(dǎo)初始cd4⁺和cd8⁺t細(xì)胞的存活和分化

在涂覆有抗cd3(5μg/ml)的96孔板中培養(yǎng)分離自初始小鼠的t細(xì)胞以提供抗原信號以及il-2。培養(yǎng)物還補充(a)作為對照的板結(jié)合的大鼠igg，(b)板結(jié)合的spd-l2，(c)板結(jié)合的spd-l2和用抗半乳糖凝集素-9(克隆108a)抗體形式的半乳糖凝集素-9抑制劑處理的細(xì)胞，(d)半乳糖凝集素-9激動劑抗體(克隆rg9.1)，和(e)抗半乳糖凝集素-9(克隆rg9.35)。spd-l2增加表達(dá)tbet的cd4+cd62l^lo細(xì)胞的百分比(圖11a)和(b)與大鼠igg對照(圖11b)相比細(xì)胞內(nèi)tbet的水平(圖11b)。該作用被抗半乳糖凝集素-9(克隆108a)抗體阻斷?？寺g9.1還增加表達(dá)tbet的cd4+cd62l^lo細(xì)胞的百分比和細(xì)胞內(nèi)tbet的水平(圖11a和b)。

用板結(jié)合的pd-l2和rg.1(rg9.1)處理的細(xì)胞的生存力在36小時后高于其他培養(yǎng)物，因此這些培養(yǎng)實驗的一些用具有低得多的cd3水平刺激(1μg/ml)對72小時培養(yǎng)物重復(fù)。如圖12所示，與對照培養(yǎng)物相比，spd-l2和rg1(rg9.1)抗體均提高cd4⁺和cd8⁺t細(xì)胞的生存力。

可溶性pd-l2和抗半乳糖凝集素-9抗體保護免受致死性瘧疾

為了確定信號傳導(dǎo)半乳糖凝集素-9是否具有與可溶性pd-l2相同的作用，用約氏瘧原蟲ym感染三個wt小鼠群組，并且在感染后第3、5和7天靜脈內(nèi)給予200μgspd-l2、抗半乳糖凝集素-9或大鼠igg。每天監(jiān)測小鼠，并對疾病的臨床癥狀進行評分，包括褶皺毛皮、駝背或缺乏活力。給予spd-l2或激動性抗半乳糖凝集素-9(克隆rg9.1)的小鼠顯示最少癥狀，并且當(dāng)所有對照小鼠死亡或被安樂死時，這些組中的2/3小鼠存活(圖12)。

半乳糖凝集素-9是spd-l2的結(jié)合伴體

進行octetred研究以確定小鼠半乳糖凝集素-9和小鼠pd-l2之間的結(jié)合的生物化學(xué)性質(zhì)。spd-l2與探針結(jié)合，并測量其與spd-1和sgalectin-9的相互作用。如圖13所示，結(jié)果顯示pd-l2和pd-1之間幾乎瞬時的結(jié)合和解離。相反，半乳糖凝集素-9結(jié)合需要約200秒與pd-l2結(jié)合和>614秒解離，表明非常穩(wěn)定的相互作用。最顯著地，盡管pd-l2-pd-1相互作用的分子比率為1:1，但半乳糖凝集素-9和pd-l2相互作用涉及在結(jié)合期間半乳糖凝集素-9的聚集或多聚化。這有助于解釋為什么spd-l2的多聚體形式對瘧疾具有保護作用，而單體或二聚體形式可能不保護。我們的通過單體和多聚體spd-l2的保護的比較研究發(fā)現(xiàn)，與其中77-92％的小鼠受到保護(圖4)的多聚體spd-l2相比，單體spd-l2不能保護小鼠免于致死性約氏瘧原蟲ym瘧疾(n＝4)或預(yù)防腦型瘧疾(n＝3)。此外，單體spd-l2加劇腦型瘧疾，表明其阻斷spd-l2與半乳糖凝集素-9的相互作用。因此，所施用的spd-l2的形式可以用于控制免疫應(yīng)答的性質(zhì)(例如，可以施用多聚體形式以提供對瘧疾或癌癥的保護，且可以施用單體形式以下調(diào)免疫系統(tǒng)以治療炎癥或自身免疫性疾病，例如哮喘或克羅恩氏病)。在這點上，在體內(nèi)促進pd-l2多聚化的試劑也可用于本發(fā)明，例如使用適體和雙特異性抗體。適體是小的寡核苷酸，其可以特異性結(jié)合寬范圍的靶分子，并且作為治療劑提供一些優(yōu)于抗體的優(yōu)點。這些可以模擬多聚體pd-l2。

抗半乳糖凝集素-9抗體激活培養(yǎng)物中的小鼠cd4⁺t細(xì)胞以分泌th1細(xì)胞因子

由dc表達(dá)的半乳糖凝集素-9也是t細(xì)胞上的tim-3的配體(zhu等人，2005)?？扇苄园肴樘悄?9誘導(dǎo)的th1細(xì)胞的死亡在體外依賴于tim-3，并且體內(nèi)施用半乳糖凝集素-9蛋白導(dǎo)致產(chǎn)生干擾素γ的t細(xì)胞的選擇性損失(zhu等人，2005)。t細(xì)胞表達(dá)的半乳糖凝集素-9的作用不太清楚。我們最初測試了3種抗半乳糖凝集素-9抗體，并發(fā)現(xiàn)2/3被激活(數(shù)據(jù)未顯示)。我們分析了在體外具有最強刺激活性的共刺激性抗半乳糖凝集素-9抗體對純化的t細(xì)胞的影響。我們評估了對照igg、可溶性小鼠pd-l2-ig或抗小鼠半乳糖凝集素-9mab對從小鼠脾臟分離并在用抗cd3抗體涂覆的塑料板上培養(yǎng)的cd4⁺t細(xì)胞的影響。培養(yǎng)3天后，測試上清液的細(xì)胞因子。與采用igg的對照培養(yǎng)物相比，固定的pd-l2和抗半乳糖凝集素-9能夠顯著增加il-2(～4倍)、ifn-γ(～4倍)和tnf-α(60％)分泌。這些研究證實pd-l2和抗半乳糖凝集素-9為小鼠t細(xì)胞提供了共刺激信號，以改善th1反應(yīng)，如先前針對小鼠pd-l2報道的(shin等人，2003)。

對人cd4⁺t細(xì)胞進行的類似測定也顯示spd-l2可增加th1細(xì)胞因子的分泌(圖15a)。

由于我們沒有找到刺激人cd4⁺t細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生的抗人半乳糖凝集素-9抗體，我們測試了抗小鼠半乳糖凝集素-9抗體(圖15b)。這種抗小鼠半乳糖凝集素-9抗體誘導(dǎo)干擾素-γ(但不是其他細(xì)胞因子)分泌至通過人spd-l2誘導(dǎo)的水平。

抗半乳糖凝集素-9保護免受瘧疾

為了證實抗半乳糖凝集素-9抗體能夠提供通過用可溶性pd-l2處理所見的相同的保護(圖4)，用致死性約氏瘧原蟲ym感染wt小鼠并用對照大鼠ig、阻斷抗tim-3或抗小鼠半乳糖凝集素-9處理(圖16a和b)。在重復(fù)實驗中，3個劑量的抗半乳糖凝集素-9抗體介導(dǎo)75％的小鼠的存活，相比之下，通過抗體介導(dǎo)的tim-3阻斷沒有提供保護作用，tim-3是半乳糖凝集素-9的另一受體。與對照大鼠ig處理的小鼠相比，tim-3阻斷沒有提供顯著的保護。

抗半乳糖凝集素-9降低腫瘤進展

鑒于th1cd4⁺t細(xì)胞免疫對于清除腫瘤也很重要，激活抗半乳糖凝集素-9抗體然后在兩個同基因小鼠乳腺癌模型中測試。四個劑量的抗半乳糖凝集素-9抗體可以阻滯原位地注射到每個受試小鼠的第四左乳腺脂肪墊中的可觸知的pymt源的乳腺癌的生長(圖17a)。與同種型對照組相比，在第16-22天給予的抗半乳糖凝集素-9處理在第27和35天之間減緩腫瘤進展。先前的研究已經(jīng)調(diào)查了treg細(xì)胞消融與ctla-4或pd-1/pd-l1阻斷組合是否影響相同的原位植入的pymt源的乳腺癌(bos等人，2013)。據(jù)發(fā)現(xiàn)雖然treg細(xì)胞消融顯著延遲原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性腫瘤進展，但檢查點阻斷并不影響致癌基因驅(qū)動的腫瘤生長。然后我們測試三個劑量的抗半乳糖凝集素-9(第8-10天給予)是否可以阻滯侵襲性轉(zhuǎn)移eo771.lmb乳腺腺癌的生長(johnstone等，2015)。雖然所有對照小鼠到第15天被安樂死，但與第15天對照相比，處理的小鼠在第15-16天具有小35％的腫瘤(圖17b)?？傮w而言，激活抗半乳糖凝集素-9處理降低原位植入乳腺癌的進展。

阻斷pd-l2可抑制tbet+th1應(yīng)答

為了證實pd-l2在體內(nèi)確實控制tbet和th1免疫，我們用約氏瘧原蟲17xnl瘧疾感染小鼠，并且當(dāng)血液中可檢測到寄生蟲時用單克隆抗體阻斷pd-l2。對于該實驗，用約氏瘧原蟲17xnl感染wt小鼠，并且在感染后(p.i.)后4天給予抗pd-l2或?qū)φ沾笫骾gg，并且每3-4天給予直到感染后第14-18天。首先，檢查cd4⁺t細(xì)胞的tbet表達(dá)，thet是th1cd4⁺t細(xì)胞的效應(yīng)子功能所必需的轉(zhuǎn)錄因子，已知th1cd4⁺t細(xì)胞介導(dǎo)對瘧疾的保護(ing和stevenson，2009；stephens和langhorne，2010)。還對t細(xì)胞評估cd62l的表達(dá)(cd62l是在初始t細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)的標(biāo)志物)，并且其還區(qū)分中樞記憶(cd62l^hi)和效應(yīng)記憶(cd62l^lo)t細(xì)胞。在感染7天后，存在具有pd-l2阻斷的脾的tbet表達(dá)cd4⁺t細(xì)胞數(shù)目降低的趨勢(圖18a)。然而，到第14天，對照小鼠與pd-l2阻斷的小鼠相比，具有每脾臟分別高2.2倍的表達(dá)tbet的cd62l^hi和高3倍的cd62l^locd4⁺t細(xì)胞(圖18b)。類似地，對照小鼠比pd-l2阻斷的小鼠具有高>5倍的分泌ifn-γ的寄生蟲特異性cd4⁺t細(xì)胞數(shù)目(如在第14天通過elispot測定測量的)(圖18c)。在pd-l2阻斷的小鼠中，可由幾種細(xì)胞類型分泌的血清ifn-γ水平在第7天降低，并且到第14天在兩組小鼠中都低(圖18d)。相比之下，具有pd-l2阻斷的小鼠到第14天時比對照小鼠具有高>2倍的血清il-10(圖18e)。該結(jié)果與每脾臟中2.6倍高的調(diào)節(jié)性t細(xì)胞(treg)數(shù)目相關(guān)(圖18f)。與感染的wt小鼠相比，用約氏瘧原蟲17xnl感染的pd-l2ko小鼠的研究還發(fā)現(xiàn)在第14天每脾臟中表達(dá)tbet和分泌ifn-γ的寄生蟲特異性cd4⁺t細(xì)胞數(shù)目顯著降低(圖19c，d)。最后，對于pd-l2ko小鼠或利用抗體的pd-l2阻斷，到感染的第14天存在分泌ifn-γ的寄生蟲特異性cd8⁺t細(xì)胞數(shù)目減少的趨勢(圖19e，f)。

總之，我們的數(shù)據(jù)顯示pd-l2表達(dá)對約氏瘧原蟲17xnl瘧疾感染期間的有效th1cd4⁺t細(xì)胞應(yīng)答是必需的。重要的是，pd-l2是表達(dá)tbet的cd4⁺t細(xì)胞的最佳擴增所需的，因為pd-l2的阻斷阻止了約氏瘧原蟲17xnl感染的第7天和第14天之間這些細(xì)胞數(shù)目的增加。值得注意的是，功能性、寄生蟲特異性分泌ifn-γ的cd4⁺t細(xì)胞在第7天存在，但在不存在pd-l2信號時到第14天減少，表明這種信號改善這些關(guān)鍵效應(yīng)子細(xì)胞的擴增和存活。鑒于這些發(fā)現(xiàn)，夏氏瘧原蟲感染的小鼠最可能在pd-l2阻斷中存活，因為大量的寄生蟲在10天內(nèi)清除，但約氏瘧原蟲17xnl實驗表明pd-l2僅在第一周后改善長期免疫。因此，僅在感染的第一周后需要pd-l2維持th1cd4⁺t細(xì)胞數(shù)目。

t盒轉(zhuǎn)錄因子t-bet已經(jīng)作為1型樣免疫的關(guān)鍵調(diào)節(jié)子出現(xiàn)，在t和b淋巴細(xì)胞以及樹突細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞中建立和/或維持效應(yīng)子細(xì)胞命運中起關(guān)鍵作用。t-bet可能在th1效應(yīng)子功能的維持中起關(guān)鍵作用。t-bet-缺陷小鼠顯示受損的th1分化，包括主要在cd4和γδt細(xì)胞中的缺陷ifn-γ產(chǎn)生。

th1反應(yīng)長期以來與自身免疫性綜合征關(guān)聯(lián)。通常被認(rèn)為是th1相關(guān)綜合征的乳糜瀉和克羅恩氏病顯示出增強的t-bet活性和/或表達(dá)。在th1相關(guān)的ibd小鼠模型中，cd4+cd62l+細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)移到嚴(yán)重的聯(lián)合免疫缺陷(scid)受體中顯示t-bet缺陷保護免于疾病的影響，而t-bet過表達(dá)促進疾病。這在多發(fā)性硬化(rack等人，2014)、炎癥性關(guān)節(jié)炎(wang等人，2006)、糖尿病(juedes等人，2004)、綜合征(li等人，2006t)和vogtkoyanagi-harada病(vkh)(li等人，2005)中同樣如此。由于阻斷pd-l2/半乳糖凝集素-9途徑會阻斷tbet，因此其具有提供治療自身免疫性疾病的新方法的潛力。

spd-l2介導(dǎo)的從致死性瘧疾的存活需要cd4⁺t細(xì)胞

為了確定t細(xì)胞對多聚體spd-l2介導(dǎo)的約氏瘧原蟲ym瘧疾存活的貢獻(xiàn)，在spd-l2處理的感染小鼠中使cd4⁺或cd8⁺t細(xì)胞耗竭。對于該實驗，用約氏瘧原蟲ym感染多組wt小鼠，并用spd-l2或人igg(hig)處理。這些小鼠在第1天和每3-4天也給予cd4⁺或cd8⁺t細(xì)胞消耗抗體或大鼠ig，直到感染后第14-18天。以前的研究證實所用的抗體會耗竭這些細(xì)胞。所有接受hig和大鼠ig的感染wt小鼠到第14天死亡或需要安樂死(圖20a和b)。相比之下，當(dāng)停止監(jiān)測時，給予spd-l2和對照大鼠ig的75％的約氏瘧原蟲ym感染小鼠在30天內(nèi)清除寄生蟲血癥并存活>50天(圖6a和b)。然而，如果cd4⁺t細(xì)胞耗竭則小鼠不受spd-l2保護，并且由于臨床癥狀的嚴(yán)重性必須被安樂死(圖20a，c)。相反，cd8⁺t細(xì)胞的耗竭不顯著影響由spd-l2提供的保護作用，盡管這些小鼠總是在大致第11-21天時具有比對照小鼠更高的寄生蟲血癥(圖20a，d)?？傊?，這些發(fā)現(xiàn)證明spd-l2可以通過cd4⁺t細(xì)胞與cd8⁺t細(xì)胞的可能較小的貢獻(xiàn)促進約氏瘧原蟲ym感染的保護、存活和寄生蟲控制。

spd-l2通過改善的cd4⁺和cd8⁺t細(xì)胞功能介導(dǎo)保護和存活

為了確定spd-l2發(fā)揮其治療效果的機制，在第3天和第5天用對照ig或spd-l2處理約氏瘧原蟲ym感染的小鼠，并在對照小鼠中嚴(yán)重臨床癥狀發(fā)作前第7天收集脾臟。從脾臟中分離t細(xì)胞，并用來自初始小鼠的脾dc和寄生蟲特異性抗原(msp119)或肽(pb1，sqllnakyl)或沒有另外的抗原進行培養(yǎng)。用spd-l2處理增加了可以在培養(yǎng)物中響應(yīng)msp119的寄生蟲特異性cd4⁺t細(xì)胞的數(shù)目，與用對照ig處理的小鼠相比，分泌ifn-γ的cd4⁺t細(xì)胞數(shù)量高約2.7倍，如通過elispot測定測量的(圖21a)。類似地，體外edu攝取測定證實spd-l2處理的小鼠具有響應(yīng)于寄生蟲抗原而增殖的更高數(shù)量的寄生蟲特異性t細(xì)胞(圖21b)。然而，群組之間的treg數(shù)目沒有差異(圖21c)。此外，spd-l2處理的小鼠還展現(xiàn)出高于對照組6倍的寄生物特異性cd8⁺t細(xì)胞(即，結(jié)合顯示寄生蟲特異性肽f4的mhc四聚體(d^b)數(shù)量(lau等人，2011))(圖21d)。然而，在7天內(nèi)這些細(xì)胞的ifn-γ分泌(圖21e)或顆粒酶b表達(dá)(圖21f)沒有顯著增加?？傊@些結(jié)果表明spd-l2通過促進分泌ifn-γ的cd4⁺t細(xì)胞的發(fā)育來保護小鼠免于致死性瘧疾，這表明已知對于防止瘧疾至關(guān)重要的th1效應(yīng)子功能得到改善(kumar和miller,1990；stephens和langhorne,2010；su和stevenson,2002)。類似地，增加的cd8⁺t細(xì)胞解釋了在約第11天至第21天用spd-l2處理的小鼠中觀察到保護的適度改善(圖18d)。

本說明書通篇旨在描述本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，而不是將本發(fā)明限于任何一個實施方案或特征的特定集合。在不脫離本發(fā)明的寬泛精神和范圍的情況下，可對在此描述和示出的實施方案進行各種改變和修改。

本文提及的所有計算機程序、算法、專利和科學(xué)文獻(xiàn)通過整體引用并入本文。

參考文獻(xiàn)

agata,y.,a.kawasaki,h.nishimura,y.ishida,t.tsubata,h.yagita和t.honjo.1996.expressionofthepd-1antigenonthesurfaceofstimulatedmousetandblymphocytes.intimmunol8:765-772.

akpogheneta,o.j.,n.o.duah,k.k.tetteh,s.dunyo,d.e.lanar,m.pinder和d.j.conway.2008.durationofnaturallyacquiredantibodyresponsestoblood-stageplasmodiumfalciparumisagedependentandantigenspecific.infectimmun76:1748-1755.

beattie,l.,c.r.engwerda,m.wykes和m.f.good.2006.cd8+tlymphocyte-mediatedlossofmarginalmetallophilicmacrophagesfollowinginfectionwithplasmodiumchabaudichabaudias.jimmunol177:2518-2526.

bos,p.d.,plitas,g.,rudra,d.,lee,s.y.和rudensky,a.y.(2013).transientregulatorytcellablationdetersoncogene-drivenbreastcancerandenhancesradiotherapy.jexpmed210,2435-2466.

butler,n.s.,j.moebius,l.l.pewe,b.traore,o.k.doumbo,l.t.tygrett,t.j.waldschmidt,p.d.crompton和j.t.harty.2012.therapeuticblockadeofpd-l1andlag-3rapidlyclearsestablishedblood-stageplasmodiuminfection.natimmunol13:188-195.

butte,m.j.,m.e.keir,t.b.phamduy,a.h.sharpe和g.j.freeman.2007.programmeddeath-1ligand1interactsspecificallywiththeb7-1costimulatorymoleculetoinhibittcellresponses.immunity27:111-122.

chandele,a.,p.mukerjee,g.das,r.ahmed和v.s.chauhan.2011.phenotypicandfunctionalprofilingofmalaria-inducedcd8andcd4tcellsduringblood-stageinfectionwithplasmodiumyoelii.immunology132:273-286.

chemnitz,j.m.,r.v.parry,k.e.nichols,c.h.june和j.l.riley.2004.shp-1andshp-2associatewithimmunoreceptortyrosine-basedswitchmotifofprogrammeddeath1uponprimaryhumantcellstimulation,butonlyreceptorligationpreventstcellactivation.jimmunol173:945-954.

crompton,p.d.,m.a.kayala,b.traore,k.kayentao,a.ongoiba,g.e.weiss,d.m.molina,c.r.burk,m.waisberg,a.jasinskas,x.tan,s.doumbo,d.doumtabe,y.kone,d.l.narum,x.liang,o.k.doumbo,l.h.miller,d.l.doolan,p.baldi,p.l.felgner和s.k.pierce.2010.aprospectiveanalysisoftheabresponsetoplasmodiumfalciparumbeforeandafteramalariaseasonbyproteinmicroarray.procnatlacadsciusa107:6958-6963.

dong,h.,g.zhu,k.tamada和l.chen.1999.b7-h1,athirdmemberoftheb7family,co-stimulatest-cellproliferationandinterleukin-10secretion.natmed5:1365-1369.

dorfman,j.r.,p.bejon,f.m.ndungu,j.langhorne,m.m.kortok,b.s.lowe,t.w.mwangi,t.n.williams和k.marsh.2005.bcellmemoryto3plasmodiumfalciparumblood-stageantigensinamalaria-endemicarea.jinfectdis191:1623-1630.

egan,a.f.,j.a.chappel,p.a.burghaus,j.s.morris,j.s.mcbride,a.a.holder,d.c.kaslow和e.m.riley.1995.serumantibodiesfrommalaria-exposedpeoplerecognizeconservedepitopesformedbythetwoepidermalgrowthfactormotifsofmsp1(19),thecarboxy-terminalfragmentofthemajormerozoitesurfaceproteinofplasmodiumfalciparum.infectimmun63:456-466.

egan,a.f.,j.morris,g.barnish,s.allen,b.m.greenwood,d.c.kaslow,a.a.holder,e.m.riley,j.a.chappel,p.a.burghaus,j.s.morris和j.s.mcbride.1996.clinicalimmunitytoplasmodiumfalciparummalariaisassociatedwithserumantibodiestothe19-kdac-terminalfragmentofthemerozoitesurfaceantigen,pfmsp-1.jinfectdis173:765-769.

freeman,g.j.,a.j.long,y.iwai,k.bourque,t.chernova,h.nishimura,l.j.fitz,n.malenkovich,t.okazaki,m.c.byrne,h.f.horton,l.fouser,l.carter,v.ling,m.r.bowman,b.m.carreno,m.collins,c.r.wood和t.honjo.2000.engagementofthepd-1immunoinhibitoryreceptorbyanovelb7familymemberleadstonegativeregulationoflymphocyteactivation.jexpmed192:1027-1034.

good,m.f.,h.xu,m.wykes和c.r.engwerda.2005.developmentandregulationofcell-mediatedimmuneresponsestothebloodstagesofmalaria:implicationsforvaccineresearch.annurevimmunol23:69-99.

hafalla,j.c.,c.claser,k.n.couper,g.e.grau,l.renia,j.b.desouza和e.m.riley.2012.thectla-4andpd-1/pd-l1inhibitorypathwaysindependentlyregulatehostresistancetoplasmodium-inducedacuteimmunepathology.plospathog8:e1002504.

horne-debets,j.m.,r.faleiro,d.s.karunarathne,x.q.liu,k.e.lineburg,c.m.poh,g.m.grotenbreg,g.r.hill,k.p.macdonald,m.f.good,l.renia,r.ahmed,a.h.sharpe和m.n.wykes.2013.pd-1dependentexhaustionofcd8(+)tcellsdriveschronicmalaria.cellreports5:1204-1213.

illingworth,j.,n.s.butler,s.roetynck,j.mwacharo,s.k.pierce,p.bejon,p.d.crompton,k.marsh和f.m.ndungu.2013.chronicexposuretoplasmodiumfalciparumisassociatedwithphenotypicevidenceofbandtcellexhaustion.jimmunol190:1038-1047.

ing,r.和stevenson,m.m.(2009).dendriticcellandnkcellreciprocalcrosstalkpromotesgammainterferon-dependentimmunitytoblood-stageplasmodiumchabaudiasinfectioninmice.infectimmun77,770-782.

iwai,y.,s.terawaki,m.ikegawa,t.okazaki和t.honjo.2003.pd-1inhibitsantiviralimmunityattheeffectorphaseintheliver.jexpmed198:39-50.

jacobs,p.,d.radzioch和m.m.stevenson.1996.ath1-associatedincreaseintumornecrosisfactoralphaexpressioninthespleencorrelateswithresistancetoblood-stagemalariainmice.infectimmun64:535-541.

johnstone,c.n.,smith,y.e.,cao,y.,burrows,a.d.,cross,r.s.,ling,x.,redvers,r.p.,doherty,j.p.,eckhardt,b.l.,natoli,a.l.等人.(2015).functionalandmolecularcharacterisationofeo771.lmbtumours,anewc57bl/6-mouse-derivedmodelofspontaneouslymetastaticmammarycancer.diseasemodels&mechanisms8,237-251.

juedes等人,2004,t-betcontrolsautoaggressivecd8lymphocyteresponsesintype1diabetes.jexpmed.2004apr19；199(8):1153–1162

keir,m.e.,m.j.butte,g.j.freeman和a.h.sharpe.2008.pd-1anditsligandsintoleranceandimmunity.annurevimmunol26:677-704.

kinyanjui,s.m.,d.j.conway,d.e.lanar和k.marsh.2007.iggantibodyresponsestoplasmodiumfalciparummerozoiteantigensinkenyanchildrenhaveashorthalf-life.malarj6:82.

kumar,s.和miller,l.h.(1990).cellularmechanismsinimmunitytobloodstageinfection.immunollett25,109-114.

latchman,y.,c.r.wood,t.chernova,d.chaudhary,m.borde,i.chernova,y.iwai,a.j.long,j.a.brown,r.nunes,e.a.greenfield,k.bourque,v.a.boussiotis,l.l.carter,b.m.carreno,n.malenkovich,h.nishimura,t.okazaki,t.honjo,a.h.sharpe和g.j.freeman.2001.pd-l2isasecondligandforpd-1andinhibitstcellactivation.natimmunol2:261-268.

lau,l.s.,fernandezruiz,d.,davey,g.m.,dekoning-ward,t.f.,papenfuss,a.t.,carbone,f.r.,brooks,a.g.,crabb,b.s.和heath,w.r.(2011).blood-stageplasmodiumbergheiinfectiongeneratesapotent,specificcd8+t-cellresponsedespiteresidencelargelyincellslackingmhciprocessingmachinery.jinfectdis204,1989-1996.

lib等人,t-betexpressionisupregulatedinactivedisease.brjophthalmol.2003oct；87(10):1264-7

lib等人,upregulationoft-betexpressioninperipheralbloodmononuclearcellsduringvogt-koyanagi-haradadisease.brjophthalmol.2005nov；89(11):1410-2.

linterman,m.a.,w.pierson,s.k.lee,a.kallies,s.kawamoto,t.f.rayner,m.srivastava,d.p.divekar,l.beaton,j.j.hogan,s.fagarasan,a.liston,k.g.smith和c.g.vinuesa.2011.foxp3+follicularregulatorytcellscontrolthegerminalcenterresponse.natmed17:975-982.

mccall,m.b.,j.hopman,m.daou,b.maiga,v.dara,i.ploemen,k.nganou-makamdop,a.niangaly,y.tolo,c.arama,j.t.bousema,j.w.vandermeer,a.j.vanderven,m.troye-blomberg,a.dolo,o.k.doumbo和r.w.sauerwein.2010.earlyinterferon-gammaresponseagainstplasmodiumfalciparumcorrelateswithinterethnicdifferencesinsusceptibilitytoparasitemiabetweensympatricfulanianddogoninmali.jinfectdis201:142-152.

mccall,m.b.和r.w.sauerwein.2010.interferon-gamma--centralmediatorofprotectiveimmuneresponsesagainstthepre-erythrocyticandbloodstageofmalaria.jleukocbiol88:1131-1143.

muxel,s.m.,a.p.freitasdorosario,c.a.zago,s.i.castillo-mendez,l.r.sardinha,s.m.rodriguez-malaga,n.o.camara,j.m.alvarez和m.r.lima.2011.thespleencd4+tcellresponsetoblood-stageplasmodiumchabaudimalariadevelopsintwophasescharacterizedbydifferentproperties.plosone6:e22434.

ocana-morgner,c.,m.m.mota和a.rodriguez.2003.malariabloodstagesuppressionofliverstageimmunitybydendriticcells.jexpmed197:143-151.

sharpe,a.h.,e.j.wherry,r.ahmed和g.j.freeman.2007.thefunctionofprogrammedcelldeath1anditsligandsinregulatingautoimmunityandinfection.natimmunol8:239-245.

shin,t.,kennedy,g.,gorski,k.,tsuchiya,h.,koseki,h.,azuma,m.,yagita,h.,chen,l.,powell,j.,pardoll,d.和housseau,f.2003.cooperativeb7-1/2(cd80/cd86)andb7-dccostimulationofcd4+tcellsindependentofthepd-1receptor.jexpmed198,31-38.

stephens,r.和j.langhorne.2010.effectormemoryth1cd4tcellsaremaintainedinamousemodelofchronicmalaria.plospathog6:e1001208.

su,z.和stevenson,m.m.2002.il-12isrequiredforantibody-mediatedprotectiveimmunityagainstblood-stageplasmodiumchabaudiasmalariainfectioninmice.jimmunol168,1348-1355.

tran,t.m.,s.li,s.doumbo,d.doumtabe,c.y.huang,s.dia,a.bathily,j.sangala,y.kone,a.traore,m.niangaly,c.dara,k.kayentao,a.ongoiba,o.k.doumbo,b.traore和p.d.crompton.2013.anintensivelongitudinalcohortstudyofmalianchildrenandadultsrevealsnoevidenceofacquiredimmunitytoplasmodiumfalciparuminfection.clininfectdis57:40-47.

tseng,s.y.,m.otsuji,k.gorski,x.huang,j.e.slansky,s.i.pai,a.shalabi,t.shin,d.m.pardoll和h.tsuchiya.2001.b7-dc,anewdendriticcellmoleculewithpotentcostimulatorypropertiesfortcells.jexpmed193:839-846.

urban,b.c.,d.j.ferguson,a.pain,n.willcox,m.plebanski,j.m.austyn和d.j.roberts.1999.plasmodiumfalciparum-infectederythrocytesmodulatethematurationofdendriticcells[seecomments].nature400:73-77.

urban,b.c.,n.willcox和d.j.roberts.2001.aroleforcd36intheregulationofdendriticcellfunction.procnatlacadsciusa98:8750-8755.

wang等人,2006,transcriptionfactort-betregulatesinflammatoryarthritisthroughitsfunctionindendriticcells,jcifeb；116(2)414-421

weiss,g.e.,b.traore,k.kayentao,a.ongoiba,s.doumbo,d.doumtabe,y.kone,s.dia,a.guindo,a.traore,c.y.huang,k.miura,m.mircetic,s.li,a.baughman,d.l.narum,l.h.miller,o.k.doumbo,s.k.pierce和p.d.crompton.2010.theplasmodiumfalciparum-specifichumanmemorybcellcompartmentexpandsgraduallywithrepeatedmalariainfections.plospathog6:e1000912.

wipasa,j.,c.suphavilai,l.c.okell,j.cook,p.h.corran,k.thaikla,w.liewsaree,e.m.riley和j.c.hafalla.2010.long-livedantibodyandbcellmemoryresponsestothehumanmalariaparasites,plasmodiumfalciparumandplasmodiumvivax.plospathog6:e1000770.

wykes,m.n.和m.f.good.2008.whatreallyhappenstodendriticcellsduringmalaria？natrevmicrobiol6:864-867.

wykes,m.n.,x.q.liu,l.beattie,d.i.stanisic,k.j.stacey,m.j.smyth,r.thomas和m.f.good.2007a.plasmodiumstraindeterminesdendriticcellfunctionessentialforsurvivalfrommalaria.plospathog3:e96.

wykes,m.n.,x.q.liu,s.jiang,c.hirunpetcharat和m.f.good.2007b.systemictumornecrosisfactorgeneratedduringlethalplasmodiuminfectionsimpairsdendriticcellfunction.jimmunol179:3982-3987.

zhu,c.,anderson,a.c.,schubart,a.,xiong,h.,imitola,j.,khoury,s.j.,zheng,x.x.,strom,t.b.和kuchroo,v.k.(2005).thetim-3ligandgalectin-9negativelyregulatesthelpertype1immunity.natimmunol6,1245-1252.