本發(fā)明涉及用于治療用途的口服組合物的制備領(lǐng)域，所述口服組合物含有與感興趣的靶標(biāo)相結(jié)合的活性成分。
背景技術(shù)：
有一定數(shù)量的胃腸系統(tǒng)疾病。為了治療這些疾病，合意的是能夠具有可用的組合物，其直接在病灶處起作用。
為了做到這一點，可以開發(fā)直腸組合物，但是口服組合物是患者所優(yōu)選的，并且能夠使治療有更好的依從性。此外，并且甚至對于治療全身性疾病(不局限于胃腸道系統(tǒng))，盡可能口服施用是優(yōu)先于其他施用方式(并且特別是注射)的，所述其他施用方式可能需要護理人員的參與。
無論何種疾病，通常有感興趣的治療靶標(biāo)，藥物在該靶標(biāo)發(fā)揮作用。其可以是細(xì)胞受體，或微生物的表面蛋白質(zhì)。通常，似乎合意的是具有組合物，所述組合物能夠在作用位點直接應(yīng)用活性成分，所述活性成分作用于感興趣的治療靶標(biāo)。然而，一些蛋白質(zhì)如抗體，當(dāng)它們通過胃時被降解。
專利申請wo2007/139397描述了pli-ob蛋白質(zhì)的文庫的用途，其中ob結(jié)構(gòu)域通過在蛋白質(zhì)與其天然配體結(jié)合的這個結(jié)構(gòu)域中引入突變而被修飾。
專利申請wo2008/068637描述了基于sac7d蛋白質(zhì)的文庫用于獲得對感興趣的靶標(biāo)具有親和性的配體的用途。在wo2008/068637中描述的方法包括組合文庫的產(chǎn)生，所述組合文庫含有大量均具有相同序列的dna分子，除了存在某些導(dǎo)致產(chǎn)生野生型蛋白質(zhì)變體的隨機突變以外，所述變體在這種野生型pli-ob蛋白質(zhì)的結(jié)合位點的某些氨基酸上表現(xiàn)出突變。特別地，在wo2008/068637的情況下，野生型pli-ob蛋白質(zhì)是sac7d蛋白質(zhì)，為了產(chǎn)生變異性，向其中引入突變，特別是在選自以下的氨基酸處：k7、y8、k9、k21、k22、w24、v26、m29、s31、t33、t40、r42、a44、s46，或在其他氨基酸處，如v26、g27、k28、m29、s31、r42、a44、s46、e47和k48。這些氨基酸基于seqidno.1所示的sac7d序列。
專利申請wo2012/150314公開了突變從sac7d家族的一種蛋白質(zhì)向相同家族的另一種蛋白質(zhì)的可攜帶性(portabilité)。這種可攜帶性意味著從sac7d家族的一種蛋白質(zhì)的突變體構(gòu)建所述家族的另一種蛋白質(zhì)的突變體，這已經(jīng)能夠通過進行wo2008/068637的方法特別地獲得。
sac7d家族被定義為與sac7d家族相關(guān)的，并且相當(dāng)于從嗜極細(xì)菌中分離的7kda的dna結(jié)合蛋白質(zhì)家族。在wo2008/068637中特別地描述了這些蛋白質(zhì)和該家族。因此，在本發(fā)明的情況下，當(dāng)一種蛋白質(zhì)具有與序列seqidno.8相對應(yīng)的序列時，則所述蛋白質(zhì)屬于sac7d家族。該家族特別地包含來源于嗜酸熱硫化葉菌(sulfolobusacidocaldarius)的sac7d或sac7e蛋白質(zhì)、來源于硫磺礦硫化葉菌(sulfolobussolfataricus)的sso7d蛋白質(zhì)、來源于極端嗜熱古菌(sulfolobustokodaii)的dbp7蛋白質(zhì)、來源于希氏硫化葉菌(sulfolobusshibatae)的ssh7b蛋白質(zhì)、來源于希氏硫化葉菌(sulfolobusshibatae)的ssh7a蛋白質(zhì)，和來源于硫磺礦硫化葉菌(sulfolobussolfataricus)的p7ss蛋白質(zhì)。
pli-ob蛋白質(zhì)是現(xiàn)有技術(shù)己知的。在上面引用的文件以及arcus(curropinstructbiol.2002十二月；12(6):794-801)中特別地描述了它們。pli-ob是具有五個貝塔(β)片層的柱狀形式。大多數(shù)pli-ob蛋白質(zhì)針對其天然配體使用同樣的結(jié)合界面，所述天然配體可以是寡糖、寡核苷酸、蛋白質(zhì)、金屬離子或催化底物。該結(jié)合界面主要包含位于β片層的殘基。位于環(huán)內(nèi)的某些殘基也可以參與pli-ob蛋白質(zhì)與其天然配體的結(jié)合。因此，專利申請wo2007/139397和wo2008/068637和arcus文獻(2002，如前所述)描述了用于與其天然配體結(jié)合的pli-ob蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。因此，專利文獻wo2008/068637詳細(xì)地描述了如何鑒定pli-ob蛋白質(zhì)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
通過使用網(wǎng)站wu-blast2(http://www.ebi.ac.uk/blast2/index.html)(lopez等人,2003,nucleicacidsres31,3795-3798)、t-coffee(http://www.ch.embnet.org/software/tcoffee.html)(notredame等人,2000,jmolbiol302,205-217)和dalilite(http://www.ebi.ac.uk/dalilite/)(holm和park,2000,bioinformatics16,566-567)，將具有pli-ob結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)的幾個序列和3d結(jié)構(gòu)相疊加，能夠鑒定結(jié)合結(jié)構(gòu)域的位置，和特別地能夠鑒定可以被修飾的氨基酸。取sac7d的序列(seqidno:1)作為參照，它們?yōu)闅埢鵹2、k3、k5、k7、y8、k9、g10、e11、k13、e14、t17、k21、k22、w24、v26、g27、k28、m29、s31、t33、y34、d36、n37、g38、k39、t40、r42、a44、s46、e47、k48、d49、a50和p51。仍以該sac7d序列作為參照，可以缺失的殘基為：a59、r60、a61、e64和/或k66。
可以如wo2008/068637所描述鑒定其他pli-ob蛋白質(zhì)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。該專利申請表明，能夠使用dali網(wǎng)站(http://www.ebi.ac.uk/dali/interactive.html)(holm和sander,1998,nucleicacidsres26,316-319)，進行pli-ob蛋白質(zhì)或結(jié)構(gòu)域的3d結(jié)構(gòu)的疊加(在該專利申請中使用了包括sac7d在內(nèi)的10個結(jié)構(gòu)域)。因此，對于任何pli-ob蛋白質(zhì)(或任何pli-ob結(jié)構(gòu)域)，容易鑒定參與結(jié)合位點且與上面提及的sac7d氨基酸相對應(yīng)的氨基酸。
wo2008/068637的教導(dǎo)還表明，氨基酸可以任選地被插入至pli-ob蛋白質(zhì)特別是sac7d家族的蛋白質(zhì)的環(huán)內(nèi)；特別地，可以在環(huán)3內(nèi)插入1至15個氨基酸殘基(如在wo2008/068637的圖1b和2中所定義)，例如在sac7d的殘基25至30的區(qū)域，優(yōu)選在殘基27和28之間；可以在環(huán)4內(nèi)插入1至15個氨基酸殘基(如在wo2008/068637的圖1b和2中所定義)，例如在sac7d的殘基35至40的區(qū)域，優(yōu)選在殘基37和38之間；并且可以在環(huán)1內(nèi)插入1至20個殘基(如在wo2008/068637的圖1b和2中所定義)，例如在sac7d的殘基7至12的區(qū)域，優(yōu)選在殘基9和10之間。
引申開來，在本申請的情況下，術(shù)語“pli-ob蛋白質(zhì)”包含天然的pli-ob蛋白質(zhì)，但也包含可以從更復(fù)雜的蛋白質(zhì)中分離的具有pli-ob的結(jié)構(gòu)域。特別地，在專利申請wo2007/139397和wo2008/068637中更為詳細(xì)地描述了這些pli-ob結(jié)構(gòu)域。該術(shù)語還包含可以通過將pli-ob蛋白質(zhì)或具有pli-ob的結(jié)構(gòu)域在n-或c-末端位置融合、遺傳工程至感興趣的蛋白質(zhì)或結(jié)構(gòu)域所獲得的多肽，所述感興趣的蛋白質(zhì)或結(jié)構(gòu)域，例如允許更好的純化的標(biāo)記。
在wo2008/068637中描述的方法的優(yōu)勢在于，其能夠通過篩選組合文庫獲得pli-ob蛋白質(zhì)的變體，所述組合文庫含有或表達(dá)大量的變體，其中一定數(shù)量的氨基酸已經(jīng)被“隨機化”，即，被隨機的氨基酸所替代。對這些文庫的篩選能夠鑒定這些蛋白質(zhì)的變體，所述變體通常以強的親和性特異性地結(jié)合感興趣的靶標(biāo)(事實上，專利申請wo2008/068637描述了一個納摩爾級的親和性)，而非野生型蛋白質(zhì)的天然配體(組合文庫從所述野生型蛋白質(zhì)產(chǎn)生)。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明人己經(jīng)表明，pli-ob蛋白質(zhì)有效地耐受胃降解，并且可以在腸內(nèi)保持，或跨越腸的屏障，因此在組合物中使用所述pli-ob蛋白質(zhì)可以口服使用以用于治療各種疾病，特別是位于腸的疾病，或者在通過全身循環(huán)后用于治療在身體的其他器官中的疾病。優(yōu)選使用pli-ob蛋白質(zhì)的變體，其結(jié)合至感興趣的靶標(biāo)，所述感興趣的靶標(biāo)參與病理狀況，特別是胃腸系統(tǒng)的病理狀況，或者全身病理狀況(也就是說，位于除了胃腸系統(tǒng)以外的器官中的病理狀況)。
因此，本發(fā)明涉及一種用于口服施用的組合物，其包含pli-ob蛋白質(zhì)或野生型pli-ob蛋白質(zhì)的變體，所述變體在所述野生型pli-ob蛋白質(zhì)與其天然配體結(jié)合的界面上具有5至32個突變的殘基。
在一個特別的實施方案中，所述變體表現(xiàn)出治療活性。特別地，所述變體特異性結(jié)合除了所述天然配體的靶標(biāo)以外的感興趣的靶標(biāo)。然后，已經(jīng)可以通過實施如在wo2008/068637或wo2007/139397中所描述的方法鑒定該變體。事實上，實施這兩件專利申請中所描述的方法通常能夠鑒定結(jié)合至任何感興趣的靶標(biāo)的任何pli-ob蛋白質(zhì)的變體。該組合物通常還含有可以用于這種口服施用的藥學(xué)上可接受的賦形劑。
如前所述，所述野生型pli-ob蛋白質(zhì)還涵蓋pli-ob結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選地，在本發(fā)明的情況中使用的變體含有最多300個氨基酸，優(yōu)選最多200個氨基酸，優(yōu)選最多175個氨基酸，更優(yōu)選最多150個氨基酸，更優(yōu)選最多100個氨基酸。在一個特別的實施方案中，其含有最多80個或最多70個氨基酸。
所述變體(相對于野生型蛋白質(zhì))中的突變的殘基的數(shù)量為5至32個。在其他實施方案中，與野生型pli-ob蛋白質(zhì)(或結(jié)構(gòu)域)相比，這些變體優(yōu)選具有至少5個，更優(yōu)選至少8個，甚至更優(yōu)選至少10個，但通常少于32個，更優(yōu)選少于24個，甚至更優(yōu)選少于20個或少于15個取代的氨基酸。優(yōu)選地，相對于野生型蛋白質(zhì)，8、9、10、11、12、13或14個氨基酸是突變的。這些突變的氨基酸位于pli-ob蛋白質(zhì)與其天然配體結(jié)合的位點中。它們通常分布于該結(jié)合結(jié)構(gòu)域的整體中?？紤]到該結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)，在(通常數(shù)個，特別是兩個或三個)β片層中發(fā)現(xiàn)某些突變的殘基。
在一個特別的實施方案中，這些變體還可以包含在連接pli-ob的β片層的環(huán)中的氨基酸插入。因此，可以向環(huán)1和/或環(huán)4和/或環(huán)3中引入1至15個氨基酸(以與wo2008/068637中相同的方式給環(huán)編號)。
在一個特別的實施方案中，所述野生型pli-ob蛋白質(zhì)選自來源于嗜酸熱硫化葉菌的sac7d或sac7e、來源于硫磺礦硫化葉菌的sso7d、來源于極端嗜熱古菌的dbp7、來源于希氏硫化葉菌的ssh7b、來源于希氏硫化葉菌的ssh7a，和來源于硫磺礦硫化葉菌的p7ss。
因此，在本發(fā)明的口服施用的組合物中使用的變體與上述蛋白質(zhì)作比較。
sac7d、sso7d、sac7e、ssh7b、ssh7a、dbp7和sis7蛋白質(zhì)的各種序列分別示于seqidno.1至seqidno.7中。
這種sac7d家族的蛋白質(zhì)的變體被稱為nanofitine。因此，優(yōu)選在seqidno.1至seqidno.7所示的蛋白質(zhì)的變體上，特別是在sac7d的變體上實施本發(fā)明。
對于液體組合物，根據(jù)本發(fā)明的組合物中的變體的濃度通常大于10ng/ml，并且低于600mg/ml。因此，其通常小于500mg/ml，優(yōu)選小于250mg/ml，優(yōu)選小于100mg/ml，或小于50mg/ml，或甚至小于10mg/ml。其通常大于10ng/ml，優(yōu)選大于50ng/ml，優(yōu)選大于100ng/ml。
將濃度調(diào)整至期望以5至20ml的攝入量施用至患者的一定劑量。
對于固體組合物，根據(jù)患者將服用的片劑(或錠劑等)的數(shù)量來調(diào)節(jié)劑量，以獲得從治療角度講有效的劑量。
通常，向患者施用非?？勺兊牧?其將特別地取決于疾病的性質(zhì)、靶向的抗原、任選地pli-ob蛋白質(zhì)的變體對該抗原的親和力、患者的重量、與用于病理狀況的其他藥物組合使用或不組合使用)。因此，范圍將通常為在一個或多個攝入中從10mg/kg到多至200mg/kg，或甚至400mg/kg的pli-ob蛋白質(zhì)變體。然而，如上面所述，這些限制值僅為說明，并且能夠制備用于施用更多或更少產(chǎn)品的組合物。
根據(jù)本發(fā)明的組合物中存在的變體特異性結(jié)合感興趣的靶標(biāo)。事實上，利用如在wo2008/068637或wo2007/139397中所描述的方法，已經(jīng)可以對其與該感興趣的靶標(biāo)的結(jié)合特異性進行篩選。此外，在這些專利申請中所描述的方法能夠獲得一個微摩爾級(wo2007/139397)或一個納摩爾級(wo2008/068637)的親和性。
根據(jù)期望治療的疾病選擇感興趣的靶標(biāo)。因此，可以提及任何抗原、抗體、細(xì)胞蛋白質(zhì)、循環(huán)蛋白質(zhì)或肽。其還可以靶向藥物的活性成分，或特定的核酸。特別考慮的是，感興趣的靶標(biāo)是白介素、細(xì)胞因子、細(xì)胞因子或白介素受體、癌基因編碼的蛋白質(zhì)、微生物的表面蛋白質(zhì)或微生物脂多糖。
根據(jù)本發(fā)明的組合物可以為本領(lǐng)域已知的任何形式。特別地，其為凝膠膠囊、片劑(薄膜包衣或未薄膜包衣)、丸劑或錠劑的形式。在另一個實施方案中，其為液體組合物的形式，如糖漿劑。其還可以為固體形式。
在組合物為固體形式的情況下，可以使用本領(lǐng)域已知的任何賦形劑，如滑石(e553b)、微晶纖維素、乳糖、淀粉(特別是玉米淀粉)、硬脂酸鎂(e572)、硬脂酸(e570)或微晶纖維素。當(dāng)組合物為薄膜包衣片劑的形式時，所述薄膜包衣可以由本領(lǐng)域已知的任何物質(zhì)形成，如羥丙甲纖維素(e464)、乙基纖維素、聚乙二醇、滑石(e553b)、二氧化鈦(e171)或氧化鐵(e172)。
組合物還可以為緩釋的。特別地在wo2011/077239中描述了這種受控制劑或緩釋制劑。因此，這些組合物可以包含基質(zhì)，在其中存在pli-ob蛋白質(zhì)(天然的或變體)與任選地其它成分。這些基質(zhì)可以允許立即釋放一部分pli-ob蛋白質(zhì)，隨后緩慢釋放這些蛋白質(zhì)的另一部分。
在固體形式的口服組合物中，如在wo98/043615中所描述，蛋白質(zhì)可以被凍干或整合到基質(zhì)中。
然而，應(yīng)當(dāng)注意，實施例清楚地顯示，pli-ob蛋白質(zhì)變體，特別是當(dāng)pli-ob蛋白質(zhì)為sac7d家族(seqidno.1至seqidno.7)時，耐受胃降解，因此可以在腸中發(fā)揮其作用，或甚至在全身循環(huán)中發(fā)揮其作用。因此，清楚的是，即使口服施用的組合物的元件能夠改善這些蛋白質(zhì)的保護，這僅僅是附加因素，而非產(chǎn)生技術(shù)效果所必需的要素。
當(dāng)組合物為液體形式時，蛋白質(zhì)通常直接存在于溶液中。
通常使用pbs(磷酸鹽緩沖鹽水，一種含有氯化鈉、磷酸二鈉、磷酸一鉀和少量氯化鉀的生理溶質(zhì))、tbs(tris-緩沖鹽水)、檸檬酸鹽緩沖劑(特別是用100mm檸檬酸單鈉制備的)或hepes(4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸，一種兩性離子有機化合物，其為一種在生理ph下具有良好穩(wěn)定性的緩沖劑)。
除了將ph調(diào)節(jié)到4至6的檸檬酸鹽緩沖劑以外，緩沖劑優(yōu)選為ph7.4。
然而，能夠使用其他類型的緩沖劑用于制備口服液體組合物。
當(dāng)然，優(yōu)選在允許施用至患者的條件下制備這些緩沖劑(可追溯性、良好操作規(guī)范等)。
可以通過固相化學(xué)合成或基因重組制備在根據(jù)本發(fā)明的組合物中使用的pli-ob蛋白質(zhì)的變體。例如，可以用appliedbiosystems自動肽合成儀(型號433a.)，或者通過fmoc化學(xué)進行化學(xué)合成，所述fmoc化學(xué)使用芴基甲氧基羰基基團暫時性地保護氨基酸的α-氨基官能團。
然而，優(yōu)選通過基因工程，特別是通過在表達(dá)載體中整合編碼所述多肽的核酸序列，以生產(chǎn)可以在本發(fā)明的情況中使用的變體。然后，將該表達(dá)載體引入宿主細(xì)胞(細(xì)菌如大腸桿菌是特別適合的)，在允許合成多肽的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞(可以特別地使用表達(dá)載體中多肽上游的誘導(dǎo)型啟動子)。然后，回收己合成的多肽。然后，可以在多肽的n或c末端位置接枝任何類型的分子。
本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉用于生產(chǎn)多肽的方法，其特別地描述于sambrook、fritsch和maniatis的molecularcloning,alaboratorymanual第二版中。
根據(jù)本發(fā)明的組合物可以僅含有pli-ob蛋白質(zhì)的變體，或者含有pli-ob蛋白質(zhì)的變體與其他活性成分。因此，組合物還可以含有至少一種選自抗細(xì)菌劑、抗寄生蟲劑、抗真菌劑、抗炎劑、止癢劑、麻醉劑、抗病毒劑、角質(zhì)軟化劑和自由基清除劑的試劑。
該組合物還可以具有ph調(diào)節(jié)劑，特別地用于使ph調(diào)節(jié)在ph＝7左右。
pli-ob蛋白質(zhì)的變體還可以與活性蛋白質(zhì)或任何其他化合物融合，特別地為了延長其半衰期。
還可以在診斷方法中使用根據(jù)本發(fā)明的組合物。因此，在一個特別的實施方案中，將pli-ob蛋白質(zhì)的變體與檢測或造影劑、示蹤劑或金屬偶聯(lián)。特別地，這使得能夠跟蹤這種檢測劑(造影劑、示蹤劑、金屬)，以確定pli-ob蛋白質(zhì)的變體所結(jié)合的器官(從而表明感興趣的靶標(biāo)的存在)。因此，本發(fā)明涉及一種用于檢測器官中(特別是胃腸系統(tǒng)中)特異性抗原的存在的方法，其包括施用如上面所描述的口服組合物的步驟，所述組合物包含pli-ob蛋白質(zhì)變體，所述pli-ob蛋白質(zhì)變體結(jié)合至所述抗原，并且其被偶聯(lián)至可檢測的示蹤劑(特別是檢測由示蹤劑或金屬或造影劑發(fā)射的輻射)。該方法還可以包括檢測人體中示蹤劑的存在的步驟，和定位檢測到該示蹤劑的器官的步驟，使得能夠得出抗原存在于檢測到該示蹤劑的器官中的結(jié)論。關(guān)于器官中存在抗原的結(jié)論是在該診斷方法中得出結(jié)論的關(guān)鍵，因為其能夠得出關(guān)于存在特定病理狀態(tài)的結(jié)論，特別地如果抗原為該病理狀態(tài)的標(biāo)志物。最常見的示蹤劑為同位素(具有小于兩小時的半衰期)，如氟18(18f)或其他放射性元素如15o、13n和11c。
本發(fā)明還涉及一種用于制備口服施用的組合物的方法，其包括將野生型pli-ob蛋白質(zhì)的變體與藥學(xué)上可接受的口服施用的賦形劑混合的步驟。
本發(fā)明還涉及一種根據(jù)本發(fā)明的口服施用的組合物作為藥物，所述口服施用的組合物含有野生型pli-ob蛋白質(zhì)的變體，所述變體在所述野生型pli-ob蛋白質(zhì)與其天然配體結(jié)合的界面上具有5至32個突變的殘基。在這種特別的情況中，所述變體特異性結(jié)合感興趣的靶標(biāo)，所述靶標(biāo)為治療靶標(biāo)。
本發(fā)明還涉及一種根據(jù)本發(fā)明的口服施用的組合物，其用于治療全身性疾病或病癥或更具體地胃腸系統(tǒng)疾病或病癥。在該實施方案中，所使用的pli-ob蛋白質(zhì)變體靶向(結(jié)合)預(yù)期的疾病的病原學(xué)因子或與該疾病相關(guān)的治療靶標(biāo)。
胃腸系統(tǒng)疾病為特別地選自以下的疾?。喊⒚装筒?、結(jié)腸和直腸癌、胃和十二指腸癌、食管癌、炎性腸病(mici)、胰腺癌、霍亂、肝炎和肝硬化(特別是由b或c病毒引起的肝硬化)、結(jié)腸炎(特別是由于梭菌屬(clostridium))、腹瀉(特別是細(xì)菌性腹瀉(特別是志賀氏菌屬(shigella)、彎曲桿菌屬(campylobacter)、沙門氏菌屬(salmonella)、耶爾森氏假結(jié)核桿菌(yersiniapseudotuberculosis)和小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(yersiniaenterocolitica))或病毒性腹瀉(特別是由細(xì)小病毒和呼腸孤病毒、輪狀病毒(呼腸孤樣病毒)、腸病毒、星狀病毒、冠狀病毒(corona-likevirus)引起)、成人腹腔疾病、惠普爾(whipple)病、胰腺炎、腸易激綜合征、腹部腫瘤、肝腫瘤、十二指腸或胃潰瘍、腸內(nèi)蠕蟲、佐林格-埃里森(zollingeretellison)綜合征。
全身性疾病為位于除胃腸系統(tǒng)以外的器官中的疾病。
因此，在該實施方案中，特別地利用在wo2008/068637中所描述的篩選方法來選擇pli-ob蛋白質(zhì)的變體，所述變體結(jié)合至參與所期望治療的疾病或病癥的治療靶標(biāo)(病原學(xué)因子或效應(yīng)子)，并且在口服施用的組合物中配制該變體。
本發(fā)明還涉及一種用于治療全身性疾病或病癥或更特別地胃腸系統(tǒng)疾病或病癥的方法，其特征在于口服施用根據(jù)本發(fā)明的組合物，所述組合物含有治療有效量的pli-ob蛋白質(zhì)，所述pli-ob蛋白質(zhì)優(yōu)選靶向(結(jié)合)所述疾病或所述病癥特有的病原學(xué)因子或治療靶標(biāo)。
具體實施方式
實施例
在所有實施例中，使用如上面所定義的nanofitine，即，根據(jù)與wo2008/068637中所描述的方法類似的方法，通過篩選針對感興趣的靶標(biāo)的組合文庫獲得的sac7d變體。這些實施例的目的在于證明pli-ob蛋白質(zhì)，特別是nanofitine，能夠耐受胃內(nèi)的降解，并且能夠直接作用于需要其活性的胃腸系統(tǒng)的位點(例如腸)。
實施例1：口服施用的nanofitine功效測試
測試了由篩選sac7d變體的文庫產(chǎn)生的三種nanofitinea1、a2、a3對感興趣的靶標(biāo)的親和力，所述靶標(biāo)參與胃腸系統(tǒng)疾病(腸炎癥)。在細(xì)菌系統(tǒng)中產(chǎn)生這些nanofitine，其為與聚組胺標(biāo)簽融合的形式，或者沒有融合(無標(biāo)簽的)。
將nanofitine懸浮于pbs(磷酸鹽緩沖鹽水)中。
如在scheiffele和fuss(currprotocimmunol.2002八月；15章:單元15.19)中所描述，在用tnbs(2,4,6-三硝基苯磺酸)誘導(dǎo)的腸炎癥(結(jié)腸炎)的鼠模型中測試這些nanofitine，在預(yù)防模式中，每天應(yīng)用nanofitine的劑量持續(xù)5天，然后用tnbs誘導(dǎo)，并在2天后處死小鼠，或者在治療模式中，從用tnbs誘導(dǎo)的當(dāng)天，每天應(yīng)用nanofitine的劑量，并在4天后處死小鼠。
從宏觀和組織學(xué)方面評價nanofitine的作用。對于宏觀評價，在解剖顯微鏡(x5)下檢查結(jié)腸，以根據(jù)華萊士(wallace)標(biāo)準(zhǔn)評價病變。華萊士評分以0至10的等級評價宏觀病變，其基于反映炎癥的標(biāo)準(zhǔn)(0對應(yīng)于不存在炎癥，10對應(yīng)于惡化的炎癥)，如充血，以及潰瘍的數(shù)量和程度(pierredesreumaux,2001,jexpmed.,193,827–838)。對于組織學(xué)評價，切出位于肛管上方2cm處的一段結(jié)腸，然后將其在4％多聚甲醛中固定過夜，并包埋在石蠟中。將用蘇木精和伊紅染色的切片“盲檢”，并根據(jù)ameho標(biāo)準(zhǔn)評價。ameho評分以0至6的等級評價病變，其基于反映炎癥的標(biāo)準(zhǔn)(0對應(yīng)于不存在炎癥，6對應(yīng)于惡化的炎癥)，如細(xì)胞浸潤，以及病變表面的深度和蔓延(pierredesreumaux,2001,jexpmed.,193,827–838)。在這兩種情況下，結(jié)果被轉(zhuǎn)化為百分比功效，其反映分?jǐn)?shù)相對于未處理的誘導(dǎo)的小鼠的總分?jǐn)?shù)的百分比下降。
作為對照，以最佳劑量使用作為腸抗炎劑銷售的參考分子
當(dāng)通過直腸施用預(yù)防性地應(yīng)用時(30mm)，
當(dāng)應(yīng)用于治療模型中時(在動物可自由獲取的食物中存在)，
表i-在腸炎癥模型中獲得的結(jié)果(百分比功效)
m：宏觀水平的功效
h：組織學(xué)水平的功效
這些結(jié)果表明，nanofitine能夠在口服施用后直接作用于位于腸中的靶標(biāo)，它們有效地通過胃而不被降解，并且它們顯示了與參考產(chǎn)品可相比的功效水平。
序列表
<110>艾菲洛之克公司
<120>包含pli-ob蛋白質(zhì)變體的口服施用的組合物
<130>brv95-wo
<150>fr14/60226
<151>2014-10-24
<160>8
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>66
<212>prt
<213>嗜酸熱硫化葉菌
<400>1
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<213>硫磺礦硫化葉菌
<400>2
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<213>嗜酸熱硫化葉菌
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<213>希氏硫化葉菌
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<213>希氏硫化葉菌
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<213>硫化葉菌屬
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<211>64
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<213>冰島硫化葉菌（sulfolobusislandicus）
<400>7
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<210>8
<211>60
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>共有序列
<220>
<221>變體
<222>(2)..(2)
<223>xaa為v,a或t
<220>
<221>變體
<222>(3)..(3)
<223>xaa為t或k
<220>
<221>變體
<222>(5)..(5)
<223>xaa為r或k
<220>
<221>變體
<222>(14)..(14)
<223>xaa為e或q
<220>
<221>變體
<222>(17)..(17)
<223>xaa為t或i
<220>
<221>變體
<222>(30)..(30)
<223>xaa為a,v或i
<220>
<221>變體
<222>(36)..(38)
<223>xaaxaaxaa為egg或dn-
<220>
<221>變體
<222>(56)..(56)
<223>xaa為m或l
<220>
<221>變體
<222>(57)..(57)
<223>xaa為q或d
<220>
<221>變體
<222>(60)..(60)
<223>xaa表示a,arae,ekqkk,eksgkk,araerekk,araekkk,
acaerekk或acaekkk
<400>8
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