專利名稱：一種甲胎蛋白異質(zhì)體的親和吸附測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及測定方法，尤其是一種甲胎蛋白異質(zhì)體的親和吸附測定方法。
背景技術(shù)：
自1970年P(guān)urves用淀粉膠電泳在肝癌患者血清中發(fā)現(xiàn)AFP異質(zhì)體以來[3]，許多人對此作了大量深入研究，AFP異質(zhì)體分類及臨床評價都有較大進(jìn)展[4，5]。國內(nèi)其測定方法主限于兩種[6，7]親和交叉免疫電泳放射自顯影法和親和電泳免疫印跡法，這兩種方法操作步驟繁多、時間長、結(jié)果的判斷還需要特殊設(shè)備，這些大大限制了AFP異質(zhì)體測定在臨床的應(yīng)用。齊為民等(2001年)提出了在親和電泳后將凝膠上的一定位置切下[8]，加入酶聯(lián)免疫吸附劑(ELISA)測定，方法仍然繁瑣且有一定隨意性，會造成較大的變異?？梢哉f，長期來AFP異質(zhì)體測定缺乏適合臨床使用的常規(guī)方法。
血清甲胎蛋白(AFP)測定已廣泛被應(yīng)用于肝癌的診斷。人們在發(fā)現(xiàn)了AFP存在糖鏈有差別的異質(zhì)體后，就利用它們與不同植物凝集素的親和性進(jìn)行分類[1]，例如，巖藻糖苷化的AFP親和豌豆凝集素(LCA)稱LCA-AFP-V，氨基葡萄糖化的親和刀豆素A(ConA)稱ConA-AFP-V。許多報道表明測定AFP的某些糖鏈異質(zhì)體可明顯提高肝癌實驗室診斷的特異性和靈敏度。但是長期以來，國內(nèi)只有少數(shù)臨床實驗室能夠測定AFP異質(zhì)體，只有少數(shù)城市能滿足臨床測定AFP異質(zhì)體的要求。這主要歸結(jié)于迄今為止的異質(zhì)體測定方法對于技術(shù)的要求較高、操作繁瑣、試劑昂貴。本研究力圖建立一種適合臨床實驗室常規(guī)分析的AFP異質(zhì)體測定方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種解決了AFP異質(zhì)體測定中測定時間長、操作繁瑣、
本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案。這種甲胎蛋白異質(zhì)體的親和吸附測定方法，主要包括如下步驟來實現(xiàn)1)、對親和吸附劑進(jìn)行預(yù)處理取一定量的親和吸附劑，加入一定量的緩沖液，混勻、離心棄上清后待用；2)、親和吸附處理標(biāo)本經(jīng)稀釋后，加入經(jīng)過預(yù)處理的親和吸附劑，在振蕩器上振搖；3)、游離AFP測定吸附后的標(biāo)本經(jīng)離心處理后，再到化學(xué)發(fā)光分析儀上測定上清液中的AFP；4)、總AFP測定標(biāo)本經(jīng)稀釋后，直接到到化學(xué)發(fā)光分析儀上測定上清液中的AFP；5)、計算出每一標(biāo)本AFP的結(jié)合率，為總AFP減去吸附后的游離AFP，再除以總AFP，即可獲得各個AFP糖鏈異質(zhì)體。
本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案還可以進(jìn)一步完善。所述的對親和吸附劑進(jìn)行預(yù)處理，取100μl的親和吸附劑，加入0.5ml緩沖液1，混勻1min，離心棄上清后，加入1ml緩沖液2混勻10min，離心棄上清后，加入100μl緩沖液2待用。所述的親和吸附為，標(biāo)本用緩沖液2稀釋至AFP大約50μg/L，吸取100μl加入經(jīng)預(yù)處理的親和吸附劑，在振蕩器上振搖(400r/min)20min。所述的游離AFP測定為，吸附后的標(biāo)本經(jīng)2000 r/min離心5min，再到ACS180化學(xué)發(fā)光分析儀上測定上清液中的AFP。所述的總AFP測定，用緩沖液2稀釋至AFP大約50μg/L的標(biāo)本中取100μl，加入緩沖液2后到ACS180化學(xué)發(fā)光分析儀上測定上清液中的AFP。
所述的緩沖液1為0.05mol/L Tris-HCl(含0.5mol/L NaCl)，pH7.6。所述的緩沖液20.01mol/L Tris-HCl(含0.5mol/L NaCl)，pH7.6，再加入1mmol/LMgCl2，1mmol/L CaCl2，1mmol/L MnCl2。所述親和劑為，扁豆凝集素(LCA)Sepharose 4B(Lentil Lectin Sepharose 4B)。所述親和劑為，刀豆凝集素A(ConA)Sepharose 4B(Concanavalin A-Sepharose 4B)。或者E-PHC或者其他外源性凝集素。
親和吸附法測定AFP異質(zhì)體的原理所有測定AFP異質(zhì)體的方法都是根據(jù)AFP異質(zhì)體對植物凝集素，包括小扁豆凝集素(LCA)或刀豆素(ConA)，的結(jié)合能力的不同而鑒別之，本方法也不例外。我們將用于親和色譜的層析柱填料用作固相吸附劑。我們的實驗證明，本文所用的ConA-Sepharose 4B和LCASepharose 4B都能有效地吸附各自親和的AFP異質(zhì)體，且AFP濃度在大約90μg/L時即基本達(dá)到平衡、可比較完全地被吸附，我們根據(jù)實驗數(shù)據(jù)選擇將樣品稀釋到AFP濃度大約50μg/L，這樣就能保證從樣品中基本除去該植物凝集素親和的AFP異質(zhì)體。經(jīng)過吸附的樣品中，只存在未被植物凝集素結(jié)合的AFP，就可以用目前臨床實驗室通用的化學(xué)發(fā)光免疫分析等方法測定。同一標(biāo)本的未吸附樣品可同時測得“總”AFP，經(jīng)計算即得到相應(yīng)AFP異質(zhì)體的百分含量和濃度。
本發(fā)明有益的效果是本方法能在50分鐘內(nèi)得出結(jié)果，靈敏度為0.1μg/L，CV可達(dá)8.3％，本法與親和電泳免疫印跡法比較結(jié)果高度相關(guān)(r＝0.895)。本文對41例肝癌、58例慢性肝病等的臨床應(yīng)用表明，本方法獲得的結(jié)果與文獻(xiàn)基本相符。親和吸附法測定AFP異質(zhì)體是一種適合臨床診斷的方法，能在較短的時間內(nèi)獲得與現(xiàn)有方法相同或更好的結(jié)果，且有方法簡便、結(jié)果可靠和測定成本低等優(yōu)點。本方法介紹的AFP異質(zhì)體測定是一種可靠和經(jīng)濟(jì)的方法。測定的條件經(jīng)過優(yōu)化后，測定時間僅需50-60min，預(yù)計測定成本60元左右，與和光公司的AFP-L3體外診斷試劑相比較，結(jié)果表明這兩種方法顯著相關(guān)(r＝0.895，P＜0.01水平)。和光公司的AFP-L3體外診斷試劑相當(dāng)昂貴(每人份測定費(fèi)在300元人民幣以上)，一般臨床診斷實驗室無法承受，測定時間也需要4-6小時，且測定步驟多(主要包括親和電泳、抗體親和印跡、免疫反應(yīng)、酶聯(lián)免疫反應(yīng)、顯色和光密度掃描測定)。我們的方法可以將實驗室內(nèi)現(xiàn)有的任何一種AFP測定“升級”為AFP異質(zhì)體的測定。


圖1是本發(fā)明的方法與親和電泳免疫印跡法測定AFP異質(zhì)體結(jié)果比較；
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述。
材料與方法一、標(biāo)本58例各類慢性肝病(經(jīng)臨床且結(jié)合B超、CT、免疫測定診斷，(男性52例，女性6例，年齡26-68歲，均來自杭州市傳染病醫(yī)院)，42例原發(fā)性肝癌(男性37例，女性5例，年齡26-72歲，來自本院、浙江省腫瘤醫(yī)院和杭州市傳染病醫(yī)院)。32例正常孕婦(均來自本院)。
二、試劑1、緩沖液10.05mol/L Tris-HCl(含0.5mol/L NaCl)，pH7.62、緩沖液20.01mol/L Tris-HCl(含0.5mol/L NaCl)，pH7.6，再加入1mmol/L MgCl2，1mmol/L CaCl2，1mmol/L MnCl23、扁豆凝集素(LCA)Sepharose 4B(Lentil Lectin Sepharose 4B)，CodeNo.17-0444-01，lot.290573，est exp 2004.08，Pharmacia Biotech.
4、刀豆凝集素A(ConA)Sepharose 4B(Concanavalin A-Sepharose 4B)，Code No.c-9017，lot.22K1480，Sigma5、AFP化學(xué)發(fā)光免疫試劑，ACS180配套，Beyer6、AFP-L3體外診斷用，AFP Differentiation Kit L，Code No.413-52101，lot.MQ403，est exp 2003.02，和光純藥工業(yè)株式會社7、統(tǒng)計方法主要采用Microsoft Excel和SPSS 10.0統(tǒng)計軟件。三、儀器1、ACS180SE化學(xué)發(fā)光免疫分析儀，Beyer2、EDAS290數(shù)碼圖像分析系統(tǒng)，Kodak這種甲胎蛋白異質(zhì)體的親和吸附測定方法，主要包括如下步驟來實現(xiàn)(1)親和吸附劑預(yù)處理，分別取100μl的親和吸附劑(LCA Sepharose 4B和ConA-Sepharose 4B)，加入0.5ml緩沖液1，混勻1min，離心棄上清后，加入1ml緩沖液2混勻10min，離心棄上清后，加入100μl緩沖液2待用；(2)親和吸附，標(biāo)本用緩沖液2稀釋至AFP大約50μg/L，吸取100μl分別加入經(jīng)預(yù)處理的這兩種親和吸附劑，在振蕩器上振搖(200r/min)20min；(3)游離AFP測定，吸附后的標(biāo)本經(jīng)2000r/min離心5min，再到ACS180化學(xué)發(fā)光分析儀上測定上清液中的AFP；(4)總AFP測定，同時從每份用緩沖液2稀釋至AFP大約50μg/L的標(biāo)本中取100μl，加入緩沖液2后到ACS180化學(xué)發(fā)光分析儀上測定上清液中的AFP；(5)每一標(biāo)本AFP的LCA(或ConA)結(jié)合率＝(總AFP-吸附后的游離AFP)/總AFP×100％，即可獲得各個AFP糖鏈異質(zhì)體。
本方法的測定精度取一份標(biāo)本分別連續(xù)測定20次，LCA游離AFP的CV為8.3％(均值11.9μg/L)和ConA游離AFP的CV為13.3％(均值5.3μg/L)。本方法的測定靈敏度AFP測定的試劑盒的最低檢測濃度為0.9μg/L。本方法與親和電泳免疫印跡法的比較對35份樣品同時用本方法測定親和LTA的AFP異質(zhì)體(LCA-AFP-V％)及電泳免疫印跡法測定AFP-L3(％)，進(jìn)行比較，結(jié)果見圖1。用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果表明這兩種方法顯著相關(guān)(r＝0.895，P＜0.01水平)。
部分病例AFP異質(zhì)體測定結(jié)果的分析本文對來自41例肝癌、58例AFP高于正常的各類慢性肝炎和32例妊娠的標(biāo)本用化學(xué)發(fā)光免疫法測定了總AFP，用本文介紹的方法測定了AFP異質(zhì)體(AFP-ConA-V和AFP-LCA-V)百分濃度，并計算了后兩者的絕對濃度以及兩者的比值(L/C)。以總AFP大于300μg/L為陽性，經(jīng)卡方檢驗，肝癌的陽性率與比慢性肝病高(x2＝3.84，P＝0.05)；經(jīng)t檢驗，AFP-ConA-V％在這兩種疾病中差別不大(t＝2.0，P＞0.05)；以AFP-LCA-V％大于25％為陽性，經(jīng)卡方檢驗，肝癌的陽性率顯著高于慢性肝病(x2＝5.1，P＜0.001)，但它與妊娠差異不大(x2＝0.46，P＞0.5)；L/C是AFP-LCA-V與AFP-ConA-V之比，經(jīng)t檢驗，肝癌與慢性肝病的差異明顯(t＝5.35，P＜0.001)，但它與妊娠差異不大(t＝0.00，P＞0.5)。
表2部分病例AFP及其異質(zhì)體測定結(jié)果的分析

我們初步應(yīng)用本方法在臨床中的發(fā)現(xiàn)我們對41例臨床診斷為肝癌、58例各種其他慢性肝病的血清標(biāo)本，用本法測定了AFP-ConA-V和AFP-LCA-V兩種異質(zhì)體，同時還比較了血清“總”AFP，以及22例孕婦的結(jié)果，這些數(shù)據(jù)與大多數(shù)文獻(xiàn)(近年的國外文獻(xiàn))報道相符[4，5，9]。根據(jù)我們的觀察，肝癌患者的血清AFP平均值比良性病變要高出兩個數(shù)量級，大于300μg/L的陽性率為80％也高于慢性肝病患者，后者中其實有相當(dāng)數(shù)量的“候補(bǔ)”的肝癌患者；同文獻(xiàn)報道的一樣，本法測定的AFP-LCA-V的百分率和絕對值、以及AFP-LCA-V和AFP-ConA-V(L/C)的比值都能很好地用于從慢性肝病中鑒別肝癌，即這兩種疾病中都有顯著差異(P＜0.001))。我們發(fā)現(xiàn)，正常孕婦的AFP異質(zhì)體百分含量和L/C比值都與肝癌患者相近，但絕對濃度較低。
權(quán)利要求
1.一種甲胎蛋白異質(zhì)體的親和吸附測定方法，其特征是，主要包括如下步驟來實現(xiàn)1)、對親和吸附劑進(jìn)行預(yù)處理取一定量的親和吸附劑，加入一定量的緩沖液，混勻、離心棄上清后待用；2)、親和吸附處理標(biāo)本經(jīng)稀釋后，加入經(jīng)過預(yù)處理的親和吸附劑，在振蕩器上振搖；3)、游離AFP測定吸附后的標(biāo)本經(jīng)離心處理后，再到化學(xué)發(fā)光分析儀上測定上清液中的AFP；4)、總AFP測定標(biāo)本經(jīng)稀釋后，直接到到化學(xué)發(fā)光分析儀上測定上清液中的AFP；5)、計算出每一標(biāo)本AFP的結(jié)合率，為總AFP減去吸附后的游離AFP，再除以總AFP，即可獲得各個AFP糖鏈異質(zhì)體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲胎蛋白異質(zhì)體的親和吸附測定方法，其特征在于所述的對親和吸附劑進(jìn)行預(yù)處理，取100μl的親和吸附劑，加入0.5ml緩沖液1，混勻1min，離心棄上清后，加入1ml緩沖液2混勻10min，離心棄上清后，加入100μl緩沖液2待用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲胎蛋白異質(zhì)體的親和吸附測定方法，其特征在于所述的親和吸附為，標(biāo)本用緩沖液2稀釋至AFP大約50μg/L，吸取100μl加入經(jīng)預(yù)處理的親和吸附劑，在振蕩器上振搖(200r/min)20min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲胎蛋白異質(zhì)體的親和吸附測定方法，其特征在于所述的游離AFP測定為，吸附后的標(biāo)本經(jīng)2000r/min離心5min，再到ACS180化學(xué)發(fā)光分析儀上測定上清液中的AFP。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲胎蛋白異質(zhì)體的親和吸附測定方法，其特征在于所述的總AFP測定，用緩沖液2稀釋至AFP大約50μg/L的標(biāo)本中取100μl，加入緩沖液2后到ACS180化學(xué)發(fā)光分析儀上測定上清液中的AFP。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4或5所述的甲胎蛋白異質(zhì)體的親和吸附測定方法，其特征在于所述的緩沖液1為0.05mol/L Tris-HCl(含0.5mol/LNaCl)pH7.6。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4或5所述的甲胎蛋白異質(zhì)體的親和吸附測定方法，其特征在于所述的緩沖液20.01mol/L Tris-HCl(含0.5mol/L NaCl)，pH7.6，再加入1mmol/L MgCl2，1mmol/L CaCl2，1mmol/L MnCl2。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4或5所述的甲胎蛋白異質(zhì)體的親和吸附測定方法，其特征在于所述親和劑為，扁豆凝集素(LCA)Sepharose 4B(Lentil LectinSepharose 4B)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4或5所述的甲胎蛋白異質(zhì)體的親和吸附測定方法，其特征在于所述親和劑為，刀豆凝集素A(ConA)Sepharose4B(Concanavalin A-Sepharose 4B)。
全文摘要
本發(fā)明是涉及一種甲胎蛋白異質(zhì)體的親和吸附測定方法，主要包括如下步驟來實現(xiàn)1)、對親和吸附劑進(jìn)行預(yù)處理取一定量的親和吸附劑，加入一定量的緩沖液，混勻、離心棄上清后待用；2)、親和吸附處理標(biāo)本經(jīng)稀釋后，加入經(jīng)過預(yù)處理的親和吸附劑，在振蕩器上振搖；3)、游離AFP測定吸附后的標(biāo)本經(jīng)離心處理后，再到化學(xué)發(fā)光分析儀上測定上清液中的AFP；4)、總AFP測定標(biāo)本經(jīng)稀釋后，直接到化學(xué)發(fā)光分析儀上測定上清液中的AFP；5)、計算出每一標(biāo)本AFP的結(jié)合率，即可獲得各個AFP糖鏈異質(zhì)體。本發(fā)明有益的效果是親和吸附法測定AFP異質(zhì)體是一種適合臨床診斷的方法，能在較短的時間內(nèi)獲得與現(xiàn)有方法相同或更好的結(jié)果，且有方法簡便、結(jié)果可靠和測定成本低等優(yōu)點。
文檔編號G01N30/00GK1430056SQ0215827
公開日2003年7月16日 申請日期2002年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月20日
發(fā)明者汪子偉 申請人:杭州市第一人民醫(yī)院