專利名稱：檢測肝癌甲胎蛋白異質(zhì)體的預(yù)裝離心柱及含有該離心柱的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及了一種檢測肝癌甲胎蛋白異質(zhì)體的預(yù)裝離心柱，還涉及了一種含有該預(yù)裝離心柱的化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒和一種含有該預(yù)裝離心柱的酶聯(lián)免疫定量檢測試劑盒及這些試劑盒的制備方法，屬醫(yī)療產(chǎn)品技術(shù)領(lǐng)域，用于對肝癌的發(fā)生進行早期診斷。
背景技術(shù)：
肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是世界范圍內(nèi)第四位常見的惡性腫瘤，每年大約有250 000名患者死于肝細胞癌，肝細胞癌的發(fā)病機制至今仍未清楚，其在臨床上惡性度較高，死亡率在消化道惡性腫瘤中排第三位，所以早期發(fā)現(xiàn)、早期治療是提高患者生存率的關(guān)鍵，而大多數(shù)患者就診時已屆中晚期，失去了最佳治療時機，危險因素包括由乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒導(dǎo)致的慢性肝炎和肝硬化。要得到有效治療，篩查和普查的臨床效率依賴于早期診斷。HCC是腫瘤病因?qū)W中的重要類型，肝硬化、病毒性肝炎、化學(xué)致癌物及環(huán)境因素等所造成的慢性肝臟損害都可誘發(fā)HCC。HCC惡性度高，容易復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移，預(yù)后差，而且早期診斷較困難，易于延誤最佳治療期。
甲胎蛋白(alphafetoprotein，AFP)是一種糖蛋白，檢測血液中的AFP含量是目前診斷肝癌最常見的手段。AFP在哺乳動物胚胎期由肝臟實質(zhì)細胞和卵黃囊細胞合成，來源于內(nèi)胚層的胃腸道粘膜細胞也可少量合成。正常情況下，AFP主要存在于胎兒循環(huán)中，隨著胎兒發(fā)育成熟，AFP合成逐漸減少。出生時臍血中AFP濃度可達10～100mg/L，出生后一年降至正常成人水平。如果新生兒AFP明顯升高提示新生兒肝炎、先天性膽道閉鎖或有能分泌AFP的胚胎性惡性腫瘤。AFP作為早期肝癌診斷指標的缺點是在肝病和肝硬化疾病中也有相當?shù)谋壤嬖陉栃越Y(jié)果，AFP輕度增高(20～200ng/ml)見于相當數(shù)量的慢性肝病患者，在肝硬化患者中11.7-44％AFP陽性。因此在分辨良性肝病和惡性肝腫瘤時，AFP作為早期肝癌篩查指標的價值大為降低。
凝集素是一類廣泛存在于自然界的一大類非免疫來源的蛋白質(zhì)或糖蛋白，它能與糖專一性地、非共價地可逆結(jié)合，并且有凝集血細胞的作用，故稱為凝集素。
Sumner和Howell于1936年首先從刀豆(jackbean，Canavalia ensiformis)種子純化了伴刀豆凝集素-ConA(Con-A)。ConA能凝集溶液中的糖元和淀粉，ConA的血凝作用可被蔗糖抑制，因而推測ConA的血凝作用是與細胞表面糖作用的結(jié)果。
目前已有近千種植物被測得具有凝集素活性。植物中，不只種子中存在凝集素，根、莖、葉、皮、果實汁中也發(fā)現(xiàn)有凝集素。除植物外，其它生物，如各種真菌、某些病毒、無脊椎動物、脊椎動物及至人體的各種組織和器官中都存在凝集素。
凝集素可與糖專一性地結(jié)合。目前按結(jié)合糖的類型，凝集素可分為六類D-甘露糖或D-葡萄糖；N-乙酰氨基葡萄糖；N-乙酰氨基半乳糖；D-半乳糖；L-巖藻糖；麥胚凝集素(WGA)可專一結(jié)合唾液酸。
鑒定得最清楚的植物凝集素家族是豆科，包括刀豆蛋白凝集素ConA、小扁豆凝集素LCA等。
小扁豆學(xué)名兵豆，從小扁豆中提取的凝集素LCA(Lens culinaris lectin)，可以特異結(jié)合巖藻糖基化聚糖。
隨著生物化學(xué)及其相關(guān)分析技術(shù)的進展與應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)AFP分子與外源性凝集素的親和力不同，即存在不均一性的糖鏈異質(zhì)性。應(yīng)用不同的凝集素親和電泳可以把它們分成若干個組分，也可以用等電聚焦技術(shù)來分離AFP組分。AFP通過LCA親和電泳可以分為三個部AFP-L1(LCA非結(jié)合型)、AFP-L2(LCA弱結(jié)合型)、AFP-L3(LCA強結(jié)合型)。AFP-L1，來自良性肝病，是AFP的主要組分；AFP-L2來自孕婦；AFP-L3為HCC細胞所特有。因此由肝癌細胞合成、分泌的含巖藻糖苷化糖鏈的AFP異質(zhì)體稱為肝癌特異性AFP(AFP-L3)。
早在1970年，就有學(xué)者發(fā)現(xiàn)肝細胞癌患者血清AFP淀粉凝膠電泳時常出現(xiàn)不同的遷移率，而新生兒、胎兒的AFP電泳遷移率相同。當時認為系A(chǔ)FP所含的唾液酸含量不同所致，并提出AFP異質(zhì)體(AFP Variants AFP-V)的概念。隨后的研究表明，AFP的糖鏈結(jié)構(gòu)存在不同程度的變異，而所謂的異質(zhì)性主要是因為AFP所含碳水化合物不同所致。AFP異質(zhì)體形成的確切機制還不十分清楚，其過程可能是這樣的增生的肝細胞及肝癌細胞于G1期和S期合成AFP，并將其分布于核周、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔及高爾基分泌小囊中，位于粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及高爾基體中的AFP在糖基化轉(zhuǎn)移酶參與下受到不同的糖基化修飾后分泌到循環(huán)中。由于糖基化的不同，導(dǎo)致了AFP異質(zhì)性的差異。另一可能的原因是糖基化轉(zhuǎn)移酶異常造成糖基化后AFP構(gòu)象的改變。AFP的糖鏈結(jié)構(gòu)能與多種凝集素相作用，與不同凝集素結(jié)合的AFP分子結(jié)構(gòu)蛋白部分基本相同，但糖鏈部分有所差異。不同的糖鏈決定其與凝集素的親和力。根據(jù)親和性的不同，可將AFP異質(zhì)體分為不同類型，如扁豆凝集素(LCA)親和型、豌豆凝集素不親和型，刀豆凝集素(ConA)親和型和ConA不親和型。另有一種分類方法是將電泳獲得的區(qū)帶從陽極開始以1、2、3編號，結(jié)合凝集素進行命名。如使用LCA則命名為AFP-L1(LCA非結(jié)合型)、AFP-L2(LCA弱結(jié)合型)、AFP-L3(LCA強結(jié)合型)；國內(nèi)外研究已經(jīng)證明AFP-L3是由肝癌細胞特異產(chǎn)生的。
AFP異質(zhì)體許多糖鏈的結(jié)構(gòu)尚未完全明了。與LCA相結(jié)合的基礎(chǔ)是AFP糖鏈巖藻糖基化(LCA與巖藻糖有較強的親和力)，由于胚胎期AFP幾乎無巖藻糖成分，因而可以認為這種分子糖鏈的異常是糖基化異常的反映。AFP-L3與LCA的結(jié)合位點是門冬酰胺連接的巖藻糖化的N-乙酰葡萄糖胺。含巖藻糖苷化糖鏈的AFP異質(zhì)體是肝細胞特異分泌的，稱為肝癌特異性AFP(AFP-L3)。
目前認為，通常所說的AFP異質(zhì)體實際是指與LCA結(jié)合的AFP-L3，1999年第四屆全國肝癌學(xué)術(shù)會議將其列為原發(fā)性肝癌臨床診斷標準的肝癌標記物之一。被公認為是比單純的AFP甲胎蛋白更為特異的原發(fā)性肝癌指標。
AFP異質(zhì)體檢測的臨床意義1)鑒別肝癌與良性肝病。原發(fā)性肝癌患者AFP常升高，但許多良性肝臟疾病也可有AFP升高，單憑AFP結(jié)果有時很難區(qū)分良、惡性病變。此時AFP異質(zhì)體檢測就具有良好的臨床意義，尤其對于AFP在30～400ng/ml之間者具有較好的價值。Yozhiaki對361例肝硬化進行了前瞻性研究，在53例AFP在30ug/L以上的患者中，2年以后21例發(fā)展為肝癌，確診肝癌時39％的患者AFP在400ug/L以下。對比研究開始時肝細胞肝癌(HCC)組與非HCC組AFP測定值，未發(fā)現(xiàn)差異有顯著性，研究發(fā)現(xiàn)病變時AFP異質(zhì)體的類型有所不同，對HCC診斷LCA陽性率87.12％假陽性率21.5％，ConA陽性率89.17％，假陽性率17.15％。目前的研究結(jié)果把AFP-L3含量大于15％作為肝癌的陽性指標。
2)肝癌術(shù)后的監(jiān)測。肝癌切除術(shù)后，血清AFP含量隨之下降，其下降速度取決于體內(nèi)殘留AFP量及半衰期，一般2月內(nèi)轉(zhuǎn)陰，轉(zhuǎn)陰時AFP異質(zhì)體隨之消失。如果AFP明顯下降但不轉(zhuǎn)陰，異質(zhì)體變化不明顯，則提示手術(shù)不徹底，可能還存在邊緣殘留、血管癌栓、衛(wèi)星結(jié)節(jié)或轉(zhuǎn)移等。如果異質(zhì)體下降至25％以下，AFP和異質(zhì)體濃度相對恒定，則可能是患者有肝炎或肝硬化所致。
3)胚胎異常發(fā)育及胎兒先天性疾患。正常妊娠期母體血清中AFP與胚胎中AFP處于平衡狀態(tài)，一旦胎兒畸形或胎盤屏障發(fā)生異常，可導(dǎo)致胎兒血清滲入羊水中或羊水滲入母體血清，造成母體羊水或血清AFP急劇升高。但僅僅測定AFP總量有一定的局限性。實驗表明神經(jīng)管缺損、無腦兒或脊柱裂等。兒童肝母細胞瘤、膽道閉鎖、性腺腫瘤、惡性畸胎瘤等可有AFP和/或AFP異質(zhì)體的陽性。
AFP-L3是唯一由患者肝臟中癌細胞生成的蛋白。在加拿大和美國的一項多中心、前瞻性、雙盲、長期臨床試驗中，對該檢測方法進行了研究。結(jié)果顯示AFP-L3％升高(15％以上)的患者，在接下來的21個月中，發(fā)生肝細胞癌的危險增加7倍之多。根據(jù)已有的肝細胞癌腫瘤學(xué)實踐指南，這些患者肝細胞癌發(fā)生率極端增高。
目前用于AFP異質(zhì)體的檢測方法有植物凝集素親和層析法、聚丙烯酰胺凝膠電泳法、親和印跡法、親和交叉免疫電泳法。親和印跡法國外應(yīng)用較多，國內(nèi)則多采用親和交叉免疫電泳技術(shù)，依染色法的不同，可分為考馬斯亮蘭法電泳后的標本直接用考馬斯亮蘭染色，洗脫后觀察峰帶。方法簡單，但干擾因素多，靈敏度約1000ug/L。
酶標法用過氧化物酶標記的抗體與電泳后的標本一起溫育、漂洗后用二氨基聯(lián)苯胺顯色，檢測靈敏度可提高至50ug/L。
金銀染色法將電泳后的標本直接與金黃色葡萄球菌蛋白A2膠金溫育，再用銀顯色液顯色，得到的峰帶清晰，靈敏度可達32ug/L。
放射自顯影法是我國迄今為止最常用的檢測方法，靈敏度達31ug/L。其原理是將標本在含凝集素的凝膠中進行分離電泳，后在添加含125IAFP、抗AFP抗體的凝膠中進行二次電泳，電泳結(jié)束后將凝膠烘干，覆蓋X線膠片爆光，沖洗成像。整個實驗過程操作復(fù)雜，長期以來，國內(nèi)只有少數(shù)臨床實驗室能夠測定AFP異質(zhì)體，少數(shù)城市能滿足臨床測定AFP異質(zhì)體的要求，并且沒有國產(chǎn)試劑供應(yīng)。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種檢測肝癌甲胎蛋白異質(zhì)體的預(yù)裝離心柱及含有該預(yù)裝柱的診斷試劑盒。通過該試劑盒可以真實地檢測出血清中甲胎蛋白異質(zhì)體的含量水平，準確地診斷出早期原發(fā)性肝癌，具有極高的靈敏度，方法快速簡便。
一種檢測肝癌甲胎蛋白異質(zhì)體的預(yù)裝離心柱，該預(yù)裝離心柱由上部分離管和下部收集管組成，所述上部分離管裝有偶聯(lián)凝集素的親合介質(zhì)，所述下部收集管中裝有緩沖溶液，所述分離管底部有一濾布，使得瓊脂糖顆粒無法穿過的濾布。
所述凝集素包括小扁豆凝集素LCA和刀豆凝集素Con-A。
所述親合介質(zhì)可采用瓊脂糖凝膠sephrose 4B、瓊脂糖凝膠sephrose 6B或瓊脂糖凝膠sephrose FF，所述緩沖溶液為凝集素的活性保護液。
所述瓊脂糖凝膠為sephrose 4B，緩沖液為凝集素的活性保護液，含1mmol/L的CaCl2、1mmol/L的MnCl2和50mmol/L的Tris-HCL，PH 7.5。
所述濾布是能阻擋偶聯(lián)有凝集素的親合介質(zhì)穿過而不阻擋液體和蛋白質(zhì)穿過的濾布。
所述裝有偶聯(lián)扁豆凝集素的瓊脂糖凝膠由以下步驟得到的采用Pharmacia公司經(jīng)CNBr活化的Sepharose 4B和Sigma公司的LCA。
(1)將1.5g Sepharose 4B浸泡于1mmol/L HCl至膨脹，移入砂蕊漏斗，以300mL 1mmol/L HCl洗滌約30min；(2)稱取2mgLCA，溶于7.5mL偶聯(lián)緩沖液(0.1mmol/L NaHCO3，0.5mol/L NaCl，pH 8.3)，與經(jīng)洗滌的Sepharose 4B合并，以帶塞的10mL試管上下顛倒混勻(室溫，2h)；(3)以10mL偶聯(lián)緩沖液洗去未偶聯(lián)的LCA，測定洗滌液中的LCAI含量，計得偶聯(lián)率為98％；(4)用0.2mol/L甘氨酸封閉剩余活化基因；(5)依次用10mL 0.1mol/L醋酸緩沖液(pH 4，含0.5mol/L NaCl)和0.1mol/L Tris緩沖液(pH 8，含0.5mol/L NaCl)洗滌3次，再以含0.1％BSA、1mmol/L CaCl2和0.1mmol/L MnCl2的PBS(PBS-BSA)洗滌1次，4℃暫存?zhèn)溆谩?br> 本發(fā)明提供了一種含有上述預(yù)裝離心柱的化學(xué)發(fā)光試劑盒及其制作方法。
該化學(xué)發(fā)光試劑盒包括了檢測肝癌甲胎蛋白異質(zhì)體的預(yù)裝離心柱；包被了甲胎蛋白單克隆抗體的化學(xué)發(fā)光酶標板；陽性對照物、陰性對照物；酶標記的抗甲胎蛋白單克隆抗體；底物溶液A、顯色液B、清洗緩沖液、標準品。
本試劑盒的制作方法如下(1)包被將普通高滴度的甲胎蛋白單克隆抗體(市售)用0.05M檸檬酸緩沖液稀釋后加入酶標板各孔，每孔100μl，吸附過夜，用吐溫磷酸鹽緩沖液洗板，再用含牛血清白蛋白的吐溫磷酸鹽緩沖液封閉過夜，甩干后晾干，即獲得單克隆抗體包被酶標板?；瘜W(xué)發(fā)光酶標板可選用國產(chǎn)板或進口板；規(guī)格可以是96孔平板或12×8、12×4可拆條板；(2)陽性、陰性對照物陽性對照物收集肝癌病人腹水，過濾除菌、分裝；陰性對照物收集正常人血清，過濾除菌、分裝；(3)酶標記單抗本試劑盒中的酶標單克隆抗體是用辣根過氧化物酶(HRP)標記單克隆抗體而制備的，步驟如下a)以NaIO4-乙二醇法進行HRP的氧化，達到終濃度10mg/m；b)單克隆抗體和HRP在堿性碳酸鹽緩沖液中透析6小時，實現(xiàn)HRP對單克隆抗體的標記，反應(yīng)結(jié)束后用NaBH4溶液終止反應(yīng)，再對PBS透析過夜；c)用飽和硫酸銨沉淀，獲得純化的HRP酶標抗AFP-L3單克隆抗體；(4)輔助試劑的配制方法如下a)底物溶液A1.0ml EDTA(1.0×10-2M)1.0ml H2O2(7.5×10-3M)、0.4ml HCl(1.0×10-2M)、0.2ml Tween20(1％)；
b)顯色液Bluminol 5.0×10-4Mol/L；c)清洗緩沖液(20倍濃縮液，20×)PBS(pH7.4)配制的0.05％吐溫20溶液；(5)將預(yù)裝離心柱、包被了甲胎蛋白單克隆抗體的化學(xué)發(fā)光酶標板、陽性對照物、陰性對照物、酶標記的抗甲胎蛋白單克隆抗體、底物溶液A、顯色液B、清洗緩沖液、標準品共同包裝，得到試劑盒。
本發(fā)明還提供了一種含有上述預(yù)裝離心柱的酶聯(lián)免疫定量檢測試劑盒及其制作。
該試劑盒包括了檢測肝癌甲胎蛋白異質(zhì)體的預(yù)裝離心柱；包被了甲胎蛋白單克隆抗體的酶標板；陽性對照物、陰性對照物；酶標記的抗甲胎蛋白單克隆抗體；底物溶液A、顯色液B、反應(yīng)終止液、清洗緩沖液、標準品。
本試劑盒的制作方法如下(1)包被將普通高滴度的甲胎蛋白單克隆抗體(市售)用0.05M碳酸緩沖液稀釋后加入酶標板各孔，每孔100μl，吸附過夜，用吐溫磷酸鹽緩沖液洗板，再用含牛血清白蛋白的吐溫磷酸鹽緩沖液封閉過夜，甩干后晾干，即獲得單克隆抗體包被酶標板。酶標板是聚苯乙烯酶標板，可選用國產(chǎn)板或進口板；規(guī)格可以是96孔平板或12×8、12×4可拆條板；(2)陽性、陰性對照物陽性對照物收集肝癌病人腹水，過濾除菌、分裝；陰性對照物收集正常人血清，過濾除菌、分裝；(3)酶標記單抗本試劑盒中的酶標單克隆抗體是用辣根過氧化物酶(HRP)標記單克隆抗體而制備的，步驟如下a)以NaIO4-乙二醇法進行HRP的氧化，達到終濃度10mg/ml；b)單克隆抗體和HRP在堿性碳酸鹽緩沖液中透析6小時，實現(xiàn)HRP對單克隆抗體的標記，反應(yīng)結(jié)束后用NaBH4溶液終止反應(yīng)，再對PBS透析過夜；
c)用飽和硫酸銨沉淀，獲得純化的HRP酶標抗AFP-L3單克隆抗體；(4)輔助試劑的配制方法如下a)底物溶液A磷酸-檸檬酸緩沖液(pH5.0)配制的3％過氧化氫溶液；b)顯色液B四甲基聯(lián)苯胺(TMB)甲醇溶液，濃度為0.1mg/ml；c)清洗緩沖液(20倍濃縮液，20×)PBS(pH7.4)配制的0.05％吐溫20溶液；d)反應(yīng)終止液2mol/L硫酸；(5)將預(yù)裝離心柱、包被了甲胎蛋白單克隆抗體的酶標板、陽性對照物、陰性對照物、酶標記的抗甲胎蛋白單克隆抗體、底物溶液A、顯色液B、清洗緩沖液、反應(yīng)終止液、標準品共同包裝，得到試劑盒。
本發(fā)明克服了以往檢測方法操作步驟煩瑣、耗時長、需要配套設(shè)備多等缺點，操作者只需要離心和溫育等簡單操作，在2小時內(nèi)就可以完成檢測，直接定量計算出血樣標本中所含的甲胎蛋白和甲胎蛋白異質(zhì)體的含量，方法簡便，檢測快捷，結(jié)果準確，為肝癌的預(yù)防、診斷、治療提供了支持。


附圖為本發(fā)明預(yù)裝離心柱的剖面結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實施例方式
下面用實施例進一步說明本發(fā)明。應(yīng)該理解的是，本發(fā)明的實施例是用于說明本發(fā)明而不是對本發(fā)明的限制。根據(jù)本發(fā)明的實質(zhì)對本發(fā)明進行的具體改進都屬于本發(fā)明要求保護的范圍。
參見附圖，本發(fā)明提供的一種檢測肝癌甲胎蛋白異質(zhì)體的預(yù)裝離心柱，由位于上部的分離管1和位于下部的收集管3組成，通?？梢圆捎脤⒎蛛x管插接到收集管上的方式實現(xiàn)兩者的連接，所述上部分離管裝有偶聯(lián)凝集素的親合介質(zhì)4(為圖面清晰起見，圖中標注的是用于裝親合介質(zhì)的管內(nèi)空間，沒有繪出介質(zhì)實物)，所述下部收集管中裝有緩沖溶液(為圖面清晰起見，圖中標注的是用于裝緩沖溶液的管內(nèi)空間，沒有繪出溶液實物)，所述分離管底部主要是一濾布，該濾布采用能阻擋偶聯(lián)有凝集素的親合介質(zhì)穿過而不阻擋液體和蛋白質(zhì)穿過的濾布，以便在離心分離時，分離出來的液體和蛋白質(zhì)能夠透過該濾布進入下面的收集管?？梢允褂矛F(xiàn)有的這種濾布，并通過在分離管底部設(shè)置一個夾持塑料墊圈，將濾布固定住。。
實施例1檢測肝癌甲胎蛋白異質(zhì)體的酶聯(lián)免疫定量檢測試劑盒的制作該試劑盒(96人份)組成包括AFP-L3陰性、陽性對照物各1瓶；AFP單克隆抗體包被板(96孔)1塊；辣根過氧化物酶(HRP)標記的AFP單克隆抗體1瓶，6ml/瓶；AFP標準品1瓶；底物溶液A、顯色液B各1瓶，5ml/瓶；反應(yīng)終止液1瓶，5ml/瓶；清洗緩沖液(20×濃縮)1瓶，30ml/瓶。
具體操作如下1.制備AFP-陰性、陽性對照物1)收集血清從醫(yī)院或血站獲得健康正常人血清、肝癌病人腹水，于-70℃保存?zhèn)溆茫?)分裝AFP-L3陽性對照物肝癌陽性病人腹水，在無菌條件下分裝入1.5mleppendorf管中，每管0.5ml。貯存于4℃；陰性對照物正常人血清，經(jīng)檢定為AFP陰性。取多份以上血清合并成批，經(jīng)60℃1小時處理后，過濾除菌。在無菌的條件下分裝入1.5ml eppendorf管中，每管0.5ml。貯存于4℃。
2.制作AFP單克隆抗體包被板
a)包被酶標板采用進口或國產(chǎn)的12×8可拆條板。將AFP單克隆抗體用0.05mol/L碳酸鹽緩沖液稀釋為20μg/ml后加入酶標板各孔，每孔100μl，吸附過夜，用清洗緩沖液洗板，再用該封閉液2％BSA封閉過夜，甩干后晾干，即獲得單克隆抗體包被酶標板。按96孔/塊用鋁箔袋包裝、真空封閉；b)制備辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗AFP單克隆抗體抗AFP單克隆抗體可以商品化購得。
3.單克隆抗體的標記1)酶的氧化(全過程避光)a)稱取HRP 5mg，加ddH2O 250μl溶解；b)稱取NaIO45mg，加ddH2O 250μl溶解，配制成20mg/mL的濃度；c)往HRP溶液中逐滴加入NaIO4溶液，邊加邊攪拌；d)將混合好的溶液置于4℃，靜置30分鐘；e)取5ml乙二醇溶于25μl ddH2O中，逐滴加入上述混合溶液中，邊加邊攪拌；f)室溫靜置30分鐘；g)酶氧化過程完成，HRP終濃度為10mg/ml。
2)單克隆抗體的準備及標記(避光)a)調(diào)整抗體濃度到5mg/ml左右(蛋白濃度過低則用PEG20000濃縮)，用pH9.5左右的50mmol/L CB(1mol/L NaHCO3與1mol/L Na2CO3按10∶1的比例混合，使用前以蒸餾水稀釋20倍)透析去甘油或雜質(zhì)(如Tris)，4℃下透析過夜，其中換液3次；b)將單克隆抗體與HRP按1∶4混合，于50mmol/L pH9.5CB中透析6小時以上，前兩個小時換液一次；
c)用新鮮配置的1mg NaBH4溶液終止反應(yīng)。搖勻，4℃靜置2小時，每半小時搖一次，NaBH4溶液加入的量要合適；d)用pH7.2的10mM PBS(預(yù)配置0.01mol/L的Na2HPO4和NaH2PO4儲備液，根據(jù)需要的pH值混勻二者成PBS緩沖液)透析過夜。換液一次即可。
3)純化HRP酶標抗AFP單克隆抗體a)完成標記的單克隆抗體溶液中逐滴加入飽和硫酸銨溶液，邊加入邊攪拌，直至飽和硫酸銨濃度降低至1/3；b)4℃靜置1小時；c)8000rpm離心10分鐘，將上清移至新管中，沉淀用等體積PBS重新懸?。籨)重復(fù)以上操作，將飽和硫酸銨濃度提高到40％，分別收集上清和沉淀；e)重復(fù)以上操作，將飽和硫酸銨濃度提高到50％，分別收集上清和沉淀；f)重復(fù)以上操作，將飽和硫酸銨濃度提高到60％，分別收集上清和沉淀；g)收集分離的各個組分，SDS-PAGE鑒定純度；h)提純的HRP-單克隆抗體對PBS透析過夜；i)超濾管離心濃縮純化的HRP-單克隆抗體，獲得克分子比接近1∶8的酶標抗單克隆抗體。
4)分裝用含10％胎牛血清的緩沖液稀釋由步驟3)獲得的酶標抗AFP-L3單克隆抗體至合適的工作濃度，按6ml/瓶分裝，貯存于4℃。
4.輔助試劑的配制1)底物溶液A磷酸-檸檬酸緩沖液(PH5.0)配制的3％過氧化氫溶液，按5ml/瓶分裝；2)顯色液BTMB(0.1mg/ml)甲醇溶液，按5ml/瓶分裝；3)反應(yīng)終止液2mol/L H2SO4，按3ml/瓶分裝；
4)清洗緩沖液(20倍濃縮液)PBS(pH7.4)配制的1％吐溫20溶液，按15ml/瓶分裝。
實施例2檢測肝癌甲胎蛋白異質(zhì)體的化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒的制作該試劑盒(48人份)組成包括AFP-L3陰性、陽性對照各1瓶；AFP單克隆抗體包被板(96孔)1塊；辣根過氧化物酶(HRP)標記的AFP單克隆抗體1瓶，6ml/瓶；AFP標準品1瓶底物溶液A、顯色液B各1瓶，5ml/瓶；清洗緩沖液(20X濃縮)1瓶，30ml/瓶。
具體操作如下1.制備AFP-陰性、陽性對照物1)收集血清從醫(yī)院或血站獲得正常人血清、肝癌病人腹水，于-70℃保存?zhèn)溆茫?)分裝AFP-L3陽性對照物肝癌陽性病人腹水，在無菌條件下分裝入1.5mleppendorf管中，每管0.5ml。貯存于4℃；陰性對照血清正常人血清，經(jīng)檢定為AFP陰性。取多份以上血清合并成批，經(jīng)60℃1小時處理后，過濾除菌。在無菌的條件下分裝入1.5ml eppendorf管中，每管0.5ml。貯存于4℃。
2.制作AFP單克隆抗體包被板a)包被化學(xué)發(fā)光酶標板采用進口或國產(chǎn)的12×8可拆條板。將步驟1)AFP單克隆抗體用0.05mol/L檸檬酸緩沖液稀釋為20μg/ml后加入酶標板各孔，每孔100μl，吸附過夜，用清洗緩沖液洗板，再用該封閉液緩沖液封閉過夜，甩干后晾干，即獲得單克隆抗體包被酶標板。按96孔/塊用鋁箔袋包裝、真空封閉；b)制備辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗AFP單克隆抗體抗AFP單克隆抗體可以商品化購得。
3.單克隆抗體的標記1)酶的氧化(全過程避光)a)稱取HRP 5mg，加ddH2O 250μl溶解；b)稱取NaIO45mg，加ddH2O 250μl溶解，配制成20mg/mL的濃度；c)往HRP溶液中逐滴加入NaIO4溶液，邊加邊攪拌；d)將混合好的溶液置于4℃，靜置30分鐘；e)取5ml乙二醇溶于25μl ddH2O中，逐滴加入上述混合溶液中，邊加邊攪拌；f)室溫靜置30分鐘；g)酶氧化過程完成，HRP終濃度為10mg/ml。
2)單克隆抗體的準備及標記(避光)a)調(diào)整抗體濃度到5mg/ml左右(蛋白濃度過低則用PEG20000濃縮)，用pH9.5左右的50mmol/L CB(1mol/L NaHCO3與1mol/L Na2CO3按10∶1的比例混合，使用前以蒸餾水稀釋20倍)透析去甘油或雜質(zhì)(如Tris)，4℃下透析過夜，其中換液3次；b)將單克隆抗體與HRP按1∶4混合，于50mmol/L pH9.5CB中透析6小時以上，前兩個小時換液一次；c)用新鮮配置的1mg NaBH4溶液終止反應(yīng)。搖勻，4℃靜置2小時，每半小時搖一次，NaBH4溶液加入的量要合適；d)用pH7.2的10mM PBS(預(yù)配置0.01mol/L的Na2HPO4和NaH2PO4儲備液，根據(jù)需要的pH值混勻二者成PBS緩沖液)透析過夜。換液一次即可。
3)純化HRP酶標抗AFP-L3單克隆抗體a)完成標記的單克隆抗體溶液中逐滴加入飽和硫酸銨溶液，邊加入邊攪拌，直至飽和硫酸銨濃度降低1/3；b)4℃靜置1小時；c)8000rpm離心10分鐘，將上清移至新管中，沉淀用等體積PBS重新懸??；d)重復(fù)以上操作，將飽和硫酸銨濃度提高到40％，分別收集上清和沉淀；e)重復(fù)以上操作，將飽和硫酸銨濃度提高到50％，分別收集上清和沉淀；f)重復(fù)以上操作，將飽和硫酸銨濃度提高到60％，分別收集上清和沉淀；g)收集分離的各個組分，SDS-PAGE鑒定純度；h)提純的HRP-單克隆抗體對PBS透析過夜；i)超濾管離心濃縮純化的HRP-單克隆抗體，獲得克分子比接近1∶8的酶標抗單克隆抗體。
4)分裝用含10％胎牛血清的緩沖液稀釋由步驟3)獲得的酶標抗AFP單克隆抗體至合適的工作濃度，按6ml/瓶分裝，貯存于4℃。
4.輔助試劑的配制1)底物溶液A1.0ml EDTA(1.0×10-2M、1.0ml H2O2(7.5×10-3M)、0.4ml HCl(1.0×10-2M)和0.2ml Tween20(1％)2)顯色液Bluminol 5.0×10-4Mol/L；3)清洗緩沖液(20倍濃縮液)PBS(pH7.4)配制的1％吐溫20溶液，按15ml/瓶分裝。
實施例3預(yù)裝離心柱的制備和使用1、預(yù)裝離心柱由離心柱和填充介質(zhì)組成，離心柱由上部的離心管和下部的收集管組成，二者套在一起，組成離心柱。
2、離心柱填充材料的制備采用Pharmacia公司經(jīng)CNBr活化的Sepharose4B和Sigma公司的LCA，按以下步驟偶聯(lián)(1)將1.5g Sepharose 4B浸泡于1mmol/L HCl至膨脹，移入砂蕊漏斗，以300mL 1mmol/L HCl洗滌約30min；(2)稱取2mgLCA，溶于7.5mL偶聯(lián)緩沖液(0.1mmol/L NaHCO3，pH8.3，0.5mol/L NaCl)，與經(jīng)洗滌的Sepharose 4B合并，以帶塞的10mL試管上下顛倒混勻(室溫，2h)；(3)以10mL偶聯(lián)緩沖液洗去未偶聯(lián)的LCA。經(jīng)測定洗滌液中的LCA I含量，計得偶聯(lián)率為98％；(4)用0.2mol/L甘氨酸封閉剩余活化基因；(5)依次用10mL 0.1mol/L醋酸緩沖液(pH 4，含0.5mol/L NaCl)和0.1mol/L Tris緩沖液(pH 8，含0.5mol/L NaCl)洗滌3次，再以含0.1％BSA，1mmol/L CaCl2和0.1mmol/L MnCl2的PBS(PBS-BSA)洗滌1次，4℃暫存?zhèn)溆谩?br> 3、在上部分離管中，加入一層濾布，并加一個塑料墊圈固定，該濾布的孔徑小于瓊脂糖，因此瓊脂糖不能經(jīng)過，但是蛋白質(zhì)量和液體可以流過。取1mL已經(jīng)偶聯(lián)的凝集素sephrose 4B加入離心柱上部的離心管中。
4、加入1ml凝集素保存緩沖液，緩沖液經(jīng)過上部離心管后主要保存于下面的收集管中，本發(fā)明預(yù)裝離心柱下部收集管中的緩沖液含1mmol/L的CaCl2、1mmol/L MnCl2和50mmol/L Tris-HCL，PH 7.5本發(fā)明的試劑盒的質(zhì)量檢測方法是1)準確性10份正常陰性質(zhì)控血清(包括特異性對照血清)參考品的檢測結(jié)果，無假陽性出現(xiàn)。5份肝癌AFP陽性質(zhì)控血清的參考品檢測結(jié)果無假陰性出現(xiàn)。
2)精密度隨機抽取20盒不同批次試劑盒，用同一份肝癌陽性質(zhì)控血清按說明書操作步驟進行重復(fù)測定。計算每次測定結(jié)果，求出均值、SD和變異系數(shù)CV。精密度試驗結(jié)果顯示批間CV小于10％。
3)檢測靈敏度根據(jù)AFP標準品稀釋測定結(jié)果，本試劑盒的檢測靈敏度為5ng/ml。
4)特異性取四份待測樣品混合后分為四份混合血清標本，每份1ml。分別加入50ng劑量的組織型纖溶酶原激活劑(tPA)、血纖維蛋白溶酶(Plasmin)、或纖粘連蛋白(FN)后制成干擾試驗血清標本#1、#2、#3，未加任何干擾物的#4混合血清標本作為基礎(chǔ)樣品。按說明書操作步驟進行測定并計算結(jié)果。然后按干擾試驗計算公式計算干擾率。標本#1、#2、#3的干擾誤差均小于5％。采用本發(fā)明提供的檢測肝癌甲胎蛋白異質(zhì)體的化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒進行甲胎蛋白異質(zhì)體AFP-L3含量檢測的方法是本發(fā)明提供的檢測甲胎蛋白異質(zhì)體AFP-L3含量的方法，包括下述步驟(1)預(yù)裝離心柱的準備取下預(yù)裝離心柱下部的收集管，將其中的液體倒掉或吸出。將收集管裝回預(yù)裝柱，4℃進行離心，3000轉(zhuǎn)10分鐘，將收集管中的液體倒掉或吸出；(2)待測血清的制備加入待檢測血清200ul，待該血清完全流入介質(zhì)中，將預(yù)裝離心柱扣上蓋子，放入溫箱溫育1小時。預(yù)裝離心柱離心2000轉(zhuǎn)10分鐘，收集管中的血清待檢測；(3)抗原-抗體反應(yīng)在試劑盒提供的包被板的微孔中分別雙孔加入50ul陽性、陰性對照血清和待測血清樣品，使用記號筆標記成1、2系列。1系列加樣孔中加入未離心處理的標本，2系列加樣孔中加入從預(yù)裝離心柱收集管中收集的血清標本，同時加入酶標單克隆抗體，37℃水浴保溫30分鐘。取出板，甩掉孔中液體。PBST洗板操作4次；
(4)顯色反應(yīng)每孔依次加入底物溶液A，顯色液B各50μl，在10分鐘內(nèi)讀值；(5)制作標準曲線以標準品濃度為橫坐標，標準品測定的RLU值為縱坐標，作出標準曲線；計算標準曲線回歸系數(shù)R2，當R2＞0.95時本次測定有效；(6)測量、計算根據(jù)待測樣品的RLU值從標準曲線計算出待測血清樣品的AFP和AFP-L3濃度；(7)結(jié)果判斷陽性質(zhì)控血清(孔1-孔2)÷孔1≥15％時，本次測定有效；陰性對照血清(孔1-孔2)÷孔1≤15％時，本次測定有效；當上述兩條同時滿足時，可以給出本次測定有效的肯定結(jié)論。
待檢測血清(孔2-孔1)÷孔2≥15％時，說明其中甲胎蛋白異質(zhì)體AFP-L3含量較高，為肝癌陽性。
采用本發(fā)明提供的檢測肝癌甲胎蛋白異質(zhì)體的酶聯(lián)免疫定量檢測試劑盒進行甲胎蛋白異質(zhì)體AFP-L3含量檢測的方法是(1)預(yù)裝離心柱的準備取下預(yù)裝離心柱下部的收集管，將其中的液體倒掉或吸出。將收集管裝回預(yù)裝柱，4℃進行離心，3000轉(zhuǎn)10分鐘，將收集管中的液體倒掉或吸出；(2)待測血清的制備加入待檢測血清200ul，待該血清完全流入介質(zhì)中，將預(yù)裝離心柱扣上蓋子，放入溫箱溫育1小時。預(yù)裝離心柱離心2000轉(zhuǎn)10分鐘，收集管中的血清待檢測；(3)抗原-抗體反應(yīng)在試劑盒提供的包被板的微孔中分別雙孔加入50ul陽性、陰性對照血清和待測血清樣品，使用記號筆標記成1、2系列。1系列加樣孔中加入未離心處理的標本，2系列加樣孔中加入從預(yù)裝離心柱收集管中收集的血清標本，同時加入酶標單克隆抗體，37℃水浴保溫30分鐘。取出板，甩掉孔中液體。PBST洗板操作4次；
(4)顯色反應(yīng)每孔依次加入底物溶液A，顯色液B各50μl，37℃水浴保溫10分鐘。加入終止液50ul，酶標儀讀值；(5)制作標準曲線以標準品濃度為橫坐標，標準品測定的OD值為縱坐標，作出標準曲線；計算標準曲線回歸系數(shù)R2，當R2＞0.95時本次測定有效；(6)測量、計算根據(jù)待測樣品的OD值從標準曲線計算出待測血清樣品的AFP和AFP-L3濃度。
(7)結(jié)果判斷陽性質(zhì)控血清(孔1-孔2)÷孔1≥15％時，本次測定有效；陰性對照血清(孔1-孔2)÷孔1≤15％時，本次測定有效；當上述兩條同時滿足時，可以給出本次測定有效的肯定結(jié)論。
待檢測血清(孔2-孔1)÷孔2≥15％時，說明其中甲胎蛋白異質(zhì)體AFP-L3含量較高，為肝癌陽性。
采用本發(fā)明提供的試劑盒對肝癌病人陽性樣品的檢測結(jié)果為判斷本發(fā)明化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒和酶聯(lián)免疫試劑盒與臨床肝癌檢測結(jié)果的符合率，取本發(fā)明的兩種試劑盒進行了對比檢測實驗。采用北京地壇醫(yī)院病毒研究室提供的標本進行對比檢測50份已知原發(fā)性肝癌陽性標本，83份體檢健康血清，100份肝硬化血清、100份肝炎，肝病標本均為AFP陽性標本。分別用化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒及酶聯(lián)免疫定量檢測試劑盒進行檢測，結(jié)果見表1。
表1.在不同標本中檢出率比較


本實驗結(jié)果表明，本發(fā)明對于原發(fā)性肝癌的符合率高達91％，在肝硬化中的特異性高達93％，在肝炎中的特異度高達94％。
本發(fā)明試劑盒對甲胎蛋白陽性的乙肝慢性大三陽肝炎標本和原發(fā)性肝癌標本的檢測分析從北京301醫(yī)院收集的原發(fā)性肝癌樣本5份，慢性肝炎大三陽標本5份，采用本發(fā)明提供的化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒進行檢測，結(jié)果見表2。
表2采用化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒對甲胎蛋白陽性的乙肝慢性大三陽肝炎標本和原發(fā)性肝癌標本的檢測


兩類標本進行AFP-L3定量檢測，原發(fā)性肝癌5份，大三陽慢性肝炎5份，檢測結(jié)果如表所示。結(jié)果顯示，本發(fā)明AFP-L3定量檢測時，可以清楚分辨出大三陽慢性肝炎和原發(fā)性肝癌之間AFP-L3含量的不同。
權(quán)利要求
1.一種檢測肝癌甲胎蛋白異質(zhì)體的預(yù)裝離心柱，其特征在于其由上部分離管和下部收集管組成，所述上部分離管裝有偶聯(lián)凝集素的親合介質(zhì)，上部分離管底部有一濾布，所述下部收集管中裝有緩沖溶液。
2，如權(quán)利要求1所述的檢測肝癌甲胎蛋白異質(zhì)體的預(yù)裝離心柱，其特征在于所述凝集素為小扁豆凝集素LCA或刀豆凝集素Con-A。
3.如權(quán)利要求1所述的檢測肝癌甲胎蛋白異質(zhì)體的預(yù)裝離心柱，其特征在于所述親合介質(zhì)采用瓊脂糖凝膠sephrose 4B、瓊脂糖凝膠sephrose 6B、或瓊脂糖凝膠sephrose FF，所述緩沖溶液為凝集素的活性保護液。
4.如權(quán)利要求1所述的檢測肝癌甲胎蛋白異質(zhì)體的預(yù)裝離心柱，其特征在于所述濾布是能阻擋偶聯(lián)有凝集素的親合介質(zhì)穿過而不阻擋液體和蛋白質(zhì)穿過的濾布。
5.如權(quán)利要求3所述的檢測肝癌甲胎蛋白異質(zhì)體的預(yù)裝離心柱，其特征在于所述裝有偶聯(lián)扁豆凝集素的瓊脂糖凝膠通過以下步驟獲得(1)將Sepharose 4B用1mmol/L HCl浸泡、洗滌；(2)稱取LCA，溶于偶聯(lián)緩沖液中，與經(jīng)洗滌的Sepharose4B合并混勻；(3)用偶聯(lián)緩沖液洗去未偶聯(lián)的LCA，測定洗滌液中的LCA含量，計得偶聯(lián)率為98％；(4)用甘氨酸封閉剩余活化基因，洗滌，4℃暫存?zhèn)溆谩?br> 6.如權(quán)利要求1所述的檢測肝癌甲胎蛋白異質(zhì)體的預(yù)裝離心柱，其特征在于下部收集管中的緩沖液含1mmol/L的CaCl2、1mmol/L的MnCl2和50mmol/L的Tris-HCL，PH7.5。
7.一種檢測肝癌甲胎蛋白異質(zhì)體的化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒，包括下列組件(1)檢測肝癌甲胎蛋白異質(zhì)體的預(yù)裝離心柱；(2)包被了甲胎蛋白單克隆抗體的化學(xué)發(fā)光酶標板；(3)陽性對照物、陰性對照物；(4)酶標記的抗甲胎蛋白單克隆抗體；(5)底物溶液A、顯色液B、清洗緩沖液、標準品，所述檢測肝癌甲胎蛋白異質(zhì)體的預(yù)裝離心柱由上部分離管和下部收集管組成，所述上部分離管裝有偶聯(lián)凝集素的親合介質(zhì)，所述下部收集管中裝有緩沖溶液。
8.如權(quán)利要求7所述的試劑盒，其制作方法包括以下步驟(1)高滴度的甲胎蛋白單克隆抗體包被到酶標板吸附過夜；(2)用吐溫磷酸鹽緩沖液洗板，再用含牛血清白蛋白的吐溫磷酸鹽緩沖液封閉過夜，甩干后晾干；(3)收集肝癌病人腹水，過濾除菌、分裝，即獲得陽性對照物。收集正常人血清，過濾除菌、分裝，即獲得陰性對照物；(4)獲得酶標記的抗甲胎蛋白單克隆抗體；(5)將預(yù)裝離心柱、包被了甲胎蛋白單克隆抗體的化學(xué)發(fā)光酶標板、陽性對照物、陰性對照物、酶標記的抗甲胎蛋白單克隆抗體、底物溶液A、顯色液B、清洗緩沖液、標準品共同包裝，得到試劑盒。
9.一種檢測肝癌甲胎蛋白異質(zhì)體的酶聯(lián)免疫定量檢測試劑盒，包括下列組件(1)檢測肝癌甲胎蛋白異質(zhì)體的預(yù)裝離心柱；(2)包被了甲胎蛋白單克隆抗體的酶標板；(3)陽性對照物、陰性對照物；(4)酶標記的抗甲胎蛋白單克隆抗體；(5)底物溶液A、顯色液B、清洗緩沖液、反應(yīng)終止液、標準品，所述檢測肝癌甲胎蛋白異質(zhì)體的預(yù)裝離心柱由上部分離管和下部收集管組成，所述上部分離管裝有偶聯(lián)凝集素的親合介質(zhì)，所述下部收集管中裝有緩沖溶液。
10.如權(quán)利要求9所述的試劑盒，其制作方法包括以下步驟(1)高滴度的甲胎蛋白單克隆抗體(市售)包被到酶標板吸附過夜；(2)用吐溫磷酸鹽緩沖液洗板，再用含牛血清白蛋白的吐溫磷酸鹽緩沖液封閉過夜，甩干后晾干；(3)收集肝癌病人腹水，過濾除菌、分裝，即獲得陽性對照物。收集正常人血清，過濾除菌、分裝，即獲得陰性對照物。(4)獲得酶標記的抗甲胎蛋白單克隆抗體；(5)將預(yù)裝離心柱、包被了甲胎蛋白單克隆抗體的酶標板、陽性對照物、陰性對照物、酶標記的抗甲胎蛋白單克隆抗體、底物溶液A、顯色液B、清洗緩沖液、反應(yīng)終止液、標準品共同包裝，得到試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明涉及了一種檢測肝癌甲胎蛋白異質(zhì)體的預(yù)裝離心柱。該離心柱由上部分離管和下部收集管組成。上部分離管裝有偶聯(lián)小扁豆凝集素(LCA)的親合介質(zhì)，上部分離管底部是一個濾布，下部收集管中裝有緩沖溶液。小扁豆凝集素(LCA)能與甲胎蛋白異質(zhì)體糖鏈相結(jié)合。本發(fā)明還涉及了一種含有該預(yù)裝離心柱的化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒和一種含有該預(yù)裝離心柱的酶聯(lián)免疫定量檢測試劑盒及其制備、使用方法。應(yīng)用該試劑盒可快速、簡便的測定肝癌甲胎蛋白異質(zhì)體的含量，準確的對肝癌進行早期診斷，為肝癌的預(yù)防、診斷、治療提供支持。
文檔編號G01N33/543GK1920520SQ20061011296
公開日2007年2月28日 申請日期2006年9月13日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月13日
發(fā)明者林長青 申請人:北京熱景生物技術(shù)有限公司