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背景技術(shù)：
：：雖然手術(shù)方法和化學療法不斷進步，卵巢癌的5年存活在近40年來改變很小。通過腫瘤浸潤t細胞引起針對卵巢癌進展的免疫壓力。盡管卵巢癌具有災難性的病程，t細胞能自發(fā)地發(fā)揮針對惡性腫瘤進展的臨床相關(guān)壓力，達到t細胞浸潤的模式和強度能預測患者結(jié)局的程度。因此，卵巢癌是免疫原性的并且是設計新的免疫療法的理想靶點。在過去的幾年里，免疫療法已作為癌癥治療中有前景的工具出現(xiàn)。例如，嵌合抗原受體(car)療法已在化學療法抵抗的血液學惡性腫瘤的治療中表現(xiàn)出極好的結(jié)果。但是，由于缺乏健康組織不存在的、腫瘤細胞表面上表達的特異性抗原，目前該技術(shù)針對包括卵巢癌在內(nèi)的大部分實體腫瘤的成功受到了阻止。尋找正常組織不存在且引發(fā)無法忍受的副作用的腫瘤細胞中特異性抗原存在相當大的難度。另外，實體瘤的腫瘤微環(huán)境的免疫抑制效應嚴重破壞抗腫瘤t細胞應答。技術(shù)實現(xiàn)要素：本文所述的組合物和方法提供有效和有用的治療癌癥的工具和方法，所述癌癥包括特征為細胞表達內(nèi)分泌受體卵泡刺激素(fshr)的實體瘤。一方面，核酸構(gòu)建體包含編碼包含配體的嵌合蛋白的核酸序列，所述配體包含卵泡刺激素(fsh)序列，所述配體結(jié)合人fshr，所述核酸序列連接于提供t細胞活化功能的序列。一方面，提供t細胞活化功能的序列為(a)編碼胞外鉸鏈結(jié)構(gòu)域、間隔子元件、跨膜結(jié)構(gòu)域、共刺激信號轉(zhuǎn)導區(qū)和信號轉(zhuǎn)導胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的核酸序列；或(b)編碼任選的間隔子和結(jié)合nkg2d的配體的核酸序列。在一個實施方案中，配體為天然存在的fsh、fsh的單個亞基、fshβ、fsh或fshβ片段或任何前述序列的經(jīng)修飾的形式。另一方面，嵌合蛋白包含配體，所述配體包含fsh序列，所述配體結(jié)合人fshr，所述配體連接于(a)胞外鉸鏈結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、共刺激信號轉(zhuǎn)導區(qū)和信號轉(zhuǎn)導胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域；或(b)任選的間隔子和結(jié)合nkg2d的配體。在一個實施方案中，配體為天然存在的fsh、fsh的單個亞基、fshβ、fsh或fshβ片段或任何前述序列的經(jīng)修飾的形式。另一方面，在藥學可接受載體中，經(jīng)修飾的人t細胞包含核酸序列，所述核酸序列編碼包含配體的嵌合蛋白，所述配體包含fsh序列，所述配體結(jié)合人fshr，所述配體連接于胞外鉸鏈結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、共刺激信號轉(zhuǎn)導區(qū)和信號轉(zhuǎn)導胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。在一個實施方案中，經(jīng)修飾的t細胞為分離自患者的自體t細胞，當t細胞被修飾為含有本文所述的核酸構(gòu)建體時，所述t細胞會被重新給予所述患者。在另一實施方案中，經(jīng)修飾的t細胞是通用同種異體平臺，即，異源t細胞，當t細胞如本文所述被修飾時，用于給予任何數(shù)量或患者。在一個實施方案中，配體為天然存在的fsh、fsh的單個亞基、fshβ、fsh或fshβ片段、或任何前述序的經(jīng)修飾的形式列。另一方面，治療人類個體癌癥的方法包括將本文所述的組合物給予有需要的個體，所述組合物包括例如核酸序列、嵌合蛋白或經(jīng)修飾的t細胞。在一個實施方案中，方法包括將經(jīng)修飾的人t細胞給予有需要的個體，所述經(jīng)修飾的人t細胞包含編碼包含配體、胞外鉸鏈結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、共刺激信號轉(zhuǎn)導區(qū)和信號轉(zhuǎn)導胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的嵌合蛋白的核酸序列，所述配體包含fsh序列，所述配體結(jié)合人fshr。另一方面，治療人類個體癌癥的方法包括將包含核酸序列的組合物給予個體，所述核酸序列編碼包含配體的嵌合蛋白，所述配體包含fsh序列，所述配體結(jié)合人fshr，所述核酸序列連接于(a)編碼胞外鉸鏈結(jié)構(gòu)域、間隔子元件、跨膜結(jié)構(gòu)域、共刺激信號轉(zhuǎn)導區(qū)和信號轉(zhuǎn)導胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的核酸序列；或(b)編碼任選的間隔子和結(jié)合nkg2d的配體的核酸序列。在一個實施方案中，配體為天然存在的fsh、fsh的單個亞基、fshβ、fsh或fshβ片段、或任何前述序列的經(jīng)修飾的形式。另一方面，治療人類個體癌癥的方法包括將包含嵌合蛋白的組合物給予個體，所述嵌合蛋白包含配體，所述配體包含fsh序列，所述配體結(jié)合人fshr，連接于(a)編碼胞外鉸鏈結(jié)構(gòu)域、間隔子元件、跨膜結(jié)構(gòu)域、共刺激信號轉(zhuǎn)導區(qū)和信號轉(zhuǎn)導胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的核酸序列；或(b)編碼任選的間隔子和結(jié)合腫瘤相關(guān)的nkg2d受體的配體的核酸序列。另一方面，治療卵巢癌的方法包括將配制于藥學可接受載體的經(jīng)修飾的人t細胞給予有需要的個體，經(jīng)修飾的人t細胞包含編碼包含配體的嵌合蛋白的核酸序列，所述配體包含fsh序列，所述配體結(jié)合人fshr，所述配體連接于胞外鉸鏈結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、共刺激信號轉(zhuǎn)導區(qū)和信號轉(zhuǎn)導胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。在一個實施方案中，配體為天然存在的fsh、fsh的單個亞基、fshβ、fsh或fshβ片段、或任何前述序列的經(jīng)修飾的形式。在另一實施方案中，在給予步驟前，女性個體已被手術(shù)治療來摘除卵巢。在下文優(yōu)選實施方案的詳細描述中，進一步描述這些組合物和方法的其他方面和優(yōu)勢。附圖說明圖1為在t細胞中表達嵌合內(nèi)分泌受體(cer)、fsh配體蛋白的一種構(gòu)建體(即，核酸構(gòu)建體或氨基酸構(gòu)建體)的示意圖。圖2a的柱狀圖顯示了含有編碼表達fsh受體的配體的嵌合蛋白的核酸序列的t細胞(fshcer-cd8)特異性地響應于表達fshr的b7f腫瘤細胞。正向轉(zhuǎn)導的(gfp+)t細胞攜帶圖1所示的靶向fshr的cer(fshcer-cd8；小棋盤格圖案)或無關(guān)的靶向間皮素(mesothelin)的(k1)car(大棋盤格圖案)與用fshcer-cd8或空載體(id-8；無關(guān)car)轉(zhuǎn)導的id8-defb29/vegf-a腫瘤細胞(b7)共同孵育(1：20)6小時。在上清中定量ifn-γ(pg/ml)。轉(zhuǎn)染fsh嵌合蛋白(或靶向fshr)的經(jīng)修飾的t細胞響應于過表達fshr的小鼠b7卵巢腫瘤細胞而分泌活化標志物干擾素-γ。針對過表達fshr的腫瘤細胞系b7f，靶向間皮素的t細胞不分泌干擾素-γ。同樣，表達fsh嵌合蛋白的t細胞不會被不表達fshr的腫瘤細胞b7活化。圖2b的柱狀圖顯示了用fshcer-cd4構(gòu)建體進行的相同分析。圖3的圖顯示了含有編碼表達fsh受體的配體的嵌合蛋白的核酸序列的t細胞延遲建立的fshr+腫瘤細胞的進展。過表達fshr的a7c11同系(b6)乳腺癌細胞被給予兩組小鼠(5只小鼠/組)的側(cè)腹。給予腫瘤細胞后4天，106個靶向fshr的經(jīng)修飾的t細胞(■)或模擬對照(pbmn)轉(zhuǎn)導的t細胞(▲)被過繼性腹膜內(nèi)轉(zhuǎn)移。用攜帶嵌合蛋白的t細胞治療的小鼠中腫瘤生長的進展被延遲。圖4a的柱狀圖顯示了在攜帶嵌合蛋白或模擬對照蛋白的t細胞給藥后第16天，用等同數(shù)量的用嵌合蛋白或模擬對照pbmnt細胞注射的小鼠的脾細胞cd4/cd8比值的。圖4b的柱狀圖顯示了按圖4a所述治療的小鼠在第16天的過繼性轉(zhuǎn)移的t細胞的細胞計數(shù)。圖4c的柱狀圖顯示了來自圖4a的小鼠在第16天的脾細胞的個體脾cd4計數(shù)。圖4d的圖顯示了來自圖4a的小鼠在第16天的脾細胞的cd8細胞計數(shù)。如以cd8和cd4標志物設門(未顯示)的這些脾細胞的流式細胞儀數(shù)據(jù)(數(shù)據(jù)圖未顯示)所示，這些圖也顯示，與給予攜帶模擬對照蛋白的t細胞的小鼠相比，給予攜帶嵌合蛋白的t細胞的小鼠的脾中cd4和cd8轉(zhuǎn)染細胞的數(shù)目均增加。圖4a-4d顯示了，與用攜帶模擬對照蛋白的t細胞注射的小鼠相比，用攜帶fsh嵌合蛋白的t細胞注射的小鼠的脾中轉(zhuǎn)移的t細胞的數(shù)目增加。轉(zhuǎn)移入攜帶嵌合蛋白的t細胞的脾細胞中檢還測到更高的cd4/cd8比值。在該卵巢癌細胞模型中，該比值被發(fā)現(xiàn)為是針對癌癥的應答的良性標志物。圖5是包含下文表1的融合組分的構(gòu)建體的核酸序列seqidno：1和氨基酸序列seqidno：2：表1圖6a是嵌合fsh-letal構(gòu)建體的示意圖，展示了其如何結(jié)合腫瘤細胞和nk細胞或t細胞(例如，cd8t細胞，γt細胞或nkt細胞)。圖6b是包含下文表2的融合組分的構(gòu)建體的核酸序列seqidno：3和氨基酸序列seqidno：4：表2圖6c是包含下文表3的融合組分的構(gòu)建體的核酸序列seqidno：5和氨基酸序列seqidno：6。構(gòu)建體的mw為45.87kd，并且利用非切割酶位點asci、bamhi、bcgi、beii、clai、hindiii、kpni、mfei、mlui、ncoi、ndei、noti、paci、pmei、psii、pvui、sacii、sali、sfii、sgfi、spei、sphi、xbai和xhoi。表3圖6d是包含下文表4的融合組分的構(gòu)建體的核酸序列seqidno：7和氨基酸序列seqidno：8：表4圖7a的柱狀圖顯示了貼壁的fshr轉(zhuǎn)導的id8-defb29/vegf-a(b7f)癌細胞與表達fshcer的或模擬對照轉(zhuǎn)導的t細胞pbmn(1：40比率)孵育24小時。去除未貼壁細胞后，在血細胞計數(shù)儀中對臺盼藍陰性細胞進行計數(shù)。fsh靶向型cert細胞有效清除fshr+腫瘤細胞。圖7b的柱狀圖顯示了用本文所述的fsh靶向型構(gòu)建體轉(zhuǎn)導的貼壁的fshr轉(zhuǎn)導的a7c11f有效清除fshr+腫瘤細胞。貼壁的fshr轉(zhuǎn)導的a7c11f癌細胞與表達fshcer的或模擬對照轉(zhuǎn)導的t細胞(1：40比率)孵育24小時。去除未貼壁細胞后，在血細胞計數(shù)儀中對臺盼藍陰性細胞進行計數(shù)。fsh靶向型cert細胞有效清除fshr+腫瘤細胞。圖8是本文所述的fsh嵌合內(nèi)分泌受體(cer)-t構(gòu)建體的變化形式的示意圖。圖9的圖顯示了人fshcert細胞以劑量依賴方式殺傷卵巢腫瘤細胞。將hla-a2+人t細胞用cona擴增，在20和44小時，用具有retronectin的pbmn中的hfshcer離心轉(zhuǎn)染或模擬對照轉(zhuǎn)導，并用1ug/ml的il-7和20u/ml的il-2保持在0.5-1×106細胞/ml。第7天，將cer和對照t細胞根據(jù)gfp表達分選，并靜置8小時，用hla-a2+人ovcar-3卵巢癌細胞(10000/孔；自發(fā)fshr+)以指定的效應物(e)與靶標(t)的比率進行接種。設置后6小時，用膜聯(lián)蛋白v和7aad染色共培養(yǎng)細胞，并通過流式細胞術(shù)分析細胞毒性。特異性溶解的百分比計算為(實驗死亡-自發(fā)死亡)/(最大死亡-自發(fā)死亡)×100％。圖10是western凝膠，顯示了晚期人卵巢癌樣本表達變化水平的fshr。通過western印記(santacruz#h-190)分析6個未經(jīng)選擇的人晚期卵巢癌樣本中fshr蛋白表達，并與fsh靶向型cert細胞敏感ovcar3細胞進行比較。β-肌動蛋白抗體，sigma#a5441圖11的圖顯示fshcert細胞消除表達fshr的原位卵巢腫瘤的進展。用fshr轉(zhuǎn)導的id8-defb29/vegf-a腫瘤細胞腹膜內(nèi)激發(fā)后第7和14天，攜帶靶向fshr的cars(fsh-cer)的t細胞或相同擴增的模擬對照轉(zhuǎn)導的t細胞(pbmn)被腹膜內(nèi)給藥(n＝5只小鼠/組)。比較惡性腫瘤進展。圖12的圖顯示通過使用tall-103/2細胞產(chǎn)生的經(jīng)修飾的同種異體或異源人fshcert細胞以劑量依賴形式殺傷卵巢腫瘤細胞。用pbmn中的hfshcer轉(zhuǎn)導tall-103/2細胞，并保持在含20u/ml的il-2的培養(yǎng)基中。去除fshcer-轉(zhuǎn)導的(■)或模擬對照轉(zhuǎn)導的(▲)tall-103/2細胞的il-2，24h后，與熒光素酶轉(zhuǎn)導的fshr+人ovcar-3卵巢癌細胞(10000/孔)以指定的效應物(e)與靶標(t)的比率孵育。設置后4小時，將共培養(yǎng)細胞裂解，并定量熒光素酶信號。特異性溶解的百分比計算為(實驗死亡-自發(fā)死亡)/(最大死亡-自發(fā)死亡)×100％。具體實施方式本文提供的組合物和方法引發(fā)針對例如卵巢癌或特征為瘤細胞攜帶fsh受體(fshr)的其他癌癥(例如，前列腺癌細胞52和轉(zhuǎn)移性腫瘤lesions51)的保護性抗腫瘤免疫以及預防復發(fā)。通過借助于內(nèi)源配體作為靶向基序的優(yōu)勢而靶向激素受體，阻止針對上皮腫瘤的某些免疫療法技術(shù)獲得成功的挑戰(zhàn)被攻克。本文使用的技術(shù)和科學術(shù)語具有與本發(fā)明所屬
技術(shù)領域：
：的普通技術(shù)人員通常理解相同的含義，并且通過引用出版的教科書，其為本領域技術(shù)人員提供說明書中使用的很多術(shù)語的一般指導。提供以下定義僅是出于清楚的目的，并且不意圖限制請求保護的發(fā)明。卵泡刺激素(fsh)哺乳動物繁殖中心激素的，主要產(chǎn)生于垂體前葉中。該激素通過結(jié)合質(zhì)膜卵泡刺激素受體(fshr)并刺激雌性中卵泡成熟和雌激素產(chǎn)生而發(fā)揮其正常生物學作用。在男性中，fsh和fshr的相互作用刺激塞爾托利細胞增殖并保持正常精子形成。天然存在的fsh激素是α和β亞基兩個亞基形成的異二聚體。α亞基也稱為cgα，并且是促黃體激素(lh)和甲狀腺刺激激素(tsh)共有的。人和其他乳動物種類的fsh的α和β亞基的核酸和氨基酸序列是公眾可知的并且能夠獲得。fshr是選擇性表達于女性的卵巢顆粒細胞中的激素受體，并且在卵巢內(nèi)皮中處于低水平。最重要的是，該表面受體表達于50-70％的卵巢癌，但是不表達于腦中，作為負反饋取決于感應激素。鑒于卵巢切除術(shù)是卵巢癌治療的標準程序，靶向fshr不應對健康組織造成損傷。本文所用的短語“配體包含fsh序列，所述配體結(jié)合fshr”包括天合適的哺乳動物的然存在的全長fsh序列。配體包含足夠的fsh序列而允許通過激素序列和受體之間的天然親和力方式的配體和fshr之間的結(jié)合。配體不是體或抗體片段，并不以該方式結(jié)合受體。如果配體是天然存在的，例如，全長fshβ-fshα序列或其天然存在的片段，配體不能在給予配體的個體中誘導免疫原性反應。如果配體包含天然存在的fsh序列的經(jīng)修飾的全長或片段，在一些實施方案中，修飾不足以在給予配體的個體中誘導任何強烈的免疫原性反應。在一個實施方案中，包含fsh序列的配體是天然存在的全長人fsh，例如，fshβ序列連接于fshα序列。在另一實施方案中，包含fsh序列的配體是連接于天然存在的fshα序列的經(jīng)修飾的fshβ序列。在另一實施方案中，包含fsh序列的配體是連接于經(jīng)修飾的fshα/cgα序列的經(jīng)修飾的fshβ序列。在另一實施方案中，配體是連接于經(jīng)修飾的fshα序列的天然存在的fshβ序列。在另一實施方案中，當個體哺乳動物是人且目標腫瘤是人腫瘤時，合適的fsh序列是人fsh或人序列的經(jīng)修飾的形式。或者，配體是經(jīng)修飾的fsh，例如，通過任選的間隔子連接于天然存在的或經(jīng)修飾的fshα序列的天然存在的或經(jīng)修飾的fshβ序列。在另一實施方案中，配體是單獨的單一天然存在的或經(jīng)修飾的fshβ亞基。在另一實施方案中，配體是天然存在的fshβ亞基，其通過任選的間隔子序列連接于經(jīng)修飾的第二fshβ序列的。在另一實施方案中，配體是經(jīng)修飾的fshβ亞基，其通過任選的間隔子序列連接于天然存在的第二fshβ序列。在另一實施方案中，配體包含天然存在的或經(jīng)修飾的fsh序列的片段。在另一實施方案中，配體包含天然存在的或經(jīng)修飾的fshβ序列的片段。在另一實施方案中，配體是連接于經(jīng)修飾的fshα亞基或其片段的天然存在的fshβ亞基。在另一實施方案中，配體是連接于天然存在的或fshα亞基的經(jīng)修飾的fshβ亞基或其片段。在另一實施方案中，配體包含連接于一起的天然存在的或經(jīng)修飾的fshβ序列的片段。“天然存在的”表示該序列是在選定哺乳動物中存在的天然核酸或氨基酸序列，包括哺乳動物種類的不同成員之間存在的序列中各種核酸和/或氨基酸位置的任何天然存在的變體。“修飾的”表示參考序列，例如，fsh或其片段或fshβ連接于fshα核酸或氨基酸序列或任一亞基序列單獨地已被故意處理。合適的修飾包括使用比天然存在的全長激素更短的序列片段。這樣的修飾包括核酸序列的改變以包含優(yōu)選密碼子，其可以編碼與天然氨基酸序列中存在的相同或相關(guān)氨基酸。修飾還包括核酸或氨基酸序列的改變以引入保守型氨基酸改變，例如，從一個帶電或中性氨基酸向不同的帶電氨基酸的改變。這樣的修飾還可以包括使用具有或不具有fshα序列的fshβ和不與fshβ或fshα一起天然存在的其他序列故意創(chuàng)造融合物。修飾還包括使用故意插入的間隔子序列連接亞基或?qū)喕芜B接在一起或?qū)⒅貜推位騺喕苑翘烊淮嬖诘娜诤衔镞B接在一起。作為一個實例，包含信號序列的天然存在的人fshβ核酸序列包含seqidno：1的核酸1-387或由其組成，氨基酸序列為seqidno：2的氨基酸1-129。fshβ信號序列自身包含seqidno：1的核酸1-54或由其組成，氨基酸序列為seqidno：2的氨基酸1-18。成熟fshβ包含seqidno：1的核酸55-38或由其組成，氨基酸序列為seqidno：2的氨基酸19-129。作為用于本文的方法和組合物的另一實例，成熟人fshβ核酸序列包含seqidno：3或7的核酸4-336或由其組成，氨基酸序列為seqidno：4或8的氨基酸2-112。作為用于本文的方法和組合物的另一實例，人fshβ核酸序列的有用的片段包含fshβseqidno：1的核酸55-99、fshβseqidno：1的核酸153-213、fshβseqidno：1的核酸207-249、或fshβseqidno：1的核酸295-339或由上述序列組成。作為用于本文的方法和組合物的另一實例，人fshβ氨基酸序列有用片段的包含fshβseqidno：2的氨基酸19-33、fshβseqidno：2的氨基酸51-71、fshβseqidno：2的氨基酸69-83、或fshβseqidno：2的氨基酸99-113、或由上述序列組成。在配體還包含fshα序列的一些實施方案中，天然存在的人fshα核酸序列包含seqidno：1的核酸433-801或由其組成，氨基酸序列為seqidno：2的氨基酸145-267。在用于本文的方法和組合物的另一實施方案中，人fshα核酸序列包含seqidno：3的核酸382-750或由其組成，氨基酸序列為seqidno：4的氨基酸128-250。在用于本文的方法和組合物的另一實施方案中，人fshα核酸序列的片段包含seqidno：7的核酸382-657或由其組成，氨基酸序列為seqidno：8的氨基酸128-219。應當理解，上文所述的施加于這些片段的氨基酸修飾物或核酸修飾物也是該方法中有用的配體。配體不結(jié)合抗體或抗體片段-抗原復合物中的fsh。如上文所述，本文所述配體利用天然激素(或天然激素的經(jīng)修飾的形式)與其受體之間的天然親和力進行結(jié)合。因為配體是天然激素或其經(jīng)修飾的形式，因此其被設計為避免誘導個體中的抗原反應。術(shù)語“連接子”和“間隔子”可交換使用，并且指編碼具有足夠長度來分隔兩個組分的肽的核酸序列和/或指所述肽自身?？梢愿鶕?jù)連接子所要施加的用途選擇連接子的組成和長度。在一個實施方案中，用于分隔fshα和fshβ(天然存在的序列或經(jīng)修飾的序列或片段)的氨基酸連接子的長度為2至70個氨基酸，包括該范圍內(nèi)的任何數(shù)值。例如，在一個實施方案中，連接子的長度為10個氨基酸。在另一實施方案中，連接子的長度為15個氨基酸。在其他實施方案中，連接子的長度為25、35、50或60個氨基酸。參見，例如，上文表1-4描述的序列所限定的間隔子/連接子。因此，編碼連接子或間隔子的核酸序列由長度6至210個核苷酸組成，包括該范圍內(nèi)的所有數(shù)值。在一些實施方案中，連接子包含多個甘氨酸殘基或編碼它們的核酸。在一些實施方案中，氨基酸連接子包含多個絲氨酸殘基或編碼它們的核酸。在其他實施方案中，連接子包含多個胸腺嘧啶殘基或編碼它們的核酸。在其他實施方案中，連接子和間隔子包含絲氨酸、胸腺嘧啶和甘氨酸殘基的任意組合。其他連接子可以容易地根據(jù)用途設計。本文所用的“載體”包含任何遺傳元件，包括但不限于裸dna、噬菌體、轉(zhuǎn)座子、粘粒、附加體、質(zhì)粒、細菌或病毒，其表達或被導致表達希望的核酸構(gòu)建體。本文所用的術(shù)語“個體”或“患者”指雄性或雌性哺乳動物，優(yōu)選人。但是，哺乳動物個體也可以是獸醫(yī)或農(nóng)場動物、馴養(yǎng)動物或?qū)櫸?，以及常用于臨床研究的動物。在一個實施方案中，這些方法和組合物的個體是人。如本領域所知，本文所用的術(shù)語“癌癥”表示特征為不受調(diào)控的細胞生長或增殖的任何疾病、狀態(tài)、性狀、基因型或表型?！鞍┘毎币圆皇芸氐纳L異常分裂和復制的細胞。該細胞能從其原始部位(例如，腫瘤)離開，移動至機體的其他部分并建立另一部位(例如，另一腫瘤)，這樣的過程稱為轉(zhuǎn)移。“腫瘤”是來自不受控的且進行性的過度細胞分裂的異常組織塊，并且也成為贅生物。腫瘤可以是良性的(非癌性)或惡性的。本文所述的組合物和方法可用于治療癌癥和腫瘤細胞，即，惡性和良性腫瘤，只要待治療的細胞表達fshr。因此，在本文所述的方法和組合物的各種實施方案中，癌癥可以包括但不限于乳腺癌、肺癌、前列腺癌、結(jié)腸直腸癌、食道癌、胃癌、膽囊癌、胰腺癌、腎癌、宮頸癌、肝癌、卵巢癌和睪丸癌。本文所用的術(shù)語“藥學可接受載體”或“稀釋劑”意圖包括與人的給藥相容的任何和全部溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗細菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲基劑、助劑等。在一個實施方案中，稀釋劑是鹽水或緩沖鹽水。術(shù)語“a”或“an”指一個或多個，例如，“抗腫瘤t細胞”被理解為代表一個或多個抗腫瘤t細胞。因此，術(shù)語“a”(或“an”)，“一個或多個”和“至少一個”在本文中可交換使用。本文所用的術(shù)語“約”修飾參考數(shù)值，并且包括該參考數(shù)值的±0.01％高至±10％的全部數(shù)值以及這些端點內(nèi)的所有數(shù)值并包括這些端點，例如，±.5％，±1％，±5％等。使用語言“包含”展示說明書中的各種實施方案，“包含”包括其他組分或方法步驟。當使用“包含”時，應當理解為相關(guān)實施方案包括使用“由…組成”術(shù)語的描述，其排除其他組分或方法步驟，和“本質(zhì)上由…組成”術(shù)語的描述，其排除實質(zhì)上改變實施方案或發(fā)明的性質(zhì)的任何組分或方法步驟。在一個實施方案中，本發(fā)明提供編碼包含配體的嵌合蛋白的核酸序列，所述配體包含結(jié)合人fshrfsh序列的，所述核酸序列連接于編碼t細胞活化功能的核酸序列。如上文更詳細地描述，在一些實施方案中，配體是具有兩個亞基的天然存在的fsh、fsh的單個亞基、僅fshβ亞基、fshα/cgα或fshβ片段、或上述序列的經(jīng)修飾的形式。在一個實施方案中，可以通過將上文所述配體與編碼設計已知嵌合抗原受體(car)中有用的組分的核酸序列連接來提供t細胞活化功能。參見，例如，sadelain,metal,"thebasicprinciplesofchimericantigenreceptor(car)design"2013april,cancerdiscov.3(4):388-398；國際專利申請公布wo2013/044255，美國專利申請公布us2013/0287748號和涉及使用這些嵌合蛋白的其他出版物。通過引用的方式并入這些出版物以提供關(guān)于在設計本文所述的某些構(gòu)建體有用的各種組分的信息。這樣的cart細胞是經(jīng)遺傳修飾的淋巴細胞，表達允許它們識別選定抗原的配體。在抗原識別后，這些經(jīng)修飾的t細胞通過將這些t細胞轉(zhuǎn)化為強細胞殺傷者的信號轉(zhuǎn)導結(jié)構(gòu)域而被活化。超過內(nèi)源t細胞的優(yōu)勢在于，它們不受mhc限制，這允許這些t細胞通過降低mhc表達19克服很多腫瘤細胞中使用的免疫監(jiān)視逃避策略。例如，可以通過將配體通過任選的間隔子連接于跨膜結(jié)構(gòu)域、共刺激信號轉(zhuǎn)導區(qū)和/或信號轉(zhuǎn)導胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域來提供這樣的t細胞活化功能。因此，本文所述方法中有用的核酸序列的一個實施方案示例于本文圖5的seqidno：1和表1。核酸序列或cer構(gòu)建體包含由以下形成的配體：由18個氨基酸的人fshβ信號序列和120個氨基酸的成熟fshβ形成的天然存在的人fshβ序列，連接于15個氨基酸的間隔子，并且連接于天然存在的123個氨基酸的fshα序列。cer構(gòu)建體還包括其他組分，即，胞外鉸鏈結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、人胞內(nèi)區(qū)和信號轉(zhuǎn)導胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。對于圖5的構(gòu)建體，例如，鉸鏈區(qū)和跨膜結(jié)構(gòu)域來自人cd8α，人胞內(nèi)區(qū)來自4-1bb，信號轉(zhuǎn)導結(jié)構(gòu)域為人cd3ζ結(jié)構(gòu)域?？捎米鬟@樣的核酸構(gòu)建體的其他實施方案可以包括具有不同配體的構(gòu)建體，例如上文所述的配體之一在一個實施方案中，圖5所述同一構(gòu)建體中的fshα序列可以為縮短的序列，具有seqidno：7的核苷酸382-657的核酸序列，和seqidno：8的氨基酸128-219的氨基酸序列。圖5的構(gòu)建體中使用的配體另一實施方案的可以包含缺少seqidno：2的信號序列氨基酸2-18的fshβ序列?？梢酝ㄟ^將表1的配體部分替換為上文討論的任何配體、修飾的、天然存在的或片段容易地設計與圖5的核酸構(gòu)建體相似的實施方案。與圖5相似的核酸構(gòu)建體的其他實施方案可以采用不同組分，例如上文引用的sadelainetal或通過引用的方式并入本文的專利公開中詳細描述的那些。例如，當采用鉸鏈結(jié)構(gòu)域時，其他天然存在的或合成的鉸鏈結(jié)構(gòu)域，包括免疫球蛋白鉸鏈區(qū)，例如來自igg1的鉸鏈區(qū)，免疫球蛋白的ch2ch3區(qū)，cd3的片段等。與圖5相似的核酸構(gòu)建體的其他實施方案可以采用獲自t細胞受體的不同天然存在的或合成的跨膜結(jié)構(gòu)域。各種跨膜蛋白含有本文所述構(gòu)建體中有用的結(jié)構(gòu)域。例如，獲自t細胞受體的跨膜結(jié)構(gòu)域、cd28、cd3ε、cd45、cd4、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137或cd154已被注意到是有用的。與圖5相似的核酸構(gòu)建體的其他實施方案可以采用不同天然存在的或合成的胞內(nèi)區(qū)，包括共刺激信號轉(zhuǎn)導區(qū)以及本領域已知的其他。共刺激信號轉(zhuǎn)導區(qū)可以為細胞表面分子的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(例如，共刺激分子)，例如cd27、cd28、4-1bb(cd137)、ox40、cd30、cd40、pd-1、icos、淋巴細胞功能相關(guān)的抗原-1(lfa-1)、cd2、cd7、light、nkg2c、b7-h3。參見，例如，上文引用的出版物列出的其他分子。與圖5相似的核酸構(gòu)建體的其他實施方案可以采用不同天然存在的或合成的胞質(zhì)信號轉(zhuǎn)導結(jié)構(gòu)域包括源自cd3ζ，tcrζ，fcrγ，fcrβ，cd3γ，cd3δ，cd3ε，cd5，cd22，25cd79a，cd79b和cd66d等的那些胞質(zhì)信號轉(zhuǎn)導結(jié)構(gòu)域以及本領域中已知的其他胞質(zhì)信號轉(zhuǎn)導結(jié)構(gòu)域在給予本文提供的教導并和使用本領域已知的信息后，可以設計例如圖5的核酸構(gòu)建體的任何數(shù)量的變化形式，用于本文所述方法。因此，本文所述另一組成部分是包含配體的嵌合蛋白，配體包含fshβ序列或所述fsh序列的修飾物或片段，該配體結(jié)合人fshr，配體連接于具有t細胞活化功能肽或蛋白。這樣的嵌合蛋白包含上文所述的結(jié)合人fshr的配體，配體連接于胞外鉸鏈結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、共刺激信號轉(zhuǎn)導區(qū)和信號轉(zhuǎn)導胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。示例性嵌合蛋白由上文所述核酸序列編碼。這樣的嵌合蛋白的一個實施方案是圖5所示的seqidno：2。利用本文鑒定的各種配體可容易地設計其他嵌合蛋白，例如，一個或多個上文詳細鑒定出的fshβ片段或本文鑒定的其他fshr結(jié)合配體替代seqidno：2具體示例的配體。在另一實施方案中，有用的cer構(gòu)建體是編碼配體的核酸序列，如上文所述，所述配體包含fshβ序列或所述fsh序列的修飾物或片段，所述配體結(jié)合人fshr，所述核酸序列連接于編碼結(jié)合腫瘤相關(guān)的nkg2d受體的配體的核酸序列。參見，例如，圖6a。一種這樣的nkg2d配體稱為letal或ulbp4。letal由seqidno：3的核苷酸796-1365的核酸序列編碼，并具有seqidno：4的氨基酸266-454的氨基酸序列。參見，例如，conejo-garcia,jetal,"letal,atumor-associatednkg2dimmunoreceptorligand,inducesactivationandexpansionofeffectorimmunecells"july2003,cane.biol.&ther.,2(4):446-451；和美國專利申請公布20060247420號，通過引用的方式將上述文獻并入本文。在本說明書中，其他nkg2d配體或letal序列氨基酸修飾物、核酸水平的修飾物或功能片段可以替換示例性letal序列。另外，任選地，這些fshr結(jié)合配體和nkg2d配體是通過上文所示合適的間隔子或連接子連接。這樣的核構(gòu)建體的具體實例提供于圖6a，圖6b，表2，seqidno：3，圖6d，表4，seqidno：7和圖8。在圖7b的實施方案中，fshr結(jié)合配體由天然存在的人fshβ序列連接于15個氨基酸的間隔子，再連接于天然存在的123個氨基酸的fshα序列形成，天然存在的人fshβ序列由來自信號序列的單個氨基酸蛋氨酸，隨后為120個氨基酸的成熟fshβ形成。該配體再通過另一15個氨基酸的間隔子連接于letal。在圖6d的實施方案中，fshr結(jié)合配體由天然存在的人fshβ序列，連接于15個氨基酸的間隔子，再連接于經(jīng)修飾的fshα序列(即，seqidno：8的氨基酸128-219的片段，由seqidno：7的核苷酸382-657編碼)形成，天然存在的人fshβ序列由來自信號序列的單個氨基酸蛋氨酸，隨后為120個氨基酸的成熟fshβ形成。該配體再通過另一15個氨基酸的間隔子連接于letal?？捎米鬟@樣的核酸構(gòu)建體的其他實施方案可以包括具有不同配體編碼序列(例如編碼上文所述配體之一的序列)的圖6b和6d的構(gòu)建體。在一個實施方案中，圖6b所述相同構(gòu)建體中的fshα序列可以為單個或多個拷貝具有或不具有信號序列的全長fshβ。作為另一實例，圖6b和6d構(gòu)建體可以含有由人fshβ片段形成的配體，所述人fshβ片段由以下核酸序列編碼：所述核酸序列包含fshβseqidno：1的核酸55-99，fshβseqidno：1的核酸153-213，fshβseqidno：1的核酸207-249，或fshβseqidno：1的核酸295-339，或由上述序列組成。配體可以由這些片段單獨、組成在一起組成，或替代全長fshβ并因此通過連接子與圖6b或6d的fshα序列融合?？梢酝ㄟ^將表2或4的配體部分替換為上文討論的任何配體，修飾的，天然存在的或片段容易地設計與圖6b或6d的核酸構(gòu)建體相似的實施方案。因此，另一方面是由上文所述核酸序列編碼的嵌合或雙特異性蛋白，并包含配體，所述配體包含本文所述的fshβ序列或所述fsh序列的修飾物或片段，所述配體結(jié)合人fshr，所述配體連接于結(jié)合nkg2d的配體。這些蛋白主要有用的是蛋白形式，并且在體內(nèi)發(fā)揮功能而將內(nèi)源淋巴細胞和fshr+腫瘤細胞引到一起。在其他方面，提供攜帶上文所述核酸構(gòu)建體的重組載體。核酸構(gòu)建體可以攜帶于基于質(zhì)粒的系統(tǒng)或復制或非復制重組病毒載體中，并且嵌合蛋白可以表達于基于質(zhì)粒的系統(tǒng)或復制或非復制重組病毒載體中，基于質(zhì)粒的系統(tǒng)中有很多是可商業(yè)購買的。本文討論的核酸序列可以在希望的宿主細胞中使用這些載體體外表達和產(chǎn)生或體內(nèi)表達和產(chǎn)生。因此，在一個實施方案中，載體為非致病性病毒。在另一實施方案中，載體為非復制病毒。在一個實施方案中，理想的病毒載體可以為逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，例如慢病毒載體。在另一實施方案中，理想的載體是腺病毒載體。在另一實施方案中，合適的載體是腺相關(guān)病毒載體。腺病毒、腺相關(guān)病毒和慢病毒通常是優(yōu)選的，因為它們主動感染分裂以及靜止和分化的細胞，例如干細胞，巨噬細胞和神經(jīng)元。多種腺病毒、慢病毒和aav株可獲自美國典型微生物收集中心(americantypeculturecollection，manassas，virginia)或通過向多種商業(yè)和學術(shù)來源申請來獲得。此外，很多這樣的病毒株的序列可獲自多種數(shù)據(jù)庫，包括例如pubmed和genbank。在一個實施方案中，使用慢病毒載體。有用的載體為馬感染性貧血病毒和貓以及牛免疫缺陷病毒，和基于hiv的載體。多種有用的慢病毒載體，以及產(chǎn)生用于轉(zhuǎn)導細胞和表達異源基因的這些載體的方法和處理，例如，nmanjunathetal,2009advdrugdelivrev.,61(9):732-745；porteretal,nengljmed.2011aug25；365(8):725-33)。在另一實施方案中，本文所用載體為腺病毒載體?？梢允褂靡环N或多種任意已知腺病毒血清型的腺病毒dna構(gòu)建這樣的載體。參見，例如，t.shenketal,adenoviridae:thevirusesandtheirreplication",ch.67,infield'svirology,6thed.,editedbyb.nfieldsetal,(lippincottravenpublishers,philadelphia,1996),p.111-2112；6,083,716，其描述兩種黑猩猩腺病毒的基因組；美國專利7,247,472號；wo2005/1071093等。本領域技術(shù)人員能容易地構(gòu)建合適的腺病毒載體，以攜帶和表達本文所述的核苷酸構(gòu)建體。在另一實施方案中，本文所用載體為腺相關(guān)病毒(aav)載體。可以使用一個或多個已知av血清型的aavdna構(gòu)建這樣的載體。參見，例如，美國專利7,803,611號；美國專利7,696,179美國專利等。在另一實施方案中，本文所用載體為細菌載體。在一個實施方案中，細菌載體為單核細胞增多性李斯特氏菌。參見，例如，laueretal,infect.immunity,76(8):3742-53(aug.2008)。因此，在一個實施方案中，細菌載體是活體減毒的或光化學失活的?？梢杂杉毦亟M表達嵌合蛋白，例如，通過導入細菌的質(zhì)粒，或整合入細菌基因組，即，通過同源重組。這些載體還包括允許轉(zhuǎn)染有質(zhì)粒載體或感染有病毒載體的細胞中的核酸構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄、翻譯和/或表達的常規(guī)控制元件。多種表達控制序列是本領域已知的并且可以使用，包括天然、組成型、誘導型和/或組織特異型啟動子。在一個實施方案中，啟動子的選擇是基于選定的載體。在另一實施方案中，當載體是慢病毒時，啟動子是u6、h1、cmvie基因、ef-1α、泛素c或磷酸甘油激酶(pgk)啟動子。在另一實施方案中，當載體是aav時，啟動子為rsv、u6或cmv啟動子。在另一實施方案中，當載體是腺病毒時，啟動子為rsv、u6、cmv或h1啟動子。在另一實施方案中，當載體是單核細胞增多性李斯特氏菌時，啟動子為hly或acta啟動子。其他常規(guī)表達控制序列包括選擇標記基因或報告基因，其可以包括編碼遺傳霉素、潮霉素、氨芐青霉素或嘌呤霉素抗性的序列等。載體的其他組分可以包括復制起點。這些和其他啟動子和載體元件的選擇是常規(guī)的，并且很多這樣的序列是可獲得的(參見，例如，本文引用的文獻)。使用本文提供的技術(shù)和序列并結(jié)合本領域技術(shù)人員已知的技術(shù)產(chǎn)生這些載體。這些技術(shù)包括常規(guī)cdna克隆技術(shù)，例如教科書中描述的技術(shù)(sambrooketal，molecularcloning：alaboratorymanual，coldspringharborpress，coldspringharbor，ny)，使用重疊寡核苷酸序列，聚合酶鏈式反應，以及提供希望的核苷酸序列任何合適的方法。因此，在一個實施方案中，使用本文教導的和公眾可知的信息和已知的載體構(gòu)建組分和技術(shù)，本領域技術(shù)人員能構(gòu)建表達希望的核酸構(gòu)建體的病毒載體(或質(zhì)粒)。由這些核酸構(gòu)建體編碼的嵌合蛋白可以體外或宿主細胞中離體表達，或通過給予哺乳動物個體而體內(nèi)表達。或者，可以通過已知化學合成方法以合成方式產(chǎn)生嵌合蛋白。根據(jù)組分、方法的效率和預期用途，本領域技術(shù)人員能選擇合適的方法來產(chǎn)生這些嵌合蛋白，例如，是作為蛋白、核酸或以過繼性t細胞給藥，或其他方式來實現(xiàn)希望的治療結(jié)果。另一方面，提供經(jīng)修飾的人t細胞，其包含編碼包含配體的嵌合蛋白的核酸序列，配體結(jié)合人fshr，所述核酸序列連接于編碼t細胞活化功能的核酸序列。在一個實施方案中，這些后面的核酸序列以藥學可接受載體編碼胞外鉸鏈結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、共刺激信號轉(zhuǎn)導區(qū)和信號轉(zhuǎn)導胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。經(jīng)修飾的t細胞為已被一種上文所述攜帶編碼嵌合蛋白的核酸構(gòu)建體的載體轉(zhuǎn)導或轉(zhuǎn)染的t細胞。理想情況下，t細胞為原代t細胞、cd8(細胞毒性)t細胞，或nkt細胞或獲自經(jīng)修飾的t細胞被給予的同一哺乳動物個體的其他t細胞，或獲自哺乳動物種類另一成員的其他t細胞。在一個實施方案中，t細胞為獲自個體或個體的骨髓移植匹配體的自體人t細胞或自然殺傷(nk)t細胞。其他合適的t細胞包括獲自切除的腫瘤的t細胞，多克隆或單克隆腫瘤反應性t細胞。t細胞通常通過分血法(apheresis)獲得，并用選擇的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導而體內(nèi)表達嵌合蛋白。其他合適的t細胞包括同種異體或異源t細胞，其可用作攜帶本文所述核酸構(gòu)建體的通用t細胞平臺。在一個實施方案中，可以選用人細胞毒性t細胞。tall-104和tall-103/2細胞是cd3響應性淋巴細胞，分別為cd3+tcrαβ+和cd3+tcrγδ+，源自兒童t細胞白血病，其展示主要組織相容性復合體非限制性，nk細胞受體介導的殺腫瘤活性，主要依賴于nkg2d59,60,61。tall細胞展示nkg2d依賴性的寬范圍的腫瘤靶標反應性。被輻射的tall-104細胞由于其自發(fā)性(nk樣)細胞溶解活性和安全性而已被用于治療轉(zhuǎn)移性乳腺和卵巢癌。這些經(jīng)修飾的t細胞，無論是自體的或內(nèi)源的，通過信號轉(zhuǎn)導結(jié)構(gòu)域被活化，信號轉(zhuǎn)導結(jié)構(gòu)域?qū)⑦@些t細胞轉(zhuǎn)化為有效細胞殺傷者。自體的細胞相比內(nèi)源t細胞的優(yōu)勢在于，它們不受mhc限制，這允許這些t細胞通過降低mhc表達克服很多腫瘤細胞中使用的免疫監(jiān)視逃避策略。諸如tall細胞的內(nèi)源細胞具有的優(yōu)勢在于，它們是通用的，適應于規(guī)模性制備、標準化和進一步細胞工程技術(shù)而靶向fshr+卵巢癌。在另一實施方案中，經(jīng)修飾的t細胞還被離體工程化而抑制、消除或降低叉頭框蛋白(foxp1)表達的。在一個實施方案中，t細胞先被工程化或處理來降低foxp1，然后用上文所述核酸序列轉(zhuǎn)染t細胞，所述核酸序列編碼包含配體的嵌合蛋白，所述配體包含天然存在的或經(jīng)修飾的fsh序列或其片段，所述配體結(jié)合人fshr，所述配體連接于其他t細胞刺激或靶向序列。在另一實施方案中，用編碼本文所述的嵌合蛋白或雙特異性蛋白的核酸序列轉(zhuǎn)染t細胞之后，進行處來降低或消除foxp1。在一個實施方案中，t細胞被預處理，使得當t細胞被遞送至個體后不表達foxp1。最理想的情況是，經(jīng)修飾的t細胞中的foxp1被消除?？梢杂靡韵绿幚韙細胞：鋅指核酸酶、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應物核酸酶(talen)、crispr/cas體系或工程化大范圍核酸酶再工程化歸巢內(nèi)切酶以及被優(yōu)化和設計為靶向獨特foxp1序列而將缺陷引入fox-p1基因組序列或缺失fox-p1基因組序列的序列。通過借助內(nèi)源dna修復機制的優(yōu)勢，在過繼性轉(zhuǎn)移之前，這些試劑從經(jīng)修飾的t細胞移除foxp1?；蛘撸梢杂迷O計為抑制、降低、下調(diào)或消除foxp1的表達的另一核酸序列共轉(zhuǎn)染t細胞。參見，例如，國際專利申請公布wo2013/063019，通過引用的方式將上述文獻并入本文。也可以在通過引入核酸構(gòu)建修飾體t細胞之前或之后，使用這些技術(shù)的各種組合。通常，當通過向t細胞轉(zhuǎn)染遞送載體時，載體的遞送量為向約1×104細胞至約1×1013細胞遞送約5μg至約100μgdna。在另一實施方案中，載體的遞送量為向1×104細胞至約×1013細胞遞送約10至約50μgdna。在另一實施方案中，載體的遞送量為向約105細胞遞送約5μg至約100μgdna。但是，可以調(diào)整載體dna與t細胞的相對量，考慮的因素例如選擇的載體、選取的遞送方法和宿主細胞?？梢赃^本領域已知的或上文公開的任何手段將載體引入t細胞，包括轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化、感染、extraporation或直接dna注射。核酸構(gòu)建體可以被穩(wěn)定地并入宿主細胞的基因組、作為附加體穩(wěn)定地表達、或瞬時表達。得到的經(jīng)修飾的t細胞被制備為表達以合適的藥學載體用于過繼性治療的核酸構(gòu)建體。但是，如上文所述，嵌合雙特異性蛋白可以作為蛋白在合適的藥學載體中給藥。上文所述全部組合物和組分可以用于本文所述方法來治療本文所述的癌癥和刺激抗腫瘤免疫活性。因此，提供治療人類個體的癌癥的方法，包括以藥學可接受制劑或載體給予個體任何如上文所述的組合物。在一個實施方案中，通過所述方法治療的個體是患有表達fsh的癌癥的個體，包括上文列出的那些癌癥。在另一實施方案中，在給予本文所述組合物之前，具有表達fshr的癌癥或腫瘤細胞的個體已被手術(shù)治療來切除問題腫瘤。在一個實施方案中，個體為患卵巢癌的女性。在另一實施方案中，患卵巢癌的女性個體已被手術(shù)治療來移除卵巢、輸卵管和/或子宮。在施用這些方法之前或之后，患有上文列舉的任何其他癌癥的個體可以通過合適的手術(shù)進行治療。在一個實施方案中，個體被給予包含上文所述的核酸構(gòu)建體的組合物。在另一實施方案中，個體被給予包含上文所述的嵌合蛋白的組合物。在一個具體實施方案中，治療人類個體的癌癥的方法包括給予有需要的個體包含配體的雙特異性蛋白，所述配體包含fshβ序列，所述配體結(jié)合人fshr，所述配體連接于結(jié)合nkg2d的配體。在另一實施方案中，組合物為攜帶核酸構(gòu)建體的病毒載體，從而允許體內(nèi)感染。在另一實施方案中，治療人類個體的癌癥的方法包括給予有需要的個體經(jīng)修飾的人t細胞，所述t細胞包含編碼嵌合蛋白的核酸序列，所述嵌合蛋白包含fsh序列，所述fsh序列的修飾物或片段，所述配體結(jié)合fshr，所述核算序列連接于編碼t細胞活化功能的核酸序列。在一個實施方案中，t細胞活化功能由編碼胞外鉸鏈結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、共刺激信號轉(zhuǎn)導區(qū)和信號轉(zhuǎn)導胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的核酸序列提供。在一個實施方案中，經(jīng)修飾的t細胞表達本文所述的任何核酸構(gòu)建體。在一個示例性實施方案中，經(jīng)修飾的t細胞表達圖5的核酸構(gòu)建體或本文所述的相似構(gòu)建體。在另一實施方案中，在給藥后，經(jīng)修飾的t細胞不表達叉頭框蛋白(foxp1)。在另一實施方案中，經(jīng)修飾的t細胞攜帶表達或共表達消除或降低foxp1表達的序列的核酸構(gòu)建體。在另一實施方案中，經(jīng)修飾的人t細胞與臨床可獲得的pd-1抑制劑一起給藥。在另一實施方案中，經(jīng)修飾的人t細胞與臨床可獲得的包括tgf-β抑制劑(包括阻斷抗體)一起給藥。在另一實施方案中，經(jīng)修飾的人t細胞與臨床可獲得的il-10抑制劑一起給藥。這些治療方法被設計為增強t細胞的治療活性和延長癌癥患者的存活。通過這些方法給予的治療組合物，例如，單獨的核酸構(gòu)建體、在病毒載體或納米顆粒中、作為嵌合或雙特異性蛋白或作為用于過繼性治療處理的經(jīng)修飾的抗腫瘤t細胞，被系統(tǒng)性給藥或直接給予至個體的癌細胞的環(huán)境或腫瘤微環(huán)境。常規(guī)和藥學可接受的給藥途徑包括但不限于系統(tǒng)性途徑，例如腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、鼻內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、氣管內(nèi)、皮下和其他胃腸外給藥途徑或腫瘤內(nèi)或淋巴結(jié)內(nèi)給藥。如果需要的話，可以組合給藥途徑。在一些實施方案中，周期性地重復給藥。在一個實施方案中，腹膜內(nèi)給予組合物。在一個實施方案中，靜脈內(nèi)給予組合物。在另一實施方案中，腫瘤內(nèi)給予組合物。這些治療組合物可以被給予患者，優(yōu)選懸浮于生物相容的溶液或藥學可接受遞送介質(zhì)。組合物的各種組分被制備為藥通過懸浮或溶解于藥學或生理學可接受的載體來進行給，例如等滲鹽水，等滲鹽溶液或本領域技術(shù)人員容易獲知的這樣給藥的其他制劑。合適的載體對于本領域技術(shù)人員是可簡單確定的，并且很大程度上取決于給藥途徑。已知可作為藥學可接受載體的和本領域技術(shù)人員公知的其他水性和非水性等滲無菌注射溶液以及水性和非水性無菌懸液可以用于該目的。這些治療組合物的劑量主要取決于某些因素，例如組合物類型(即，t細胞、載體、核酸構(gòu)建體或蛋白)，待治療的疾病狀態(tài)，患者的年齡、體重和健康水平，并且可以在患者之間有所不同。在一個實施方案中，以2×106至200×106個經(jīng)修飾的t細胞的多個劑量給予含有經(jīng)修飾的t細胞的組合物?？梢赃x擇之間的任何值，取決于個體患者的狀態(tài)和應答。作為另一實例，過繼性轉(zhuǎn)移的抗腫瘤t細胞的數(shù)目可以由本領域技術(shù)人員優(yōu)化。在一個實施方案中，這樣的劑量范圍可以為每公斤個體體重約105至約1011細胞。在另一實施方案中，抗腫瘤t細胞的劑量為每公斤體重約1.5×105細胞。在另一實施方案中，抗腫瘤t細胞的劑量為每公斤體重約1.5×106細胞。在另一實施方案中，抗腫瘤t細胞的劑量為每公斤體重約1.5×107細胞。在另一實施方案中，抗腫瘤t細胞的劑量為每公斤體重約1.5×108細胞。在另一實施方案中，抗腫瘤t細胞的劑量為每公斤體重約1.5×109細胞。在另一實施方案中，抗腫瘤t細胞的劑量為每公斤體重約1.5×1010細胞。在另一實施方案中，抗腫瘤t細胞的劑量為每公斤體重約1.5×1011細胞。這些方法也考慮這些具體量內(nèi)的其他劑量。在另一實施方案中，病毒載體的治療有效的成人或獸醫(yī)劑量通常的范圍是約100μl至約100ml載體，所述載體含有濃度為約1×106至約1×1015個顆粒，約1×1011至1×1013個顆粒，或約1×109至1×1012個顆粒的病毒。含有蛋白的組合物的給藥可以范圍為0.01mg至100mg蛋白的單位劑量(等同于約12.5μg/kg體重)。確定給藥的頻率時機(加強劑)的方法會包括評價腫瘤對給藥的相應。在其他實施方案中，通過給予本文所述組合物治療癌癥的這些方法是與癌癥的各種其他處理或治療的聯(lián)合治療的一部分。在一個實施方案中，方法包括給予例如il-7的細胞因子治療作為腫瘤特異性宿主條件化策略。外源給予il-7還能特異性地提高foxp1缺陷型t細胞的體內(nèi)活性。在另一實施方案中，方法還包括給予個體本文所述組合物以及附加抗癌治療，附加抗癌治療可以包括單克隆抗體、化學療法、放射治療、細胞因子或它們的組合。在另一實施方案中，本文的方法可以包括共同給藥或治療過程，其也使用用于癌癥的控制和治療的其他小核酸分子或小化學分子或治療或治療劑。在一個實施方案中，本發(fā)明的治療方法包括在適合癌癥治療的條件下使用一種或多種藥物治療。如上文提及的，在一些實施方案中，手術(shù)減瘤是是去除大腫瘤塊的必要操作，并且可以在施用本文所述的方法和組合物之前、過程中或之后進行。在其他實施方案中，化學療法和放射療法支持本文所述方法的效果。這樣的聯(lián)合方式(手術(shù)加化學療法/放射加免疫治療)預期與本文所述方法一起用于治療很多癌癥中會成功。在其他實施方案中，治療具有表達fshr的癌癥或腫瘤的個體的方法包括在給予本文所述組合物之前實施以下步驟。在一個實施方案中，所述方法包括從個體移除t細胞和用表達嵌合蛋白的載體離體轉(zhuǎn)導t細胞。在另一實施方案中，在用本文所述核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)導移除的t細胞之前或之后，移除的t細胞被處理為消除或降低t細胞中的fox-p1表達。在另一方法中，在給藥前，移除的、經(jīng)處理的t細胞被培養(yǎng)以從細胞離體去除foxp1。另一方法步驟包括在給藥前將t細胞配制于合適的藥學載體。也可以冷凍移除的、經(jīng)處理的t細胞，用于后續(xù)解凍和給藥。治療方法還可以包括從個體提取t細胞，用于修飾和離體細胞擴增，隨后用化學療法治療個體并消耗個體的淋巴細胞，以及任選地，手術(shù)切除腫瘤?？梢栽谙騻€體給予經(jīng)修飾的t細胞或其他組合物之前進行這些步驟?，F(xiàn)結(jié)合以下實施例描述本發(fā)明。提供這些實施例僅是舉例說明的目的。在本申請的教導下，可以制備和實施本文公開的和/或請求保護的組合物、實驗操作和方法，不需要過度實驗。實施例中描述的操作和方法不應考慮為限制請求保護的發(fā)明的范圍。事實上，本說明書應當解釋為涵蓋從本文提供的教導能夠容易得出的任何和全部變化形式。本領域技術(shù)人員應當理解，可以在實施例公開的實施方案中進行這樣的改變或變化，并且預期能獲得相似結(jié)果。例如，與本文所述的試劑在化學或生理學相關(guān)的試劑替換預期能產(chǎn)生相同或相似結(jié)果。所有這樣相似的替換和修飾是本領域技術(shù)人員容易獲知的，并且落入本發(fā)明的范圍。實施例1：人和小鼠的靶向fshr的構(gòu)建體的制備我們制備了針對小鼠fshr的新的全鼠源的本文所述的構(gòu)建體，其包含成功用于人類患者的小鼠形式的全部信號。為了靶向fshr，我們合成了構(gòu)建體，其表達信號肽隨后為內(nèi)源fsh的兩個亞基(α和β)，通過連接子隔開(參見圖1)。該靶向基序與以下同框克?。簛碜允骾gg(例如cd8α)的鉸鏈結(jié)構(gòu)域，隨后為cd8α的跨膜結(jié)構(gòu)域，共刺激調(diào)節(jié)物(例如，鼠4-1bb或cd28)的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，最后為活化cd3ζ結(jié)構(gòu)域。我們還制備了具有對應人序列的構(gòu)建體(參見圖5，表1，seqidnos：1和2)。制備表達fshr的構(gòu)建體的人變體以界定領袖制劑并證明小鼠中實驗的相關(guān)性。用含有fsh靶向構(gòu)建體逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒儲備液轉(zhuǎn)導來自健康供體的人hla-a2+t細胞(>50％的高加索人為a2+)，所述構(gòu)建體被優(yōu)化用于細胞毒性測試。制備與上文所述的小鼠序列相似的同框構(gòu)建體，以比較cd28與4-1bb/cd137。cd28是可選的胞內(nèi)共刺激基序，原因在于，雖然在公開的car-t細胞實驗中，表達4-1bb/cd137的t細胞在異種移植物模型中表現(xiàn)出增強的持久性，未知的是t細胞的長期存活在多次注射中是優(yōu)選的。另外，測試了人fsh的α亞基的兩種人變體(nm_000735.3與nm_001252383.1)。這兩種亞基具有不同長度，并且具有促進不同結(jié)合親和力的可能性?？傊?，克隆(同框)用于表達至病毒載體的8種變體為：1)cgα(長)+4-1bb；2)cgα(長)+cd28；3)cgα(短)+4-1bb；和4)cgα(短)+cd28(參見圖8)。僅使用fsh的β亞基(其提供fshr結(jié)合的特異性)和也結(jié)合fshr的β亞基的15個氨基酸的結(jié)合區(qū)(例如，fshβ的seqidno：2的氨基酸19-32的片段或上文鑒定的其他fshβ片段)設計其他構(gòu)建體。實施例2：fsh構(gòu)建體特異性響應于fshr+腫瘤細胞。測試了逆轉(zhuǎn)錄病毒(psfg)與慢病毒(pelns)載體去將攜帶fshr的構(gòu)建體轉(zhuǎn)導入人t細胞。沒有正式的證據(jù)表明慢病毒載體在離體轉(zhuǎn)導中是優(yōu)異的。最重要的是，在十年來安全使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體后，關(guān)于在t細胞中插入基因之后的插入性腫瘤形成的風險擔憂很小。特別是在臨床試驗中，psfg載體已被使用很多次用于相似的t細胞逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導41,42。制備表達這些構(gòu)建體的逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒儲備液，并將其用于轉(zhuǎn)導來自健康hla-a2供體(>50％高加索人)的人t細胞。逆轉(zhuǎn)錄病毒儲備液被用于轉(zhuǎn)導cd3/cd28活化的t細胞脾細胞，其被基于共表達gfp進行facs分選。然后，測試表達實施例1的fsh核酸構(gòu)建體的經(jīng)修飾的t細胞針對fshr或模擬對照轉(zhuǎn)導的id8-defb29/vegf-a卵巢癌細胞的結(jié)合特異性。如圖2所示，用fhsr靶向構(gòu)建體轉(zhuǎn)導的t細胞的共同孵育引起ifn-γ分泌，而攜帶無關(guān)的間皮素靶向構(gòu)建體(k1)的t細胞未觀察到這樣的結(jié)果。進一步支持fshr識別的特異性，在模擬對照轉(zhuǎn)導的(天然fshr)腫瘤細胞的存在下，ifn-γ分泌不發(fā)生。實施例3：表達fsh構(gòu)建體的t細胞的腫瘤內(nèi)給藥延遲fshr+乳腺腫瘤的進展。為了了解靶向fshr的經(jīng)修飾的t細胞在免疫活性小鼠體內(nèi)的可能功效和安全性的信息，我們還用小鼠fshr轉(zhuǎn)導a7c11乳腺癌細胞，a7c11乳腺癌細胞是從本體p53/kras突變的腫瘤產(chǎn)生的細胞系。然后，用側(cè)腹腫瘤攻擊同系小鼠，通過腹膜內(nèi)注射給予等同處理的106靶向fshr的經(jīng)修飾的t細胞或模擬對照轉(zhuǎn)導的t細胞。如圖3所示，靶向fshr的經(jīng)修飾的t細胞的單次給藥足以顯著延遲建立的側(cè)腹腫瘤的進展，而沒有明顯副作用。這些結(jié)果支持單獨使用靶向fshr的經(jīng)修飾的t細胞或與其他臨床可用免疫治療組合來對抗卵巢原位腫瘤。相比于使用靶向人fshr的構(gòu)建體，在免疫缺陷小鼠中，使用小鼠fsh作為靶向基序?qū)τ诎邢騠shr的經(jīng)修飾的t細胞的效果具有更好的預測性，因為：1)表達小鼠fsh的t細胞可能靶向于表達內(nèi)源fshr的身份不明的健康細胞(不同于給予免疫缺陷小鼠的表達人fsh的t細胞)；2)某些t細胞(例如，cer-t細胞)能通過經(jīng)由抗原傳播增強預先存在的t細胞應答和降低免疫抑制負荷而加強多克隆抗腫瘤免疫；和3)fsh和其特異性受體之間的相互作用是高度保守的。為了證實含有fshr構(gòu)建體的t細胞特異性針對fshr+腫瘤細胞的細胞毒性潛力，我們再次將fshr構(gòu)建體或模擬對照轉(zhuǎn)導的t細胞與fshr+id8-defb29/vegf-a33(卵巢腫瘤)或a7c1134(從本體p53/kras突變的乳腺腫瘤的實驗室產(chǎn)生的細胞系34)細胞一起孵育(按40：1的比率，孵育24h)，并通過計數(shù)臺盼藍陰性(活)腫瘤細胞測定細胞毒性殺傷。如圖7a和7b所示，fshcert細胞消除兩種類型的腫瘤細胞，但是模擬對照轉(zhuǎn)導的淋巴細胞未觀察到該結(jié)果。在mts測試中獲得相當?shù)慕Y(jié)果(未顯示)，進一步支持fsh靶向基序能以fshr特異性方式引發(fā)cer介導的t細胞細胞毒性活性。實施例4：免疫活性宿主的臨床前卵巢癌模型中表達fsh配體的經(jīng)修飾的t細胞的功效與毒性為了界定在免疫活性臨床前腫瘤模型中使用靶向fshr的經(jīng)修飾的t細胞的免疫學結(jié)果，所述模型包括內(nèi)源fsh可能結(jié)合(在患者中會發(fā)生)的全部健康組織，我們用全部靶向和活化結(jié)構(gòu)域的小鼠對應物制備了新的核酸構(gòu)建體。參見表3，圖6c和seqidnos4和5。我們驗證了靶向fshr的經(jīng)修飾的t細胞表現(xiàn)出對表達fshr的細胞選擇性活性的假設，破壞腫瘤進展，同時在小鼠中不造成明顯副作用。這些結(jié)果界定了該有前景的治療對卵巢癌的效果，并確保其對該方法未來應用于臨床的安全性。我們利用侵襲性原位id8-vegf/defb29腫瘤，其已被小鼠fshr轉(zhuǎn)導和選擇。我們使用轉(zhuǎn)導的母體id8細胞和/或本體p53依賴性誘導型腫瘤模型或我們衍生的細胞系而證實選擇的發(fā)現(xiàn)的一般應用性。實施例5：小鼠臨床試驗：界定靶向fshr的經(jīng)修飾的t細胞對人卵巢癌的功效我們用全部人結(jié)構(gòu)域制備了構(gòu)建體(參見圖5)，將其用于我們建立的nsg小鼠中原發(fā)性腫瘤衍生的異種移植物的隊列。通過使用相同患者的腫瘤和t細胞，我們模擬有限的臨床試驗，其概括臨床卵巢癌的異質(zhì)性。我們假設，靶向fshr的經(jīng)修飾的t細胞能有效對抗來自不同患者的建立的fshr+卵巢癌，并且與靶向tme的組合式干預協(xié)同作用。通過在多種臨床前模型中建立靶向fshr的經(jīng)修飾的t細胞的功效和可能毒性，我們提供機制性原理來測試這些t細胞作為針對卵巢癌的潛在治療。通過使用fshr作為特異性腫瘤靶標和包含fsh序列作為靶向基序的配體，我們克服了阻止多種技術(shù)對于上皮腫瘤成功的某些挑戰(zhàn)。為了界定靶向fshr的經(jīng)修飾的t細胞在免疫活性宿主中的體內(nèi)全譜活性，我們制備了全鼠源的靶向fshr的經(jīng)修飾的t細胞。在腫瘤攻擊后7天，(cd45.1+，同系)用106腹腔注射抗靶向fshr的經(jīng)修飾的t細胞治療(cd45.2+)攜帶建立的(fshr+和fshr-)卵巢腫瘤的小鼠(n≥10/組)。對照小鼠接受模擬對照轉(zhuǎn)導的t細胞。我們比較存活作為公認的功效讀數(shù)。根據(jù)這些結(jié)果給予靶向fshr的經(jīng)修飾的t細胞的額外注射。在不同小鼠中，在腫瘤攻擊后14、21和28天，我們追蹤(特異性cd45.1+)轉(zhuǎn)移的cd4和cd8t細胞的歸巢和持續(xù)性。包括來自脾、引流(縱膈)淋巴結(jié)、骨髓和腫瘤床(腹膜清洗)的樣品。包括轉(zhuǎn)移淋巴細胞中活化(例如，cd44，cd69，cd27，cd25)與耗竭(例如，pd-1，lag3)標志物的詳細分析。另外，分析了bm和淋巴結(jié)中靶向fshr的經(jīng)修飾的t細胞的可能的中樞記憶分化(同系)，作為長期植入和持久保護的可能預測指標。實施例6：靶向fshr的經(jīng)修飾的t細胞對有抗腫瘤免疫的效果我們確定靶向fshr的經(jīng)修飾的cer-t細胞通過抗原傳播和降低免疫抑制負荷對進行中的抗腫瘤免疫應答的效果。為了該目的，我們用靶向fshr的經(jīng)修飾的cer-t細胞和模擬對照轉(zhuǎn)導的t細胞治療攜帶腫瘤的小鼠，并且在過繼性轉(zhuǎn)移后7和14天(腫瘤后14和21天)，facs分選來自腫瘤和淋巴位置的內(nèi)源(cd3+cd8+cd45.2+)t細胞。通過ifnγ和顆粒酶belispot分析定量可歸因于受治療影響的已有t細胞的抗腫瘤免疫應答的程度。內(nèi)源t細胞中的活化與耗竭標志物還界定靶向fshr的經(jīng)修飾的t細胞的效果。為了界定針對這些組合式干預可能引起的復發(fā)的免疫保護，如果小鼠排斥它們的腫瘤，則再次攻擊小鼠。實施例7：靶向fshr的經(jīng)修飾的t細胞可能誘導的短期和長期毒性t細胞過繼性轉(zhuǎn)移方案在短期的主要擔憂是出現(xiàn)細胞因子釋放綜合征，其是系統(tǒng)性炎癥反應，誘導非感染性發(fā)熱并且與高水平tnfα和il-6相關(guān)。除了明顯的疾病指征(例如，毛皮褶皺)，我們首先監(jiān)測治療與對照小鼠的溫度和細胞因子水平。如果細胞因子釋放綜合征頻繁出現(xiàn)，我們界定是否使用類皮質(zhì)激素或il6清除能使其成為可控事件。沒有報道表明fshr能表達于卵巢或睪丸之外的正常組織；因此，我們預期不會有長期副作用。但是，我們監(jiān)測治療小鼠的任何肉眼改變直至治療后4個月。實施例8：患者衍生的異種移植物的小鼠臨床試驗我們移植我們收到的新鮮的晚期卵巢癌(約2-3樣本/月)。新鮮樣本被通過速遞在切除后2h內(nèi)遞送，并且通過優(yōu)化的手術(shù)操作將約1mm3的團塊移植入nsg(重度免疫缺陷)小鼠的卵巢囊。重要的是，我們收到來自相同患者的外周血，并且立即冷凍保存血沉棕黃層。在最近2個月，我們用7個不同樣本攻擊約35只小鼠。盡管腫瘤進展緩慢，但是大部分腫瘤在約45天內(nèi)變得可觸感和可見。每月收到約2-3個新的新鮮樣本。我們?yōu)閬碜圆煌颊叩摹?0個原發(fā)性腫瘤制備異種移植物。小鼠被用于界定靶向fshr的經(jīng)修飾的t細胞對抗異種人卵巢腫瘤的功效。為了該目的，我們cd3/cd2擴增和轉(zhuǎn)導靶向fhsr的構(gòu)建體至來自相同患者的t細胞，由此模擬其可能的臨床應用。我們已用圖1所示對應的人內(nèi)源fsh、、鉸鏈和跨膜結(jié)構(gòu)域以及共刺激4-1bb和活化cd3ζ基序(全人序列-參見圖5)制備fsh靶向型經(jīng)修飾的t細胞。我們通過western印跡分析確定每種異種移植物中fshr的表達，從而界定其如何預測功效。來自健康供體的具有匹配hla的t細胞可以被轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)移。為了界定靶向fshr的經(jīng)修飾的t細胞對抗卵巢癌的功效，我們使用我們的移植人卵巢癌樣本(≥3只小鼠/腫瘤；10名不同患者)的自體外周血。擴增t細胞，用靶向人fshr的核酸構(gòu)建體或空載體(和/或無關(guān)人cart19)進行轉(zhuǎn)導，并過繼性轉(zhuǎn)移入被同時攻擊的攜帶異種移植物的nsg小鼠。通過觸診和超聲監(jiān)測腫瘤生長，并且當腫瘤通過腹部突出時處死小鼠，或者如果小鼠表現(xiàn)出危急或晚期疾病的指征，則更早地處死小鼠。腫瘤生長、轉(zhuǎn)移和存活被定量為功效讀數(shù)。界定腫瘤生長如何被影響作為fshr表達的函數(shù)，在匹配手術(shù)樣本中使用wb分析。我們分解腫瘤樣本來確定轉(zhuǎn)移t細胞在存在和缺少靶標(不具有內(nèi)源淋巴細胞的nsg小鼠)情況下的積累。測定骨髓和淋巴結(jié)位置處靶向fshr的經(jīng)修飾的t細胞的持續(xù)性，并與靶向激素受體(fshr)的表達和功效相關(guān)。實施例9：調(diào)節(jié)免疫抑制來增強靶向fshr的經(jīng)修飾的t細胞活性對抗卵巢癌的效果。針對實體瘤的過繼性t細胞轉(zhuǎn)移干預的潛在挑戰(zhàn)是tme中的免疫抑制網(wǎng)絡消除外源t細胞的保護性活性的前景。為了調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境從而降低其免疫抑制效果和增加存活，用靶向fshr的經(jīng)修飾的t細胞施加附屬方法。為了引發(fā)腫瘤排斥和持續(xù)保護，靶向fshr的經(jīng)修飾的t細胞與臨床可獲得的pd-1抑制劑聯(lián)合給藥(或?qū)φ战M中單獨的pd1阻斷劑)。以腫瘤細胞中pd-l1表達的函數(shù)監(jiān)測功效?；蛘撸覀冏钄嘟邮馨邢騠shr的經(jīng)修飾的t細胞的小鼠中卵巢癌微環(huán)境的其他免疫抑制通路，包括tgf-β(對其的阻斷抗體最近被開發(fā)出來)和il-10?？傊衔膶嵤├C實，我們靶向g蛋白偶聯(lián)受體(fshr)，其表達于大部分腫瘤的卵巢癌細胞表面并且還未被用于基于t細胞的干預。為了增強特異性和受體：配體相互作用，我們使用內(nèi)源激素作為靶向基序，從而提供攜帶這些基序的人對應物的靶向fshr的經(jīng)修飾的t細胞的臨床測試的機理。我們使用內(nèi)源配體(激素)，與抗fshr抗體或抗體片段作為配體相反，來確保功效或特異性。我們證實，針對fshr的經(jīng)修飾的t細胞是安全的，并且不誘導明顯體內(nèi)毒性。與本申請最相關(guān)的是，靶向fshr+腫瘤細胞的經(jīng)修飾的t細胞的細胞毒性活性通過抗原傳播加強已有淋巴細胞應答，由此加強多克隆抗腫瘤免疫。另外，我們界定whetherof卵巢癌微環(huán)境中運行的抑制網(wǎng)絡的組合式靶向是否解除靶向fshr的經(jīng)修飾的t細胞和來自能抑制其保護性活性的致耐受性通路的腫瘤浸潤淋巴細胞的束縛。因此，本申請在多個概念和實驗水平上具有創(chuàng)新性。我們利用新鮮的、原位移植的原發(fā)性卵巢癌異種移植物的集合來反映人類疾病在fshr表達和應答變化性方面的異質(zhì)性。特別是，我們預期上述研究能證實，與接受模擬對照轉(zhuǎn)導的t細胞的對照相比用靶向fshr的經(jīng)修飾的t細胞治療的攜帶卵巢癌的小鼠如何顯著增加存活(甚至在某些病例中腫瘤排斥)。因此，我們與對照t細胞相比在較長的時間段體內(nèi)鑒定治療的小鼠中靶向fshr的經(jīng)修飾的t細胞。因為骨髓是我們的系統(tǒng)中記憶t細胞的儲存庫，因此骨髓是我們觀察到的持續(xù)性靶向fshr的經(jīng)修飾的t細胞的微環(huán)境。靶向fshr的經(jīng)修飾的t細胞對腫瘤珠處的耗竭機制較為不敏感?？傊?，這些結(jié)果被理解為靶向fshr的經(jīng)修飾的t細胞的治療潛能的證據(jù)，并且為后續(xù)臨床測試鋪路。數(shù)據(jù)預期能證明，靶向fshr的經(jīng)修飾的t細胞誘導已有t細胞的次優(yōu)的、但可測量的抗腫瘤活性的顯著加強，正如elispot分析所定量的。靶向fshr的經(jīng)修飾的t細胞和內(nèi)源淋巴細胞的聯(lián)合活性相應地賦予針對排斥建立的腫瘤的那些小鼠的復發(fā)保護。這突出了靶向fshr的經(jīng)修飾的t細胞在引發(fā)對腫瘤復發(fā)的多克隆免疫記憶的潛能，即使腫瘤在過程中丟失靶向的fshr。數(shù)據(jù)預期能證明對卵巢癌不存在長期(例如，自身免疫)顯著不利作用，因為fshr的表達局限于卵巢(包括所有有核細胞)。我們不能排除以下可能性：靶向fshr的經(jīng)修飾的t細胞的急性給藥會導致類似感冒的癥狀，但是這不太可能導致細胞因子釋放綜合征。總之，這些數(shù)據(jù)進一步支持在卵巢癌患者中使用靶向fshr的經(jīng)修飾的t細胞。數(shù)據(jù)預期能證明，>50％的原發(fā)性腫瘤最終以指數(shù)方式在nsg小鼠中生長，并允許依次植入不同小鼠。50-70％的這些腫瘤表達表面fshr。盡管我們已經(jīng)證實移植人培養(yǎng)的卵巢細胞(其可以用作備選或補充方式)的可行性，但是這樣的資源概括了人類疾病的異質(zhì)性。數(shù)據(jù)預期能證明，靶向fshr的經(jīng)修飾的t細胞還能有效對抗表達fshr的異種移植的人卵巢癌，但不對抗fshr-腫瘤。因此，我們預計，具有較高fshr表達水平的腫瘤是更好的響應者。因此，我們發(fā)現(xiàn)fshr高腫瘤攜帶宿主中經(jīng)修飾的t細胞的增強的持久性，更強的浸潤(由于fsh誘導的增殖)和較少的耗竭。這些結(jié)果進一步支持本文所述的靶向fshr的組合物的特異性和治療潛能。pd-1抑制劑與靶向fshr的經(jīng)修飾的t細胞的組合促進pd-l1+腫瘤的排斥，同時使用個體治療僅觀察到惡性腫瘤進展中顯著的延遲?？紤]到pd-1阻斷劑初現(xiàn)的臨床成功，我們預期，它們總體上會優(yōu)于其他靶向免疫抑制的干預，如論如何這在pd-l1-腫瘤中是更有效的。整合細胞學和分子學免疫療法的組合式干預具有后續(xù)臨床測試的明顯暗示意義。實施例10：人t細胞中cer變體的表達我們使用來自健康hla-a2+供體(>50％的高加索人)的分血法的外周血，以最小化當轉(zhuǎn)導的t細胞與(a2+)腫瘤細胞共同孵育時的同種異體反應。我們使用5,29,30,44,45所述的方法和資源。簡言之，從分血法產(chǎn)物去除單核細胞，并在5％正常人ab血清中使用偶聯(lián)抗cd3(okt3)和抗cd28(克隆9.3)抗體(3：1的珠/cd3+細胞比)的珠擴增t細胞。在刺激后第1天，在retronectin包被的培養(yǎng)板、50ui/ml的il-2和1ng/ml的il-7的存在下，將t細胞暴露于編碼fsh靶向型構(gòu)建體變體(moi～3)的逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒上清物，隨后進行離心接種(1000g，45min，4℃)。第2天，改變培養(yǎng)基并重復離心接種，隨后是長達12天擴增。細胞培養(yǎng)完成后，通過磁分離去除磁珠，清洗細胞并重懸于plasmalytea(baxter)。通過流式細胞術(shù)、使用針對表達于感染的細胞外部的人fshβ的一抗(克隆405326)和pe標記的抗小鼠igg作為二抗，測定轉(zhuǎn)導效率。優(yōu)化人hla-a2+t細胞的轉(zhuǎn)導用于全部變體的細胞毒性測試。實施例11：fsh靶向型cer變體的體外抗腫瘤活性體外熒光素酶分析被用于測試按照上文實施例所述產(chǎn)生的fsh靶向型t細胞變體的功效，即，細胞毒性活性。我們使用人hla-a2+ovcar3卵巢癌細胞19，其也已知為表達高水平的fshr20,46。通過使用hla-a2+ovcar3t細胞(表達50％的高加索人和35％的非裔美國人中存在的最常見hla類型)，我們可以使用來自多種供體的t細胞，而不會引發(fā)同種免疫應答。因此，我們將細胞毒性殺傷的引發(fā)限制于fshr受體的特異性識別。我們還測量了轉(zhuǎn)導的t細胞響應于表達fshr的腫瘤細胞的ifn-γ產(chǎn)生。表現(xiàn)出最佳的細胞毒性活性和ifn-γ產(chǎn)生組合的兩種表達fshr的t細胞變體被選擇用于后續(xù)體內(nèi)測試。用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pbabe-luc-puro的轉(zhuǎn)染使得ovcar3細胞自發(fā)表達螢火蟲熒光素酶，并允許嘌呤霉素抗性基因的選擇。本文所述的靶向人hla-a2+fsh的構(gòu)建體轉(zhuǎn)導的t細胞被用作效應物。如果多于60％的t細胞被轉(zhuǎn)導，t細胞被認為已準備好用于分析。如果少于60％的t細胞被轉(zhuǎn)導，我們通過facs分選fsh+細胞來富集轉(zhuǎn)導的t細胞。在克隆選擇和擴增表達熒光素酶的ovcar3(ovcar3-luc)后，我們每孔接種10000個細胞，并與表達不同fsh構(gòu)建體變體的t細胞以1：1、1：5、1：10和1：20的比率(腫瘤細胞：t細胞)共培養(yǎng)。我們還有無t細胞的條件作為陰性對照(無細胞死亡)和用tritonx處理的另一條件作為最大腫瘤細胞死亡的陽性對照。接種細胞共培養(yǎng)后18小時，我們?nèi)コ囵B(yǎng)基，清洗孔，裂解細胞添加熒光素酶底物。我們測量熒光素酶信號的量，以測定ovcar3-luc細胞被fsh靶向型cert細胞的特異性溶解。實施例12：所有cert細胞變體中響應于fshr的ifn-γ產(chǎn)生可能對治療功效重要的另一參數(shù)是效應物細胞因子的產(chǎn)生，其可以影響體內(nèi)免疫環(huán)境。作為補充，我們以1：1、1：10和1：20的腫瘤細胞與t細胞比共培養(yǎng)ovcar3細胞和表達fsh靶向型構(gòu)建體的不同變體的t細胞，并在18小時收集上清，用于通過elisa測定ifnγ產(chǎn)生。如果時間允許，我們還通過與fshr+腫瘤細胞孵育的fsh靶向型轉(zhuǎn)染t細胞的胞內(nèi)染色測定ifn-γ產(chǎn)生，以及其他細胞因子，例如tnf-α(elisa)和顆粒酶b(胞內(nèi)染色)。這些實驗(至少)以3平行樣品進行，并重復3次，以取得統(tǒng)計學顯著性(p<0.05)，使用mann-whitney檢驗。我們鑒定兩種fsh靶向型構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的t細胞變體，用于下一步研究和體內(nèi)體系的開發(fā)。我們按照優(yōu)先級選擇提供以下的fsh靶向型cer變體：1)不同比率下最高百分比的特異性ovcar3-luc細胞溶解；2)選擇最高水平的ifn-γ分泌。當在不同比率存在不同最佳候選物時，我們選擇在最低比率下具有最高特異性溶解的候選物。如果所有變體表現(xiàn)相似活性，我們優(yōu)先使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，包括cd28替代4-1bb，和較短的cgα變體。如果沒有差異，我們選擇表現(xiàn)較高轉(zhuǎn)導效率的變體。如果ovcar3細胞的靶向fshr的殺傷是次優(yōu)的，我們使用caov-3卵巢癌細胞(atcc#htb-75)，其還共表達fshr和hla-a2。在這種情況下，該細胞系用于后續(xù)體內(nèi)測試。實施例13：卵巢癌異種移植物中體內(nèi)測試fshr構(gòu)建體變體我們比較上文實施例鑒定的兩種領袖cert細胞變體的體內(nèi)功效。ovcar3細胞(hla-a2+19；fshr+20)被植入nsg(嚴重免疫缺陷)小鼠的卵巢囊9。如下所述，用hla-a2+cert細胞治療攜帶原位腫瘤的小鼠。腫瘤塊(～1mm3)來源于tov-21g卵巢透明細胞癌細胞，植入免疫缺陷小鼠的側(cè)腹，在約1個月內(nèi)移植入nsg小鼠的卵巢囊。受攻擊的卵巢被惡性腫瘤生長占據(jù)，并與左對側(cè)卵巢比較。腫瘤(圖中未顯示)特別具有侵襲性，并生長約21天。我們還用來自相同新鮮分解的原發(fā)性卵巢癌樣本的腫瘤塊(右側(cè)卵巢)或單細胞懸液攻擊小鼠。為了界定fsh靶向型構(gòu)建體轉(zhuǎn)導的t細胞針對fshr+卵巢癌的功效，我們使用表現(xiàn)細胞毒性活性和ifn-γ產(chǎn)生的最佳組合的兩種cert細胞變體。如果所有變體表現(xiàn)相似活性，我們優(yōu)先使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，包括cd28替代4-1bb，和較短的cgα變體。通過超聲和/或觸診表現(xiàn)相似尺寸的建立的原位卵巢腫瘤的小鼠(≥5只小鼠/組)接受用靶向fshr的構(gòu)建體轉(zhuǎn)導的兩種變體轉(zhuǎn)導的t細胞，或模擬對照轉(zhuǎn)導的t細胞作為可選對照。如果達到<60％轉(zhuǎn)導，將陽性轉(zhuǎn)導的t細胞進行facs分選，并允許在治療前靜置2h。在這些分析中給予107靶向fshr的構(gòu)建體轉(zhuǎn)導的t細胞/注射，兩次注射間隔14天(腹膜內(nèi)注射，配制于pbs)。通過觸診和超聲監(jiān)測腫瘤生長，并且當腫瘤通過腹部突出時處死小鼠，或者如果小鼠表現(xiàn)出危急或晚期疾病的指征，則更早地處死小鼠。腫瘤生長、轉(zhuǎn)移和存活被首先定量為公認的功效讀數(shù)。實施例14：攜帶腫瘤的小鼠中兩種cert細胞變體的體內(nèi)持久性長期保護相關(guān)的重要參數(shù)是能在腫瘤復發(fā)時產(chǎn)生新一波的t細胞效應物的中樞記憶fsh靶向型構(gòu)建體轉(zhuǎn)導的t細胞的持久性。為了確定什么樣的cert細胞變體在體內(nèi)持續(xù)更長時間，我們用fsh靶向型構(gòu)建體轉(zhuǎn)導的t細胞等同地治療不同生長ovcar3的小鼠(≥5只小鼠/組)，并監(jiān)測它們聚集和駐留的位置。首先，在過繼性轉(zhuǎn)移后14和28天，使用解離的腫瘤組織、骨髓(中樞記憶t細胞的儲存庫)、淋巴結(jié)和脾樣品，通過facs分析測定轉(zhuǎn)移的t細胞的積累。我們使用人cd3，因為nsg小鼠不具有內(nèi)源淋巴細胞。測定它們在淋巴和bm位置的記憶歸屬(cd62l+cd45ra-cd122+cd127+)。如果在fsh靶向型t細胞給藥時小鼠排斥腫瘤，我們用ovacr3側(cè)腹腫瘤再攻擊它們，并且與天然(未處理)nsg小鼠的腫瘤進展進行比較?；谖覀冎暗挠^察，我們預期，每組5只小鼠應當提供5％的顯著水平和95％的效力來使用mann-whitney或wilcoxon檢驗檢測20％或更高的差異。實驗使用至少5只小鼠/組(加上重復)，并且根據(jù)這些統(tǒng)計學參數(shù)進行分析。由此，我們鑒定fsh靶向型t細胞領袖變體，其被用于最終臨床前優(yōu)化。選擇的候選者按照重要性表現(xiàn)以下的組合：1)針對建立的腫瘤生長的最強功效；2)淋巴或骨髓位置的中樞記憶分化；和3)優(yōu)異的總體體內(nèi)持久性?；谥委煱籽〉呐R床證據(jù)12,38,48，我們的理論是，fsh靶向型t細胞的持久性對于長期緩解是重要的。如果fsh靶向型構(gòu)建體轉(zhuǎn)導的t細胞變體都表達cd28并且不能持續(xù)至少2周，我們還測試攜帶使用4-1bb的構(gòu)建體的t細胞的體內(nèi)功效。如果實現(xiàn)相當?shù)哪[瘤減小，我們會選擇cd28作為共刺激結(jié)構(gòu)域。我們使用caov-3卵巢癌細胞補充這些實驗，caov-3卵巢癌細胞表達更高水平的fsh受體并且是hla-a2+。實施例15：單劑量給藥的最大耐受劑量(mtd)界定mtd的實驗計劃包括：(1)向攜帶腫瘤的免疫活性小鼠中給予單劑量(2×106，107和5×107)小鼠t細胞；(2)向攜帶人腫瘤的免疫缺陷小鼠中給予單劑量(2×106，107和5×107)人t細胞；和(3)向無腫瘤免疫活性小鼠中給予單劑量(2×106，107和5×107)小鼠t細胞。從這些實驗獲得單劑量mtd之后，進行以下實驗：(4)在21、28和32天向攜帶腫瘤的免疫活性小鼠中給予多劑量mtd(小鼠t細胞)；(5)向攜帶人癌癥的免疫缺陷小鼠給予多劑量mtd(人t細胞)(3次，間隔一周)；和(6)在0、7和14天向無腫瘤的免疫活性小鼠給予多劑量mtd(小鼠t細胞)。這些實驗的結(jié)果界定多劑量mtd。這些實驗提供后續(xù)開發(fā)fsh靶向型cert細胞用于治療卵巢癌的機理。它們允許鑒定用于臨床干預的領袖變體。為了為立即臨床測試鋪設道路，我們測定我們的fsh靶向型cer領袖的單次輸注最大耐受劑量(mtd)。在輸注fsh靶向型cert細胞后，我們評估腫瘤依賴性、fsh受體特異性和非特異性毒性。免疫活性小鼠的體內(nèi)單劑量逐步升級為了確定單次輸注mtd，在攜帶腫瘤和未攜帶腫瘤的免疫活性小鼠中進行單劑量逐步升級。因此，雖然nod/scid/γc-/-(nsg)小鼠是評估cert細胞對表達fshr的腫瘤的臨床前功效的最佳可用模型，但是小鼠腫瘤異種移植物模型對于測定該具體cert細胞的某些毒理學性質(zhì)是不相關(guān)種類，因為人fsh組分可以不結(jié)合正常小鼠fshr，并因此，該小鼠能過低地預測毒性。由于該原因，我們首先使用待由鼠原代t細胞表達的fsh靶向型cert細胞構(gòu)建體，其含有每個鑒定的基序準確的小鼠對應物的。這些初始實驗的目的是具有內(nèi)源(小鼠fshr)激素受體存在于卵巢和可能身份不明的健康組織的系統(tǒng)。這些研究測試宿主策劃炎癥反應的能力，這與在存在完整免疫系統(tǒng)的情況下癌癥患者中能觀察到的現(xiàn)象相似。因為慢病毒不感染小鼠淋巴細胞，所以用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體實施小鼠原代t細胞中fsh靶向型cer的表達，與i期的結(jié)果無關(guān)?；诟鞣N臨床前模型7,30,43,49,50中具有t細胞過繼性轉(zhuǎn)移5年經(jīng)驗選擇劑量，包括使用fsh靶向型cer淋巴細胞治療免疫活性小鼠的fshr+腫瘤(圖3)?！皹藴省庇行Ш头嵌拘詣┝繛?07個細胞，但是我們已經(jīng)證實低于該劑量的功效。向小鼠輸注2×106、107和5×107模擬對照轉(zhuǎn)導的t細胞，fsh靶向型cert細胞或hbss。因為fshr的表達也被報道為存在于轉(zhuǎn)移性病變中發(fā)現(xiàn)的改變的內(nèi)皮(但是不存在于健康血管)51，以及前列腺癌癥的上皮細胞52，我們?yōu)槊總€方案構(gòu)建兩個獨立實驗：一個使用雄性小鼠，另一個使用雌性小鼠，每個實驗每組5只小鼠。通過不排除健康雄性或雌性組織中內(nèi)源fshr的可能存在，這些實驗界定兩種性別的毒性。在雄性和雌性中，給予fshr轉(zhuǎn)導的id8-defb29/vegf-a卵巢癌細胞來產(chǎn)生散布于腹膜腔的卵巢腫瘤。這些腫瘤也生長于雄性小鼠，雖然較為緩慢并且增殖性稍差。腫瘤注射后5天，向攜帶腫瘤的小鼠輸注t細胞或hbss。因為臨床中其他cart細胞的標準給藥涉及事先淋巴細胞去除28，所以在t細胞過繼性轉(zhuǎn)移前5h，我們以亞致死性方式輻照小鼠(300rads)。所有腫瘤細胞和t細胞是初始腹腔內(nèi)輸注，因為這是臨床中靶向卵巢癌的nci所支持的途徑53。如果兩只或更多只小鼠在特定t細胞劑量表現(xiàn)毒性指征，該劑量的全部小鼠和配對的hbss治療對照被處死進行分析。在這樣的情況下，評估cert細胞的靜脈內(nèi)給藥。攜帶人卵巢癌的小鼠的體內(nèi)單劑量逐步升級這些補充實驗在攜帶ovcar3(fshr+)卵巢癌的nsg小鼠中進行，該小鼠是評估cert細胞對表達fshr的腫瘤的臨床前功效(存活)的最佳可用模型。用研發(fā)用于臨床測試的病毒載體表達fsh靶向型cer。來自hla-a2+健康供體的分血法的去除單核細胞的人t細胞被用于轉(zhuǎn)導(人)fsh靶向型cert細胞變體。因為nsg小鼠不具有t、nk或b細胞，過繼性轉(zhuǎn)移t細胞無論如何會經(jīng)歷自我平衡擴增，使得淋巴細胞去除(亞致死性照射)不是必要的。這些研究的目的在于鑒定局限于使用人t細胞的可能副作用。例如，人il-6已知能在小鼠受體上進行信號轉(zhuǎn)導，并因此可以檢測可能的細胞因子釋放綜合征。在兩組實驗中，監(jiān)測以下讀數(shù)：監(jiān)測小鼠的健康狀態(tài)，并按照1至4的尺度進行分級：1–正常且健康；1.5–一定程度嗜睡，行走稍緩慢；2–行走緩慢并且稍微肢體拖拽；2.5–移動時肢體拖拽；3–縮團姿勢且移動很少；3.5–仰面躺姿，觸摸時不移動或移動很少；4–死亡。t細胞輸注后6至20小時處死小鼠隊列(≥5/組)，并記錄它們的健康狀態(tài)。記錄存在cer和hbss下的可能差異和存在和不存在腫瘤之間的可能差異。如果小鼠表現(xiàn)3-4級健康惡化的指征，則收集血清用于定量il-6循環(huán)水平，因為該細胞因子造成一些患者中觀察到的細胞因子釋放綜合征。我們還測量和記錄t細胞輸注的每天和后續(xù)3天的體重。我們繼續(xù)監(jiān)測整個實驗中的體重。如果小鼠在24h內(nèi)表現(xiàn)>10％的體重丟失，將它們處死。否則，將記錄的體重與對照小鼠比較，并且也比較存在和不存在腫瘤的情況。對所有的處死小鼠，以盲法方式分析組織切片。檢查肝、胰腺、脾、小腸、大腸、心臟、腎和肺的h&e染色的組織損傷證據(jù)以及通過ihc檢查(cd45+)炎癥浸潤物的存在。將健康組織的白細胞積累與用cert細胞與hbss治療的小鼠進行比較，并且也比較存在和不存在腫瘤的情況。另外監(jiān)測肺泡腔或氣道中紅細胞是否存在以監(jiān)測急性出血。監(jiān)測接受cer和對照t細胞的單次輸注的無腫瘤的小鼠與攜帶腫瘤的小鼠的存活。如果輸注最高劑量(5×107細胞)的fsh靶向型cert細胞的小鼠遭受嚴重急性毒性，則將它們處死，無論它們是否具有腫瘤。這些實驗界定單次輸注我們的fsh靶向型t細胞的最大耐受劑量。多劑量給藥的最大耐受劑量單劑量mtd可能為2×106至5×107的fsh靶向型cert細胞。為了確定類似于臨床背景的治療方案的fsh靶向型cert細胞的多次給藥的毒性，在輸注fsh靶向型cert細胞后，評價腫瘤依賴性、fsh受體特異性和非特異性毒性。人異種移植物和免疫活性小鼠體系均用于預測臨床背景下的可能副作用。為了確定該劑量的多次輸注是否會導致基于t細胞的體內(nèi)積累或宿主敏感化作用的毒性，通過3次輸注mtd的cert細胞、相同量的模擬對照轉(zhuǎn)導的(對照)t細胞或hbss治療攜帶腫瘤的和未攜帶腫瘤的小鼠。攜帶fshr-轉(zhuǎn)導的id8-defb29/vegf-a卵巢癌的免疫活性小鼠接受用小鼠形式的我們fsh靶向型cer轉(zhuǎn)導的原代小鼠t細胞。用人hla-a2+fsh靶向型cert細胞治療生長fshr+hla-a2+ovcar3人卵巢癌細胞的免疫缺陷小鼠。為了最大化腫瘤相關(guān)毒性的可能性，當腫瘤建立后，在稍晚的時間點治療小鼠。在腫瘤攻擊后21天，缺少治療的情況下腹水變得明顯，開始治療具有原位id8-defb29/vegf-a卵巢腫瘤的小鼠。重復注射，間隔7天(腫瘤攻擊后28和32天)。對于攜帶ovcar3腫瘤的小鼠，當腫瘤變得可觸知或通過超聲確定明顯建立時，啟動治療。給予后續(xù)注射，間隔一周。接受人t細胞的nsg小鼠預期不能在首次輸注30天之前表現(xiàn)gvhd的指征，這提供足夠長的演變期來以功效函數(shù)界定毒性。通過在晚期階段治療腫瘤，我們預期到對用fsh靶向型cert細胞治療的小鼠存在顯著存活益處，但是我們沒有預期完全腫瘤消除。在首次t細胞給藥后28天處死用人cert細胞治療的nsg小鼠。同樣地，每組5只小鼠用于每個實驗。監(jiān)測如上文所述的相同讀數(shù)，即，健康狀態(tài)、體重、組織學和存活。我們沒有預期在第二和第三次給藥后鑒定毒性指征。我們比較腫瘤存在和不存在如何影響毒性。如果發(fā)生在重復注射時觀察到顯著毒性的意外事件，我們逐步下調(diào)第二和第三次輸注，以先前確定的mtd的50％開始，并在最后一次注射給予全劑量。如果毒性繼續(xù)存在，則測試最后兩次注射的后續(xù)降低(50％)。在每次t細胞輸注當天和后續(xù)3天開始評估體重。我們監(jiān)測整個實驗過程中的體重。我們預期在這些輸注后一天體重輕度降低(約1％)，可能是反映操作和注射的應激。但是，我們不會預期大量體重丟失。如果發(fā)生的話，我們逐步下調(diào)第二和第三次注射。我們收集所有的處死小鼠的肝、胰腺、脾、小腸、大腸、心臟、腎和肺，并制備組織切片用于分析明顯的組織損傷和炎癥浸潤物。比較用對照和cert細胞治療后的組織學模式，以及在存在和不存在腫瘤的情況下給藥的組織學模式。監(jiān)測接受多個劑量的cer和對照t細胞的無腫瘤的和攜帶腫瘤的小鼠的存活。我們不會預期未攜帶腫瘤的小鼠的存活存在差異。但是，我們預期，接受多個劑量的fsh靶向型cert細胞的攜帶晚期腫瘤的小鼠會表現(xiàn)出比用對照(模擬對照轉(zhuǎn)導的)t細胞治療的小鼠顯著更長的存活。記錄所有組的存活。實施例16：評價生物標志物監(jiān)測輸注的t細胞的pk/pd的能力對于在早期臨床解釋結(jié)果、確定機制和鑒定可能副作用是重要的。另外，重要的考慮在于，cer可以變得具有免疫原性31,32。我們fsh靶向型cer的內(nèi)源激素的表達最小化那些可能副作用。非正常并列的人信號轉(zhuǎn)導結(jié)構(gòu)域的融合點處產(chǎn)生新的表位(例如，cd28和cd3ζ的連接區(qū)，或cgα和鉸鏈區(qū)的連接區(qū))。cer的免疫原性能導致過繼性轉(zhuǎn)移t細胞的排斥并造成炎癥反應。作為理解fsh靶向型cert細胞的體內(nèi)功能和那些理論上的副作用的手段，我們評價血清中具有細胞活性的特異性生物標志物。使用elisa和標準測試分析血清的以下標志物：細胞因子是cart細胞針對腫瘤細胞的體內(nèi)活性(例如，腫瘤溶解和可能的過敏/炎癥反應的重要預測指標。通過elisa測定治療和對照小鼠的血清中以下炎癥細胞因子：il-6，ifn-γ和tnf-α。在這些細胞因子中，基于臨床證據(jù)54，il-6預期能表現(xiàn)與明顯行為學改變或體重改變的最強關(guān)聯(lián)。我們預期，相比于輸注hbss，在cert細胞給藥后前3天內(nèi)至少il-6會存在一定升高。這種假設的毒性機制是臨床中完全能理解的，并且有效干預(通常為甾體類或il-6阻斷劑)是已知的并且常規(guī)使用。這些炎癥標志物可用于臨床試驗來監(jiān)測患者和確定初始劑量。我們不預期系統(tǒng)性炎癥細胞因子在治療后>3天持續(xù)上升，但是無論如何也要監(jiān)測它們。記錄可能改變并與臨床應答相關(guān)。這些代表標志物用于確定最小的預期生物學效應水平。高峰出現(xiàn)在2-3天的高鐵蛋白血癥是臨床中細胞因子釋放綜合征的另一重要代表標志物57。我們確定對照和治療小鼠中血清鐵蛋白的濃度，并將這些水平與健康惡化、體重丟失和組織學改變相關(guān)聯(lián)。肌酐被測量為腎功能的可能損傷的指示物。對照小鼠中的值與接受fsh靶向型cert細胞的小鼠的值進行比較。同樣，我們不預期由于cert細胞給藥會造成任何腎損傷。ast被確定為可能肝損傷的指示物。肝組織的組織學分析與ast值相關(guān)，包括肝中可能的腫瘤生長，因為卵巢癌是腹膜疾病。接受hbss的對照小鼠的值與輸注cert細胞的小鼠的值進行比較?；谄渌鹀er制劑的臨床證據(jù)，我們不預期fsh靶向型t細胞的治療會對肝造成不利影響。基于臨床信息，我們相信，當靶向的腫瘤決定因素是真的特異性時，長期保護的重要預測指標是過繼性轉(zhuǎn)移t細胞的持久性。我們分析攜帶不同異種移植物的nsg小鼠(≥5/組)的淋巴結(jié)、骨髓和腫瘤組織(如果腫瘤不被排斥)中fsh靶向型cert細胞的累積。通過在過繼性轉(zhuǎn)移后7和14天(gvhd發(fā)生之前56)分析解離的淋巴結(jié)和骨髓，流式細胞術(shù)確定(cd3+，因為nsg小鼠不具有t或b細胞)持續(xù)性cert細胞在獲得記憶性質(zhì)方面(cd45ra-cd62l+ccr7+cd122+淋巴細胞)的表型。因此，雖然免疫缺陷小鼠可能允許，但是轉(zhuǎn)移的人t細胞中共刺激結(jié)構(gòu)域的存在促進長期植入和記憶分化。這被解釋為后續(xù)治療功效的預測指標，但是也可以反映循環(huán)細胞因子的水平。對于另外的安全性，在小鼠初始使用大大低于毒性劑量的大劑量，但是隨著患者被監(jiān)測毒指征性，劑量緩慢逐步升級。在一項已知的研究中，用抗間皮素cart細胞治療攜帶人間皮瘤的nsg小鼠的最大耐受劑量(mtd)為50×107細胞/小鼠?？紤]到我們的靶標的特異性，我們預期相似或更好的結(jié)果?；诓煌瑃細胞過繼性轉(zhuǎn)移方案的臨床前證據(jù)7,30,43，給藥達到3次每周注射。但是，臨床方案是基于在3天的療程輸注cart細胞28。如果在第三次每周注射后觀察到顯著毒性，則調(diào)整cert細胞的劑量，用于當連續(xù)3天給藥時能耐受。實施例17：最小預期生物學效應水平(mabel)對于人的最小預期生物學效應水平是基于動物/人系統(tǒng)中在體內(nèi)和/或體外數(shù)據(jù)產(chǎn)生活性所需的最低動物劑量或濃度。通過來自用cert細胞治療的攜帶人腫瘤的nsg小鼠的體內(nèi)研究的劑量-響應數(shù)據(jù)界定mabel。劑量/濃度-效果曲線從實驗數(shù)據(jù)生成，并且從動物外推至人，以起始小心的劑量逐步升級。起點是對應于最小生物學效應的劑量，使用上文定義的生物標志物作為代表標志物。為了確定mabel，通過將ovcar3(fshr+)卵巢癌細胞注射入卵巢囊(n≥5/組)攻擊不同nsg小鼠。當腫瘤變的可觸知并通過超聲表現(xiàn)相似尺寸(約300mm3)時，來自hla-a2+健康供體的分血法的cd3/cd28擴增的人t細胞中由病毒載體表達fsh靶向型cer。選定的(人)fsh靶向型cert細胞變體被轉(zhuǎn)導，并給予不會觀察到的副作用的cert細胞的最大劑量。對照小鼠接受hbss。在觀察到升高的時間點(即，預期僅在前3天內(nèi)發(fā)生)，再次測定血清中的il-6、ifn-γ、tnf-α和鐵蛋白?；谠摶€，不同隊列的攜帶腫瘤的小鼠被同樣地治療，其中cert細胞劑量逐步下調(diào)50％，直至上述細胞因子的任何升高(相比于對照小鼠)消失(變?yōu)榕c對照組相同)。這樣的fsh靶向型cert細胞的量，相對于體重計算，被用于界定人類干預的起始劑量。在進行中的試驗中，患者目前接受按照不同cer/kg體重轉(zhuǎn)導的107至108個t細胞28?？紤]到我們在109/kg體重(～107cert細胞/小鼠；～30g/小鼠；圖3)的劑量下尚未在小鼠中觀察到明顯毒性，我們預期，可以在不同患者中調(diào)整和逐步升級安全初始劑量，以達到低于這些量的“無可觀察副作用水平”。對于額外的安全性，在3天中進行定量給藥的“分次劑量”方法，給予cer-轉(zhuǎn)導的t細胞，在第0天使用總計劃劑量的10％，第1天30％，第2天60％，遵循化學療法開始2天28。通過對人fsh的qpcr分析和elisa，我們分析測試批次的初始病毒來確定哪個克隆產(chǎn)生高滴度的fsh靶向型cer病毒。我們用該病毒轉(zhuǎn)導人t細胞，并通過流式細胞術(shù)測定fshβ、cd3、cd4和cd8的表達，和與fshr+ovcar3腫瘤細胞共培養(yǎng)的ifn-γ產(chǎn)生(如圖2所示)。我們選擇產(chǎn)生最高滴度的細胞克隆用于擴增、測試和產(chǎn)生主要細胞庫。該主要細胞庫可用作產(chǎn)病毒細胞的資源用于另外的研究。然后，我們測試產(chǎn)品以確保生物產(chǎn)品的安全性，包括測試(1)無菌性，(2)支原體，和(3)外來病毒體，遵循fda指導。實施例18：外周血中cer-t細胞的持久性建立用于確定外周血中過繼性轉(zhuǎn)移cert細胞的體內(nèi)轉(zhuǎn)運和持久性的q-pcr分析。引物和taqman探針被設計為跨越cer的cgα和跨膜結(jié)構(gòu)域的序列之間的連接區(qū)，其不是天然存在于任何患者細胞。另外，基于檢測轉(zhuǎn)導的(cd3+)t細胞上的fshβ優(yōu)化轉(zhuǎn)移cert細胞的流式細胞術(shù)分析，通過熒光標記的可獲得抗人fsh抗體，或使用抗fsh一抗和熒光標記的二抗。轉(zhuǎn)移t細胞的追蹤包括分析中的cd4和cd8抗體，從而獲得治療功效的機制理解。在新隊列的攜帶ovcar3腫瘤的nsg小鼠(≥5)中測試這些試劑，小鼠被過繼性轉(zhuǎn)移用臨床級載體和操作轉(zhuǎn)導的來自健康供體的a2+t細胞。該實驗驗證新試劑對抗腫瘤生長的功效。所預期的主要毒性是t細胞是否會通過殺傷表達靶標的腫瘤細胞而導致炎癥。在設定起始劑量后，常規(guī)的劑量逐步升級保守地基于3倍遞增。因為我們使用內(nèi)源fsh，之前對于異種(鼠)scfv描述的cart細胞的過敏性反應或免疫靶向的風險可以忽略。重要的是，通過數(shù)百萬年的進化，fsh受體的表達局限于卵巢。因為它們在卵巢癌患者中常規(guī)被切除，并且應該沒有其他器官結(jié)合fsh激素，我們預期，fsh靶向型cert細胞代表安全且有效的干預手段。實施例19：使用tall細胞作為通用平臺cer構(gòu)建體已被表達于tall-103/2細胞和tall-104細胞(atcccrll1386；美國專利5,702,702號)，通過配體代替scfv而將它們的細胞毒性潛能重新定向于fshr+腫瘤，但是另外方面使用活化結(jié)構(gòu)域成功對于對抗白血病。優(yōu)化tall-103/2細胞作為通用同種異體平臺是一項實施方案，因為它們的體外生長顯著快于tall-104細胞，并因此更易于操作用于規(guī)模生產(chǎn)。盡管如此，我們也會使用tall-104細胞，它們自發(fā)運輸至腫瘤床。通過其內(nèi)源(非免疫原性)配體而將它們的細胞毒性活性重新定向于fshr+卵巢癌細胞，表達fsh靶向型嵌合受體增強tall-103/2和tall-104細胞的治療潛能。初步結(jié)果表明，轉(zhuǎn)導我們的fshcer賦予tall-103/2或tall-104細胞的殺死自發(fā)表達fshr的卵巢癌細胞的能力顯著有效于它們的模擬對照轉(zhuǎn)導的對應物。fsh靶向型certall細胞能特異性且有效地殺傷表達fshr的卵巢癌細胞，在臨床相關(guān)卵巢癌模型中消除惡性腫瘤進展，而不產(chǎn)生顯著副作用。這些預期能在后續(xù)臨床試驗中轉(zhuǎn)用至卵巢癌患者。我們已經(jīng)用編碼人靶向fshr的cer的pbmn逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導和選擇tall-103/2和tall-104細胞。為了證實tall-103/2細胞的自發(fā)性(nk樣)細胞溶解活性能夠通過表達我們的fsh靶向型cer而顯著增強，我們使用人卵巢癌(a2+fshr+)ovcar3細胞作為靶標再次進行體外細胞毒性實驗。如圖12所示，模擬對照轉(zhuǎn)導的tall-103/2細胞如預期地表現(xiàn)出針對卵巢癌細胞的一定劑量依賴性抗腫瘤活性。但是，我們的fsh靶向型cer的表達賦予該細胞系低至1：4的效應物：靶標比率清除約60％的腫瘤細胞的能力。這些實驗支持，通過表達fshrcer，將我們的通用同種異體平臺更特異性重新定向于fshr+(70％)卵巢腫瘤是可能的。值得注意的是，在我們的生物反應器中，fsh靶向型certall-103/2細胞與母體細胞同樣有效地生長。該實驗為潛在的更安全且通用可接受的系統(tǒng)提供概念證據(jù)；即，將tall-103/2或tall104細胞的自發(fā)治療活性與我們的fsh靶向型活化受體的效力結(jié)合在一起，從而最大化它們的特異性和它們的抗腫瘤細胞毒性活性。重要的是，在不存在car/cer表達時，tall-103/2細胞的自發(fā)細胞毒性活性受限于表達nkg2d配體的nk敏感靶標，例如k562和u937白血病細胞，而健康細胞完全免受細胞毒性殺傷。另外，tall-103/2細胞不太可能在給藥至患者時導致gvhd，因為它們表達單個(γδ)tcr，正如對tall-104細胞所證實的。但是，通過cd3活化或il-2給藥可以引發(fā)tall-103/2細胞的效應物活性。并且它們相比于臨床可獲得的tall-104細胞能在生物反應器中較快地離體生長，這些性質(zhì)使得tall-103/2細胞可能成為優(yōu)異的同種異體平臺，用于通過表達我們的fsh靶向型cer將它們的抗腫瘤潛能重新定向。但是，tall-104細胞對于該用途也是理想的，因為它們自發(fā)運輸至腫瘤床。通過引用的方式將本文引用的包括美國臨時專利申請62/059,068、美國臨時專利申請62/202,824在內(nèi)的每篇專利、專利申請和任何文件以及本文全文引用的任何可公開獲得的核酸和/或肽序列的序列明確地整體并入本文。除了上文具體公開的實施方案，本領域技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明的實質(zhì)和范圍的情況下可以設計本發(fā)明的實施方案和變化形式。所附權(quán)利要求包括這些實施方案和等同變化形式。參考文獻1.siegel,r.,ma,j.,zou,z.&jemal,a.cancerstatistics,2014.cacancerjclin64,9-29(2014).2.curiel,t.j.,etal.specificrecruitmentofregulatorytcellsinovariancarcinomafostersimmuneprivilegeandpredictsreducedsurvival.natmed10,942-949(2004).3.zhang,l.,etal.intratumoraltcells,recurrence,andsurvivalinepithelialovariancancer.′hengljmed348,203-213(2003).4.cubillos-ruiz,j.r.,etal.polyethylenimine-basedsirnananocomplexesreprogramtumor-associateddendriticcellsviatlr5toelicittherapeuticantitumorimmunity.jclininvest119,2231-2244(2009).5.cubillos-ruiz,j.r.,etal.cd277isanegativeco-stimulatorymoleculeuniversallyexpressedbyovariancancermicroenvironmentalcells.oncotarget1,329-328(2010).6.huarte,eetal.depletionofdendriticcellsdelaysovariancancerprogressionbyboostingantitumorimmunity.cancerres68,7684-7691(2008).7.nesbeth,y.,etal.ccl5-mediatedendogenousantitumorimmunityelicitedbyadoptivelytransferredlymphocytesanddendriticcelldepletion.cancerres69,6331-6338(2009).8.scarlett,u.k.,etal.insitustimulationofcd40andtoll-likereceptor3transformsovariancancer-infiltratingdendriticcellsfromimmunosuppressivetoimmunostimulatorycells.cancerres69,7329-7337(2009).9.scarlett,u.k.,etal.ovariancancerprogressioniscontrolledbyphenotypicchangesindendriticcells.jexpmed209,495-506(2012).10.cubillos-ruiz,j.r.,etal.reprogrammingtumor-associateddendriticcellsinvivousingmicrornamimeticstriggersprotectiveimmunityagainstovariancancer.cancerres72,1683-1693(2012).11.porter,d.l.,levine,b.l.,kalos,m.,bagg,a.&june,c.h.chimericantigenreceptor-modifiedtcellsinchroniclymphoidleukemia.nengljmed365,725-733(2011).12.maus,m.v.,grupp,s.a.,porter,d.l.&june,c.h.antibody-modifiedtcells:carstakethefrontseatforhematologicmalignancies.blood123,2625-2635(2014).13.kalos,metal.tcellswithchimericantigen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