干擾素調(diào)節(jié)因子4基因在治療動(dòng)脈粥樣硬化中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種干擾素調(diào)節(jié)因子4（IRF4）在動(dòng)脈粥樣硬化中的功能及應(yīng)用，屬于基因的功能與應(yīng)用領(lǐng)域。本發(fā)明以ApoE-/-小鼠及IRF4-/-ApoE-/-小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過高脂飲食誘導(dǎo)獲得動(dòng)脈粥樣硬化模型，結(jié)果表明與ApoE-/-小鼠對(duì)比，IRF4基因缺陷顯著增加了主動(dòng)脈的斑塊面積，降低主動(dòng)脈竇斑塊的穩(wěn)定性，顯著惡化了炎癥反應(yīng)。這表明IRF4在動(dòng)脈粥樣硬化中的功能，主要體現(xiàn)在IRF4具有抑制主動(dòng)脈斑塊形成的作用，特別是IRF4能夠抑制動(dòng)脈粥樣硬化的作用。針對(duì)IRF4的上述功能，IRF4可用于制備預(yù)防、緩解和/或治療動(dòng)脈粥樣硬化的藥物。
【專利說明】干擾素調(diào)節(jié)因子4基因在治療動(dòng)脈粥樣硬化中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因的功能與應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及一種干擾素調(diào)節(jié)因子4 (IRF4)在治療動(dòng)脈粥樣硬化中的功能和應(yīng)用，具體是IRF4在制備預(yù)防、緩解和/或治療動(dòng)脈粥樣硬化的藥物中應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]心腦血管疾病在許多發(fā)達(dá)國(guó)家中是主要致死性病因，在我國(guó)的發(fā)病率和致死率也逐年升高。心腦血管疾病的基礎(chǔ)是動(dòng)脈粥樣硬化(Atheosclersisis, AS),動(dòng)脈粥樣硬化可使動(dòng)脈管壁增厚、變硬、管腔狹窄，導(dǎo)致很多心腦血管事件發(fā)生。而動(dòng)脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊的破裂、血小板的聚集及血栓形成造成的冠狀動(dòng)脈急性狹窄和閉塞是導(dǎo)致急性冠狀動(dòng)脈綜合征(acute coronary syndrome, ACS)的重要原因。
[0003]動(dòng)脈粥樣硬化是多種遺傳基因、危險(xiǎn)因素及免疫機(jī)制共同參與的一種慢性炎癥性疾病，局部和全身的炎癥免疫反應(yīng)在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用，固有免疫和適應(yīng)性免疫共同參與調(diào)節(jié)動(dòng)脈粥樣硬化病變，病理上表現(xiàn)為大、中動(dòng)脈多處斑塊形成，好發(fā)于血液分流、動(dòng)脈彎曲及動(dòng)脈分支等區(qū)域，其病變特征是血中脂質(zhì)在動(dòng)脈內(nèi)膜沉積，弓丨起內(nèi)膜灶性纖維性增厚，病灶深部為由壞死組織和細(xì)胞外脂質(zhì)池形成的粥樣物質(zhì)。動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中存在著多種免疫細(xì)胞，其中以巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞最為常見，此外還有少量的樹突狀細(xì)胞(Dentritic cell,DC)、自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell,NK cell)和肥大細(xì)胞(mast cell)等,偶有B淋巴細(xì)胞。
[0004]動(dòng)脈粥樣硬化最早期肉眼可見的損傷是脂質(zhì)條紋，主要由攝取了大量膽固醇的巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞構(gòu)成。血液循環(huán)中的單核細(xì)胞在動(dòng)脈易損部位黏附到活性內(nèi)皮細(xì)胞，啟動(dòng)了脂質(zhì)條紋的形成，黏附的單核細(xì)胞隨后受局部產(chǎn)生的化學(xué)趨附分子的吸引遷移到內(nèi)膜下，并進(jìn)一步分化為巨噬細(xì)胞。大量膽固醇脂在巨噬細(xì)胞內(nèi)積聚，形成泡沫細(xì)胞，這是動(dòng)脈粥樣硬化形成早期的特征性病理生理過程。動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生是多因素共同作用的結(jié)果，目前已發(fā)現(xiàn)的動(dòng)脈粥樣硬化危險(xiǎn)性因素很多，但相關(guān)針對(duì)治療及控制效果均不理想，降脂和抗炎治療是目前最主要的治療措施。
[0005]干擾素調(diào)節(jié)因子(interferon regulatory factors, IRFs)家族，至今已鑒定出10個(gè)家族成員，分別為IRF1-10，其中IRF1-9僅在哺乳動(dòng)物存在【I】。研究提示，IRFs參與胞漿模式識(shí)別受體介導(dǎo)的和Toll樣受體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)控I型干擾素的表達(dá)【2】。IRFs還對(duì)天然免疫及免疫細(xì)胞的分化起重要表達(dá)調(diào)控作用【3】。IRFs通過調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡，參與惡性腫瘤的形成和發(fā)展【4】。此外，我們最新的研究提示，IRFs家族成員也在心肌肥厚等心血管疾病中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用【5】。IRFs參與脂肪生成和脂肪細(xì)胞脂質(zhì)代謝【6，7】。IRF4是IRF家族的一員，和其他家族成員一樣，IRF4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域位于氨基端由115個(gè)殘基組成的高度同源序列上，它包含5個(gè)色氨酸殘基組成的重復(fù)序列，這個(gè)重復(fù)序列識(shí)別并結(jié)合含GAAA或AANNNGAA的DNA序列，繼而進(jìn)行基因調(diào)控。IRF4在B細(xì)胞、T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的功能中發(fā)揮重要的作用，IRF4在成熟的B細(xì)胞上大量表達(dá)，并且在淋巴細(xì)胞、骨髓細(xì)胞和樹突細(xì)胞的分化過程中扮演著重要的角色。淋巴細(xì)胞調(diào)節(jié)及其分泌的紊亂在炎癥性疾病中起著至關(guān)重要的作用，IRF4通過影響淋巴細(xì)胞的分化及干擾素轉(zhuǎn)錄調(diào)控等參與炎癥過程【8-10】。基于上述研究基礎(chǔ)，我們認(rèn)為IRF4在動(dòng)脈粥樣硬化形成早期的特征性病理生理過程中可能扮演著重要角色，但其在動(dòng)脈粥樣硬化形成早期的特征性病理生理過程中的生物學(xué)功能和可能的作用機(jī)制尚未闡明。
[0006]小鼠和基因工程小鼠資源是目前疾病機(jī)制研究、基因功能研究、藥物創(chuàng)制等領(lǐng)域最重要的動(dòng)物模型之一，也是這些領(lǐng)域創(chuàng)新研究的必須條件。利用基因工程小鼠針對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化病理過程中的各個(gè)分子環(huán)節(jié)進(jìn)行研究，對(duì)闡明動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過程中的分子機(jī)制，尋找動(dòng)脈粥樣硬化治療的分子靶點(diǎn)具有重要的意義。
[0007]【參考文獻(xiàn)】
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【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的在于確定IRF4基因的表達(dá)和動(dòng)脈粥樣硬化的相互關(guān)系，提供一個(gè)用于預(yù)防、緩解和/或治療動(dòng)脈粥樣硬化的靶基因IRF4的新用途。
[0009]本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
本發(fā)明確定的IRF4基因的表達(dá)和動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)系如下:
1.1RF4基因敲除顯著增加了動(dòng)脈粥樣硬化的斑塊面積
本發(fā)明以ApoE基因敲除(ApoE-/-)小鼠與IRF4/ApoE雙基因敲除(IRF4-/_ApoE-/-)小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，分別通過低脂飼料和高脂飼料飲食誘導(dǎo)獲得動(dòng)脈粥樣硬化小鼠模型(AS)。結(jié)果表明ApoE-/-和IRF4-/-ApoE-/-小鼠通過低脂飼料飲食，主動(dòng)脈樹有少量斑塊形成,通過高脂飼料飲食后,斑塊面積顯著增加，IRF4-/-ApoE-/_小鼠的主動(dòng)脈樹、主動(dòng)脈竇以及頭臂干的斑塊面積均顯著高于ApoE-/-小鼠(圖1-2)。
[0010]2.1RF4基因敲除顯著降低主動(dòng)脈竇斑塊的穩(wěn)定性
本發(fā)明以ApoE基因敲除(ApoE-/-)小鼠與IRF4/ApoE雙基因敲除(IRF4-/_ApoE-/-)小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過高脂飼料飲食誘導(dǎo)獲得動(dòng)脈粥樣硬化小鼠模型(AS)，對(duì)主動(dòng)脈竇斑塊的穩(wěn)定性進(jìn)行研究。結(jié)果表明IRF4基因敲除顯著增加了主動(dòng)脈竇斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞的含量和壞死中心的面積，減少了斑塊內(nèi)平滑肌細(xì)胞的含量和膠原成分含量，整體減弱了主動(dòng)脈竇斑塊的穩(wěn)定性(圖3)。
[0011]3.1RF4基因敲除顯著惡化了炎癥反應(yīng)
本發(fā)明以ApoE基因敲除(ApoE-/-)小鼠與IRF4/ApoE雙基因敲除(IRF4-/_ApoE-/-)小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過高脂飼料飲食誘導(dǎo)獲得動(dòng)脈粥樣硬化小鼠模型(AS)，對(duì)主動(dòng)脈竇斑塊的炎癥因子的表達(dá)進(jìn)行研究。結(jié)果表明IRF4基因敲除顯著升高了主動(dòng)脈竇斑塊的ICAM-1和IL-6等促炎因子，降低了 IL-1O等抑炎因子的表達(dá)水平(圖4)。
[0012]由以上結(jié)果可知發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化時(shí)，IRF4基因缺陷增加了斑塊面積，減弱主動(dòng)脈竇斑塊的穩(wěn)定性，顯著惡化了炎癥反應(yīng)。因此IRF4具有抑制動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的作用，為研究防治動(dòng)脈粥樣硬化的新靶點(diǎn)和新策略提供了理論依據(jù)和臨床基礎(chǔ)。
[0013]針對(duì)IRF4的上述功能，提供一種IRF4的應(yīng)用，主要體現(xiàn)在IRF4基因在制備預(yù)防、緩解和/或治療動(dòng)脈粥樣硬化的藥物中的應(yīng)用。
[0014]一種預(yù)防、緩解和/或治療動(dòng)脈粥樣硬化的藥物，包含IRF4。
[0015]本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果:
1.本發(fā)明發(fā)現(xiàn)IRF4基因的新功能，即IRF4能夠顯著抑制動(dòng)脈粥樣硬化的作用。
[0016]2.基于IRF4在抑制動(dòng)脈粥樣硬化中的功能，為研制動(dòng)脈粥樣硬化的藥物提供基礎(chǔ)，可用于制備預(yù)防、緩解和/或治療動(dòng)脈粥樣硬化中的藥物。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1是ApoE-/-和IRF4-/-ApoE-/-小鼠的主動(dòng)脈樹油紅O染色及斑塊面積統(tǒng)計(jì)圖，結(jié)果表明IRF4基因敲除顯著增加了主動(dòng)脈樹的斑塊面積。
[0018]圖2是ApoE-/-和IRF4-/-ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈竇及頭臂干HE染色及斑塊面積統(tǒng)計(jì)柱狀圖，結(jié)果表明IRF4基因敲除顯著增加了主動(dòng)脈竇以及頭臂干的斑塊面積(*:p <
0.05vs HFD ApoE-/-組)。
[0019]圖3是ApoE-/-和IRF4-/-ApoE-/-小鼠的主動(dòng)脈竇斑塊內(nèi)壞死中心、膠原成分、巨噬細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞含量染色圖及結(jié)果統(tǒng)計(jì)柱狀圖，結(jié)果表明IRF4基因敲除顯著增加主動(dòng)脈竇斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞的含量和壞死中心的面積，減少了斑塊內(nèi)平滑肌細(xì)胞的含量和膠原成分含量(* =P < 0.05vs HFD ApoE-/-組)。
[0020]圖4 是 ApoE-/-和 IRF4-/-ApoE-/_ 小鼠的主動(dòng)脈竇斑塊內(nèi) ICAM_1、IL_6 ,IL-1O等炎癥因子的表達(dá)水平免疫熒光染色圖及結(jié)果統(tǒng)計(jì)柱狀圖，結(jié)果表明IRF4基因敲除顯著升高了主動(dòng)脈竇斑塊的促炎因子ICAM-1和IL-6的表達(dá)水平，降低了抗炎因子IL-1O的表達(dá)水平(*:P < 0.05vs HFD ApoE-/-組)。

【具體實(shí)施方式】
[0021]下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。
[0022]實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物及飼養(yǎng)
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種屬，性別，周齡及來源=ApoE基因敲除(ApoE-/-)小鼠與IRF4/ApoE雙基因尚支除(IRF4-/-ApoE-/-)小鼠，雄性，8周齡，體重19-25g。ApoE基因敲除小鼠(ApoE-/-,購(gòu)自 Jackson Laboratory,貨號(hào) 002052) ;IRF4-/_ApoE-/-小鼠由 IRF4 基因敲除小鼠(購(gòu)自Jackson Laboratory,貨號(hào)009380)和ApoE基因敲除小鼠雜交得到。
[0023]實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料配方:高脂飼料(HFD，購(gòu)自北京華阜康生物科技有限公司，按AIN-76 A Western Diets配方，熱量百分比:蛋白質(zhì)15.8%，脂肪40%，碳水化合物44.2%);低脂飼料(NC，購(gòu)自北京華阜康生物科技有限公司，貨號(hào)D12450B):熱量百分比:蛋白質(zhì)20%，碳水化合物70%，脂肪10%。
[0024]動(dòng)物飼養(yǎng)及環(huán)境條件:所有的實(shí)驗(yàn)小鼠均飼養(yǎng)在武漢大學(xué)心血管病研究所SPF級(jí)動(dòng)物房(許可證號(hào)=SYXK (鄂):2009-0053)。每12小時(shí)交替照明，溫度24±2°C，濕度40%-70%，小鼠自由飲水進(jìn)食。
[0025]實(shí)施例1小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型(AS)獲得
1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組:選用8周齡，體重19-25g，雄性，ApoE-/-小鼠和IRF4-/_ApoE-/-小鼠，分別給予高脂飼料(Western Diets,HFD)和低脂飼料(Normal chow,NC)飼養(yǎng),ApoE-/-HFD 組，ApoE-/- NC 組，IRF4-/-ApoE-/- HFD 組，IRF4-/-ApoE-/- NC 組共 4 個(gè)組別，每組各20只。
[0026]2.動(dòng)脈粥樣硬化模型通過高脂飼料誘導(dǎo)操作流程:
采用ApoE-/-小鼠和IRF4-/-ApoE-/-小鼠，建立AS模型，進(jìn)行表型相關(guān)分析，明確IRF4基因?qū)?dòng)脈粥樣硬化疾病發(fā)揮的作用。小鼠從8周齡開始，HFD組全程高脂飼料喂養(yǎng)28周處死并收集樣本，NC組全程低脂飼料喂養(yǎng)28周處死并收集樣本。
[0027]實(shí)施例2 AS模型小鼠斑塊面積測(cè)定 1.小鼠終末組織取材
小鼠喂養(yǎng)高脂或低脂飼料直至28周時(shí)，稱重，用3%戊巴比妥鈉，90mg/kg麻醉小鼠，用針頭固定于取材板，用紗布濕潤(rùn)小鼠胸腹部皮膚，用眼科剪剪開胸腔，暴露心臟，剪開右心耳，把輸液器的針頭刺進(jìn)左心室，用50mL注射器緩慢推注10-15mL PBS緩沖液，待右心耳流出液清亮，換上4%多聚甲醛繼續(xù)推注10-15mL。灌流結(jié)束后，清除胸腹腔臟器，僅保留心臟。將小鼠置于顯微鏡下，分離主動(dòng)脈弓周圍筋膜、脂肪組織，剪下頭臂干，放入裝有4%多聚甲醛的5mL EP管中，在升主動(dòng)脈起始部剪下心臟，在胸主動(dòng)脈中部剪斷，并在頸總和鎖骨下約3mm處剪斷，把主動(dòng)脈弓放入上述EP管中。
[0028]2.主動(dòng)脈樹斑塊面積測(cè)定
主動(dòng)脈樹置于4%多聚甲醛中隔夜固定一純水漂洗30min — 60%異丙醇處理10 min —油紅O染液(公司sigma,貨號(hào)00625)染色60 min — 60%異丙醇漂洗lminX3次至背景干凈一解剖鏡下去除殘余外壁脂肪一將染色好的動(dòng)脈平鋪于黑色解剖蠟板上，染色后用數(shù)碼相機(jī)拍照，并使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件進(jìn)行斑塊面積定量測(cè)定(油紅O原液=0.5克油紅0+100毫升100%異丙醇，油紅O染液(工作液):V (油紅O原液)/ V (H20)=3/2)。
[0029]主動(dòng)脈樹斑塊面積(％)=斑塊總面積/主動(dòng)脈樹總面積*100%。
[0030]3.病理組織處理
3.1石蠟標(biāo)本制備
4%多聚甲醛中隔夜固定后，將頭臂干、主動(dòng)脈弓用濾紙小心包好，以防從包埋框間隙中漏出。流水沖洗30min后放入脫水機(jī),30%乙醇15min — 50%乙醇15min — 75%乙醇15min — 85% 乙醇 15min — 95% 乙醇 15min — 100% 乙醇 15min — 100% 乙醇 15min —二甲苯15min — 二甲苯15min —石臘30min —石臘30min。頭臂干及主動(dòng)脈弓脫水完成后,從脫水機(jī)拿出。頭臂干呈Y直立于石蠟中，主動(dòng)脈弓平躺于石蠟中。
[0031]3.2主動(dòng)脈組織切片
使用切片機(jī)分別對(duì)主動(dòng)脈竇和頭臂干石蠟標(biāo)本切片(切片厚度5 μ m)。
[0032]4.主動(dòng)脈竇斑塊面積測(cè)定
蘇木素伊紅染色(HE染色):取主動(dòng)脈竇石蠟白片65°C烘烤30分鐘一二甲苯5分鐘X 3次一100%乙醇I分鐘一95%乙醇I分鐘一70%乙醇I分鐘一純水漂洗(以玻片上不掛有水珠為標(biāo)準(zhǔn))一甩盡載玻片上的水分，蘇木素溶液(珠海貝索，BA-4021)浸染5分鐘一自來水漂洗(去除玻片上蘇木素的浮色)一1%鹽酸乙醇1-3秒一自來水漂洗(去除玻片上鹽酸乙醇)一Scott液(碳酸氫鈉0.35g,硫酸鎂2g,蒸懼水10mDl分鐘一自來水浸洗(去除玻片上的Scott液)一甩盡在玻片上的水分，伊紅溶液(珠海貝索，BA-4024)染色10秒鐘一純水漂洗(去除玻片上伊紅的浮色)一70%乙醇一下一95%乙醇一下一100%乙醇30秒，3次一二甲苯2分鐘，3次一趁二甲苯未干時(shí)封片(以切片無(wú)氣泡為原則)一通風(fēng)櫥內(nèi)吹干，顯微鏡拍照。
[0033]5.頭臂干斑塊面積測(cè)定
蘇木素伊紅染色(HE染色)，取頭臂干石蠟白片，具體操作方法同實(shí)施例2.4。
[0034]HE染色圖片統(tǒng)計(jì):直接用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件圈主動(dòng)脈竇和頭臂干斑塊面積。
[0035]通過主動(dòng)脈樹油紅O染色可大體評(píng)估整條血管上動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的多少、分布情況及斑塊面積的大小。圖1是小鼠AS模型后油紅O染色結(jié)果圖，頭臂干和主動(dòng)脈竇是動(dòng)脈粥樣硬化斑塊最明顯的部位，ApoE-/-和IRF4-/-ApoE-/-小鼠通過低脂飼料飲食，主動(dòng)脈樹就有少量斑塊形成；通過高脂飲食誘導(dǎo)后，斑塊含量顯著增加，IRF4-/_ApoE-/-小鼠的主動(dòng)脈樹斑塊面積顯著大于ApoE-/-小鼠。圖2是小鼠AS模型后主動(dòng)脈竇和頭臂干HE染色結(jié)果圖，結(jié)果表明經(jīng)高脂飲食后IRF4-/-ApoE-/-小鼠的主動(dòng)脈竇和頭臂干的斑塊面積也顯著大于ApoE-/-小鼠。以上結(jié)果表明IRF4基因敲除顯著增加了動(dòng)脈粥樣硬化的斑塊面積。
[0036]實(shí)施例3 AS模型小鼠斑塊穩(wěn)定性的測(cè)定
1.主動(dòng)脈竇壞死中心的面積大小測(cè)定
蘇木素伊紅染色(HE染色)，方法同實(shí)施例2.4，選取含膽固醇結(jié)晶、無(wú)細(xì)胞核纖維結(jié)構(gòu)的組織顯微鏡拍照。
[0037]壞死中心的面積測(cè)定:使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件圈壞死中心面積。
[0038]2.主動(dòng)脈竇膠原成分含量測(cè)定:
天狼星紅(PSR)染色，主要步驟為:55°C烘烤30min—二甲苯2min，3次一100%酒精I(xiàn)min — 95%酒精I(xiàn)min — 70%酒精lmin—流水沖洗lOmin—雙蒸水lmin—質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%磷鑰酸2min — 0.1%天狼猩紅苦味酸溶液滴于組織上,濕盒中染色90min —去除殘液一0.0lN鹽酸4s — 70%酒精I(xiàn)次一90%酒精I(xiàn)次一100%酒精30s，3次一二甲苯2min，3次一趁二甲苯未干立即蓋玻片封片，顯微鏡拍照。
[0039]膠原比例測(cè)定:使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件圈紅色膠原面積,膠原比例(％)=膠原面積/斑塊面積*100%。
[0040]3.主動(dòng)脈竇巨噬細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞表達(dá)測(cè)定
免疫熒光染色檢測(cè)巨噬細(xì)胞標(biāo)志物⑶68，平滑肌細(xì)胞標(biāo)志物SMA (Smooth MuscleActin)的表達(dá)。所需一抗信息:CD68 (MCA1957; 1:100; rat; AbD Serotec), SMA(ab5694; 1:100; rabbit; Abeam);所需二抗信息:Alexa Flour? 568 goat ant1-rat IgG(Al 1077 ；Invitrogen,), Alexa Fluor 488-conjugated goat ant1-rabbit IgG (Al1008 ；Invitrogen)。
[0041]主要步驟為:
I)烤片:將石蠟切片置于烤箱中30min以上。
[0042]2)脫蠟:二甲苯 5minX3 次。
[0043]3)水合:100% 乙醇 5minX2 次；95% 乙醇 5min ；70% 乙醇 5min ;ddH20浸洗 5minX2次。
[0044]4)檸檬酸鹽組織抗原修復(fù)(高壓修復(fù)):取一定量的pH6.0檸檬酸鹽抗原修復(fù)工作液于修復(fù)盒中，放入高壓鍋中，大火加熱至沸騰，將脫蠟水合后的組織切片置于修復(fù)盒中，蓋上鍋蓋，扣上壓力閥，繼續(xù)加熱至噴氣，開始計(jì)時(shí)5min后，取出修復(fù)盒；室溫放置20min，自然冷卻后取出切片。
[0045]5) ddH20 漂洗 5minX2 次，PBS 漂洗 5minX2 次。
[0046]6)組化筆劃圈，滴加10%羊血清(GTX27481，GeneTex)封閉，于濕盒中37°C封閉60mino
[0047]7)棄封閉液,滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗，4°C孵育過夜,37°C復(fù)溫30min,棄去一抗，PBS 洗 1minX 3 次。
[0048]8)滴加二抗，于濕盒中37°C孵育60min，棄去二抗，PBS浸洗5minX3次。
[0049]9) SlowFade Gold antifade reagent with DAPI (S36939, Invitrogen)封片。
[0050]10)熒光鏡下觀察，拍照。
[0051]突光定量統(tǒng)計(jì):使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)測(cè)定，CD68/SMA (%)=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/斑塊面積*100%。
[0052]巨噬細(xì)胞是斑塊內(nèi)最重要的細(xì)胞成分，它主要有血液循環(huán)單核細(xì)胞進(jìn)入內(nèi)皮下后分化而來，單核/巨噬細(xì)胞可分泌多種粘附、趨化因子如細(xì)胞黏附分子(ICAM-1)、單核細(xì)胞趨化和激活因子(MCP-1)等，增進(jìn)斑塊內(nèi)細(xì)胞的進(jìn)入，此外巨噬細(xì)胞還可分泌多種基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)，降低斑塊內(nèi)膠原面積，從而破壞斑塊的穩(wěn)定性；平滑肌細(xì)胞可分泌多種細(xì)胞基質(zhì)，是動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)分泌膠原的細(xì)胞源，主要作用是修復(fù)被破壞的細(xì)胞基質(zhì)成分從而起到保護(hù)作用；膠原成分是斑塊內(nèi)最重要的細(xì)胞外基質(zhì)，也是纖維帽的主要成分，具有抗血流沖擊防止斑塊破裂的作用，也是維護(hù)斑塊穩(wěn)定性的重要評(píng)估指標(biāo)。
[0053]圖3是ApoE-/-小鼠和IRF4-/_ApoE-/-小鼠的斑塊內(nèi)含物的分析結(jié)果圖。主動(dòng)脈竇HE染色可見IRF4-/_ApoE-/-小鼠的壞死中心面積明顯大于ApoE-/-小鼠；PSR染色結(jié)果表明高脂飲食后的模型，IRF4-/-ApoE-/-組小鼠的膠原比例明顯低于ApoE-/-小鼠；免疫熒光發(fā)觀察巨噬細(xì)胞標(biāo)志物⑶68在IRF4-/-ApoE-/-小鼠斑塊內(nèi)表達(dá)量則顯著高于ApoE-/-小鼠；平滑肌細(xì)胞標(biāo)志物SMA在IRF4-/-ApoE-/-小鼠斑塊內(nèi)表達(dá)量明顯低于ApoE-/-小鼠。以上結(jié)果表明IRF4基因敲除顯著增加主動(dòng)脈竇斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞的含量和壞死中心的面積，降低了斑塊內(nèi)平滑肌細(xì)胞的含量和膠原成分含量；因此IRF4基因敲除可以降低主動(dòng)脈竇斑塊的穩(wěn)定性(圖3)
實(shí)施例4 AS模型小鼠斑塊內(nèi)炎癥因子表達(dá)的測(cè)定
免疫熒光染色檢測(cè)ICAM-1、IL-6、IL-1O等炎癥因子的表達(dá)。所需一抗信息:ICAM-1(AF796 ;1:100 ;goat ;R&D systems) > IL-6 (AF-406-NA ;1:100 ;goat ;R&D systems)、IL-1O (AF-217-NA ； 1:100 ；goat ；R&D systems);所需二抗信息:Alexa Flour? 568 donkeyant1-goat IgG (Al1057 ;Invitrogen)。
[0054]主要步驟為:參見實(shí)施例3.3。
[0055]熒光定量統(tǒng)計(jì):使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行吸光度(1D)測(cè)定。
[0056]炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂的主要因素之一。炎性細(xì)胞分泌大量細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素6 (IL-6)，白細(xì)胞介素10 (IL-1O)等可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞的活化、平滑肌細(xì)胞的增生凋亡及粥樣病變的進(jìn)展。受損的內(nèi)皮細(xì)胞和單核/巨噬細(xì)胞分泌的粘附、趨化因子是介導(dǎo)炎癥細(xì)胞向動(dòng)脈粥樣硬化斑塊聚集的關(guān)鍵因子。通過免疫熒光染色觀察ICAM-1、IL-6、IL-10等炎癥因子的表達(dá)變化，結(jié)果表明IRF4基因敲除顯著提高了主動(dòng)脈竇斑塊內(nèi)促炎因子ICAM-1、IL-6的表達(dá)水平，降低了 IL-1O抑炎癥因子的表達(dá)水平(圖4)。
[0057]上述實(shí)施例結(jié)果顯示，ApoE-/-小鼠及IRF4-/-ApoE-/_小鼠在高脂飲食的誘導(dǎo)下發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化，和ApoE-/-小鼠相比，IRF4/ApoE雙基因敲除后小鼠的主動(dòng)脈斑塊面積顯著增加，斑塊穩(wěn)定性降低，炎癥反應(yīng)明顯加重。這些結(jié)果表明，IRF4可顯著抑制主動(dòng)脈斑塊的形成和動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。本發(fā)明證明了 IRF4在動(dòng)脈粥樣硬化模型中有著重要的保護(hù)作用，其可用于制備預(yù)防、緩解和/或治療動(dòng)脈粥樣硬化疾病的藥物。
[0058]上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.干擾素調(diào)節(jié)因子4(IRF4)基因在制備預(yù)防、緩解和/或治療動(dòng)脈粥樣硬化的藥物中的應(yīng)用。
2.一種預(yù)防、緩解和/或治療動(dòng)脈粥樣硬化的藥物，其特征在于:包含IRF4。
【文檔編號(hào)】A61P9/10GK104324388SQ201410514206
【公開日】2015年2月4日 申請(qǐng)日期:2014年9月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月29日
【發(fā)明者】李紅良, 蔣丁勝, 鄧克窮, 張曉晶 申請(qǐng)人:武漢大學(xué)