Mindin基因在治療動(dòng)脈粥樣硬化中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種Mindin基因在動(dòng)脈粥樣硬化中的功能及應(yīng)用，屬于基因的功能與應(yīng)用領(lǐng)域。本發(fā)明以ApoE-/-小鼠及Mindin-/-ApoE-/-小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過高脂飲食誘導(dǎo)獲得動(dòng)脈粥樣硬化模型，結(jié)果表明與ApoE-/-小鼠對(duì)比，Mindin基因缺陷顯著減少了主動(dòng)脈的斑塊面積，增強(qiáng)主動(dòng)脈竇斑塊的穩(wěn)定性，顯著減輕了炎癥反應(yīng)。這表明Mindin在動(dòng)脈粥樣硬化中的功能，主要體現(xiàn)在Mindin具有促進(jìn)主動(dòng)脈斑塊形成的作用，特別是Mindin能夠促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的作用。針對(duì)Mindin的上述功能，Mindin可作為藥物靶標(biāo)用于篩選預(yù)防、緩解和/或治療動(dòng)脈粥樣硬化的藥物，Mindin的抑制劑可用于制備預(yù)防、緩解和/或治療動(dòng)脈粥樣硬化的藥物。
【專利說明】Mindin基因在治療動(dòng)脈粥樣硬化中的應(yīng)用
[0001]

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明屬于基因的功能與應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及一種Mindin在治療動(dòng)脈粥樣硬化中的功能和應(yīng)用，具體是Mindin在制備預(yù)防、緩解和/或治療動(dòng)脈粥樣硬化的藥物中應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0003]心腦血管疾病在許多發(fā)達(dá)國家中是主要致死性病因，在我國的發(fā)病率和致死率也逐年升高。心腦血管疾病的基礎(chǔ)是動(dòng)脈粥樣硬化(Atheosclersisis, AS),動(dòng)脈粥樣硬化可使動(dòng)脈管壁增厚、變硬、管腔狹窄，導(dǎo)致很多心腦血管事件發(fā)生。而動(dòng)脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊的破裂、血小板的聚集及血栓形成造成的冠狀動(dòng)脈急性狹窄和閉塞是導(dǎo)致急性冠狀動(dòng)脈綜合征(acute coronary syndrome, ACS)的重要原因。
[0004]動(dòng)脈粥樣硬化是多種遺傳基因、危險(xiǎn)因素及免疫機(jī)制共同參與的一種慢性炎癥性疾病，局部和全身的炎癥免疫反應(yīng)在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用，固有免疫和適應(yīng)性免疫共同參與調(diào)節(jié)動(dòng)脈粥樣硬化病變，病理上表現(xiàn)為大、中動(dòng)脈多處斑塊形成，好發(fā)于血液分流、動(dòng)脈彎曲及動(dòng)脈分支等區(qū)域，其病變特征是血中脂質(zhì)在動(dòng)脈內(nèi)膜沉積，弓丨起內(nèi)膜灶性纖維性增厚，病灶深部為由壞死組織和細(xì)胞外脂質(zhì)池形成的粥樣物質(zhì)。動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中存在著多種免疫細(xì)胞，其中以巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞最為常見，此外還有少量的樹突狀細(xì)胞(Dentritic cell,DC)、自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell,NK cell)和肥大細(xì)胞(mast cell)等,偶有B淋巴細(xì)胞。
[0005]動(dòng)脈粥樣硬化最早期肉眼可見的損傷是脂質(zhì)條紋，主要由攝取了大量膽固醇的巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞構(gòu)成。血液循環(huán)中的單核細(xì)胞在動(dòng)脈易損部位黏附到活性內(nèi)皮細(xì)胞，啟動(dòng)了脂質(zhì)條紋的形成，黏附的單核細(xì)胞隨后受局部產(chǎn)生的化學(xué)趨附分子的吸引遷移到內(nèi)膜下，并進(jìn)一步分化為巨噬細(xì)胞。大量膽固醇脂在巨噬細(xì)胞內(nèi)積聚，形成泡沫細(xì)胞，這是動(dòng)脈粥樣硬化形成早期的特征性病理生理過程。動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生是多因素共同作用的結(jié)果，目前已發(fā)現(xiàn)的動(dòng)脈粥樣硬化危險(xiǎn)性因素很多，但相關(guān)針對(duì)治療及控制效果均不理想，降脂和抗炎治療是目前最主要的治療措施。
[0006]Mindin又稱為Spondin 2,屬于Mindin-F-Spondin細(xì)胞外基質(zhì)蛋白家族，于1997年由Higashijima等首次在斑馬魚中克隆,并發(fā)現(xiàn)其能促進(jìn)海馬神經(jīng)元的粘附與生長。隨后的研究證實(shí)Mindin廣泛表達(dá)于哺乳動(dòng)物的各組織，其結(jié)構(gòu)包含一個(gè)氨基末端的F底板反應(yīng)蛋白(F-spondin，F(xiàn)S)結(jié)構(gòu)域和一個(gè)羧基末端的血小板反應(yīng)蛋白I型重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域(thrombospondin type I repeat,TSR)。Mindin在不同種屬間結(jié)構(gòu)高度保守,例如小鼠和人的Mindin氨基酸序列的同源性達(dá)85%,提示Mindin可能具有重要的生物學(xué)功能。Mindin是一種模式識(shí)別分子，能夠與病原體和PAMPs結(jié)合，并作為一種噬菌素調(diào)控巨噬細(xì)胞的吞噬功能，參與調(diào)節(jié)天然免疫的宿主防御反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)Mindin通過整合素與中性粒細(xì)胞結(jié)合，調(diào)控中性粒細(xì)胞的募集、粘附和遷移功能；而Mindin基因敲除使骨髓來源的樹突狀細(xì)胞中小分子G蛋白R(shí)ac-1與Rac-2的表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致其活化T細(xì)胞能力受損，而Mindin仍然是通過整合素與樹突狀細(xì)胞結(jié)合并介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控；進(jìn)一步分析Mindin的蛋白結(jié)構(gòu)，確定了 Mindin識(shí)別PAMPs的結(jié)構(gòu)為TSR結(jié)構(gòu)域,而F-spondin結(jié)構(gòu)域則是Mindin與整合素的結(jié)合位點(diǎn)。越來越多的研究證明Mindin不僅在免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，而且還參與多種疾病的病理過程。我們已有研究表明Mindin在心肌肥厚、腦卒中及糖尿病疾病模型中發(fā)揮著重要的作用:在心肌肥厚模型中，Mindin作為內(nèi)源性保護(hù)因子，通過抑制AKT/GSK3i3信號(hào)通路，從而抑制因適應(yīng)不良引起心臟重構(gòu)而導(dǎo)致的心力衰竭(Bian ZY etl,Disrupt1n of mindin exacerbates cardiac hypertrophy and fibrosis.J Mol Med (Berl) (2012);90 (8):895-910);在缺血性腦損傷中 Mindin 通過 Akt 信號(hào)通路從而發(fā)揮生物學(xué)功倉泛(Wang L etl, Mindin is a critical mediator of ischemic braininjury in an experimental stroke model.Exp Neurol(2013);247:506-16);在糖尿病模型中，Mindin通過與PPARα作用，從而調(diào)節(jié)小鼠的肝臟脂質(zhì)代謝以及減輕肝脂肪變性、月巴胖、炎癥等(Zhu LH et al, Mindin/Spondin 2 inhibits hepatic steatosis, insulinresistance, and obesity via interact1n with peroxisome proliferator-activatedreceptor a in mice.J Hepatol (2014);60 (5): 1046-54);基于上述研究基礎(chǔ)，我們認(rèn)為Mindin在動(dòng)脈粥樣硬化形成早期的特征性病理生理過程中可能扮演著重要角色，但其在動(dòng)脈粥樣硬化形成早期的特征性病理生理過程中的生物學(xué)功能和可能的作用機(jī)制尚未闡明。
[0007]小鼠和基因工程小鼠資源是目前疾病機(jī)制研究、基因功能研究、藥物創(chuàng)制等領(lǐng)域最重要的動(dòng)物模型之一，也是這些領(lǐng)域創(chuàng)新研究的必須條件。利用基因工程小鼠針對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化病理過程中的各個(gè)分子環(huán)節(jié)進(jìn)行研究，對(duì)闡明動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過程中的分子機(jī)制，尋找動(dòng)脈粥樣硬化治療的分子靶點(diǎn)具有重要的意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]為解決上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷和不足，本發(fā)明的首要目的在于確定Mindin基因的表達(dá)和動(dòng)脈粥樣硬化的相互關(guān)系，提供一個(gè)用于預(yù)防、緩解和/或治療動(dòng)脈粥樣硬化的靶基因Mindin的新用途。
[0009]本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
本發(fā)明確定的Mindin基因的表達(dá)和動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)系如下:
1.Mindin基因敲除顯著減少了動(dòng)脈粥樣硬化的斑塊面積
本發(fā)明以ApoE基因敲除(ApoE-/-)小鼠與Mindin/ApoE雙基因敲除(Mindin-/-ApoE-/-)小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過高脂飼料飲食誘導(dǎo)獲得動(dòng)脈粥樣硬化小鼠模型(AS)。結(jié)果表明ApoE-/-和Mindin-/-ApoE-/-小鼠通過高脂飼料飲食后，Mindin-/_ApoE-/-小鼠的主動(dòng)脈樹以及主動(dòng)脈竇斑塊面積均顯著小于ApoE-/-小鼠，而體重?zé)o顯著差異(圖1-3)。
[0010]2.Mindin基因敲除顯著增強(qiáng)主動(dòng)脈竇斑塊的穩(wěn)定性
本發(fā)明以ApoE基因敲除(ApoE-/-)小鼠與Mindin/ApoE雙基因敲除(Mindin-/-ApoE-/-)小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過高脂飼料飲食誘導(dǎo)獲得動(dòng)脈粥樣硬化小鼠模型(AS)，對(duì)主動(dòng)脈竇斑塊的穩(wěn)定性進(jìn)行研究。結(jié)果表明Mindin基因敲除顯著減少主動(dòng)脈竇斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞的含量，增加斑塊內(nèi)平滑肌細(xì)胞的含量和膠原成分含量，增強(qiáng)了主動(dòng)脈竇斑塊的穩(wěn)定性(圖4-5)。
[0011]3.Mindin基因敲除顯著減輕了炎癥反應(yīng)
本發(fā)明以ApoE基因敲除(ApoE-/-)小鼠與Mindin/ApoE雙基因敲除(Mindin-/-ApoE-/-)小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過高脂飼料飲食誘導(dǎo)獲得動(dòng)脈粥樣硬化小鼠模型(AS)，對(duì)主動(dòng)脈竇斑塊的炎癥因子的表達(dá)進(jìn)行研究。結(jié)果表明Mindin基因敲除顯著降低了主動(dòng)脈竇斑塊的ICAM-1和IL-6等促炎因子，升高了 IL-1O等抑炎因子的表達(dá)水平(圖6)。
[0012]由以上結(jié)果可知發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化時(shí)，Mindin基因缺陷減少了斑塊面積，增強(qiáng)主動(dòng)脈竇斑塊的穩(wěn)定性，顯著減輕了炎癥反應(yīng)。因此Mindin具有促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的作用，為研究防治動(dòng)脈粥樣硬化的新靶點(diǎn)和新策略提供了理論依據(jù)和臨床基礎(chǔ)。
[0013]因此，Mindin基因可作為藥物靶點(diǎn)，構(gòu)建Mindin基因過表達(dá)的體外細(xì)胞模型或動(dòng)物模型，用于篩選預(yù)防、緩解和/或治療動(dòng)脈粥樣硬化的藥物；Mindin基因也可作為基因治療中的靶基因，設(shè)計(jì)并制備預(yù)防、緩解和/或治療動(dòng)脈粥樣硬化的藥物和/或生物學(xué)試劑，通過基因工程技術(shù)達(dá)到預(yù)防、緩解和/或治療動(dòng)脈粥樣硬化的目的。例如以Mindin為靶基因，設(shè)計(jì)可干擾Mindin表達(dá)的雙鏈siRNA,通過化學(xué)方法合成以后,注射入人體通過RNA干擾的方法使Mindin基因沉默來治療動(dòng)脈粥樣硬化；還可以設(shè)計(jì)并構(gòu)建Mindin的突變體，注射后進(jìn)入細(xì)胞，競(jìng)爭(zhēng)Mindin原形的作用底物，從而抑制Mindin的功能，起到治療目的；此夕卜，還可以以Mindin為祀點(diǎn)設(shè)計(jì)小分子化合物抑制劑,利用Mindin基因過表達(dá)的體外細(xì)胞模型或動(dòng)物模型，通過篩選，發(fā)現(xiàn)其中能夠特異性抑制Mindin的分子，從而為動(dòng)脈粥樣硬化的治療提供新的治療性分子。
[0014]針對(duì)Mindin的上述功能,提供Mindin作為藥物祀標(biāo)在篩選預(yù)防、緩解和/或治療動(dòng)脈粥樣硬化的藥物中的應(yīng)用。
[0015]針對(duì)Mindin的上述功能,提供Mindin的抑制劑在制備預(yù)防、緩解和/或治療動(dòng)脈粥樣硬化的藥物中的應(yīng)用。
[0016]一種預(yù)防、緩解和/或治療動(dòng)脈粥樣硬化的藥物，包含Mindin的抑制劑。
[0017]所述的Mindin的抑制劑優(yōu)選為Mindin基因的siRNA、Mindin基因的RNA干擾載體，Mindin的抗體及其他能夠抑制Mindin表達(dá)的抑制劑中的一種。
[0018]本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果:
1.本發(fā)明發(fā)現(xiàn)Mindin基因的新功能，即Mindin能夠促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的作用。
[0019]2.基于Mindin在促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的功能，為研制動(dòng)脈粥樣硬化的藥物提供靶標(biāo)。
[0020]3.Mindin的抑制劑可用于制備預(yù)防、緩解和/或治療動(dòng)脈粥樣硬化的藥物。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021 ] 圖1是ApoE-/-和Mindin-/-ApoE-/_小鼠的主動(dòng)脈樹油紅O染色及斑塊面積統(tǒng)計(jì)圖，結(jié)果表明Mindin基因敲除顯著減少了主動(dòng)脈樹的斑塊面積。
[0022]圖2是ApoE-/-和Mindin-/_ApoE-/-小鼠HFD飲食后28周的體重統(tǒng)計(jì)圖，結(jié)果表明2組小鼠的體重?zé)o差異。
[0023]圖3是ApoE-/-和Mindin-/_ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈竇HE染色及斑塊面積統(tǒng)計(jì)柱狀圖，結(jié)果表明Mindin基因敲除顯著減少了主動(dòng)脈竇的斑塊面積(*:p < 0.05vs HFDApoE-/-組)。
[0024]圖4是ApoE-/-和Mindin-/-ApoE-/-小鼠的主動(dòng)脈竇斑塊內(nèi)膠原成分含量染色圖，結(jié)果表明Mindin基因敲除顯著增加了主動(dòng)脈竇的膠原纖維含量(#:p < 0.0lvs HFDApoE-/-組)。
[0025]圖5是ApoE-/-和Mindin-/-ApoE-/-小鼠的主動(dòng)脈巨噬細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞含量染色圖，結(jié)果表明Mindin基因敲除顯著減少主動(dòng)脈竇斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞的含量，增加斑塊內(nèi)平滑肌細(xì)胞的含量(#:P < 0.0lvs HFD ApoE-/-組；圖中m代表主動(dòng)脈中膜，A代表斑塊，L代表主動(dòng)脈管腔)。
[0026]圖6 是 ApoE-/-和 Mindin-/_ApoE-/-小鼠的主動(dòng)脈竇斑塊內(nèi) ICAM-1、IL-6、IL-1O等炎癥因子的表達(dá)水平免疫熒光染色圖和熒光定量統(tǒng)計(jì)柱狀圖，結(jié)果表明Mindin基因敲除顯著降低了主動(dòng)脈竇斑塊的促炎因子ICAM-1和IL-6的表達(dá)水平，升高了抗炎因子IL-1O的表達(dá)水平(*:p < 0.05vs HFD ApoE-/-組；圖中m代表主動(dòng)脈中膜，A代表斑塊，L代表主動(dòng)脈管腔)。

【具體實(shí)施方式】
[0027]下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。
[0028]實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物及飼養(yǎng)
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種屬、性別、周齡及來源=ApoE基因敲除(ApoE-/-)小鼠與Mindin/ApoE雙基因尚支除(Mindin-/-ApoE-/-)小鼠,雄性，8周齡,體重19-25g。ApoE基因敲除小鼠(ApoE-/-,購自 Jackson Laboratory,貨號(hào) 002052) ;Mindin-/_ApoE-/-小鼠由 Mnkl 基因敲除小鼠(由杜克大學(xué)醫(yī)學(xué)中心免疫學(xué)(Department of Immunology, Duke University MedicalCenter)何有文構(gòu)建，并友情贈(zèng)送。)和ApoE基因敲除小鼠雜交得到(上述Mindin基因敲除小鼠制造參考以下文獻(xiàn):You-ffen He et al, The extracellular matrix protein mindinis a pattern—recognit1n molecule for microbial pathogens.Nature immunology(2004)，5(1):88-97)。
[0029]實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料配方:高脂飼料(HFD，購自北京華阜康生物科技有限公司，按AIN-76 A Western Diets配方，熱量百分比:蛋白質(zhì)15.8%，脂肪40%，碳水化合物44.2%)。
[0030]動(dòng)物飼養(yǎng)及環(huán)境條件:所有的實(shí)驗(yàn)小鼠均飼養(yǎng)在武漢大學(xué)心血管病研究所SPF級(jí)動(dòng)物房(許可證號(hào)=SYXK (鄂):2009-0053)。每12小時(shí)交替照明，溫度24±2°C，濕度40%-70%，小鼠自由飲水進(jìn)食。
[0031]實(shí)施例1小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型(AS)獲得
1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組:選用8周齡，體重19-25g，雄性，ApoE-/-小鼠和Mindin-/-ApoE-/_ 小鼠,分別給予高脂飼料(Western Diets, HFD)飼養(yǎng)，ApoE-/- HFD 組，Mindin-/-ApoE-/- HFD組共2個(gè)組別，每組各20只。
[0032]2.動(dòng)脈粥樣硬化模型通過高脂飼料誘導(dǎo)操作流程:
采用ApoE-/-小鼠和Mindin -/-ApoE-/-小鼠，建立AS模型，進(jìn)行表型相關(guān)分析，明確Mindin基因?qū)?dòng)脈粥樣硬化疾病發(fā)揮的作用。小鼠從8周齡開始，HFD組全程高脂飼料喂養(yǎng)28周處死并收集樣本。
[0033]實(shí)施例2 AS模型小鼠斑塊面積測(cè)定 1.小鼠終末組織取材
小鼠喂養(yǎng)高脂或低脂飼料直至28周時(shí)，稱重，用3%戊巴比妥鈉，90mg/kg麻醉小鼠，用針頭固定于取材板，用紗布濕潤小鼠胸腹部皮膚，用眼科剪剪開胸腔，暴露心臟，剪開右心耳，把輸液器的針頭刺進(jìn)左心室，用50mL注射器緩慢推注10-15mL PBS緩沖液，待右心耳流出液清亮，換上4%多聚甲醛繼續(xù)推注10-15mL。灌流結(jié)束后，清除胸腹腔臟器，僅保留心臟。將小鼠置于顯微鏡下，分離主動(dòng)脈弓周圍筋膜、脂肪組織，剪下頭臂干，放入裝有4%多聚甲醛的5mL EP管中，在升主動(dòng)脈起始部剪下心臟，在胸主動(dòng)脈中部剪斷，并在頸總和鎖骨下約3mm處剪斷，把主動(dòng)脈弓放入上述EP管中。
[0034]2.主動(dòng)脈樹斑塊面積測(cè)定
主動(dòng)脈樹置于4%多聚甲醛中隔夜固定一純水漂洗30min — 60%異丙醇處理10 min —油紅O染液(公司sigma,貨號(hào)00625)染色60 min — 60%異丙醇漂洗lminX3次至背景干凈一解剖鏡下去除殘余外壁脂肪一將染色好的動(dòng)脈平鋪于黑色解剖蠟板上，染色后用數(shù)碼相機(jī)拍照，并使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件進(jìn)行斑塊面積定量測(cè)定(油紅O原液=0.5克油紅0+100毫升100%異丙醇，油紅O染液(工作液):V (油紅O原液)/ V (H20)=3/2)。
[0035]主動(dòng)脈樹斑塊面積(％)=斑塊總面積/主動(dòng)脈樹總面積*100%。
[0036]3.病理組織處理 3.1石蠟標(biāo)本制備
4%多聚甲醛中隔夜固定后，將頭臂干、主動(dòng)脈弓用濾紙小心包好，以防從包埋框間隙中漏出。流水沖洗30min后放入脫水機(jī),30%乙醇15min — 50%乙醇15min — 75%乙醇15min — 85% 乙醇 15min — 95% 乙醇 15min — 100% 乙醇 15min — 100% 乙醇 15min —二甲苯15min — 二甲苯15min —石臘30min —石臘30min。頭臂干及主動(dòng)脈弓脫水完成后,從脫水機(jī)拿出。頭臂干呈Y直立于石蠟中，主動(dòng)脈弓平躺于石蠟中。
[0037]3.2主動(dòng)脈組織切片
使用切片機(jī)分別對(duì)主動(dòng)脈竇和頭臂干石蠟標(biāo)本切片(切片厚度5 μ m)。
[0038]4.主動(dòng)脈竇斑塊面積測(cè)定
蘇木素伊紅染色(HE染色):取主動(dòng)脈竇石蠟白片65°C烘烤30分鐘一二甲苯5分鐘X 3次一100%乙醇I分鐘一95%乙醇I分鐘一70%乙醇I分鐘一純水漂洗(以玻片上不掛有水珠為標(biāo)準(zhǔn))一甩盡載玻片上的水分，蘇木素溶液(珠海貝索，BA-4021)浸染5分鐘一自來水漂洗(去除玻片上蘇木素的浮色)一1%鹽酸乙醇1-3秒一自來水漂洗(去除玻片上鹽酸乙醇)一Scott液(碳酸氫鈉0.35g,硫酸鎂2g,蒸懼水10mDl分鐘一自來水浸洗(去除玻片上的Scott液)一甩盡在玻片上的水分，伊紅溶液(珠海貝索，BA-4024)染色10秒鐘一純水漂洗(去除玻片上伊紅的浮色)一70%乙醇一下一95%乙醇一下一100%乙醇30秒，3次一二甲苯2分鐘，3次一趁二甲苯未干時(shí)封片(以切片無氣泡為原則)一通風(fēng)櫥內(nèi)吹干，顯微鏡拍照。
[0039]HE染色圖片統(tǒng)計(jì):直接用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件圈主動(dòng)脈竇斑塊面積。
[0040]通過主動(dòng)脈樹油紅O染色可大體評(píng)估整條血管上動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的多少、分布情況及斑塊面積的大小。圖1是小鼠AS模型后油紅O染色結(jié)果圖，頭臂干和主動(dòng)脈竇是動(dòng)脈粥樣硬化斑塊最明顯的部位，ApoE-/-和Mindin-/-ApoE-/-小鼠通過高脂飼料飲食后，Mindin-/_ApoE-/-小鼠的主動(dòng)脈樹斑塊面積顯著小于ApoE-/-小鼠，而體重?zé)o顯著差異(圖2)。圖3是小鼠AS模型后主動(dòng)脈竇HE染色結(jié)果圖，結(jié)果表明經(jīng)高脂飲食后Mindin-/-ApoE-/_小鼠的主動(dòng)脈竇的斑塊面積顯著小于ApoE-/-小鼠。以上結(jié)果表明Mindin基因敲除顯著降低了動(dòng)脈粥樣硬化的斑塊面積。
[0041]實(shí)施例3 AS模型小鼠斑塊穩(wěn)定性的測(cè)定 1.主動(dòng)脈竇膠原成分含量測(cè)定:
天狼星紅(PSR)染色，主要步驟為:55°C烘烤30min—二甲苯2min，3次一100%酒精lmin —95%酒精I(xiàn)min — 70%酒精lmin—流水沖洗lOmin—雙蒸水lmin—質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%磷鑰酸2min — 0.1%天狼猩紅苦味酸溶液滴于組織上,濕盒中染色90min —去除殘液一0.0lN鹽酸4s — 70%酒精I(xiàn)次一90%酒精I(xiàn)次一100%酒精30s，3次一二甲苯2min，3次一趁二甲苯未干立即蓋玻片封片，顯微鏡拍照。
[0042]膠原比例(％)=膠原面積/斑塊面積*100%。
[0043]2.主動(dòng)脈竇巨噬細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞表達(dá)測(cè)定
免疫熒光染色檢測(cè)巨噬細(xì)胞標(biāo)志物⑶68，平滑肌細(xì)胞標(biāo)志物SMA (Smooth MuscleActin)的表達(dá)。所需一抗信息:CD68 (MCA1957; 1:100; rat; AbD Serotec), SMA(ab5694; 1:100; rabbit; Abeam);所需二抗信息:Alexa Flour? 568 goat ant1-rat IgG(Al1077 ；Invitrogen,), Alexa Fluor 488-conjugated goat ant1-rabbit IgG (Al1008 ；Invitrogen)。
[0044]主要步驟為:
I)烤片:將石蠟切片置于烤箱中30min以上。
[0045]2)脫蠟:二甲苯 5minX3 次。
[0046]3)水合:100% 乙醇 5minX2 次；95% 乙醇 5min ；70% 乙醇 5min ;ddH20浸洗 5minX2次。
[0047]4)檸檬酸鹽組織抗原修復(fù)(高壓修復(fù)):取一定量的pH6.0檸檬酸鹽抗原修復(fù)工作液于修復(fù)盒中，放入高壓鍋中，大火加熱至沸騰，將脫蠟水合后的組織切片置于修復(fù)盒中，蓋上鍋蓋，扣上壓力閥，繼續(xù)加熱至噴氣，開始計(jì)時(shí)5min后，取出修復(fù)盒；室溫放置20min，自然冷卻后取出切片。
[0048]5 ) ddH20 漂洗 5min X 2 次，PBS 漂洗 5min X 2 次。
[0049]6)組化筆劃圈，滴加10%羊血清(GTX27481，GeneTex)封閉，于濕盒中37°C封閉60mino
[0050]7)棄封閉液,滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗，4°C孵育過夜,37°C復(fù)溫30min,棄去一抗，PBS 洗 1minX 3 次。
[0051]8)滴加二抗，于濕盒中37°C孵育60min，棄去二抗，PBS浸洗5minX3次。
[0052]9) SlowFade Gold antifade reagent with DAPI (S36939, Invitrogen)封片。
[0053]10)熒光鏡下觀察，拍照。
[0054]突光定量統(tǒng)計(jì):使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件對(duì)陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)測(cè)定，CD68/SMA (%)=陽性細(xì)胞數(shù)/斑塊面積*100%。
[0055]巨噬細(xì)胞是斑塊內(nèi)最重要的細(xì)胞成分，它主要有血液循環(huán)單核細(xì)胞進(jìn)入內(nèi)皮下后分化而來，單核/巨噬細(xì)胞可分泌多種粘附、趨化因子如細(xì)胞黏附分子(ICAM-1)、單核細(xì)胞趨化和激活因子(MCP-1)等，增進(jìn)斑塊內(nèi)細(xì)胞的進(jìn)入，此外巨噬細(xì)胞還可分泌多種基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)，降低斑塊內(nèi)膠原面積，從而破壞斑塊的穩(wěn)定性；平滑肌細(xì)胞可分泌多種細(xì)胞基質(zhì)，是動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)分泌膠原的細(xì)胞源，主要作用是修復(fù)被破壞的細(xì)胞基質(zhì)成分從而起到保護(hù)作用；膠原成分是斑塊內(nèi)最重要的細(xì)胞外基質(zhì)，也是纖維帽的主要成分，具有抗血流沖擊防止斑塊破裂的作用，也是維護(hù)斑塊穩(wěn)定性的重要評(píng)估指標(biāo)。
[0056]圖4-5是ApoE-/-小鼠和Mindin-/-ApoE-/_小鼠的斑塊內(nèi)含物的分析結(jié)果圖。主動(dòng)脈棄HE染色可見Mindin-/-ApoE-/-小鼠的壞死中心面積明顯小于ApoE-/-小鼠(圖3下)；PSR染色結(jié)果表明高脂飲食后的模型，Mindin-/-ApoE-/-組小鼠的膠原比例明顯高于ApoE-/-小鼠；免疫熒光發(fā)觀察巨噬細(xì)胞標(biāo)志物⑶68在Mindin-/-ApoE-/-小鼠斑塊內(nèi)表達(dá)量則顯著低于ApoE-/-小鼠；平滑肌細(xì)胞標(biāo)志物SMA在Mindin-/-ApoE-/-小鼠斑塊內(nèi)表達(dá)量明顯高于ApoE-/-小鼠。以上結(jié)果表明Mindin基因敲除顯著減少主動(dòng)脈竇斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞的含量和壞死中心的面積，增加斑塊內(nèi)平滑肌細(xì)胞的含量和膠原成分含量;Mindin基因敲除可以增強(qiáng)主動(dòng)脈竇斑塊的穩(wěn)定性(圖4-5)
實(shí)施例4 AS模型小鼠斑塊內(nèi)炎癥因子表達(dá)的測(cè)定
免疫熒光染色檢測(cè)ICAM-1、IL-6、IL-1O等炎癥因子的表達(dá)。所需一抗信息:ICAM-1(AF796 ； 1:100 ；goat ；R&D systems)、IL-6 (AF-406-NA ； 1:100 ；goat ；R&D systems)>IL-1O (AF-217-NA ；1:100 ；goat ；R&D systems);所需二抗信息:Alexa Flour? 568 donkeyant1-goat IgG (Al1057 ;Invitrogen)。
[0057]主要步驟為:參見實(shí)施例3.2
熒光定量統(tǒng)計(jì):使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件對(duì)陽性細(xì)胞進(jìn)行吸光度(1D)測(cè)定。
[0058]炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂的主要因素之一。炎性細(xì)胞分泌大量細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素6 (IL-6)，白細(xì)胞介素10 (IL-1O)等可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞的活化、平滑肌細(xì)胞的增生凋亡及粥樣病變的進(jìn)展。受損的內(nèi)皮細(xì)胞和單核/巨噬細(xì)胞分泌的粘附、趨化因子是介導(dǎo)炎癥細(xì)胞向動(dòng)脈粥樣硬化斑塊聚集的關(guān)鍵因子。通過免疫熒光染色觀察ICAM-1、IL-6、IL-1O等炎癥因子的表達(dá)變化，結(jié)果表明Mindin基因敲除顯著降低了主動(dòng)脈竇斑塊內(nèi)促炎因子ICAM-1、IL-6的表達(dá)水平，升高了 IL-1O抗炎癥因子的表達(dá)水平(圖6)。
[0059]上述實(shí)施例結(jié)果顯示，ApoE-/-小鼠及Mindin-/-ApoE-/_小鼠在高脂飲食的誘導(dǎo)下發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化，和ApoE-/-小鼠相比，Mindin/ApoE雙基因敲除后小鼠的主動(dòng)脈斑塊面積顯著減少，斑塊穩(wěn)定性也增加，炎癥反應(yīng)明顯減輕。這些結(jié)果表明，Mindin可顯著促進(jìn)主動(dòng)脈斑塊的形成和動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。本發(fā)明證明了 Mindin在動(dòng)脈粥樣硬化模型中有著重要的惡化作用，其抑制劑可用于制備預(yù)防、緩解和/或治療動(dòng)脈粥樣硬化疾病的藥物。
[0060]上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.Mindin基因作為藥物靶標(biāo)在篩選預(yù)防、緩解和/或治療動(dòng)脈粥樣硬化的藥物中的應(yīng)用。
2.Mindin的抑制劑在制備預(yù)防、緩解和/或治療動(dòng)脈粥樣硬化的藥物中的應(yīng)用。
3.一種預(yù)防、緩解和/或治療動(dòng)脈粥樣硬化的藥物，其特征在于:包含Mindin的抑制劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用或權(quán)利要求3所述的藥物，其特征在于:所述的Mindin的抑制劑為Mindin基因的siRNA、Mindin基因的RNA干擾載體或Mindin的抗體及其他能夠抑制Mindin表達(dá)的抑制劑中的一種。
【文檔編號(hào)】A61K45/00GK104324390SQ201410514154
【公開日】2015年2月4日 申請(qǐng)日期:2014年9月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月29日
【發(fā)明者】李紅良, 朱麗華, 張鵬, 程文林 申請(qǐng)人:武漢大學(xué)