干擾素調(diào)節(jié)因子9(irf9)及其抑制劑在肝臟缺血疾病中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種IRF9及其抑制劑在肝臟缺血疾病中的應(yīng)用，屬于基因的功能與應(yīng)用領(lǐng)域。本發(fā)明以IRF9基因敲除小鼠和肝細胞特異性IRF9轉(zhuǎn)基因小鼠為實驗對象，通過肝缺血再灌注損傷模型，結(jié)果表明與野生型C57小鼠對比，IRF9基因敲除小鼠肝臟壞死明顯被抑制，肝功能也明顯好轉(zhuǎn)，而肝細胞特異性IRF9轉(zhuǎn)基因小鼠的肝臟壞死則明顯增加，且肝功能明顯惡化。因此IRF9基因具有惡化肝功能的作用，特別是IRF9基因能夠惡化肝缺血疾病的作用。針對IRF9的上述功能，提供IRF9作為肝缺血疾病治療的藥物靶標(biāo)在研制肝缺血疾病藥物中應(yīng)用。
【專利說明】干擾素調(diào)節(jié)因子9(IRF9)及其抑制劑在肝臟缺血疾病中的應(yīng)用
[0001]
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明屬于基因的功能與應(yīng)用領(lǐng)域，更具體的說本發(fā)明涉及干擾素調(diào)節(jié)因子9(Interferon Regulatory Factor 9, IRF9)作為藥物祀標(biāo)在篩選治療肝缺血疾病藥物中的應(yīng)用，以及IRF9的抑制劑在制備治療肝缺血疾病藥物中的應(yīng)用。
[0003]
【背景技術(shù)】
[0004]缺血再灌注損傷是指組織缺血缺氧達到一定的時間和程度引起細胞發(fā)生病理改變，在恢復(fù)血液供應(yīng)后不一定使病變的細胞恢復(fù)功能，反而在一定條件下進一步加重的現(xiàn)象。缺血-再灌注損傷(ischemia/reperfusion injury, I/R)發(fā)生機制的研究己成為移植界關(guān)注的熱點。導(dǎo)致缺血再灌注損傷的原因很多，確切的發(fā)病機制仍不十分清楚。目前，對于肝臟缺血再灌注損傷發(fā)生機制的研究己成為移植界關(guān)注的熱點。在肝臟，肝臟缺血再灌注后肝竇內(nèi)皮細胞和枯否細胞(Kupffer cells)活化，釋放出多種炎性因子如氧自由基、細胞因子等，引起中性粒細胞趨化，粘附聚集，變形穿過肝竇內(nèi)皮并浸潤至肝細胞之間，然后活化釋放出多種效應(yīng)介質(zhì)，最終引起肝臟細胞的壞死和凋亡?，F(xiàn)在的理論研究和臨床實踐都證實，在血液供應(yīng)阻斷30min以上就會引起各細胞器超微結(jié)構(gòu)的改變和功能障礙，導(dǎo)致細胞不可逆的損傷乃至死亡，及時恢復(fù)血液供應(yīng)被視為挽救這部分組織的重要措施。
[0005]肝臟缺血再灌注損傷可以分為兩個時限，早期階段以Kupffer細胞激活為主要特征。Kupffer細胞可以釋放大量的氧自由基或超氧陰離子，可以引起肝細胞的急性損傷。在缺血再灌注損傷的第二階段，Kupffer細胞激活以后，可以引起大量的炎癥因子的釋放，激活炎癥反應(yīng)通路，使大量的中性粒細胞在肝臟內(nèi)浸潤。中性粒細胞在肝臟內(nèi)浸潤后可以通過釋放氧自由基和蛋白酶，引起嚴(yán)重的肝功能損害。
[0006]眾多文獻資料表明缺血再灌注損傷可能與下列因素有關(guān):1.氧自由基的生成；2.鈣超載；3.細胞因子的參與；4.Kupffer細胞及中性粒細胞激活；5.內(nèi)皮素(Endothelin，ET)和一氧化氮(NO)濃度的失衡?？傊闻K缺血再灌注損傷是由各種機制相互影響，綜合作用的結(jié)果，進一步了解及明確其作用機制，將對臨床防治肝臟缺血再灌注損傷有著重要的意義。
[0007]干擾素 調(diào)節(jié)因子(interferon regulatory factor, IRF)家族現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)有10個成員，其組成為IRFl~IRF10。現(xiàn)有的研究提示，IRF家族成員參與了廣泛的生物學(xué)過程，主要涉及天然免疫和獲得性免疫反應(yīng)，調(diào)控細胞生長及生存、凋亡和增殖，參與造血，抗腫瘤形成等。IRF9又稱為P48,干擾素刺激基因因子(IFN-stimulated gene factor 3 y ,ISGF3 y)0目前有IRF-9的研究主要集中在抗病毒，IRF-9和HBV干擾素刺激應(yīng)答元件樣結(jié)構(gòu)域結(jié)合后，其表達迅速上調(diào)可以增強IFN-a誘導(dǎo)的HBV mRNA水平的顯著抑制。最近有報道，小鼠在IRF9基因敲除(Knockout，KO)后，表現(xiàn)為增加小腸粘液和淋巴結(jié)里的T細胞及中性粒細胞數(shù)目，這提示IRF9與炎癥有著密切聯(lián)系。(Lohoff M等，Nature reviewsImmunology.2005;5(2):125-35; Honda K等，Nature reviews Immunology.2006; 6(9):644-58.)

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]為解決上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷和不足，本發(fā)明的首要目的在于提供IRF9作為藥物靶標(biāo)在篩選治療肝缺血疾病藥物中的應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明的另一目的在于提供一種IRF9的抑制劑在制備治療肝缺血疾病藥物中的應(yīng)用。
[0010]本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn):
本發(fā)明以IRF9基因敲除小鼠和肝細胞特異性IRF9轉(zhuǎn)基因小鼠為實驗對象，通過肝缺血再灌注損傷模型，結(jié)果表明與野生型C57小鼠對比，IRF9基因敲除小鼠肝臟壞死面積明顯被抑制，而肝細胞特異性IRF9轉(zhuǎn)基因小鼠的肝臟壞死面積則明顯增加。這提示IRF9基因具有惡化肝功能的作用，為IRF9在研究防治肝缺血的新靶點和新策略中所發(fā)揮的作用提供了理論依據(jù)和臨床基礎(chǔ)。
[0011]針對IRF9的上述功能，提供IRF9作為藥物靶標(biāo)在篩選治療肝缺血疾病藥物中的應(yīng)用。
[0012]針對IRF9的上述功能，提供IRF9的抑制劑在制備治療肝缺血疾病藥物中的應(yīng)用。
[0013]一種治療肝缺血疾病的藥物，包含IRF9。
[0014]所述的IRF9的抑制劑優(yōu)選為IRF9基因的siRNA、IRF9基因的RNA干擾載體、IRF9的抗體及其他能夠抑制IRF9表達的抑制劑中的一種。
[0015]本發(fā)明的研究成果表明，IRF9-K0小鼠在肝臟缺血再灌注引起的損傷中，小鼠肝臟壞死面積明顯減少，肝細胞凋亡明顯減少，證明IRF9基因在肝缺血疾病模型中有著重要的惡化作用且可能與肝細胞凋亡密切相關(guān)。抑制IRF9表達可以改善肝組織缺血/再灌注損傷，。
[0016]本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點及效果: 1.本發(fā)明發(fā)現(xiàn)IRF9基因的新功能，即IRF9基因能夠惡化肝缺血損傷疾病的作用。
[0017]2.本發(fā)明中根據(jù)IRF9在惡化肝缺血損傷疾病中的作用，為研制肝缺血疾病的藥物提供靶標(biāo)。
[0018]3.本發(fā)明中根據(jù)IRF9在惡化肝缺血損傷疾病中的作用，提供了 IRF9的抑制劑在制備治療肝缺血疾病的藥物中應(yīng)用。
[0019]
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1肝細胞特異性IRF9轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建及鑒定結(jié)果圖 A為IRF9載體的構(gòu)建圖；
B為肝細胞特異性IRF9轉(zhuǎn)基因小鼠的鑒定結(jié)果圖。
[0021 ] 圖2小鼠在不同時間點肝臟的壞死情況對比圖。[0022]A為WT和IRF9-K0小鼠在不同時間點肝臟HE染色圖及壞死面積統(tǒng)計柱狀圖；
B為NTG和IRF9-TG小鼠在不同時間點肝臟HE染色圖及壞死面積統(tǒng)計柱狀圖。
[0023]圖3小鼠在不同時間點血清中ALT及AST的含量統(tǒng)計比較圖。
[0024]A為WT和IRF9-K0小鼠在不同時間點肝臟血清中ALT及AST的含量統(tǒng)計柱狀圖； B為NTG和IRF9-TG小鼠在不同時間點肝臟血清中ALT及AST的含量統(tǒng)計柱狀圖。
[0025]圖4為WT，IRF9-K0, NTG和IRF9-TG小鼠缺血在再灌注12h時TUNEL細胞數(shù)的柱狀統(tǒng)計圖。
[0026]A為WT和IRF9-K0小鼠在再灌注12h時TUNEL免疫熒光柱狀統(tǒng)計圖；
B為NTG和IRF9-TG小鼠在再灌注12h時TUNEL免疫熒光柱狀統(tǒng)計圖。
[0027]
【具體實施方式】
[0028]下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。
[0029]實驗用動物及飼養(yǎng) 實驗動物:選用8-10周齡、體重在24g-27g，背景為雄性C57BL/6品系的野生型小鼠(WT，購自北京華阜康生物科技有限公司)、IRF9基因敲除小鼠(IRF9-K0，C57BL/6J背景，購買自RIKEN BRC公司(BRC編號:RBRC00916))、非轉(zhuǎn)基因小鼠(NTG，C57BL/6J背景)及肝細胞特異性IRF9轉(zhuǎn)基因小鼠(TG，肝細胞特異性IRF9轉(zhuǎn)基因小鼠由武漢大學(xué)心血管病研究所李紅良教授實驗室構(gòu)建)為實驗對象。
[0030]飼養(yǎng)環(huán)境:所有實驗小鼠均飼養(yǎng)在武漢大學(xué)心血管病研究所SPF級實驗動物中心。小鼠專用飼料由中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心提供。飼養(yǎng)條件:室溫在22-24°C之間，濕度在40-70%之間，明暗交替照明時間為12h，自由飲水?dāng)z食。
[0031]【實施例1】肝細胞特異性IRF9轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建:
為進一步研究IRF9過表達對于肝臟缺血/再灌注損傷的影響，我們構(gòu)建了幾株肝細胞特異性IRF9轉(zhuǎn)基因小鼠(IRF9-TG)。轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建信息:用上游引物，即5’ -TAACCTCGAGGCCACCATGGCATCAGGCAGGGCACG-3’ (SEQ ID N0.1);下游引物，即 5’ -GTATCAGCGGCCGCTCAGCAGGCTCTACACAGGG-3’ (SEQ ID N0.2)，擴增小鼠 IRF9 全長基因(NCBI,Gene ID: 16391，NM_001159417.1)，把 cDNA 插入 pGEM-T 載體(Promega 公司產(chǎn)品，貨號A1360)白蛋白(Albumin)啟動子下游，將構(gòu)建的載體通過顯微注射構(gòu)造成受精胚胎(C57BL/6J背景)，得到肝細胞特異性IRF9轉(zhuǎn)基因小鼠。轉(zhuǎn)基因小鼠通過剪尾巴取基因組DNA，使用PCR鑒定，檢測其中的外源基因結(jié)構(gòu)，PCR鑒定引物信息為:檢測正向引物5’- GCGGTCTGGCAGTAAAAACTATC-3’ (SEQ ID N0.3)，檢測反向引物 5’- GTGAAACAGCATTGCTGTCACTT-3’ (SEQ ID N0.4)。
[0032]通過蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot )實驗鑒定不同轉(zhuǎn)基因鼠肝臟中IRF9蛋白的表達量:提取不同轉(zhuǎn)基因鼠肝臟組織蛋白，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。
[0033]肝細胞IRF9的表達由Albumin啟動子驅(qū)動(圖1A),并通過Western Blot實驗驗證IRF9過表達(圖1B)。為了反映病理生理狀態(tài)下IRF9的改變，我們選擇了 IRF9-TG10小鼠，Western Blot及定量分析顯示，其肝臟組織中IRF9表達量約為正常組織5.2倍。[0034]【實施例2】小鼠肝缺血再灌注損傷模型(ischemia/reperfusioninjury, I/R)獲得
1.實驗動物分組:雄性C57BL/6品系野生型小鼠、IRF9基因敲除小鼠及IRF9轉(zhuǎn)基因小鼠和非轉(zhuǎn)基因小鼠，通過肝臟缺血再灌注建立肝缺血模型(I/R)。隨機分為8組:C57BL/6J品系野生型小鼠假手術(shù)組(WT SHAM)及I/R手術(shù)組(WT I/R)、IRF9基因敲除小鼠假手術(shù)組(K0 SHAM)及I/R手術(shù)組(K0 I/R)、非轉(zhuǎn)基因小鼠假手術(shù)組(NTG SHAM)及I/R手術(shù)組(NTG I/R)、肝細胞特異性IRF9轉(zhuǎn)基因小鼠假手術(shù)組(TG SHAM)及I/R手術(shù)組(TG I/R)。
[0035]2.肝缺血再灌注損傷模型I/R手術(shù)(采用無創(chuàng)血管夾夾閉中葉和左葉的門靜脈和肝動脈，使約70%的肝臟缺血)模型操作流程:
I)手術(shù)前12 h給小鼠禁食，可自由飲水。
[0036]2)手術(shù)前用3%戊巴比妥鈉成功麻醉小鼠后，將其平臥固定肢體，用剃毛器將小鼠腹部術(shù)區(qū)毛刮凈，用10%碘酒和75%乙醇對術(shù)區(qū)消毒。
[0037]3 )取腹正中切口進腹，暴露肝臟左、中葉之肝蒂。
[0038]4)用無創(chuàng)血管夾夾閉中葉和左葉的門靜脈和肝動脈，使約70%的肝臟缺血，以防止發(fā)生嚴(yán)重腸系膜靜脈淤血。0.5min后，與非阻斷的右葉相比，可見阻斷葉變白，說明阻斷成功。此時，注意記錄缺血開始時間，維持缺血約60分鐘，期間用濕的鹽水紗布覆蓋切口，并注意小鼠的保溫(Sham組的 小鼠在阻斷成功即刻去除血管夾，恢復(fù)缺血肝血流)。
[0039]5)缺血60分鐘后去除血管夾，恢復(fù)缺血的肝臟血流，然后關(guān)閉腹腔，分兩層關(guān)腹，先把內(nèi)層縫好，再縫皮，將手術(shù)后的小鼠置于干凈的籠子中單獨飼養(yǎng)，觀察。
[0040]【實施例3】肝臟壞死面積及肝功能指標(biāo)(AST，ALT)測定
肝臟缺血/再灌注損傷嚴(yán)重程度的評估指標(biāo)主要包括肝臟壞死面積和肝功能指標(biāo)(AST, ALT)，這些指標(biāo)均與肝臟缺血/再灌注損傷嚴(yán)重程度正相關(guān)。
[0041]1.取材
術(shù)后分別在假手術(shù)組(Sham)，以及缺血再灌注12h，24h，48h時頸椎脫臼處死小鼠，立即自下腔靜脈取血lmL，分離血清。同時統(tǒng)一取缺血區(qū)肝左葉組織大小約
1.5cmX IcmX 0.2cm于10%中性福爾馬林中固定24h后脫水,包埋,進行石臘切片后進行HE染色。(分離血清:收集血液的EP管于室溫下靜置1-2h使血液自然凝固。4°C，4000rpm/min,尚心30min,充分分尚血清。用微量移液器分別吸取血清20 y L, 20 y L, 30 y L, 30 y L置
0.2mL無菌EP管中，對EP管進行標(biāo)記，隨后保存于_80°C冰箱)。
[0042]2.制備石蠟標(biāo)本切片
I)主要操作程序包括:包埋框處理一流水沖洗一脫水一透明一浸蠟一包埋一切片一攤片一晾干或烘烤后備用。
[0043]2)用石蠟切片機的標(biāo)準(zhǔn)程序切5um的石蠟切片備用。
[0044]3.HE 染色
主要步驟為:55 °C烘烤30min — 二甲苯5min，3次一100%酒精Imin — 95%酒精Imin — 70%酒精Imin —雙蒸水Imin —蘇木素溶液5min —水洗Imin — 1%鹽酸酒精l_3s —水洗Imin — Scott液(碳酸氫鈉0.35g,硫酸鎂2g,蒸懼水100ml)Imin —水洗Imin —伊紅溶液3-5min —蒸餾水洗去浮色一70%酒精Is — 95%酒精Is — 100%酒精30s，3次一二甲苯2min，3次一趁二甲苯未干立即封片一通風(fēng)櫥內(nèi)吹干，顯微鏡拍照。
[0045]4.小鼠血清ALT、AST含量測定
①從_80°C冰箱中取出血清樣本，迅速置于冰上，在室溫下待樣品融化；
②在室溫下，4000轉(zhuǎn)/分鐘離心I分鐘，讓EP管壁的血清聚集至管底。
[0046]③按照操作流程,打開全自動生化分析儀(Sysmex, Chemix 180i),清洗加樣器。
[0047]④按照全自動生化分析儀樣品盤的標(biāo)記順序，逐一放入待測的EP管。
[0048]⑤準(zhǔn)確安裝試劑檢測盤，開始使用全自動生化分析儀檢測ALT、AST水平。
[0049]WT和IRF9-K0組在肝臟缺血再灌注損傷后的HE染色結(jié)果見圖2A:顯微鏡下可見SHAM組肝組織基本正常，肝組織結(jié)構(gòu)整齊，無明顯的纖維組織增生。I/R組隨著再灌注的時間的延長，肝組織結(jié)構(gòu)模糊，排列紊亂。其內(nèi)有大小不等、形狀不規(guī)則的壞死灶，壞死灶內(nèi)肝細胞結(jié)構(gòu)模糊，排列紊亂，離斷，與正常肝臟比較，壞死肝臟的肝小葉內(nèi)見大片壞死灶，壞死組織邊緣可見炎性反應(yīng)帶，肝細胞核發(fā)生典型的壞死改變，可見核固縮。這種現(xiàn)象在缺血再灌注后24h達到高峰。實驗結(jié)果表明，給予IRF9-K0小鼠I/R后的梗死面積明顯低于WT組小鼠(圖2A);同樣IRF9-TG小鼠I/R后的梗死面積明顯大于NTG組小鼠(圖2B)，因此，IRF9在肝臟缺血再灌注引起的損傷中可能起到重要作用。
[0050]血清中ALT及AST的含量統(tǒng)計結(jié)果見圖3。經(jīng)血清ALT、血清AST檢測水平表明，在I/R組各時間點ALT、AST水平均明顯高于Sham組，在再灌注后12h達到高峰，隨后下降，IRF9- KO小鼠I/R后的AL T、AST水平明顯低于WT組小鼠(3A) ;IRF9 TG小鼠I/R后的ALT、AST水平顯著高于NTG組小鼠(3B)。
[0051]【實施例4】缺血再灌注后肝細胞凋亡情況測定
用 TUNEL 試劑盒染色檢測凋亡。(TUNEL 試劑盒:ApopTag? Plus In Situ ApoptosisFluorescein Detection Kit (S7111, Chemicon)):
1)將石蠟切片置于烤箱中，60°C烤片30分鐘；
2)二甲苯，5分鐘X3次；
3)100%乙醇，5分鐘X 2次；95%乙醇，5分鐘；70%乙醇，5分鐘；
4)ddH20漂洗，5分鐘X2次；
5)蛋白酶K37°C孵育15分鐘；
6)PBS 漂洗 5minX2 次；
7)直接滴加EquilibrationBuffer于組織上(13 ii L/cm2),室溫孵育至少IOs ；
8)棄去Equilibration Buffer,滴加 TdT Enzyme 工作液(77 u LReaction Buffer+33 u LTdT Enzyme)于組織上(lly L/cm2)，置濕盒于 37°C孵育 Ih ；
9)將切片置于盛有Stop/Wash Buffer 工作液(lmL Stop/Wash Buffer+34mlLddH2O)的染色缸中振蕩15s后室溫孵育IOmin (等待過程中，將適當(dāng)量的Ant1-DigoxigeninConjugate吸出，至于EP管中，避光放置在室溫下，使其平衡至室溫)；
10)PBS 漂洗 IminX3 次；
11)輕輕甩去組織多余殘留的液體，將組織周圍液體吸3滴加Ant1-DigoxigeninFluorescein 工作液(53%Blocking Solution+ 47%Anti_Digoxigenin Conjugate)于組織上(13 ii L/cm2)，置濕盒中室溫避光孵育30min ；
12)PBS漂洗2minX4次(每次換新的PBS)；13)SlowFade Gold antifade reagent with DAPI (Invitrogen ,S36939)封片；突光鏡下觀察，拍照。若需保存，于暗濕盒中4°C保存。
[0052]肝組織細胞凋亡情況測定結(jié)果見圖4所示，檢測了 IRF9-K0小鼠和野生型小鼠I/R術(shù)后12小時肝細胞凋亡情況。TUNEL細胞凋亡檢測顯示，IRF9-K0小鼠肝細胞凋亡明顯比野生型小鼠降低，IRF9-TG小鼠肝細胞凋亡明顯比非轉(zhuǎn)基因小鼠增加，進一步提示IRF9與肝細胞缺血/再灌注時死亡相關(guān)。這些結(jié)果表明，抑制IRF9表達可以改善肝組織缺血/再灌注損傷，且可能與肝細胞凋亡密切相關(guān)。
[0053]研究成果表明，IRF9- KO小鼠在肝臟缺血再灌注引起的損傷中，小鼠肝臟壞死面積顯著減少，肝功能明顯改善，肝細胞凋亡也明顯減少。證明IRF9基因在腦缺血疾病模型中有著重要的惡化作用。
[0054]上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方 式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1. 1RF9作為藥物靶標(biāo)在篩選治療肝缺血疾病藥物中的應(yīng)用。
2. 1RF9的抑制劑在制備治療肝缺血疾病藥物中的應(yīng)用。
3.一種治療肝缺血疾病的藥物，其特征在于:包含IRF9。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用或權(quán)利要求3所述的藥物，其特征在于:所述的IRF9的抑制劑為IRF9基因的siRNA、IRF9基因的RNA干擾載體或IRF9的抗體中的一種。
【文檔編號】A61K48/00GK103784976SQ201410031619
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年1月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月23日
【發(fā)明者】李紅良, 張曉東, 王丕曉, 蔣丁勝, 張艷, 萬埝 申請人:武漢大學(xué)