抑郁癥的調(diào)節(jié)因子及其應(yīng)用的制作方法【專利摘要】本發(fā)明提供了抑郁癥的調(diào)節(jié)因子及其應(yīng)用。具體地，本發(fā)明提供了βCaMKII抑制劑在制備預(yù)防和/或治療抑郁癥的藥物中應(yīng)用。本發(fā)明的研究表明，在外側(cè)韁核過表達(dá)βCaMKII(而非αCaMKII)可誘導(dǎo)出快感缺乏和行為絕望的核心抑郁癥狀。在外側(cè)韁核下調(diào)βCaMKII的表達(dá)水平，降低它的激酶活性或者阻斷它的下游分子GluR1則可以逆轉(zhuǎn)動(dòng)物的抑郁表型?！緦＠f明】抑郁癥的調(diào)節(jié)因子及其應(yīng)用【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001]本領(lǐng)域涉及生物技術(shù)及醫(yī)藥領(lǐng)域，特別地，涉及抑郁癥的調(diào)節(jié)因子及其應(yīng)用?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]重度抑郁癥（MDD)，是最常見和最致殘的精神疾病之一，其具有以下特點(diǎn)，心情低落，動(dòng)力缺失，絕望，無法感受開心，也被稱為快感缺乏（1)。對(duì)于導(dǎo)致MDD的原因，現(xiàn)今觀點(diǎn)認(rèn)為，在響應(yīng)外界刺激比如壓力時(shí)，特定大腦環(huán)路的神經(jīng)活動(dòng)發(fā)生了改變。而這種改變是由于特定分子及細(xì)胞水平的變化所引起的。最近，外側(cè)韁核（LHb)，作為從邊緣前腦向眾多單胺中心傳遞信息的核心腦區(qū)，已經(jīng)成為抑郁癥病理生理學(xué)和治療研究的關(guān)鍵大腦區(qū)域。LHb神經(jīng)元被厭惡情緒激活，包括壓力，沮喪，恐懼或預(yù)期的負(fù)回報(bào)。與之一致的是，神經(jīng)影像學(xué)研究已經(jīng)確定了在抑郁狀態(tài)下韁核活躍度的提高。此外，最近的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，在動(dòng)物抑郁模型中，突觸活性和LHb神經(jīng)元峰值輸出都得到增強(qiáng)。然而LHb中這些異常細(xì)胞過程的分子機(jī)制以及誘導(dǎo)抑郁癥的刺激如壓力如何導(dǎo)致這些變化的產(chǎn)生仍然需要研究確定。[0003]為了對(duì)抑郁癥進(jìn)行預(yù)防和治療，本領(lǐng)域迫切需要抑郁癥調(diào)節(jié)的相關(guān)因子及其作用機(jī)制，并開發(fā)可用于預(yù)防和/或治療抑郁癥的藥物。【
發(fā)明內(nèi)容】[0004]本發(fā)明的目的就是提供可用于預(yù)防和/或治療抑郁癥的活性成分和藥物[0005]在本發(fā)明的第一方面，提供了一種βCaMKII抑制劑的用途，用于制備預(yù)防和/或治療抑郁癥的藥物。[0006]在另一優(yōu)選例中，所述的抑制劑選自下組：[0007]⑴干擾βCaMKII表達(dá)的干擾RNA或其前體；[0008](ii)激酶活性下降或喪失的突變型βCaMKII蛋白或其編碼序列；[0009](iii)抑制βCaMKII活性的抑制劑；[0010](iv)βCaMKII的競爭性抑制劑；[0011](V)抗βCaMKII的抗體；[0012](vi)阻遏βCaMKII調(diào)控AMPARGluRl通路的拮抗劑。[0013]在另一優(yōu)選例中，所述的干擾RNA是βRNAi(SEQIDNO.:1，5'-GAGTATGCAGCTAAGATCA-3'）。[0014]在另一優(yōu)選例中，所述的突變型βCaMKII蛋白是βCaMKII蛋白顯性失活因子，較佳地為PK43R(WaymanGAetal.2011)。[0015]在另一優(yōu)選例中，所述的PCaMKII的抑制劑包括KN-93、KN-62、AC3-I(Autocamtide-3DerivedInhibitoryPeptide)、Ant_AIP-II(Autocamtide-2RelatedInhibitoryPeptideII，CelI-permeable)〇[0016]在另一優(yōu)選例中，所述組分（vi)是AMPARGluRl的顯性失活因子，較佳地為GluRICt。[0017]在另一優(yōu)選例中，所述的抑制劑或拮抗劑包括以下形式：多核苷酸、多肽、表達(dá)載體、小分子化合物、或其組合。[0018]在另一優(yōu)選例中，所述的表達(dá)載體選自下組：病毒載體。[0019]在另一優(yōu)選例中，所述的βCaMKII抑制劑還用于制備降低外側(cè)韁核的神經(jīng)元峰電位輸出的藥物和/或降低外側(cè)韁核的突觸效能的藥物。[0020]在另一優(yōu)選例中，所述藥物是靶向作用于外側(cè)韁核的藥物，或所述藥物是施用于外側(cè)韁核區(qū)域或附近區(qū)域的藥物。[0021]在本發(fā)明的第二方面，提供了一種可用于預(yù)防和/或治療抑郁癥的藥物組合物，所述的藥物組合物包括：[0022]藥學(xué)上可接受的載體；和[0023]有效量活性成分，其中所述的活性成分為βCaMKII抑制劑或拮抗劑。[0024]在另一優(yōu)選例中，所述的活性成分對(duì)aCaMKII基本上無抑制/拮抗作用。[0025]在另一優(yōu)選例中，所述的活性成分對(duì)δCaMKII基本上無抑制/拮抗作用。[0026]在另一優(yōu)選例中，所述的活性成分對(duì)YCaMKII基本上無抑制/拮抗作用。在另一優(yōu)選例中，所述的活性成分對(duì)YCaMKII有抑制/拮抗作用。[0027]在另一優(yōu)選例中，所述的活性成分選擇性抑制βCaMKII，而對(duì)其他CaMKII(包括aCaMKII、YCaMKII、和δCaMKII)無或基本上無抑制/拮抗作用。[0028]在另一優(yōu)選例中，所述PCaMKII抑制劑或拮抗劑選自下組：PCaMKII-RNAi、βK43R、KN-93、KN-62、AC3-I(Autocamtide-3DerivedInhibitoryPeptide)、Ant-AIP-II(Autocamtide-2RelatedInhibitoryPeptideII，Cell-permeable)〇[0029]在另一優(yōu)選例中，所述的藥物組合物為口服制劑、注射劑、靶向制劑等。[0030]在本發(fā)明的第三方面，提供了一種βCaMKII蛋白或其編碼序列和/或βCaMKII促進(jìn)劑的用途，它被用于制備一試劑或組合物，所述試劑或組合物用于構(gòu)建抑郁癥動(dòng)物模型。[0031]在另一優(yōu)選例中，所述的抑郁癥動(dòng)物模型中，PCaMKII是高表達(dá)的。[0032]在另一優(yōu)選例中，所述的抑郁癥動(dòng)物模型中，βCaMKII在外側(cè)韁核中是高表達(dá)的。[0033]在另一優(yōu)選例中，所述的高表達(dá)（按mRNA水平或蛋白水平）指彡150%，較佳地彡200%，更佳地彡200%。[0034]在另一優(yōu)選例中，所述高表達(dá)（按mRNA水平或蛋白水平）的上限為<2000%、較佳地彡1000%、更佳地彡500%。[0035]在本發(fā)明的第四方面，提供了一種篩選用于預(yù)防和/或治療抑郁癥潛在物質(zhì)的方法，包括步驟：[0036](1)給抑郁癥動(dòng)物模型施用待篩選的測試物，其中在所述抑郁癥動(dòng)物模型的外側(cè)韁核中βCaMKII是高表達(dá)的；和[0037](2)觀察所述抑郁癥動(dòng)物模型中的抑郁癥的相關(guān)癥狀和/或指標(biāo)，并與對(duì)照組進(jìn)行比較；[0038]其中，所述抑郁癥動(dòng)物模型中抑郁癥的相關(guān)癥狀有顯著改善，則表示該測試物是可用于預(yù)防和/或治療抑郁癥潛在物質(zhì)。[0039]在另一優(yōu)選例中，所述的動(dòng)物模型為非人哺乳動(dòng)物，如嚙齒動(dòng)物、兔、靈長動(dòng)物。[0040]在另一優(yōu)選例中，在步驟（2)，通過動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)觀察抑郁癥狀。[0041]在另一優(yōu)選例中，所述的動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)選自下組：習(xí)得無助實(shí)驗(yàn)、強(qiáng)制游泳實(shí)驗(yàn)、蔗糖偏好實(shí)驗(yàn)、懸尾實(shí)驗(yàn)、新奇抑制攝食實(shí)驗(yàn)。[0042]在另一優(yōu)選例中，所述的癥狀選自下組：習(xí)得無助（按杠桿次數(shù)減少）、放棄游泳提早且靜止時(shí)間增加、糖水消耗減少、掙扎減少、攝食抑制增加。[0043]在另一優(yōu)選例中，所述的指標(biāo)包括：βCaMKII的表達(dá)水平、βCaMKII的活性水平。[0044]在另一優(yōu)選例中，所述的施用（或給藥）包括口服施用。[0045]在另一優(yōu)選例中，所述的對(duì)照組包括：陰性對(duì)照組和/或陽性對(duì)照組。[0046]在另一優(yōu)選例中，所述的陰性對(duì)照組包括：未施用測試物的對(duì)照組；或施用測試物之前的同一試驗(yàn)組。[0047]在本發(fā)明的第五方面，提供了一種篩選用于預(yù)防和/或治療抑郁癥潛在物質(zhì)的方法，包括步驟：[0048](1)在測試組中，向體外檢測體系中加入待檢測的測試物；和[0049](2)檢測所述測試組的體外檢測體系中βCaMKII的表達(dá)水平和/或活性，并與陰性對(duì)照組進(jìn)行比較；[0050]其中，如果與加入了陰性對(duì)照組相比，測試組中PCaMKII的表達(dá)水平顯著下降，和/或βCaMKII的活性顯著下降，則表示所述測試物是預(yù)防和/或治療抑郁癥的潛在物質(zhì)。[0051]在另一優(yōu)選例中，所述的體外檢測體系包括細(xì)胞體系；較佳地為神經(jīng)元細(xì)胞體系；較佳地為外側(cè)韁核神經(jīng)元體系。[0052]在另一優(yōu)選例中，所述的顯著下降指，與陰性對(duì)照相比，測試組中PCaMKII的表達(dá)水平或活性是陰性對(duì)照組的5-90%，較佳地10-60%，更佳地20-50%。[0053]在另一優(yōu)選例中，所述的步驟（2)還包括與陽性對(duì)照組進(jìn)行比較。[0054]在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括以下一個(gè)或多個(gè)步驟：[0055]對(duì)上一步驟篩選出的潛在物質(zhì)，進(jìn)一步測試其對(duì)GluRl的膜部分的影響；[0056]對(duì)上一步驟篩選出的潛在物質(zhì)，施用于動(dòng)物模型，觀察其對(duì)抑郁癥癥狀的影響。[0057]在另一優(yōu)選例中，在測試其對(duì)GluRl的膜部分的影響時(shí)，如果與陰性對(duì)照組（或空白對(duì)照組）相比，加入或施用所述測試物的測試組中GluRl含量降低，則表示該測試物是預(yù)防和/或治療抑郁癥的潛在物質(zhì)。[0058]在另一優(yōu)選例中，所述的GluRl含量是在神經(jīng)元細(xì)胞膜上的GluRl含量。[0059]在本發(fā)明的第六方面，提供了一種GluRl抑制劑的用途，用于制備預(yù)防和/或治療抑郁癥的藥物。[0060]在另一優(yōu)選例中，所述藥物還用于降低外側(cè)韁核的神經(jīng)元峰電位輸出和突觸效能。[0061]在另一優(yōu)選例中，所述的GluRl抑制劑是βCaMKII抑制劑。[0062]在另一優(yōu)選例中，所述的GluRl抑制劑是GluRl的競爭性抑制劑，包括顯性失活因子，較佳地為GluRlCt。[0063]在另一優(yōu)選例中，所述的GluRl抑制劑選自下組：多核苷酸、多肽、表達(dá)載體、小分子化合物、或其組合。[0064]在本發(fā)明的第七方面，提供了一種預(yù)防和/或治療抑郁癥的方法，包括步驟：給需要的對(duì)象施用安全有效量的βCaMKII抑制劑。[0065]在另一優(yōu)選例中，所述的施用是施用于外側(cè)韁核區(qū)域。[0066]在本發(fā)明的第八方面，提供了一種降低神經(jīng)元峰電位輸出和突觸效能的方法，包括步驟：給需要的對(duì)象施用安全有效量的βCaMKII抑制劑。[0067]在另一優(yōu)選例中，所述的對(duì)象是哺乳動(dòng)物，包括嚙齒動(dòng)物（如大鼠、小鼠）、靈長動(dòng)物（如人）。[0068]在另一優(yōu)選例中，所述的施用是施用于外側(cè)韁核區(qū)域。[0069]在本發(fā)明的第九方面，提供了一種預(yù)防和/或治療抑郁癥的方法，包括步驟：給需要的對(duì)象施用安全有效量的GluRl抑制劑。[0070]在另一優(yōu)選例中，所述的施用是施用于外側(cè)韁核區(qū)域。[0071]應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文（如實(shí)施例）中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述?！緦＠綀D】【附圖說明】[0072]圖1顯示了抑郁大鼠LHb中βCaMKII的上調(diào)。（A)cLH大鼠的抑郁癥表型。數(shù)字代表所用動(dòng)物數(shù)量。LH測試中，最大壓力數(shù)設(shè)置為15。（B)基于穩(wěn)定同位素標(biāo)記的高通量定量蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)略圖。簡要地，未標(biāo)記的韁核（14N)WT或cLH大鼠進(jìn)行解剖，勻化，并以1:1的比例與15N標(biāo)記的大鼠總腦組織勻漿混合。濃縮膜部分，500g蛋白質(zhì)樣品被用于標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜分析。計(jì)算每個(gè)已鑒定肽段的14N/15N比例。比較cLH和對(duì)照組每個(gè)蛋白質(zhì)肽段比率詳情請(qǐng)看方法部分。（C)在3個(gè)獨(dú)立的蛋白質(zhì)組學(xué)運(yùn)行中確定βCaMKII的蛋白質(zhì)組學(xué)分析，基于總的肽段，或獨(dú)特的肽段（不為家系里其他成員所共有的肽段）。（D，E)Westernblot分析顯示在cLH大鼠韁⑶或的海馬（E)膜部分PCaMKII的變化。組織的大量微管蛋白被用作加載控制。蛋白表達(dá)進(jìn)行定量標(biāo)準(zhǔn)化。（F)韁中PCaMKIImRNA的qPCR分析。（G)外側(cè)韁核部分（LHb)中CaMKII水平增加，如左邊IHC圖像和右邊定量圖所示。比例尺，200μm。(H)在急性習(xí)得無助和慢性應(yīng)激（CMS)抑郁模型中βCaMKII水平增加。ALH和ANLH為受到LH壓力的大鼠組，但ALH)表現(xiàn)LH癥狀，ANLH沒有表現(xiàn)LH癥狀。（I)Westernblot分析顯示cLH大鼠用生理鹽水或抗抑郁藥丙咪嗪處理后韁膜部分中PCaMKII水平。數(shù)據(jù)是平均值土SEM。*P〈0.05，#P〈0.01，*#P〈0.001與對(duì)照組相比。N.S.表示差異不顯著。其他的圖標(biāo)相同。[0073]圖2顯示了小鼠和大鼠中βCaMKI(而非aCaMKII)的過表達(dá)引起抑郁行為。（A)AAV載體工程改造用來過表達(dá)控制結(jié)構(gòu)，PCaMKII，aCaMKII，或激酶死亡突變體PCaMKII的示意圖。ITR，反向末端重復(fù)序列；巨細(xì)胞病毒（CMV)，巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子；Ubi:泛素啟動(dòng)子；2A:允許多種非融合蛋白翻譯的病毒2A連接肽。（B)WT小鼠或大鼠用于行為測試的實(shí)驗(yàn)范式。（C)小鼠LHb雙邊AAV-βCaMKII病毒注射圖示（使用抗GFP和核標(biāo)記Hoechst復(fù)染色）。比例尺，50μΜ.(D-I)動(dòng)物抑郁模型，小鼠（D-G)和大鼠（Η，Ι)，動(dòng)物L(fēng)Hb中表達(dá)不同病毒構(gòu)建物對(duì)行為的影響。（F，G)對(duì)比LHb感染細(xì)胞分?jǐn)?shù)繪制的在強(qiáng)迫游泳中標(biāo)準(zhǔn)化不動(dòng)時(shí)間（F)或蔗糖偏好測試（G)。數(shù)據(jù)采用注射AAV對(duì)照小鼠平均值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。*P<0.05，**P〈0.01，***P〈0.OOl相比于未注射WT#P<0.05與AAV對(duì)照。[0074]圖3顯示了βCaMKII的過表達(dá)增強(qiáng)LHb神經(jīng)元突觸活性和的峰電位輸出。（A)外側(cè)韁核配對(duì)記錄示意圖（左圖）。右圖：在透射（頂部）和熒光（底部）光學(xué)顯微鏡下βCaMKII感染LHb神經(jīng)元配對(duì)修補(bǔ)（綠色箭頭）和相鄰的未受感染神經(jīng)元（紅色箭頭指出）。比例尺，10μΜ.⑶全細(xì)胞模式下檢測到的對(duì)照組LHb神經(jīng)元或AAV-βCaMKII、AAV-aCaMKII感染神經(jīng)元的mEPSC痕跡示例。（C，D)mEPSC間期和平均頻率的累積分布(左），被AAV-βCaMKII(C)或AAV-aCaMKII⑶感染神經(jīng)元的mEPSC振幅（右）。每一行代表一對(duì)對(duì)照神經(jīng)元和相鄰的病毒感染神經(jīng)元的值。（E)全細(xì)胞模式下檢測到的對(duì)照組LHb神經(jīng)元或AAV-βCaMKII、AAV-aCaMKII感染神經(jīng)元的自發(fā)發(fā)放峰電位痕跡示例。（F，G)被AAVICaMKII(F)或AAV-aCaMKII(G)感染神經(jīng)元的平均自發(fā)放電頻率。[0075]圖4顯示了LHb中βCaMKII敲除能救治cLH大鼠的抑郁癥表型和降低LHb神經(jīng)元突觸活度。（A)工程修飾用來過表達(dá)βCaMKII的RNAi的AAV載體示意圖。Hl:人Hl啟動(dòng)子。（B)用βCaMKIIRNAi構(gòu)建物特異性敲除βCaMKII而不是aCaMKII。在293tn細(xì)胞中pSUPER-βCaMKII-RNAi構(gòu)建物是和AAV-βCaMKII或AAV-aCaMKII質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，并在western分析前先表達(dá)48小時(shí)。左：代表westernblot。右：敲除效果定量。（C)病毒侵染cLH大鼠行為測試的實(shí)驗(yàn)范式。（D-E)cLH大鼠LHb表達(dá)AAV-βRNAi和AAV-βK43R后強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)（D)和習(xí)得無助測試（E，F(xiàn))中的行為影響。（F)每類動(dòng)物百分比。LH:彡5桿壓迫習(xí)得無助大鼠。NLH:彡10桿壓迫非習(xí)得無助大鼠。（G)亞病毒感染次區(qū)域表征。上圖：AAVIRNAi病毒感染cLH大鼠腦片中外側(cè)韁核（LHb-L)和內(nèi)側(cè)韁核（LHb-m)分區(qū)圖例。比例尺，10010μM。下圖：對(duì)比cLH大鼠LHb-I和LHb-m感染率繪制的在習(xí)得無助實(shí)驗(yàn)中行為響應(yīng)。（H)cLH大鼠AAV-βRNAi感染LHb神經(jīng)元mEPSCs發(fā)生改變。上圖：mEPSC痕跡示例。被AAV-βRNAi感染LHb神經(jīng)元的mEPSC間期和平均頻率累積分布（左下），mEPSC振幅（右下）。*Ρ〈〇·05,**Ρ〈0·01，*#Ρ〈0·001跟cLH/AAV-對(duì)照比較[0076]圖5顯示了阻斷GluRl-typeAMPA受體的突觸結(jié)合（一個(gè)βCaMKII的下游分子）可減輕抑郁。（A，B)Westernblot分析顯示cLH大鼠韁核蛋白提取物膜部分的GluRl的表達(dá)水平增加（A)，抗抑郁藥丙咪嗪處理后明顯下降（B)。（C)用AAV-0CaMKII-2A-GluRlCt病毒共同表達(dá)βCaMKII和GluRlCt增強(qiáng)了LHb中CaMKII和GluRl的免疫組織化學(xué)信號(hào)。右：IHC信號(hào)量化。比例尺，100μΜ.(D，Ε)雙側(cè)LHb內(nèi)βCaMKII和GluRlCt共表達(dá)阻斷了^CaMKII過表達(dá)引起的強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)（D)和快感缺乏（E)表型。（F)模型圖解：在正常狀態(tài)下，LHb對(duì)VTA和DRN具有相對(duì)較弱抑制。在抑郁狀態(tài)，壓力引起的PCaMKII的表達(dá)水平上調(diào)，這導(dǎo)致GluRl膜運(yùn)輸增加，增加LHb神經(jīng)元突觸效能和峰電位輸出。因此，LHb對(duì)于VTA和DRN的抑制被增強(qiáng)，進(jìn)而導(dǎo)致快感缺乏及行為絕望。[0077]圖6顯示了蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)分析。（A)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)流程圖.（B)標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)分布.（C)為了驗(yàn)證這一實(shí)驗(yàn)技術(shù)，一個(gè)樣品被分成兩個(gè)相同部分并在質(zhì)譜儀上運(yùn)行兩次。兩次實(shí)驗(yàn)重復(fù)數(shù)據(jù)相互比較，表現(xiàn)出高度相關(guān)。[0078]圖7顯示了經(jīng)過蛋白質(zhì)組學(xué)篩選鑒定的的候選蛋白表達(dá)水平八個(gè)上調(diào)（A)，四個(gè)下調(diào)（B)。值得注意的是，絕大部分表達(dá)上調(diào)蛋白為神經(jīng)元中豐富的分子，絕大部分表達(dá)下調(diào)蛋白為參與基礎(chǔ)代謝功能的催化分子。[0079]圖8顯示了表達(dá)水平上調(diào)候選蛋白的qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果。*ρ〈(λ05,#ρ〈(λ01與對(duì)照組相比[0080]圖9顯示了CamKII家族另外三個(gè)成員的測定結(jié)果。（A,B)western印跡分析顯示cLH大鼠韁核（A)或海馬⑶膜部分中的α-，δ-和Y-CaMKII的變化。[0081]圖10顯示了單側(cè)注射病毒構(gòu)建物的過表達(dá)水平估算的結(jié)果。（A)經(jīng)由這三種病毒單側(cè)注射的小鼠冠狀鬧切片示意圖。頂部面板：用抗GFP(綠色）染色或直接可視化tdTomato(紅色）的腦切片，Hoechst(藍(lán)色）復(fù)染色的腦切片。左：非注射側(cè)。右：注射側(cè)。D3V:背第三室。底部面板：相同小鼠的相鄰腦切片，用抗CamKII抗體染色，以用于B圖中的定量化。（B)注射側(cè)和非注射側(cè)的CaMKII的信號(hào)強(qiáng)度比所代表過表達(dá)水平。11=5€(^4八￥-βCaMKII-2A-GFP，n=4forAAV-aCaMKII-2A-tdTomato和AAV-βCaMKII-K43R-2A-GFP.[0082]圖11顯示了小鼠LHb病毒靶向區(qū)域示意圖.⑷大部分病毒表達(dá)所在的前后區(qū)域。左圖為來自于注射AAV-PCaMKII病毒小鼠的腦切片示意圖。右圖為改編自Paxinos&Franklin2004圖冊(cè)的對(duì)應(yīng)原理圖。[0083]圖12顯示了注射不同病毒小鼠的開放場實(shí)驗(yàn)結(jié)果。㈧總位移距離。⑶開放場實(shí)驗(yàn)中中心停留時(shí)間。[0084]圖13顯示了LHb中異質(zhì)性mEPSC響應(yīng)圖。（A)LHb不同子區(qū)域內(nèi)mEPSC記錄。每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)神經(jīng)元的記錄。mEPSC響應(yīng)頻率被顏色標(biāo)注。（B)每個(gè)點(diǎn)代表該區(qū)域記錄的一對(duì)神經(jīng)元。各對(duì)神經(jīng)元mEPSC頻率的值都已標(biāo)注。（C)圖B所記錄的成對(duì)神經(jīng)元中一個(gè)神經(jīng)元對(duì)比另一個(gè)神經(jīng)元的mEPSC頻率。值得注意的是，盡管位置不同，來自同一對(duì)的神經(jīng)元表現(xiàn)出高度相同的mEPSC頻率。[0085]圖14顯示了韁核蛋白裂解物全部或者膜部分GluRl的表達(dá)水平。（A)顯示cLH大鼠和對(duì)照大鼠的韁核總組分或者膜部分GluRl水平變化的western印跡分析示意圖。（B)GluRl水平變化的定量化?！揪唧w實(shí)施方式】[0086]本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，首次意外地發(fā)現(xiàn)βCaMKII是抑郁癥的一個(gè)至關(guān)重要的調(diào)節(jié)因子，結(jié)合了分子、行為和電生理等手段，確定了PCaMKII是導(dǎo)致韁核過度活躍和行為抑郁的關(guān)鍵分子，在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。[0087]具體地，在外側(cè)韁核過表達(dá)βCaMKII(而非aCaMKII)不僅可以明顯增強(qiáng)突出傳遞效率和外側(cè)韁核神經(jīng)元的動(dòng)作電位輸出，而且可以誘導(dǎo)出快感缺乏和行為絕望的核心抑郁癥狀。在外側(cè)韁核下調(diào)PCaMKII的表達(dá)水平，降低它的激酶活性或者阻斷它的下游分子GluRl則可以逆轉(zhuǎn)動(dòng)物的抑郁表型。以上結(jié)果表明PCaMKII是調(diào)節(jié)LHb神經(jīng)元在抑郁癥的病理發(fā)生中發(fā)揮功能的關(guān)鍵分子。[0088]定義[0089]如本文所用，術(shù)語CaMKII,是指鈣調(diào)蛋白激酶II(CaMkinaseII)。[0090]如本文所用，術(shù)語"βCaMKII抑制劑"和"βCaMKII拮抗劑"可互換使用，都指能夠抑制和/或拮抗βCaMKII的表達(dá)水平或蛋白活性、以及阻止或阻遏βCaMKII功能的物質(zhì)。[0091]如本文所用，術(shù)語mEPSCs，是指微型興奮性突出后電流。[0092]如本文所用，AMPAR,α-氛基-3-輕基_5_甲基_4_異惡唑丙酸（a-amin〇-3_hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionicacid(AMPA))受體[0093]方法[0094]本發(fā)明提供了一種篩選用于預(yù)防和/或治療抑郁癥潛在物質(zhì)的方法，包括步驟：[0095](1)給抑郁癥動(dòng)物模型施用待篩選的測試物，其中在所述抑郁癥動(dòng)物模型中βCaMKII是高表達(dá)的；和[0096](2)觀察所述抑郁癥動(dòng)物模型中的抑郁癥的相關(guān)癥狀和/或指標(biāo)，并與對(duì)照組進(jìn)行比較；[0097]其中，所述抑郁癥動(dòng)物模型中抑郁癥的相關(guān)癥狀有顯著改善，則表示該測試物是可用于預(yù)防和/或治療抑郁癥潛在物質(zhì)。[0098]另外，所述的動(dòng)物模型為非人哺乳動(dòng)物，如嚙齒動(dòng)物、兔、靈長動(dòng)物。[0099]此外，在步驟（2)，通過動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)觀察抑郁癥狀。所述的動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)包括：強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)，蔗糖偏好實(shí)驗(yàn)，開放場實(shí)驗(yàn)。所述的指標(biāo)包括：βCaMKII的表達(dá)水平、βCaMKII的活性水平。[0100]本發(fā)明還提供了另一種篩選用于預(yù)防和/或治療抑郁癥潛在物質(zhì)的方法，包括步驟：[0101](1)在測試組中，向體外檢測體系中加入待檢測的測試物；和[0102](2)檢測所述測試組的體外檢測體系中βCaMKII的表達(dá)水平和/或活性，并與陰性對(duì)照組進(jìn)行比較；[0103]其中，如果與加入了陰性對(duì)照組相比，測試組中PCaMKII的表達(dá)水平顯著下降，和/或βCaMKII的活性顯著下降，則表示所述測試物是預(yù)防和/或治療抑郁癥的潛在物質(zhì)。所述的體外檢測體系包括細(xì)胞體系；較佳地為神經(jīng)元細(xì)胞體系。[0104]另外，所述的顯著下降指，與陰性對(duì)照相比，測試組中PCaMKII的表達(dá)水平或活性是陰性對(duì)照組的5-90%，較佳地10-60%，更佳地20-50%。所述的步驟（2)還包括與陽性對(duì)照組進(jìn)行比較。[0105]此外，所述方法還包括以下一個(gè)或多個(gè)步驟：[0106]對(duì)上一步驟篩選出的潛在物質(zhì)，進(jìn)一步測試其對(duì)GluRl的膜部分的影響；[0107]對(duì)上一步驟篩選出的潛在物質(zhì)施用于動(dòng)物模型，觀察其對(duì)抑郁癥癥狀的影響。[0108]在測試其對(duì)GluRl的膜部分的影響時(shí)，如果與陰性對(duì)照組（或空白對(duì)照組）相比，加入或施用所述測試物的測試組中GluRl含量降低，則表示該測試物是預(yù)防和/或治療抑郁癥的潛在物質(zhì)。所述的GluRl含量是在神經(jīng)元細(xì)胞膜上的GluRl含量。[0109]應(yīng)用[0110]本發(fā)明可以應(yīng)用于抑郁癥預(yù)防和/或治療，也可以應(yīng)用于藥物的篩選和制備。[0111]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆：實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)（NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)是重量百分比和重量份數(shù)。[0112]通用材料和方法[0113]動(dòng)物材料[0114]雄性CHL癥大鼠（4-7周齡）和同齡的SpragueDawley大鼠。CHL大鼠飼養(yǎng)如前所述（1)。大鼠兩只/籠，12小時(shí)的明暗周期（7am-7pm有光）。成年（10-14周齡）C57BL/6小鼠被用于行為測試：4只/籠，12小時(shí)明暗周期（5am-5pm有光）。大鼠和小鼠都能夠自由攝取穩(wěn)定的水和食物，所有的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)過中科院神經(jīng)科學(xué)研究所動(dòng)物保護(hù)和使用委員會(huì)的批準(zhǔn)。[0115]蛋白組學(xué)[0116]對(duì)三組大腦樣品進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，每組包括野生型SD大鼠對(duì)照和先天習(xí)得無助（cHL)大鼠，其中先天習(xí)得無助大鼠在習(xí)得無助實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中都表現(xiàn)出抑郁行為。異氟醚麻醉后取下大腦，迅速解剖取下僵帶組織，液氮冷凍。不同樣本的韁組織和經(jīng)15N標(biāo)記（大鼠15N喂食兩代使得原子富集15N達(dá)95%)的大鼠全腦組織分別加入預(yù)冷勻漿緩沖液（320mMsucrose,4mMHEPESρΗ7·4,ImMMgCl2和0·5mMCaCl2,5mMNaF,ImMNa3VO4，EDTA_free，ProteaseInhibitorcocktailtablets(Roche))，用玻璃勻楽器制成勻漿。用Bradford測定蛋白含量（Bio-Rad)，將各樣本勻漿分別和15N全腦勻漿按蛋白比例(w/w)1:1混合?；旌衔?00g，4°C離心15min取上清，上清液1000g，15min離心取沉淀。沉淀即為細(xì)胞膜部分，將IOOug沉淀溶于勻漿緩沖液中，用多維蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)分析（MudPIT)⑶。對(duì)于每個(gè)蛋白，在肽水平估算14N/15N的比值，然后求蛋白水平的平均值。成千上萬的蛋白的該比值求log轉(zhuǎn)化為正態(tài)分布，歸一化使得中值為0。正態(tài)化之后，CHL的該值除以對(duì)照的該值就是這個(gè)蛋白在抑郁癥下的變化情況。正態(tài)化后的平均比值減去2倍標(biāo)準(zhǔn)差就是每個(gè)蛋白的顯著值。變化>50%并且顯著值>0的蛋白作為候選，進(jìn)行下一步驗(yàn)證。對(duì)每個(gè)蛋白取log之后的變化倍數(shù)進(jìn)行Student'st-test，p值見表1。[0117]病毒構(gòu)建[0118]通過標(biāo)準(zhǔn)方法設(shè)計(jì)和構(gòu)建AAV-βCaMKII-2A-EGFP,AAV-aCaMKII-2A_tdTomat〇,AAV-βCaMKII-K43R-2A-EGFP,AAV-βCaMKII-2A-Glu-RlCt,AAV-GFP-CRE和AAV-GFP質(zhì)粒。βCaMKII和aCaMKII全長cDNA從SD大鼠cDNA文庫中得到。2A信號(hào)肽序列從plenti-2A_EGFP質(zhì)粒中推斷獲得，AAV骨架序列由AAV-GFP-CRE質(zhì)粒（LisaMonteggia惠贈(zèng)）克隆得到。對(duì)于AAV-βCaMKII-2A-EGFP質(zhì)粒，[0119]1)將βCaMKII序列先力P到plenti-Ubiquitin-2A_EGFP質(zhì)粒上，得至IjUbiquitin-βCaMKII-2A-EGFP質(zhì)粒，再通過BglII和XhoI酶切位點(diǎn)引入AAV骨架。[0120]2)aCaMKII通過BamHl和Xbal酶切位點(diǎn)克隆到pLenti-2A_tdTomato載體上，PCR擴(kuò)增Ienti載體上的aCaMKII-2A-tdTomato段，然后通過Xball和BsrGl內(nèi)切酶克隆到AAV載體上。[0121]3)ΑΑν-βCaMKII-K43R-2A-EGFP質(zhì)粒，βCaMKII-K43R片段通過XbaLl和EcoRl酶切位點(diǎn)克隆到AAV-2A-EGFP上。[0122]4)ΑΑν-βCaMKII-2A-EGFP-GluRlCt質(zhì)粒，從pSindbis-EGFP-GluRICt質(zhì)粒中擴(kuò)增得到EGFP-GluRlCt片段，與AAV-βCaMKII-2A連接。[0123]5)βCaMKII的短發(fā)夾寡聚核苷酸序列（shRNAi)是5'-GAGTATGCAGCTAAGATCA-3'，AAV-βCaMKII-RNAi由NeuronBiotech公司合成（shanghai，china)。[0124]這些構(gòu)建物都是用前面所述AAV2方法生成的。[0125]簡言之，將一個(gè)AAV載體與兩個(gè)輔助載體（pXX680和pXX2)，一起轉(zhuǎn)染到HEK293TN細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后兩天，用肝素瓊脂糖柱從細(xì)胞裂解液中純化病毒，并超濃縮得到終體積。AAV2的輔助質(zhì)粒pM680和pXX2從UniversityofNorthCarolina購得。用10倍梯度稀釋的病毒感染HEK293TN細(xì)胞測定病毒效價(jià)。[0126]抗抑郁治療[0127]cLH大鼠的通過連續(xù)14天注射丙米嗪（10mg/kg，sigma)進(jìn)行抗抑郁治療。注射后分析行為測試。[0128]立體定向注射和組織學(xué)[0129]向小鼠注射病毒時(shí)，腹腔注射氯胺酮（l〇〇mg/kg體重）和賽拉嗪（8mg/kg)麻醉后，置于立體定位架上（Stoeltinginstruments)。手術(shù)前所有的小鼠群居2周以上。將0.8-lul純化濃縮的AAV病毒（?1012感染單位/ml)雙側(cè)注入到每只小鼠的LHb位置（前囪坐標(biāo)位置：-1.32mm前后側(cè)（AP)，±I.04mm內(nèi)外側(cè)（ML)，-2.48mm背腹側(cè)（DV)，冠狀面中線14°角），使用玻璃微電極緩慢注入（?100_150nl/min)，輸液完成后5min注射電極緩慢撤回。[0130]向大鼠注射病毒，腹腔注射10%水合氯醛（4ml/kg體重）麻醉，LHb位置（SD大鼠4周齡，從前囪門起AP-3.0mm，ML±0.7mm，從前囪門起DV-4.4mm;CHL大鼠4周齡，從前囪門起AP-3.0mm，ML±0.7mm，從前囪門起DV-4.45mm;CHL大鼠6周齡，從前囪門起AP-3.3mm，ML±0.7mm，從前囪門起DV-4.7mm)注射1-1.5ul的AAV病毒，微電極束上發(fā)現(xiàn)了微弱的標(biāo)簽效應(yīng)。術(shù)后至少7天，開展行為實(shí)驗(yàn)或者電生理實(shí)驗(yàn)。行為實(shí)驗(yàn)結(jié)束后檢查注射位置，只使用正確注射的那些動(dòng)物數(shù)據(jù)。注射了AAV-αCaMKII-tdTomato的大鼠或者小鼠的腦切片在熒光顯微鏡下檢查，其它標(biāo)記了GFP的病毒在顯微檢查之前用抗體檢查GFP蛋白。每個(gè)大腦的韁區(qū)切成6組連續(xù)的切片（小鼠30um的切片，每組6片；大鼠40um切片，每組8-9片）。所有的切片在安裝到固定片之前用Hoechst復(fù)染色。計(jì)算韁區(qū)的感染率。感染率計(jì)數(shù)是通過使用ImageJ在一組從前到后的腦切片中進(jìn)行的，一個(gè)區(qū)的總神經(jīng)數(shù)是用兩個(gè)對(duì)照組的一組切片里的NeuN信號(hào)取平均。用感染細(xì)胞數(shù)除以總神經(jīng)元數(shù)就是感染率。[0131]免疫組化和免疫印跡[0132]灌流：大鼠或小鼠用10%水合氯醛深度麻醉，用磷酸鹽緩沖液（PBS)和含4%多聚甲醛（w/v)的磷酸鹽進(jìn)行心臟灌流。大腦在同樣4%多聚甲醛溶液過夜后固定處理，然后浸泡在30%蔗糖（PBS)溶液中1天（小鼠）或3天（大鼠）。冰凍的大腦在冠狀面上用滑動(dòng)切片機(jī)（CM1950,Leica)切成30um(小鼠）或40um(大鼠）切片。切片浸泡在PBS中4°C冷藏以待后用?？贵w是兔抗CaKMII(1:300,Epitomics)兔抗GluRl(1:300,Chemicon)，鼠抗NeuNantibody(l:1000,Chemicon),兔抗GFPantibody(l:1000,Invitrogen),雞抗GFPantibody(1:1000,ABCAM),AlexaFluor488羊抗兔IgG,AlexaFluor488羊抗雞IgG,AlexaFluor594羊抗鼠IgG(alll:1000,Invitrogen),生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG,生物素標(biāo)記的羊抗鼠IgG(all1:250,Vectorlaboratories),Cy3-偶聯(lián)鏈霉親和素，Cy2-偶聯(lián)鏈霉親和素(alll:1000,JacksonImmunoResearch)。特別的是對(duì)于CaKMII和GluRl的著色，我們米用了三步放大操作：切片依次使用CaKMII抗體或GluRl抗體、生物素標(biāo)記的二抗、Cy3或Cy2偶聯(lián)鏈霉親和素孵育。所有的切片最后用Hoechst孵育。突光成像采用OlympusFluoviewFVlOOO共聚焦顯微鏡（10X、20X物鏡）和OlympusMVXIOmicroscope(MVPLAP02XC物鏡）。圖片分析軟件為Image-ProPlus和ImageJ。CaKMII和GluRl的熒光強(qiáng)度定量：在20X下相同設(shè)置下捕獲LHb感染側(cè)和未感染側(cè)共聚焦圖像，并通過Image-ProPlus進(jìn)一步分析。Hoechst信號(hào)的區(qū)域值除以IHC信號(hào)的綜合光密度（IOD)得到熒光強(qiáng)度。比較LHb的病毒注入側(cè)和未注入側(cè)的熒光強(qiáng)度得到過表達(dá)水平。[0133]免疫印跡：韁或海馬組織的處理與之譜分析的處理相同。10%PAGE膠SDS電泳，每泳道上樣量5_8ug蛋白，轉(zhuǎn)模做western印跡，抗體是anti-βCaMKII(1:4000,invitrogen)，anti-aCaMKII(1:2000,millipore)，anti-γCaMKII(1:1000,PTG)，anti-δCaMKII(1:500,SantaCruz)和anti-tubulin(1:10000,Bio-Rad)。使用高靈敏度的ECL試劑（GEHelthcare)〇[0134]切片準(zhǔn)備[0135]用異氟烷將SD大鼠（出生后40-50天）麻醉后，灌注20ml預(yù)冷解剖緩沖液（25.OmMNaH⑶3,I.25mMNaH2PO4,2.5mMKC1，0·5mMCaCl2,7.OmMMgCl2,25.OmMglucose,110.OmMcholinechloride,11.6mMascorbicacid和3.ImMpyruvicacid,gassedwith95%02和5%C02)，斷頭后快速解剖大腦，冠狀韁在氧化的冷凍解剖緩沖液中用振動(dòng)切片機(jī)（DSKII)切成350μπι切片。韁切片在含氧的ACFS溶液NaCl，2.5mMKC1，26mMNaH⑶3,ImMNaH2PO4,IOmMglucose,I.3mMMgCl2和2.5mMCaCl2,gassedwith95%02和5%C02)中恢復(fù)兩小時(shí)，轉(zhuǎn)移至持續(xù)供給含氧的ACFS溶液的槽中。[0136]電生理[0137]外側(cè)韁神經(jīng)元膜片鉗實(shí)驗(yàn)溫度27±1°C，使用Multiclamp700B放大器（MolecularDevices)和配備紅外微分干涉對(duì)比的奧林巴斯光學(xué)顯微鏡。電極電阻為3-4ΜΩ。為了mEPSC記錄，在ΤΤΧ(1μM)和印防己毒素（100μM)存在的ACSF溶液中，在-60mv下將神經(jīng)元夾緊。胞內(nèi)溶液包含CsMeS03115mM,CsC120mM,HEPESlOmM,MgCl22.5mM,Na2-ATP4mM,Na-GTPO.4mM,Na-phosphocreatinelOmM,EGTA0.6mM。數(shù)據(jù)通過Digidatal322A(MolecularDevices)在2kHz過濾并在IOkHz隨機(jī)抽樣。mEPSC分析米用MiniAnalysisProgram(Synaptosoft)，閾值幅度為5PA。為了測定自發(fā)發(fā)放率，將神經(jīng)元接上細(xì)胞連接裝置，在存在印防己毒素(picrotoxin)的ACSF溶液中。電極電阻6-7ΜΩ，電極內(nèi)溶液為NaC1118mM，HEPES10mM。每個(gè)細(xì)胞記錄50次掃描，每次掃描持續(xù)7s，數(shù)據(jù)通過pClamplO軟件分析。[0138]行為實(shí)驗(yàn)[0139]所有行為實(shí)驗(yàn)都是在黑夜生理節(jié)奏期進(jìn)行（小鼠18:00-23:00);大鼠19:00-24:00).[0140]習(xí)得無助實(shí)驗(yàn)范例依據(jù)前面所述優(yōu)化的說明書進(jìn)行（5)。實(shí)驗(yàn)是對(duì)同窩cLH或野生型SD大鼠進(jìn)行。范式包含兩個(gè)部分。"訓(xùn)練部分"包括在刺激室（coulbourn儀器）中，120次不可避免的、不受控的0.8mA足底電刺激超過40分鐘，隨機(jī)刺激持續(xù)時(shí)間和范圍從5秒到15秒間隔刺激時(shí)間，總刺激持續(xù)時(shí)間為20分鐘。"測試部分"訓(xùn)練24小時(shí)后進(jìn)行，習(xí)得無助表型是由一個(gè)桿壓迫任務(wù)進(jìn)行評(píng)估，期間一個(gè)光照指示桿被放入刺激室中。這一部分包括15次可逃避的0.8mA強(qiáng)度電刺激和24s實(shí)驗(yàn)間隔。每次刺激持續(xù)了60秒，但是能被桿壓迫終止。超過10次失敗被定義為"習(xí)得無助"（LH);少于5次失敗為"非習(xí)得無助"（NLH)。[0141]強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中，大鼠或小鼠被放置在水缸中6min(水溫23-25°C;對(duì)于小鼠，水缸直徑12cm，高度25cm;對(duì)于大鼠，水缸直徑為20cm，高度40cm。水的深度是為了防止動(dòng)物用它們的后肢觸底）。大鼠在前一天有一個(gè)額外的15min游泳引導(dǎo)。動(dòng)物行為被從側(cè)面錄像記錄。每個(gè)動(dòng)物在測試最后4min的不動(dòng)時(shí)間由不知?jiǎng)游锾幚矸绞降挠^察員計(jì)算。不動(dòng)的定義是浮動(dòng)或靜止不動(dòng)，這意味著除了保持頭部露出水面的動(dòng)作不存在任何其他運(yùn)動(dòng)。[0142]蔗糖偏好測試中，先將小鼠單獨(dú)安置1周，然后習(xí)慣于兩瓶1%蔗糖喂食3天，接著兩瓶水喂食一天。然后小鼠停止進(jìn)水24小時(shí),然后暴露在兩瓶裝滿1%鹿糖或水前2h。Ih后兩瓶位置互換。測定各流體的總消耗量，蔗糖偏好被定義2h測試中的蔗糖溶液消耗量占蔗糖溶液和水總消耗量的比例。[0143]開放場試驗(yàn)是在所有其他的行為測試之后進(jìn)行的。在一個(gè)明亮房間內(nèi)，大鼠或小鼠被放置在一個(gè)塑料盒的中心（對(duì)于小鼠：40cmX40cmX40.5cm;對(duì)于大鼠80cmX80cmX40cm)6min，測試期間，動(dòng)物行為被錄像，隨后使用EthoVisionPro視頻跟蹤系統(tǒng)和軟件（Noldus)分析。使用軟件計(jì)算小鼠移動(dòng)的總距離和在盒子中心所花的時(shí)間。[0144]統(tǒng)計(jì)分析[0145]所有的數(shù)據(jù)都以平均值土SEM。對(duì)于所有的行為數(shù)據(jù)，采用two-tailedStudent'st-testsQAAV-βCaMKII-2A_EGFP和AAV-αCaMKII-2A_tdTomato過表達(dá)的westernblot數(shù)據(jù)和電生理數(shù)據(jù)，采用雙尾配對(duì)t檢驗(yàn)。AAV-βCaMKIIRNAi的電生理檢測數(shù)據(jù)，采用pairedWilcoxon-tests。[0146]實(shí)施例I[0147]選擇性的培育表型習(xí)得性無助cLH大鼠，結(jié)果如圖IA所示，表現(xiàn)為在從可逃脫足底電擊下逃脫次數(shù)明顯減少，這種表現(xiàn)能被慢性抗抑郁藥治療逆轉(zhuǎn)（丙咪嗪，ip，IOmg/kg，14天）（圖1A)。cLH大鼠在強(qiáng)迫游泳測試中也表現(xiàn)為不動(dòng)性增加（圖1A)。[0148]實(shí)施例2[0149]分離cLH和野生型對(duì)照組大鼠的雙側(cè)韁核組織，進(jìn)行定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析。[0150]提取蛋白質(zhì)用于15N穩(wěn)定同位素標(biāo)記的定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析（圖1B)。為了減少樣品的復(fù)雜性，我們提取了膜蛋白組分并進(jìn)行了三次獨(dú)立樣本分析（圖6、圖7、圖8,表1)。研究表明cLH大鼠韁核內(nèi)βCaMKII表達(dá)顯著上調(diào)（是野生型對(duì)照的1.9倍，P=O.01，圖1C)。對(duì)CaMKII家族的其他亞型也進(jìn)行了檢測：aCaMKII在不同樣品中的表達(dá)水平相差很大，但仍然觀察到了上調(diào)趨勢；SCaMKII保持不變；YCaMKII顯示了1.3倍的增加（P=O.0013)(圖9)。由于大腦中PCaMKII比YCaMKII更豐富，我們針對(duì)這個(gè)CaMKII的亞型進(jìn)行研究。通過Western印跡分析二次驗(yàn)證，確定了cLH韁核樣品膜蛋白提取物中PCaMKII較對(duì)照組有0.86倍的增加（P=O.003)(圖1D)，但cLH海馬樣品中則沒有增加（P=O.33,圖1E)。實(shí)時(shí)定量PCR檢測顯示βCaMKII的mRNA水平表現(xiàn)出0.37倍的增加（P=0.04)(圖1F)，這表明轉(zhuǎn)錄調(diào)控至少部分導(dǎo)致了蛋白水平的變化。免疫組化的韁腦切片染色顯示：CaMKII蛋白表達(dá)水平的增加發(fā)生在外側(cè)韁（圖1G)。[0151]表1[0152]【權(quán)利要求】1.一種PCaMKII抑制劑的用途，其特征在于，用于制備預(yù)防和/或治療抑郁癥的藥物。2.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的抑制劑選自下組：⑴干擾0CaMKII表達(dá)的干擾RNA或其前體；(ii)激酶活性下降或喪失的突變型PCaMKII蛋白或其編碼序列；(iii)抑制0CaMKII活性的抑制劑；(iv)0CaMKII的競爭性抑制劑；(v)抗PCaMKII的抗體；(vi)阻遏PCaMKII調(diào)控AMPARGluRl通路的拮抗劑。3.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的抑制劑或拮抗劑包括以下形式：多核苷酸、多肽、表達(dá)載體、小分子化合物、或其組合。4.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的PCaMKII抑制劑還用于制備降低外側(cè)韁核的神經(jīng)元峰電位輸出的藥物和/或降低外側(cè)韁核的突觸效能的藥物。5.-種可用于預(yù)防和/或治療抑郁癥的藥物組合物，其特征在于，所述的藥物組合物包括：藥學(xué)上可接受的載體；和有效量活性成分，其中所述的活性成分為0CaMKII抑制劑或拮抗劑。6.-種PCaMKII蛋白或其編碼序列和/或@CaMKII促進(jìn)劑的用途，其特征在于，用于制備一試劑或組合物，所述試劑或組合物用于構(gòu)建抑郁癥動(dòng)物模型。7.-種篩選用于預(yù)防和/或治療抑郁癥潛在物質(zhì)的方法，其特征在于，包括步驟：(1)給抑郁癥動(dòng)物模型施用待篩選的測試物，其中在所述抑郁癥動(dòng)物模型的外側(cè)韁核中3CaMKII是高表達(dá)的；和(2)觀察所述抑郁癥動(dòng)物模型中的抑郁癥的相關(guān)癥狀和/或指標(biāo)，并與對(duì)照組進(jìn)行比較；其中，所述抑郁癥動(dòng)物模型中抑郁癥的相關(guān)癥狀有顯著改善，則表示該測試物是可用于預(yù)防和/或治療抑郁癥潛在物質(zhì)。8.-種篩選用于預(yù)防和/或治療抑郁癥潛在物質(zhì)的方法，其特征在于，包括步驟：(1)在測試組中，向體外檢測體系中加入待檢測的測試物；和(2)檢測所述測試組的體外檢測體系中PCaMKII的表達(dá)水平和/或活性，并與陰性對(duì)照組進(jìn)行比較；其中，如果與加入了陰性對(duì)照組相比，測試組中0CaMKII的表達(dá)水平顯著下降，和/或3CaMKII的活性顯著下降，則表示所述測試物是預(yù)防和/或治療抑郁癥的潛在物質(zhì)。9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法還包括以下一個(gè)或多個(gè)步驟：對(duì)上一步驟篩選出的潛在物質(zhì)，進(jìn)一步測試其對(duì)GluRl的膜部分的影響；對(duì)上一步驟篩選出的潛在物質(zhì)，施用于動(dòng)物模型，觀察其對(duì)抑郁癥癥狀的影響；在測試其對(duì)GluRl的膜部分的影響時(shí)，如果與陰性對(duì)照組（或空白對(duì)照組）相比，加入或施用所述測試物的測試組中GluRl含量降低，則表示該測試物是預(yù)防和/或治療抑郁癥的潛在物質(zhì)；所述的GluRl含量是在神經(jīng)元細(xì)胞膜上的GluRl含量。10.-種GluRl抑制劑的用途，其特征在于，用于制備預(yù)防和/或治療抑郁癥的藥物；較佳地，所述藥物還用于降低外側(cè)韁核的神經(jīng)元峰電位輸出和突觸效能?！疚臋n編號(hào)】A61K39/395GK104338135SQ201310347938【公開日】2015年2月11日申請(qǐng)日期:2013年8月9日優(yōu)先權(quán)日:2013年8月9日【發(fā)明者】胡海嵐,李坤,周濤申請(qǐng)人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院