脂質(zhì)衍生的中性納米顆粒的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了新型脂質(zhì)、使用該化合物制備的脂質(zhì)體組合物以及中和或以其他方式改性此類(lèi)脂質(zhì)體組合物的相關(guān)方法。本文所述的脂質(zhì)可用作例如脂質(zhì)體媒介物來(lái)促進(jìn)囊封的多核苷酸向靶細(xì)胞的傳遞，以及隨后此類(lèi)靶細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。在某些實(shí)施方案中，包括脂質(zhì)體傳遞媒介物的一種或多種化合物可以被中和或進(jìn)一步改性，使得脂質(zhì)體傳遞媒介物的性質(zhì)被改性。
【專(zhuān)利說(shuō)明】脂質(zhì)衍生的中性納米顆粒
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)
[0002] 本申請(qǐng)要求2012年3月29日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No. 61/617,478的權(quán)益，該申 請(qǐng)的公開(kāi)內(nèi)容以引用方式并入本文。
【背景技術(shù)】
[0003] 使用脂質(zhì)體傳遞媒介物來(lái)促進(jìn)治療劑的位點(diǎn)特異性傳遞代表了快速發(fā)展的藥品 傳遞領(lǐng)域；然而治療劑高效傳遞至靶細(xì)胞和組織、以及隨后轉(zhuǎn)染這些靶細(xì)胞和組織仍具有 技術(shù)上的挑戰(zhàn)。盡管多種脂質(zhì)和脂質(zhì)體基傳遞系統(tǒng)在促進(jìn)治療劑向靶細(xì)胞和組織的傳遞中 具有可利用性，但是在體內(nèi)和體外應(yīng)用中仍有許多挑戰(zhàn)。例如脂質(zhì)體基傳遞系統(tǒng)的突出缺 點(diǎn)涉及脂質(zhì)體的構(gòu)建，其中所述的脂質(zhì)體具有足夠的穩(wěn)定性，以及此類(lèi)脂質(zhì)體能夠高效地 將它們囊封的內(nèi)容物釋放至靶細(xì)胞和組織的能力。
[0004] 就用于傳遞核酸的脂質(zhì)體傳遞媒介物的研發(fā)而言，引入陽(yáng)離子脂質(zhì)作為脂質(zhì)體媒 介物的成分代表了重要的進(jìn)步。陽(yáng)離子脂質(zhì)體的性質(zhì)（包括例如它們的穩(wěn)定性、尺寸和表 面電荷）使得它們成為用于將負(fù)電荷核酸囊封并傳遞至靶細(xì)胞和組織的理想載體。包括此 類(lèi)陽(yáng)離子脂質(zhì)體媒介物的陽(yáng)離子成分（例如陽(yáng)離子脂質(zhì)和/或陽(yáng)離子聚合物）會(huì)促進(jìn)脂質(zhì) 體的脂質(zhì)雙層與負(fù)電荷核酸之間的相互作用，并由此增加此類(lèi)陽(yáng)離子脂質(zhì)體媒介物的囊封 效率。所制備的包括陽(yáng)離子脂質(zhì)（例如1，2_二油酰基-3-三甲基銨-丙烷（DOTAP))的脂 質(zhì)體部分由于它們的正的表面電荷，已經(jīng)證明了高效地裝載負(fù)電荷核酸的能力，并且使用 陽(yáng)離子脂質(zhì)體媒介物可以促進(jìn)濃度適當(dāng)超過(guò)使用中性脂質(zhì)體媒介物所取得的濃度的核酸 被囊封。例如在某些情況下，陽(yáng)離子脂質(zhì)納米顆粒系統(tǒng)可以表征為當(dāng)裝載負(fù)電荷核酸時(shí)，囊 封效率接近 100% (例如參見(jiàn)Li,etal.PharmRes.，2007, 24:438-449)。
[0005] 但是，用于構(gòu)建此類(lèi)脂質(zhì)體媒介物的許多陽(yáng)離子脂質(zhì)通常是有毒的，因此特別在 傳遞治療有效量的囊封內(nèi)容物（例如核酸）所需的量方面，可以限定使用。進(jìn)一步限定電 荷脂質(zhì)體系統(tǒng)的使用，則在將它們給予受試對(duì)象后，此類(lèi)電荷系統(tǒng)可以快速地由系統(tǒng)性的 循環(huán)中清除，由此限制了它們?cè)诎屑?xì)胞和組織中的分布和累積。為了克服與陽(yáng)離子脂質(zhì)體 媒介物的使用相關(guān)的技術(shù)挑戰(zhàn)，已經(jīng)使用了多成分脂質(zhì)體傳遞系統(tǒng)。具體而言，使用可電離 的脂質(zhì)來(lái)制備脂質(zhì)體媒介物已經(jīng)用作響應(yīng)于脂質(zhì)體所暴露的環(huán)境PH(例如生理pH)的變化 來(lái)調(diào)控脂質(zhì)體電荷的手段。因此，此類(lèi)可電離的脂質(zhì)容許它們表面電荷中的變化，這種變化 可以被操縱，從而例如增加脂質(zhì)體的囊封效率。
[0006] 盡管之前所述的限制，以及脂質(zhì)體基的媒介物促進(jìn)囊封物質(zhì)向靶細(xì)胞的傳遞的能 力，脂質(zhì)體基的媒介物是用于治療劑的有吸引力的載體，并將該主題保持為不斷研發(fā)的努 力。盡管就囊封和穩(wěn)定性而言，包括陽(yáng)離子成分的脂質(zhì)體基媒介物已經(jīng)顯示出有前途的結(jié) 果，但是仍非常需要改善的脂質(zhì)體基傳遞系統(tǒng)。
[0007] 與電荷脂質(zhì)體基媒介物相反，中性脂質(zhì)體媒介物通常表征為具有相對(duì)改善的藥代 動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。而且，部分由于使用中性脂質(zhì)體觀察到囊封的效率低，所以實(shí)施有限的研究來(lái) 調(diào)查中性脂質(zhì)體將治療劑傳遞至靶細(xì)胞的用途。仍需要新型的脂質(zhì)，該脂質(zhì)引入了用于傳 遞囊封的核酸和多核苷酸的多功能方法。特別需要保持了中性和電荷脂質(zhì)體傳遞系統(tǒng)的一 些有利特征的脂質(zhì)納米顆粒。
[0008] 發(fā)明概述
[0009] 本發(fā)明描述了新型脂質(zhì)及包括此類(lèi)脂質(zhì)的脂質(zhì)體組合物。此外，本發(fā)明公開(kāi)了使 用此類(lèi)脂質(zhì)（例如可切割的陽(yáng)離子脂質(zhì)）作為脂質(zhì)體組合物的成分、從而有助于將一種或 多種治療劑（例如治療多核苷酸）囊封于此類(lèi)脂質(zhì)體組合物中的方法。此外，本發(fā)明還公 開(kāi)了制備中性脂質(zhì)體組合物的方法，其中所述的中性脂質(zhì)體組合物可表征為具有高的囊封 效率（例如相對(duì)傳統(tǒng)的中性脂質(zhì)體組合物而言）。本發(fā)明所述的新方法、脂質(zhì)和組合物使用 了多功能策略來(lái)促進(jìn)將一種或多種治療劑囊封于中性脂質(zhì)體組合物中，以及隨后使用此類(lèi) 脂質(zhì)體組合物轉(zhuǎn)染一種或多種靶細(xì)胞。
[0010] 本發(fā)明公開(kāi)了新型脂質(zhì)及使用此類(lèi)脂質(zhì)來(lái)調(diào)控例如脂質(zhì)體媒介物（例如脂質(zhì)納 米顆粒）（其中引入了此類(lèi)新型脂質(zhì)）的性質(zhì)（例如表明電荷）的相關(guān)方法。例如在某些 實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及操縱脂質(zhì)體媒介物（例如脂質(zhì)納米顆粒）的方法，其中所述的脂質(zhì) 體媒介物包括至少一種具有可釋放的極性頭部基團(tuán)的脂質(zhì)，所述的方法包括脂質(zhì)體媒介物 與一種或多種試劑接觸從而使極性頭部基團(tuán)由所述的至少一種脂質(zhì)上釋放的步驟。在一些 實(shí)施方案中，在此類(lèi)極性頭部基團(tuán)由脂質(zhì)上釋放時(shí)，剩余脂質(zhì)體媒介物的表面電荷被改變。 例如在極性頭部基團(tuán)由脂質(zhì)上釋放后，脂質(zhì)體媒介物可以具有總體為中性的表面電荷（例 如大約-2. 5至大約+2. 5mV的凈表面電荷或zeta電位）。備選地，在極性頭部基團(tuán)由脂質(zhì) 上釋放后，脂質(zhì)體媒介物可以具有總體為負(fù)的表面電荷（例如低于大約_25mV的凈表面電 荷或zeta電位）。
[0011] 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明公開(kāi)的脂質(zhì)通常包括極性頭部基團(tuán)（例如以R1基團(tuán)表 示），其通過(guò)連接基團(tuán)與親脂性尾部基團(tuán)（例如以R2基團(tuán)表示）結(jié)合。在一些實(shí)施方案中， 連接基團(tuán)（或者包括功能基團(tuán)，該功能基團(tuán)）在暴露于一種或多種試劑或環(huán)境（例如在暴 露于酸性環(huán)境或還原條件時(shí)）時(shí)容易進(jìn)行化學(xué)或酶切割（例如通過(guò)還原或水解）。在一個(gè) 實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及中和或以其他方法改變脂質(zhì)體組合物的方法。通常，此類(lèi)脂質(zhì)體組 合物包括至少一種脂質(zhì)，該脂質(zhì)具有可釋放的頭部基團(tuán)、尾部基團(tuán)以及具有式I結(jié)構(gòu)的可 切割的連接基團(tuán)：
[0012]
【權(quán)利要求】
1. 一種中和脂質(zhì)納米顆粒的方法，其中所述的脂質(zhì)納米顆粒包括至少一種具有可釋放 的極性頭部基團(tuán)的脂質(zhì)，所述的方法包括使所述的脂質(zhì)納米顆粒與一種或多種試劑接觸的 步驟，從而使所述的極性頭部基團(tuán)由所述的脂質(zhì)上釋放并使所述的脂質(zhì)納米顆粒由此被中 和。
2. 權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的脂質(zhì)具有以下結(jié)構(gòu)：
其中&為所述的可釋放的極性頭部基團(tuán)，并且選自咪唑、胍鹽、亞胺、烯胺、氨基、可任 選地取代的烷基氨基和可任選地取代的吡啶基；其中R2選自可任選地取代的、可變的飽和 或不飽和的烷基，可任選地取代的、可變的飽和或不飽和的?；?，可任選地取代的吡啶基，
其中馬和1?4均獨(dú)立地選自可任選地取代的、可變的飽和或不飽和的C6-C2(l烷基，和可 任選地取代的、可變的飽和或不飽和的C6-C2(l?；徊⑶? 其中n為0或任何正整數(shù)。
3. 權(quán)利要求2所述的方法，其中所述的一種或多種試劑能夠以還原方式切割所述的脂 質(zhì)的-硫鍵。
4. 權(quán)利要求3所述的方法，其中在以還原方式切割所述的脂質(zhì)的二硫鍵時(shí)，由所述的 脂質(zhì)上釋放： 并且所述的脂質(zhì)由此被中和。
5. 權(quán)利要求3所述的方法，其中在以還原方式切割所述的脂質(zhì)的二硫鍵時(shí)，剩余的中 性脂質(zhì)具有以下結(jié)構(gòu)：
6. 權(quán)利要求5所述的方法，其進(jìn)一步包括改性所述的剩余的中性脂質(zhì)的步驟，從而形 成改性的脂質(zhì)； 其中所述的改性的脂質(zhì)具有以下結(jié)構(gòu)：
其中R5選自聚合物，肽，靶向配體，可任選地取代的、可變的飽和或不飽和的烷基，及加 帽結(jié)構(gòu)；以及 其中n為0或任何正整數(shù)。
7. 權(quán)利要求6所述的方法，其中所述的改性中性脂質(zhì)的步驟包括在氧化條件下使所述 的中性脂質(zhì)與具有以下結(jié)構(gòu)的第二化合物接觸，從而形成二硫鍵并由此使所述的中性脂質(zhì) 被改性：
8. 權(quán)利要求6所述的方法，其中所述的改性中性脂質(zhì)的步驟包括使所述的中性脂質(zhì)與 具有以下結(jié)構(gòu)的第二化合物接觸：
其中R5選自聚合物，肽，靶向配體，可任選地取代的、可變的飽和或不飽和的烷基，及加 帽結(jié)構(gòu)；以及 其中n為0或任何正整數(shù)。
9. 權(quán)利要求6所述的方法，其中所述的改性中性脂質(zhì)的步驟包括使所述的中性脂質(zhì)與 具有以下結(jié)構(gòu)的第二化合物接觸：
其中R5選自聚合物，肽，靶向配體，可任選地取代的、可變的飽和或不飽和的烷基，及加 帽結(jié)構(gòu)；以及 其中n為0或任何正整數(shù)。
10. 權(quán)利要求6所述的方法，其中R5為靶向配體，其選自肽、適體、維生素和寡核苷酸。
11. 權(quán)利要求6所述的方法，其中R5為靶向配體，其選自阿樸脂蛋白-B、阿樸脂蛋白-E、 葡萄糖、半乳糖和甘露糖。
12. 權(quán)利要求6所述的方法，其中R5為聚乙二醇。
13. 權(quán)利要求6所述的方法，其中R5為可任選地取代的、可變的飽和或不飽和的Ci-C% 燒基。
14. 權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的一種或多種試劑為還原劑。
15. 權(quán)利要求14所述的方法，其中所述的還原劑選自三（2-羧基乙基）膦（TCEP)、 巰基乙醇（P-ME)、二硫蘇糖醇（DTT)、谷胱甘肽、二硫赤蘚醇和它們的組合。
16. 權(quán)利要求15所述的方法，其中所述的還原劑為溶液形式。
17. 權(quán)利要求15所述的方法，其中所述的脂質(zhì)納米顆粒與所述的還原劑接觸至少大約 5分鐘。
18. 權(quán)利要求15所述的方法，其中所述的脂質(zhì)納米顆粒與所述的還原劑接觸至少大約 1小時(shí)。
19. 權(quán)利要求15所述的方法，其中所述的脂質(zhì)納米顆粒與所述的還原劑接觸至少大約 3小時(shí)。
20. 權(quán)利要求15所述的方法，其中所述的脂質(zhì)納米顆粒與所述的還原劑接觸至少大約 24小時(shí)。
21. 權(quán)利要求15所述的方法，其中所述的脂質(zhì)納米顆粒的zeta電位在該脂質(zhì)納米顆粒 與所述的還原劑接觸之前為至少大約25mV，而在該脂質(zhì)納米顆粒與所述的還原劑接觸之后 為低于大約5mV。
22. 權(quán)利要求15所述的方法，其中所述的脂質(zhì)納米顆粒的zeta電位在該脂質(zhì)納米顆粒 與所述的還原劑接觸之后為大約-25.OmV至大約5.OmV。
23. 權(quán)利要求21所述的方法，其中所述的脂質(zhì)納米顆粒的zeta電位在該脂質(zhì)納米顆粒 與所述的還原劑接觸之后為大約-5.OmV至大約5.OmV。
24. 權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的脂質(zhì)納米顆粒進(jìn)一步包括選自PEG改性的脂 質(zhì)、非陽(yáng)離子脂質(zhì)和輔助脂質(zhì)中的一種或多種化合物。
25. 權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的脂質(zhì)納米顆粒囊封了一種或多種治療劑。
26. 權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的脂質(zhì)納米顆粒在中和該脂質(zhì)納米顆粒之前裝 載一種或多種治療劑。
27. 權(quán)利要求25所述的方法，其中所述的治療劑包括一種或多種多核苷酸。
28. 權(quán)利要求27所述的方法，其中所述的一種或多種多核苷酸包括mRNA。
29. 權(quán)利要求28所述的方法，其中所述的mRNA包括選自鎖核酸（LNA)、2' -0-烷基-RNA 單元、2' -OMe-RNA單元、2' -氨基-DNA單元和2' -氟代-DNA單元中的一種或多種核苷酸改 性。
30. 權(quán)利要求27所述的方法，其中所述的中和的脂質(zhì)納米顆粒包括至少0. 1iig囊封的 多核苷酸。
31. 權(quán)利要求27所述的方法，其中所述的中和的脂質(zhì)納米顆粒包括至少0. 5yg囊封的 多核苷酸。
32. 權(quán)利要求27所述的方法，其中所述的一種或多種多核苷酸選自反義寡核苷酸、 siRNA、miRNA、snRNA、snoRNA和它們的組合。
33. 權(quán)利要求27所述的方法，其中所述的一種或多種多核苷酸包括一種或多種LNA。
34. 權(quán)利要求27所述的方法，其中所述的一種或多種多核苷酸包括DNA。
35. 權(quán)利要求27所述的方法，其中所述的一種或多種多核苷酸包括RNA。
36. 權(quán)利要求35所述的方法，其中所述的RNA選自mRNA、siRNA、snoRNA、microRNA和 它們的組合。
37. 權(quán)利要求35所述的方法，其中所述的RNA編碼了蛋白質(zhì)或酶。
38. 權(quán)利要求37所述的方法，其中所述的蛋白質(zhì)或酶選自人類(lèi)生長(zhǎng)激素、紅細(xì)胞生 成素、a1-抗胰蛋白酶、酸性a葡萄糖苷酶、芳基硫酸酯酶、羧基肽酶N、a半乳糖苷酶 A、a-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖酸酯-2-硫酸酯酶、艾杜糖酸酯硫酸酯酶、N-乙酰葡糖 胺-1-磷酸轉(zhuǎn)移酶、N-乙酰氨基葡糖苷酶、a-氨基葡糖苷乙?；D(zhuǎn)移酶、N-乙酰葡糖胺 6_硫酸酯酶、N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶、0 -葡萄糖苷酶、半乳糖-6-硫酸硫酸酯酶、 3 -半乳糖苷酶、3 -葡萄糖醛酸酶、葡萄糖腦苷脂酶、硫酸乙酰肝素硫酸脂酶、肝素-N-硫 酸酯酶、溶酶體酸脂酶、透明質(zhì)酸酶、半乳糖腦苷脂酶、編碼鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶（0TC)、氨甲 酰磷酸合成酶1(CPS1)、精氨酸琥珀酸合成酶（ASS1)、精氨酸代琥珀酸裂解酶（ASL)、精氨 酸酶1 (ARG1)、囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)因子（CFTR)、存活運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元（SMN)、因子IX、因子VIII和低密度脂蛋白受體。
39. -種根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法制備的中性脂質(zhì)納米顆粒。
40. 權(quán)利要求39所述的中性脂質(zhì)納米顆粒，其進(jìn)一步包括一種或多種治療劑。
41. 一種根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法制備的改性的脂質(zhì)納米顆粒。
42. 權(quán)利要求41所述的改性的脂質(zhì)納米顆粒，其進(jìn)一步包括一種或多種治療劑。
43. -種治療方法，其包括將權(quán)利要求40或42所述的脂質(zhì)納米顆粒給予受試對(duì)象。
44. 一種將一種或多種治療劑囊封于中性脂質(zhì)納米顆粒中的方法，該方法包括以下步 驟：(a)使用所述的一種或多種治療劑裝載包括至少一種可還原的陽(yáng)離子脂質(zhì)的脂質(zhì)納米 顆粒；以及（b)使所述的脂質(zhì)納米顆粒與一種或多種還原劑接觸，使得所述的脂質(zhì)納米顆 粒被中和。
45. 權(quán)利要求44所述的方法，其中所述的中性脂質(zhì)納米顆粒的囊封效率為至少50%。
46. 權(quán)利要求44所述的方法，其中所述的中性脂質(zhì)納米顆粒的囊封效率為至少75%。
47. 權(quán)利要求44所述的方法，其中所述的中性脂質(zhì)納米顆粒的囊封效率為至少90%。
48. 權(quán)利要求44所述的方法，其中所述的可還原的陽(yáng)離子脂質(zhì)具有以下結(jié)構(gòu)：
49. 權(quán)利要求44所述的方法，其中所述的可還原的陽(yáng)離子脂質(zhì)具有以下結(jié)構(gòu)：
50. 權(quán)利要求44所述的方法，其中所述的可還原的陽(yáng)離子脂質(zhì)具有以下結(jié)構(gòu)：
51. 權(quán)利要求44所述的方法，其中所述的一種或多種還原劑選自三（2-羧基乙基）膦 (TCEP)、0-巰基乙醇（0-ME)、二硫蘇糖醇（DTT)、谷胱甘肽、硫赤蘚醇和它們的組合。
52. 權(quán)利要求44所述的方法，其中所述的脂質(zhì)納米顆粒與所述的還原劑接觸至少大約 5分鐘。
53. 權(quán)利要求44所述的方法，其中所述的脂質(zhì)納米顆粒與所述的還原劑接觸至少大約 1小時(shí)。
54. 權(quán)利要求44所述的方法，其中所述的脂質(zhì)納米顆粒與所述的還原劑接觸至少大約 3小時(shí)。
55. 權(quán)利要求44所述的方法，其中所述的脂質(zhì)納米顆粒與所述的還原劑接觸至少大約 24小時(shí)。
56. 權(quán)利要求44所述的方法，其中所述的脂質(zhì)納米顆粒的zeta電位在該脂質(zhì)納米顆粒 與所述的一種或多種還原劑接觸之前為至少大約25mV，而在該脂質(zhì)納米顆粒與所述的一種 或多種還原劑接觸之后為低于大約5mV。
57. 權(quán)利要求56所述的方法，其中所述的脂質(zhì)納米顆粒的zeta電位在該脂質(zhì)納米顆粒 與所述的一種或多種還原劑接觸之后為大約-25.OmV至大約5.OmV。
58. 權(quán)利要求56所述的方法，其中所述的脂質(zhì)納米顆粒的zeta電位在該脂質(zhì)納米顆粒 與所述的一種或多種還原劑接觸之后為大約-10.OmV至大約5.OmV。
59. 權(quán)利要求44所述的方法，其中所述的脂質(zhì)納米顆粒進(jìn)一步包括選自PEG改性的脂 質(zhì)、非陽(yáng)離子脂質(zhì)和輔助脂質(zhì)中的一種或多種化合物。
60. 權(quán)利要求44所述的方法，其中所述的治療劑包括一種或多種多核苷酸。
61. 權(quán)利要求60所述的方法，其中所述的一種或多種多核苷酸選自反義寡核苷酸、 siRNA、miRNA、snRNA、snoRNA和它們的組合。
62. 權(quán)利要求60所述的方法，其中所述的一種或多種多核苷酸包括一種或多種LNA。
63. 權(quán)利要求60所述的方法，其中所述的一種或多種多核苷酸包括DNA。
64. 權(quán)利要求60所述的方法，其中所述的一種或多種多核苷酸包括RNA。
65. 權(quán)利要求64所述的方法，其中所述的RNA為mRNA并且其中所述的mRNA包括選自 鎖核酸（LNA)、2' -0-烷基-RNA單元、2' -OMe-RNA單元、2' -氨基-DNA單元和2' -氟代-DNA 單元中的一種或多種核苷酸改性。
66. 權(quán)利要求64所述的方法，其中所述的RNA選自mRNA、siRNA、snoRNA、microRNA和 它們的組合。
67. 權(quán)利要求64所述的方法，其中所述的RNA編碼了蛋白質(zhì)和酶。
68. -種根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法制備的中性脂質(zhì)納米顆粒。
69. -種治療方法，其包括將權(quán)利要求68所述的中性脂質(zhì)納米顆粒給予受試對(duì)象。
70. -種中和脂質(zhì)納米顆粒的方法，其中所述的脂質(zhì)納米顆粒包括至少一種具有可釋 放的極性頭部基團(tuán)的脂質(zhì)，所述的方法包括使所述的脂質(zhì)納米顆粒與一種或多種試劑接觸 的步驟，從而使所述的極性頭部基團(tuán)由所述的脂質(zhì)上釋放并使所述的脂質(zhì)納米顆粒由此被 中和；其中所述的脂質(zhì)具有以下結(jié)構(gòu)：
其中&為所述的可釋放的極性頭部基團(tuán)，并且選自咪唑、胍鹽、亞胺、烯胺、氨基、可任 選地取代的烷基氨基和可任選地取代的吡啶基；其中R2選自可任選地取代的、可變的飽和 或不飽和的烷基，可任選地取代的、可變的飽和或不飽和的?；?，可任選地取代的吡啶基，
其中馬和1?4均獨(dú)立地選自可任選地取代的、可變的飽和或不飽和的C6-C2(l烷基，和可 任選地取代的、可變的飽和或不飽和的C6-C2(l?；?； 其中x為可切割的連接基團(tuán)，其選自二硫化物、酯、腙、亞胺、縮醛、縮酮、cis-烏頭 ?；?、原酸酯、酐、硫代丙酸酯、乙烯醚、氨基磷酸酯、GLFG、Val-Cit、GG、AA、GGGF和PVGLIG;以及 其中n為0或任何正整數(shù)。
71. 權(quán)利要求70所述的方法，其中所述的可切割的連接基團(tuán)為二硫化物。
72. 權(quán)利要求71所述的方法，其中所述的一種或多種試劑為還原劑。
73. 權(quán)利要求72所述的方法，其中所述的還原劑選自三（2-羧基乙基）膦（TCEP)、 巰基乙醇（P-ME)、二硫蘇糖醇（DTT)、谷胱甘肽、二硫赤蘚醇和它們的組合。
74. 權(quán)利要求72所述的方法，其中所述的脂質(zhì)納米顆粒與所述的還原劑接觸至少大約 5分鐘。
75. 權(quán)利要求72所述的方法，其中所述的脂質(zhì)納米顆粒與所述的還原劑接觸至少大約 1小時(shí)。
76. 權(quán)利要求72所述的方法，其中所述的脂質(zhì)納米顆粒與所述的還原劑接觸至少大約 3小時(shí)。
77. 權(quán)利要求72所述的方法，其中所述的脂質(zhì)納米顆粒與所述的還原劑接觸至少大約 24小時(shí)。
78. 權(quán)利要求72所述的方法，其中所述的脂質(zhì)納米顆粒的zeta電位在該脂質(zhì)納米顆粒 與所述的一種或多種還原劑接觸之前為至少大約25mV，而在該脂質(zhì)納米顆粒與所述的一種 或多種還原劑接觸之后為低于大約5mV。
79. 權(quán)利要求78所述的方法，其中所述的脂質(zhì)納米顆粒的zeta電位在該脂質(zhì)納米顆粒 與所述的還原劑接觸之后為大約-25.OmV至大約5.OmV。
80. 權(quán)利要求78所述的方法，其中所述的脂質(zhì)納米顆粒的zeta電位在該脂質(zhì)納米顆粒 與所述的還原劑接觸之后為大約-5.OmV至大約5.OmV。
81. 權(quán)利要求71所述的方法，其中所述的一種或多種試劑為酶。
82. 權(quán)利要求81所述的方法，其中所述的酶選自堿性磷酸酶、羧基肽酶G2、胞嘧啶脫氨 酶、硝基還原酶、葡萄糖苷酸酶、a-半乳糖苷酶、硫氧還蛋白和Y干擾素誘導(dǎo)的溶酶體 巰基還原酶（GILT)。
83. 權(quán)利要求71所述的方法，其中所述的脂質(zhì)具有以下結(jié)構(gòu)：
84. 權(quán)利要求71所述的方法，其中所述的脂質(zhì)具有以下結(jié)構(gòu)：
85. 權(quán)利要求71所述的方法，其中所述的脂質(zhì)具有以下結(jié)構(gòu)：
86. 權(quán)利要求70所述的方法，其中所述的可切割的連接基團(tuán)為酯。
87. 權(quán)利要求86所述的方法，其中所述的一種或多種試劑在接觸所述的脂質(zhì)納米顆粒 時(shí)水解所述的酯。
88. -種根據(jù)權(quán)利要求70所述的方法制備的脂質(zhì)納米顆粒。
89. 權(quán)利要求88所述的脂質(zhì)納米顆粒，其中所述的脂質(zhì)納米顆粒的囊封效率為至少 50%。
90. 權(quán)利要求88所述的脂質(zhì)納米顆粒，其中所述的脂質(zhì)納米顆粒的囊封效率為至少 75%。
91. 權(quán)利要求88所述的脂質(zhì)納米顆粒，其中所述的脂質(zhì)納米顆粒的囊封效率為至少 90%。
92. 權(quán)利要求88所述的脂質(zhì)納米顆粒，其進(jìn)一步包括一種或多種治療劑。
93. 權(quán)利要求92所述的脂質(zhì)納米顆粒，其中所述的治療劑為mRNA。
94. 權(quán)利要求92所述的脂質(zhì)納米顆粒，其中所述的脂質(zhì)納米顆粒包括至少0. 1yg囊封 的治療劑。
95. 權(quán)利要求92所述的脂質(zhì)納米顆粒，其中所述的脂質(zhì)納米顆粒包括至少0. 5yg囊封 的治療劑。
96. 權(quán)利要求93所述的脂質(zhì)納米顆粒，其中所述的mRNA包括選自鎖核酸（LNA)、 2' -0-烷基-RNA單元、2' -OMe-RNA單元、2' -氨基-DNA單元和2' -氟代-DNA單元中的一種 或多種核苷酸改性。
97. 權(quán)利要求93所述的脂質(zhì)納米顆粒，其中所述的mRNA包括一種或多種硫代磷酸酯核 苷酸間連鍵基團(tuán)。
98. 權(quán)利要求93所述的脂質(zhì)納米顆粒，其中所述的mRNA包括所有硫代磷酸酯核苷酸間 連鍵基團(tuán)。
99. 權(quán)利要求93所述的脂質(zhì)納米顆粒，其中所述的mRNA包括獨(dú)立地選自5-甲基胞核 嘧啶、異胞核嘧啶、假異胞核嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌 呤、肌苷、假尿苷、2-硫脲嘧啶、二氨基嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤胞核嘧啶中的至少一種改 性的核苷酸。
100. -種調(diào)控脂質(zhì)體媒介物的表面電荷的方法，其中所述的脂質(zhì)體媒介物包括至少一 種含有可釋放的極性頭部基團(tuán)的脂質(zhì)；所述的方法包括使所述的脂質(zhì)體媒介物與至少一種 試劑接觸的步驟；其中在所述的脂質(zhì)體媒介物與所述的至少一種試劑接觸時(shí)，所述的極性 頭部基團(tuán)由所述的脂質(zhì)上釋放，并且所述的脂質(zhì)體媒介物的表面電荷由此被調(diào)控。
101. 權(quán)利要求100所述的方法，其中所述的脂質(zhì)體媒介物進(jìn)一步包括選自PEG改性的 脂質(zhì)、非陽(yáng)離子脂質(zhì)和輔助脂質(zhì)中的一種或多種化合物。
102. 權(quán)利要求101所述的方法，其中所述的脂質(zhì)體媒介物的凈表面電荷在該脂質(zhì)體媒 介物與所述的至少一種試劑接觸之前為至少大約+25mV，而在該脂質(zhì)納米顆粒與所述的至 少一種試劑接觸之后為低于大約-5.OmV。
103. 權(quán)利要求101所述的方法，其中所述的脂質(zhì)體媒介物為脂質(zhì)納米顆粒。
104. 權(quán)利要求100所述的方法，其中所述的經(jīng)調(diào)控的脂質(zhì)體媒介物的凈表面電荷為低 于大約-25mV。
105. 權(quán)利要求100所述的方法，其中所述的經(jīng)調(diào)控的脂質(zhì)體媒介物的凈表面電荷為低 于大約_50mV至大約_10mV。
106. 權(quán)利要求100所述的方法，其中所述的經(jīng)調(diào)控的脂質(zhì)體媒介物的凈表面電荷為低 于大約_5.OmV至大約+5.OmV。
107. 權(quán)利要求100所述的方法，其中所述的試劑為選自三（2-羧基乙基）膦（TCEP)、 巰基乙醇（P-ME)、二硫蘇糖醇（DTT)、谷胱甘肽、二硫赤蘚醇和它們的組合中的還原 劑。
108. 權(quán)利要求100所述的方法，其中所述的脂質(zhì)具有以下結(jié)構(gòu)：
109. 權(quán)利要求100所述的方法，其中所述的脂質(zhì)具有以下結(jié)構(gòu)：
110. 權(quán)利要求100所述的方法，其中所述的脂質(zhì)具有以下結(jié)構(gòu)：
【文檔編號(hào)】A61K9/127GK104487055SQ201380026368
【公開(kāi)日】2015年4月1日 申請(qǐng)日期:2013年3月29日 優(yōu)先權(quán)日:2012年3月29日
【發(fā)明者】F·德羅莎, B·C·吉爾德, M·哈特萊因 申請(qǐng)人:夏爾人類(lèi)遺傳性治療公司