一種抑制FOXC1基因表達的siRNA及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種抑制人FOXC1基因表達的siRNA分子及其應用，屬于分子生物學領域。一種抑制FOXC1基因表達的siRNA，其序列為：正義鏈：5′-CGGACAAGAAGATCACCCTtt-3′，反義鏈：5′-AGGGTGATCTTCTTGTCCGtt-3′。本發(fā)明siRNA能夠有效抑制人FOXC1基因的表達，并能夠顯著抑制喉鱗癌細胞系Hep-2、TU-177細胞增殖、克隆能力，以及細胞的遷移及侵襲能力，可用于靶向FOXC1的抗喉癌藥物的制備。
【專利說明】—種抑制F0XC1基因表達的siRNA及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學領域，涉及一種抑制人FOXCl基因表達的siRNA分子及其應用。
【背景技術】
[0002]喉癌是一種發(fā)生在喉黏膜上皮的惡性腫瘤，好發(fā)于50~60歲男性，是頭頸部第二常見的原發(fā)惡性腫瘤，病理類型以鱗狀細胞癌為主，約占90%以上。
[0003]喉癌起源于喉黏膜上皮，位居頭頸部常見惡性腫瘤第二位，病死率較高。我國部分省份的發(fā)病率為1.5-3.4/10萬人，近20年呈上升并有年輕化趨勢。由于喉腔具有解剖結構局限及淋巴組織等豐富的特點，侵襲轉移成為其顯著惡性生物學特征。喉鱗癌局部復發(fā)及轉移是患者5年內死亡的主要原因，據(jù)臨床統(tǒng)計，有80%以上的腫瘤患者死于侵襲轉移，而未有侵襲轉移者，則預后較好。
[0004]人類FOXCl基因是叉頭 框轉錄因子基因家族(F0X家族)的一員。FOXCl基因長度為1.6kb，位于人類染色體6p25基因編碼區(qū)，編碼的蛋白質共有553個氨基酸殘基的蛋白質。在乳腺癌、子宮內膜癌等研究中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXCl可以促進癌細胞的增殖、侵襲及遷移，這些研究同時指出FOXCl促進癌細胞侵襲及遷移的作用可能是通過參與EMT (上皮一間質轉化)，從而導致EMT相關的分子標記表達變化，且FOXCl的高表達提示預后較差?，F(xiàn)代腫瘤醫(yī)學，2012，20:930-933.記載了 FOXCl蛋白在喉鱗狀細胞癌中表達及臨床意義，F(xiàn)OXCl蛋白在喉鱗癌組織中陽性表達率明顯高于癌旁正常切緣組織，它可能在喉鱗癌的侵襲、轉移過程中發(fā)揮重要作用。
[0005]RNA 干擾(RNA interference, RNAi)是由雙鏈 RNA(double_stranded RNA, dsRNA)引發(fā)的轉錄后基因沉默機制。其作用機制是=RNase III核酶家族的Dicer，與雙鏈RNA結合，將其剪切成21-23nt及3'端突出的小干擾RNA (small interfering RNA, siRNA),隨后siRNA與RNA誘導沉默復合物(RNA-1nduced silencing complex, RISC)結合,解旋成單鏈，活化的RISC受已成單鏈的siRNA引導，序列特異性地結合在靶mRNA上并將其切斷，引發(fā)靶mRNA的特異性分解，從而阻斷相應基因表達的轉錄后基因沉默機制。RNAi已作為一種簡單有效的基因敲除的技術，廣泛地應用于功能基因組學的研究中。設計針對人FOXCl基因的siRNA,對腫瘤細胞中FOXCl進行干擾，從而抑制腫瘤細胞惡性增殖、侵襲、轉移的惡性生物學表型，可能成為抗腫瘤靶向治療的有效藥物。

【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明的目的在于利用RNA干擾技術，針對FOXCl基因設計siRNA，抑制FOXCl表達。
[0007]本發(fā)明的另一個目的在于提供上述抑制FOXCl基因表達的siRNA的應用。
[0008]本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的:
[0009]一種抑制FOXCl基因表達的siRNA，其序列為:[0010]正義鏈:5'-CGGACAAGAAGATCACCCTtt-3'
[0011]反義鏈:5'-AGGGTGATCTTCTTGTCCGtt-3'。
[0012]進一步地，優(yōu)選在3'端懸掛由脫氧核苷組成的堿基TT，用于提高基因沉默效率以及增強siRNA化合物的穩(wěn)定性。
[0013]更進一步地，本發(fā)明提供了上述抑制FOXCl基因表達的siRNA在制備抗喉癌藥物中的應用。上述siRNA能夠有效抑制人FOXCl基因的表達，并能夠顯著抑制喉鱗癌細胞系Hep-2,TU-177細胞增殖、克隆能力，以及細胞的遷移及侵襲能力，可用于靶向FOXCl的抗喉癌藥物的制備。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1為FOXClmRNA分別在20例喉鱗癌組織及癌旁正常黏膜組織中的相對表達量。
[0015]圖2為FOXClmRNA分別在頸淋巴結轉移(N+)及非頸淋巴結轉移(NO)病理中的相
對表達量。
[0016]圖3為FOXCl蛋白在喉鱗癌組織中的免疫組化表達(箭頭指示陽性表達部位，放大倍數(shù)400倍)；
[0017]圖中:A:FOXCI蛋白在喉鱗癌細胞質中強陽性表達；
[0018]B =FOXCl蛋白在喉鱗癌細胞核中強陽性表達；
[0019]C =FOXCl蛋白在喉鱗癌細胞質及細胞核強陽性表達；
[0020]D:FOXCI蛋白在喉鱗癌組織中陰性對照片。
[0021]圖4為:F0XClmRNA喉鱗癌細胞系H印_2、TU-177及3個癌旁正常黏膜組織中的相對表達水平。
[0022]圖5 為喉鱗癌細胞系 H印-2、TU-177 篩選有效性 FOXClsiRNA (s1-FOXCl-1/2/3)。
[0023]圖6為喉鱗癌細胞系H印-2、TU-177轉染FOXClsiRNA，F(xiàn)OXClmRNA相對表達水平。
[0024]圖7為喉鱗癌細胞系H印-2、TU-177轉染FOXClsiRNA，F(xiàn)OXCl蛋白相對表達水平。
[0025]圖8為喉鱗癌細胞系H印-2轉染FOXClsiRNA (s1-FOXCl-2后)細胞增殖能力變化。
[0026]圖9為喉鱗癌細胞系TU-177轉染FOXClsiRNA (s1-F0XCl-2后)細胞增殖能力變化。
[0027]圖10為喉鱗癌細胞系ifep-2轉染FOXClsiRNA (s1-FOXCl-2后)細胞克隆能力變化。
[0028]圖11為喉鱗癌細胞系TU-177轉染FOXClsiRNA (s1-FOXCl-2后)細胞克隆能力變化。
[0029]圖12為喉鱗癌細胞系H印-2轉染FOXClsiRNA (s1-FOXCl-2后)細胞遷移能力變化。 [0030]圖13為喉鱗癌細胞系TU-177轉染FOXClsiRNA (s1-FOXCl-2后)細胞遷移能力變化。
[0031]圖14為喉鱗癌細胞系H印-2轉染FOXClsiRNA (s1-FOXCl-2后)細胞侵襲能力變化。
[0032]圖15為喉鱗癌細胞系TU-177轉染FOXClsiRNA (s1-FOXCl-2后)細胞侵襲能力變化。
[0033]圖16為定量PVR反應條件圖。
【具體實施方式】
[0034]以下結合實施例對本發(fā)明作進一步說明。
[0035]一、FOXClmRNA在喉鱗癌組織及對應正常癌旁黏膜組織中的表達
[0036](I)標本獲取
[0037]標本取自山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院首診及手術的患者，具體為20例喉鱗癌癌組織及同一患者癌旁正常黏膜對照組織；標本分離后15分內進行封裝并液氮凍存；病理證實所取得標本均為喉鱗癌，癌旁正常黏膜對照組織中未見癌；腫瘤分期(?M)采用Π(Χ2012版本；病理學分級采用WHO標準；本實驗經過山西醫(yī)科大學科學研究倫理委員會批準；人口學資料見表1。
[0038]表1:喉鱗癌患者人口學資料
【權利要求】
1.一種抑制FOXCl基因表達的siRNA，其特征在于，其序列為: 正義鏈:5' - CGGACAAGAAGATCACCCTtt-3' 反義鏈:5' -AGGGTGATCTTCTTGTCCGtt-3'。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種抑制FOXCl基因表達的siRNA，其特征在于，在3'端懸掛由脫氧核苷組成的堿基TT。
3.權利要求1或2所述的抑制FOXCl基因表達的siRNA在制備抗喉癌藥物中的應用。
【文檔編號】A61K48/00GK103667295SQ201310651571
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月5日 優(yōu)先權日:2013年12月5日
【發(fā)明者】高偉, 張春明, 王斌全, 盧巖, 賀小玲, 溫樹信, 皇甫輝 申請人:山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院