一種副雞嗜血桿菌、滅活疫苗及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種副雞嗜血桿菌、滅活疫苗及其制備方法，所述副雞嗜血桿菌為副雞嗜血桿菌（Haemophilusparagallinarum)HN-VA株，已于2012年7月23日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏號：CGMCCNO.7211。本發(fā)明首次采用副雞嗜血桿菌HN-VA株制備針對雞傳染性鼻炎的滅活疫苗，該疫苗的研究和制備有效解決了當(dāng)前我國雞傳染性鼻炎難以有效預(yù)防，發(fā)病率高、死亡率高的問題，且不會對雞產(chǎn)生任何不良反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)安全性高，接種后可在雞體內(nèi)產(chǎn)生高效價的中和抗體，免疫效果較好。
【專利說明】一種副雞嗜血桿菌、滅活疫苗及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種副雞嗜血桿菌，同時該副雞嗜血桿菌的滅活疫苗及其制備方法， 屬于微生物制劑領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 副雞嗜血桿菌（Haemophilus paragallinarum)是一種引起雞急性上呼吸道疾病 的致病菌。該病首先發(fā)現(xiàn)于波蘭和美國，以后在其它各國經(jīng)常發(fā)生。1980年以來，我國也屢 有本病的報道。該呼吸道疾病俗稱雞傳染性鼻炎，臨床上以面部水腫、鼻竇炎、流淚為主要 特征，可引起產(chǎn)蛋雞的產(chǎn)蛋量下降，育成雞的生長受阻、開產(chǎn)期推遲，肉雞增重下降，給養(yǎng)禽 業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前對副雞嗜血桿菌的治療主要以抗生素為主，但是采用抗生素 常會造成耐藥菌株的出現(xiàn)，導(dǎo)致副雞嗜血桿菌在同一雞群中復(fù)發(fā)。因此副雞嗜血桿菌疫苗 的研究成為熱點(diǎn)，但是目前副雞嗜血桿菌疫苗對部分患病雞預(yù)防效果較差。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是提供一種副雞嗜血桿菌。
[0004] 本發(fā)明的目的還在于提供一種副雞嗜血桿菌的滅活疫苗。
[0005] 本發(fā)明的目的還在于提供一種副雞嗜血桿菌的滅活疫苗的制備方法。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是提供一種副雞嗜血桿菌，所述副 雞嗜血桿菌為副雞嗜血桿菌（Haemophilus paragallinarum)HN_VA株，已于2012年7月23 日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址：北京市朝陽區(qū)北辰 西路1號院3號，保藏號：CGMCC NO. 7211。
[0007] 所述副雞嗜血桿菌HN-VA株的分離方法如下：
[0008] (1)病料的處理：從發(fā)病雛雞鼻竇內(nèi)深部取分泌物作為病料，將病料接種于雞血清 瓊脂肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)，進(jìn)行分離純化；
[0009] (2)病原禽胚分離培養(yǎng)：將步驟（1)純化的病原菌接種于SPF雞胚，收集死亡雞胚 的卵黃液，即得副雞嗜血桿菌HN-VA株。
[0010] 本發(fā)明所采用的技術(shù)方案還在于提供一種副雞嗜血桿菌的滅活疫苗，其活性成分 為滅活的副雞嗜血桿菌HN-VA株。
[0011] 本發(fā)明所采用的技術(shù)方案還在于提供一種副雞嗜血桿菌滅活疫苗的制備方法，包 括以下步驟：
[0012] (1)將副雞嗜血桿菌HN-VA株接種于SPF雞胚，收集接種后死亡的SPF雞胚卵黃 液，得到生產(chǎn)用種子；
[0013] (2)將生產(chǎn)用種子擴(kuò)大培養(yǎng)，加入滅活劑滅活，然后加入防腐劑和礦物油佐劑進(jìn)行 乳化，制得副雞嗜血桿菌的滅活疫苗。
[0014] 所述滅活劑為甲醛。
[0015] 所述甲醛終體積濃度0· 2%。
[0016] 所述防腐劑為硫柳汞。
[0017] 所述硫柳汞的用量為終質(zhì)量濃度0. 01%。
[0018] 所述礦物油佐劑為白油佐劑。
[0019] 本發(fā)明首次采用副雞嗜血桿菌HN-VA株制備針對雞傳染性鼻炎的滅活疫苗，該疫 苗的研究和制備有效解決了當(dāng)前我國雞傳染性鼻炎難以有效預(yù)防，發(fā)病率高、死亡率高的 問題，且不會對雞產(chǎn)生任何不良反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)安全性高，接種后可在雞體內(nèi)產(chǎn)生高效價的中和 抗體，免疫效果較好。
[0020] 本發(fā)明用HN-VA株制備滅活疫苗工藝簡單、操作方便、制備的疫苗抗原性好、安全 性高，對外界環(huán)境無任何不良影響，安全評估系數(shù)高。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021] 圖1為副雞嗜血桿菌HN-VA株的PCR擴(kuò)增片段的瓊脂糖凝膠電泳圖。

【具體實(shí)施方式】
[0022] 實(shí)施例1
[0023] 本發(fā)明的副雞嗜血桿菌HN-VA株，是通過以下方式獲得的：
[0024] 2012年6月，鄭州尉氏某雞廠大批7周齡以上雛雞發(fā)生多起以打噴嚏，流鼻液，顏 面浮腫，眼瞼和肉髯水腫為主要特征的傳染病，造成雞只死亡和產(chǎn)蛋率下降。因此針對該批 發(fā)病雛雞，分離純化得到病原菌，命名為HN-VA株。通過對HN-VA株各項(xiàng)觀察，特異性PCR 鑒定和測序分析表明，HN-VA株屬于副雞嗜血桿菌。
[0025] (1)病料的處理：用無菌拭子插入發(fā)病雛雞鼻竇內(nèi)深部取分泌物做病料，然后劃線 培養(yǎng)于雞血清瓊脂肉湯培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)48h，再挑取單個菌落接種于雞血清肉湯培養(yǎng)基 上中培養(yǎng)16-20h。
[0026] (2)病原禽胚分離培養(yǎng)：將純化的病原菌接種于雞血清肉湯液體培養(yǎng)基中培養(yǎng) 16h，然后將菌液接種于6日齡SPF雞胚3枚，每枚0. lml。觀察接種24h后的雞胚死亡情 況，收集30h內(nèi)死亡的雞胚的卵黃液，獲得的菌株命名為HN-VA株。將等量的卵黃液分裝于 滅菌瓶內(nèi)，每瓶2ml，檢驗(yàn)合格后作為一級種子。也可用雞胚復(fù)壯，但不應(yīng)超過6代。檢驗(yàn)方 法：取1瓶卵黃液，接種于含有雞肉湯培養(yǎng)基的三角瓶內(nèi)，培養(yǎng)16-20小時后，觀察三角瓶， 若液體菌種均勻一致渾濁生長，則檢驗(yàn)菌液合格。
[0027] (3) HN-VA 株的鑒定
[0028] (a)染色鏡檢：挑取單個菌落進(jìn)行革蘭氏染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)菌的形態(tài)特 征。鏡下可見大量的單個、成對或短璉的兩極濃染的革蘭氏陰性細(xì)小桿菌。
[0029] (b)衛(wèi)星現(xiàn)象：取2個副雞嗜血桿菌培養(yǎng)基的平板，一個劃線接種所分離純化的細(xì) 菌并點(diǎn)種金黃色葡萄球菌，另一個只劃線接種分離菌作對照。于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，發(fā) 現(xiàn)其在葡萄球菌周圍長出"衛(wèi)星現(xiàn)象"。
[0030] (C)挑取單個菌落用生理鹽水稀釋，震蕩均勻后制成懸液。在載玻片的一端，滴加 菌體懸液50 μ 1，另一端加入50 μ 1生理鹽水，兩端再各加入50 μ 11%雞血紅細(xì)胞，輕輕晃 勻。溫箱中反應(yīng)3分鐘左右觀察。雞血紅細(xì)胞出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，這說明HN-VA株為A型副雞 嗜血桿菌。
[0031] (d) PCR鑒定：根據(jù)副雞嗜血桿菌的16SrRNA基因（GenBank中登錄號為 AY498870. 1)的保守區(qū)設(shè)計引物，由Invitro-gen公司合成，引物序列如下：
[0032] 上游引物 HP16S-F :5' -CCAACCTTCCTCACCACC-3'（如 SEQ ID No. 1 所示），
[0033] 下游引物 HP16S-R :5' -CCGCATAGAATCGGAAGA-3'（如 SEQ ID No. 2 所示）。
[0034] 按照《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》的方法提取菌體基因組DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
[0035] PCR 反應(yīng)體系為：10XPCRbuffer2y 1，（1ΝΤΡ2μ 1，MgCl2Iy 1，Taq 酶 0· 2μ 1，上、 下游引物各 〇· 5μ 1，模板 0· 5μ 1，ddH2013. 5μ 1。
[0036] PCR 反應(yīng)條件為：95°C 5min，94°C lmin，56°C 50s，2°C 50s，35 個循環(huán)；72°C 延長 5min〇
[0037] 將PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上電泳，結(jié)果如圖I所示。圖I中1、2分別為分離的 2株菌株擴(kuò)增出的特異條帶，擴(kuò)增片段大小為250-350bp，條帶位置與預(yù)期一致。經(jīng)測序后 與GenBank中的登錄號為AY498870. 1的序列進(jìn)行比較，同源性高達(dá)98%，擴(kuò)增片段的核苷酸 序列詳見序列表SEQ ID No. 3所不。以上結(jié)果表明，分離于發(fā)病雛雞中的HN-VA株屬于副雞 嗜血桿菌。
[0038] 實(shí)施例2
[0039] 本發(fā)明副雞嗜血桿菌的滅活疫苗，制備方法如下：
[0040] (1)生產(chǎn)用種子檢驗(yàn)：將一級種子采用瓊脂平板進(jìn)行菌落計數(shù)。細(xì)菌計數(shù)按農(nóng)業(yè) 部頒發(fā)的獸醫(yī)微生物制品規(guī)程進(jìn)行，以ΚΓ 1，1〇_2,1〇_3, KTltl稀釋，然后取0. ImL稀釋液均勻 地涂抹在瓊脂平板上，每個稀釋度做2板，置于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16?20h，2板的平均數(shù) 即為該稀釋度的細(xì)菌數(shù)，用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)的菌液作為對照，每毫升菌落數(shù)不低于15億方可 用于生產(chǎn)。
[0041] (2)滅活疫苗制備：將生產(chǎn)用種子按萬倍擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)基用半合成肉湯培養(yǎng)基， 調(diào)pH到7. 2,115°C滅菌30分鐘。在菌液中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的甲醛溶液，使甲醛溶液占菌 液總體積的〇. 2%，然后2-8°C滅活8天，滅活期間每天振搖5次。然后在滅活合格的菌液中 加入硫柳汞，使硫柳汞終濃度為〇. 01% (質(zhì)量)，和菌液2倍體積的白油佐劑進(jìn)行乳化，制得 副雞嗜血桿菌滅活疫苗。
[0042] 滅活菌液檢測方法：取檢品在無菌條件下接種沙氏培養(yǎng)基或不滴定pH普通瓊脂 斜面2支、血斜2支、0. 2ml/支、置20?30°C培養(yǎng)。同時接種裝置不少于50ml的馬丁肉液 和厭氣肝湯各2支，Iml/支，置37°C培養(yǎng)，3日后，自厭氣肝湯管中吸取適量培養(yǎng)物，移植于 鮮血瓊脂斜面和厭氣肝湯小管各1支，自馬丁湯大管中吸取適量培養(yǎng)物移植于鮮血瓊脂斜 面和馬丁肉湯小管各一支，連前繼續(xù)培養(yǎng)5日，均應(yīng)無菌生長。
[0043] 上述實(shí)施例中所采用的培養(yǎng)基均為半合成培養(yǎng)基，購自鄭州博賽生物技術(shù)股份有 限公司。
[0044] 試驗(yàn)例
[0045] 1、安全檢測
[0046] 用2月齡SPF雞60只，隨即分成4組，每組15只，3組實(shí)驗(yàn)組SPF雞分別經(jīng)頸背部 皮下注射副雞嗜血桿菌滅活疫苗，一次單劑量接種〇. Iml/只，第4組為對照組，注射滅菌生 理鹽水。對實(shí)驗(yàn)組SPF雞和對照組SPF雞連續(xù)觀察2周，觀察有無發(fā)病、死亡和體重變化。 結(jié)果3個實(shí)驗(yàn)組SPF雞和對照組SPF雞體重?zé)o差異，無發(fā)病、死亡，無局部和全身不良反應(yīng)。
[0047] 2、效力檢驗(yàn)
[0048] 用6周齡SPF雞20只，10只各皮下注射疫苗0. 25ml，另10只作對照。接種30日 后，取免疫雞和對照雞，每只雞各眶下鼻竇內(nèi)注射副雞嗜血桿菌HN-Vl株培養(yǎng)物0. 2ml，觀 察2周。對照組發(fā)病5只，免疫組保護(hù)7只。
【權(quán)利要求】
1. 一種副雞嗜血桿菌，其特征在于，所述副雞嗜血桿菌為副雞嗜血桿菌（Haemophilus paragallinarum)HN-VA株，已于2012年7月23日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會 普通微生物中心，保藏地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏號：CGMCC NO. 7211。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的副雞嗜血桿菌，其特征在于，所述副雞嗜血桿菌HN-VA株的分 離方法如下： (1) 病料的處理：從發(fā)病雛雞鼻竇內(nèi)深部取分泌物作為病料，將病料接種于雞血清瓊脂 肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)，進(jìn)行分離純化； (2) 病原禽胚分離培養(yǎng)：將步驟（1)純化的病原菌接種于SPF雞胚，收集死亡雞胚的卵 黃液，即得副雞嗜血桿菌HN-VA株。
3. -種權(quán)利要求1所述的副雞嗜血桿菌的滅活疫苗，其特征在于，其活性成分為滅活 的副雞嗜血桿菌HN-VA株。
4. 一種如權(quán)利要求3所述的副雞嗜血桿菌滅活疫苗的制備方法，其特征在于，包括以 下步驟： (1) 將副雞嗜血桿菌HN-VA株接種于SPF雞胚，收集接種后死亡的SPF雞胚卵黃液，得 到生產(chǎn)用種子； (2) 將生產(chǎn)用種子擴(kuò)大培養(yǎng)，加入滅活劑滅活，然后加入防腐劑和礦物油佐劑進(jìn)行乳 化，制得副雞嗜血桿菌的滅活疫苗。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種副雞嗜血桿菌滅活疫苗的制備方法，其特征在于，所述 滅活劑為甲醛。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種副雞嗜血桿菌滅活疫苗的制備方法，其特征在于，所述 甲醒終體積濃度〇. 2%。
7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種副雞嗜血桿菌滅活疫苗的制備方法，其特征在于，所述 防腐劑為硫柳萊。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種副雞嗜血桿菌滅活疫苗的制備方法，其特征在于，所述 硫柳汞的用量為終質(zhì)量濃度〇. 01%。
9. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種副雞嗜血桿菌滅活疫苗的制備方法，其特征在于，所述 礦物油佐劑為白油佐劑。
【文檔編號】A61P31/04GK104212736SQ201310462857
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2013年9月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月30日
【發(fā)明者】王衛(wèi)芳, 徐進(jìn), 陳建暉 申請人:鄭州后羿制藥有限公司