專利名稱：一種具有支化結(jié)構(gòu)的緩控釋酸敏感陽離子聚合物基因載體的制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥、高分子醫(yī)用材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一類以乙二醇二縮水甘油醚及一種兩端含氨基的原酸酯新單體為原料制備的具有支化結(jié)構(gòu)的、酸敏感的陽離子聚合物的合成方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
基因治療是一種全新的疾病治療模式，是通過一定方式將正?；蚧蚓哂兄委熥饔玫幕?qū)肴梭w靶細(xì)胞進(jìn)行適當(dāng)表達(dá)，以糾正或改善疾病基因所產(chǎn)生的缺陷，達(dá)到治療疾病的目的。隨著基因治療研究的不斷深入，缺乏安全、有效的基因傳遞系統(tǒng)是制約基因治療實(shí)施的一個(gè)主要瓶頸。所以，開發(fā)合適的載體，尤其是酸敏感的、具有胞內(nèi)緩釋性能的基因載體，使目的基因在靶細(xì)胞安全、可控及高效表達(dá)，是基因治療能否成功的關(guān)鍵?；蛑委熭d體主要分病毒載體和非病毒載體。病毒載體具有較高的轉(zhuǎn)染效率，但存在免疫原性高、毒性大、靶向特異性差等弊端，嚴(yán)重限制了它們?cè)谂R床上的應(yīng)用。非病毒載體主要是指帶正電荷的陽離子基因載體，包括陽離子脂質(zhì)體和陽離子聚合物，具有低毒、低免疫反應(yīng)、無基因插入片段大小限制等優(yōu)點(diǎn)。常見的陽離子聚合物如聚乙酰亞胺(PEI)、聚賴氨酸、殼聚糖、樹裝大分子等，通過靜電作用與DNA形成聚電解質(zhì)復(fù)合物，可有效縮合質(zhì)粒DNA。但是，強(qiáng)烈的靜電作用也限制了基因進(jìn)入細(xì)胞液后從復(fù)合物中的釋放，限制基因表達(dá)。細(xì)胞組件如細(xì)胞質(zhì)、內(nèi)涵體、溶酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、線粒體、細(xì)胞核都維持獨(dú)特的PH值(pH值從溶酶體的4.5到線粒體的8.0)。細(xì)胞內(nèi)不同組分的pH值梯度及顯著的理化性質(zhì)的變化，具有酸敏感的基因轉(zhuǎn)運(yùn)體系將對(duì)基因的細(xì)胞內(nèi)傳遞產(chǎn)生積極影響。因此，PH酸敏感聚合物載體，可以通過改變自身大分子構(gòu)象、結(jié)構(gòu)對(duì)外界微環(huán)境的刺激做出響應(yīng)，可以有效解決常規(guī)聚合物載體對(duì)于DNA “包裝易、拆解難”的弊端，應(yīng)用前景良好。目前，聚乙酰亞胺PEI具有良好的DNA裝載能力，及可促進(jìn)DNA從內(nèi)涵體逃逸至細(xì)胞質(zhì)中的“質(zhì)子海綿”特性，且轉(zhuǎn)染效率高，是目前被研究的陽離子聚合物基因載體，有研究表明，PEI支化程度增加可以增強(qiáng)其包裹DNA的能力，但其不可降解，轉(zhuǎn)染效率越高，細(xì)胞毒性也越大。本研究中合成的具有支化結(jié)構(gòu)的陽離子聚合物，具有較強(qiáng)的包裹DNA能力，且細(xì)胞毒性低，其具備的酸敏感性能又使其具備較好的釋放DNA的能力，能夠滿足臨床的使用要求。并且，通過比較不同支化程度的基因載體，綜合考察其性質(zhì)(如DNA包裹能力，轉(zhuǎn)染效果，細(xì)胞毒性，降解程度)等，為探尋最佳的基因載體提供可能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的 目的在于提供一種合成的、具有支化結(jié)構(gòu)的、酸敏感的、細(xì)胞毒性低、轉(zhuǎn)染效率高的陽離子聚合物基因載體。該陽離子聚合物基因載體具有制備方法簡(jiǎn)單、成本低、細(xì)胞毒性低、安全實(shí)用、生物相容性好、可控的降解性能、基因轉(zhuǎn)染效率高等優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明的目的在于提供上述具有支化結(jié)構(gòu)的、酸敏感的、細(xì)胞毒性低、轉(zhuǎn)染效率高的陽離子聚合物基因載體的制備方法。該制備方法工藝簡(jiǎn)單，易于控制，成本低廉。本發(fā)明的目的在于提供上述陽離子聚合物在基因治療中作為基因載體的應(yīng)用。本發(fā)明的目的在于提供一種具有支化結(jié)構(gòu)的、酸敏感的、細(xì)胞毒性低、轉(zhuǎn)染效率高的陽離子聚合物基因載體，是以乙二醇二縮水甘油醚和一種二元胺原酸酯單體(4’ -二亞
甲基氧-二 - (2-氨基乙氧基-1，3- 二氧戊烷)為骨架，按摩爾比
1: 1-2的比例聚合而成。本發(fā)明提供的陽離子聚合物基因載體的制備方法包括以下步驟:取乙二醇二縮水甘油醚置于雙頸瓶中，加入適量DMF，攪拌溶解后，向其中加入二元胺型原酸酯單體(乙二醇二縮水甘油醚:二元胺型原酸酯單體摩爾比=1-2: I)攪拌均勻，無水無氧室溫條件下反應(yīng)48h ;將反應(yīng)產(chǎn)物裝入截止分子量為3000-4000的透析袋中，蒸餾水(其中加入0.01%三乙胺)透析24-48h ;精確量取ImL透析產(chǎn)品冷凍干燥，即得支化程度不同的系列聚合物。本發(fā)明提供的陽離子聚合物由乙二醇二縮水甘油醚和二元胺原酸酯單體聚合物而成，在兩者比例不同時(shí)，隨著乙二醇二縮水甘油醚摩爾比的增大，聚合物由線性結(jié)構(gòu)開始逐步交聯(lián)(支化)，最終形成三維立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。聚合物中所含氨基帶有正電荷，能夠壓縮DNA，形成納米級(jí)的復(fù)合物，使其可以將核酸遞送到細(xì)胞中。此聚合物中包含多胺及pH敏感原酸酯結(jié)構(gòu)，具有微酸響應(yīng)和降解可控的特點(diǎn)，使該聚合物作為基因載體可以使包裹的基因藥物易于從內(nèi)涵體和溶酶體中釋放，有利于提高轉(zhuǎn)染效率；其可降解性還使此聚合物具有良好的生物相容性，細(xì)胞毒性較不能 降解的PEI大大降低。本發(fā)明的聚合物既保留了和PEI相當(dāng)?shù)母咿D(zhuǎn)染效率，又大大降低了細(xì)胞毒性，且具備酸敏感和降解可控的特點(diǎn)。本發(fā)明提供了不同支化程度的聚合物，通過比較其性質(zhì)，得出結(jié)論:支化程度越高對(duì)DNA包裹能力就越大,但細(xì)胞毒性也相應(yīng)增大,轉(zhuǎn)染效率也會(huì)降低，因此選擇合適支化程度的聚合物才能獲得最高的轉(zhuǎn)染效率。


圖1為乙二醇二縮水甘油醚和二元胺原酸酯單體按照摩爾比為1: 1、1.5: I和
2: I的比例合成得到的聚合物1、2、3的示意圖。圖2為MTT法測(cè)定聚合物1、2、3細(xì)胞毒性示意圖；其中，圖2-2為2-1的局部放大圖；圖3為聚合物1、2、3和DNA以不同質(zhì)量比形成的復(fù)合物的凝膠電泳圖；圖4-1為聚合物1、2、3和DNA以不同質(zhì)量比形成的復(fù)合物的粒徑分析圖；圖4-2為聚合物1、2、3和DNA以不同質(zhì)量比形成的復(fù)合物的電位分析圖；圖5為聚合物1、2、3和DNA以不同質(zhì)量比形成的復(fù)合物的基因轉(zhuǎn)染情況具體實(shí)施例方式下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明。本發(fā)明不局限于如下實(shí)施例，在本發(fā)明權(quán)利要求所闡明的范圍內(nèi)，可對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種改變和等同替換。實(shí)施例1具有支化結(jié)構(gòu)的酸敏感陽離子聚合物基因載體的制備方法取乙二醇二縮水甘油醚0.283g置于雙頸瓶中，加入ImL DMF，攪拌溶解后，向其中加入0.5g 二元胺型酸敏感單體(即乙二醇二縮水甘油醚:二元胺型酸敏感單體摩爾比=
1: I)攪拌均勻，無水無氧室溫條件下反應(yīng)48h ;將反應(yīng)產(chǎn)物裝入截止分子量為3000-4000的透析袋中，蒸餾水(其中加入0.01%三乙胺)透析24-48h ;精確量取ImL透析產(chǎn)品冷凍干燥，稱取凍干后的質(zhì)量，即得到ImL透析溶液中聚合物的濃度。剩余量以液體形式冷凍保存。此聚合產(chǎn)物為聚合物I。取乙二醇二縮水甘油醚0.424g置于雙頸瓶中，加入ImL DMF，攪拌溶解后，向其中加入0.5g 二元胺型酸敏感單體(即乙二醇二縮水甘油醚:二元胺型酸敏感單體摩爾比=1.5: I)攪拌均勻，無水無氧室溫條件下反應(yīng)48h;將反應(yīng)產(chǎn)物裝入截止分子量為3000-4000的透析袋中，蒸餾水(其中加入0.01%三乙胺)透析24-48h ;精確量取ImL透析產(chǎn)品冷凍干燥，稱取凍干后的質(zhì)量，即得到ImL透析溶液中聚合物的濃度。剩余量以液體形式冷凍保存。此聚合產(chǎn)物為聚合物2。取乙二醇二縮水甘油醚0.565g置于雙頸瓶中，加入ImL DMF，攪拌溶解后，向其中加入0.5g 二元胺型酸敏感單體(即乙二醇二縮水甘油醚:二元胺型酸敏感單體摩爾比=
2: I)攪拌均勻，無水無氧室溫條件下反應(yīng)48h ;將反應(yīng)產(chǎn)物裝入截止分子量為3000-4000的透析袋中，蒸餾水(其中加入0.01%三乙胺)透析24-48h ;精確量取ImL透析產(chǎn)品冷凍干燥，稱取凍干后的質(zhì)量，即得到ImL透析溶液中聚合物的濃度。剩余量以液體形式冷凍保存。此聚合產(chǎn)物為聚合物3。如圖1所示，將二元胺型酸敏感單體與乙二醇二縮水甘油醚在不同的摩爾比的條件下，開環(huán)加成聚合，形成微觀結(jié)構(gòu)為線性、枝化或網(wǎng)狀型高聚物。當(dāng)兩者摩爾比為1:1時(shí)，聚合物主要以線性形式存在；隨著單體2的增加，線性聚合物間開始交聯(lián)(枝化)，從而形成網(wǎng)狀；當(dāng)單體1:單體2的摩爾比為1: 2，聚合物將形成三維立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(圖1)。實(shí)施例2以MTT法測(cè)定 聚合物的細(xì)胞毒性NIH/3T3細(xì)胞接種到96孔板中(I X IO4個(gè)/孔)，每孔加入含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基200 μ L37°C ,5% CO2條件下培養(yǎng)24h。棄培養(yǎng)基，向各孔加入180 μ L新鮮DMEM培養(yǎng)基及以20μ L以20mM HEPES溶液配置系列濃度的陽離子聚合物溶液，使聚合物終濃度為:lmg/mL、5mg/mL、10mg/mL、50mg/mL、100mg/mL、500mg/mL、1000mg/mL、5000mg/mLo 37 °C，5 %CO2條件下再培養(yǎng)24h。每孔加入階1'溶液(511^/1^)2(^1^，371:繼續(xù)培養(yǎng)411。終止培養(yǎng)，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，加入100 μ L 二甲基亞砜(DMSO)，輕輕震蕩lOmin。測(cè)定各孔于570nm的吸光值，計(jì)算細(xì)胞活性(見圖2)。如圖得知，聚合物1、2、3的隨著支化程度的提高，細(xì)胞毒性增加。但是聚合物1、2、3比PEI的細(xì)胞毒性小很多。PEI在濃度為25mg/mL的時(shí)候，細(xì)胞存活率為50%。而聚合物
1、2、3 分別在 3500mg/mL、1000mg/mL 和 275mg/mL 時(shí)，細(xì)胞存活率為 50%。實(shí)施例3復(fù)合物形成以綠色熒光蛋白質(zhì)粒pEG-Nl為研究對(duì)象考察DNA和陽離子聚合物的結(jié)合情況。提取純度> 95 %的pEG-Nl溶解于20mM HEPES溶液中，配置成0.1 μ g/ μ L的DNA儲(chǔ)液；用20mM HEPES溶液將聚合物1、2、3稀釋到合適濃度梯度。取50 μ L DNA儲(chǔ)液(即DNA量為5 μ g)，向其中加入50 μ L復(fù)合物梯度濃度溶液，使最終體積為100 μ L，并使DNA:聚合物(質(zhì)量比)分別為8: 1、4: 1、2: 1、1: 1、1: 2、1: 4、1: 8、1: 16。將復(fù)合物渦旋振蕩30s，室溫放置20min即得。
實(shí)施例4復(fù)合物的瓊脂糖凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)和DNase I對(duì)復(fù)合物的酶解分析按DNA:聚合物(質(zhì)量比)8: 1、4: 1、2: 1、1: 1、1: 2、1: 4、1: 8、1: 16配置復(fù)合物，每組中DNA量均為5 μ g，復(fù)合物終體積為100 μ Lo渦旋振蕩30s混勻復(fù)合物，室溫下靜止20min。取10 μ L復(fù)合物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)復(fù)合物阻滯程度(見圖3中(A))。利用DNase I酶考察復(fù)合物對(duì)DNA的包裹情況，反應(yīng)體系如下:復(fù)合物89 μ LDNase I buffer IOuLDNase IIyL (0.1U/ μ L)以上體系37°C保溫lOmin，取10 μ L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA降解程度(見圖3中(B))ο隨著聚合物質(zhì)量比的增大，可以逐漸和DNA形成穩(wěn)定的復(fù)合物。聚合物帶有不同程度的正電荷，可以屏蔽DNA磷酸基團(tuán)所帶的正電荷，在電場(chǎng)中不能呈現(xiàn)由負(fù)極向正極的移動(dòng)。即復(fù)合物在凝膠中的運(yùn)動(dòng)被阻滯。在穩(wěn)定的復(fù)合物中，聚合物/DNA的質(zhì)量比足夠大，可以完全包裹DNA，從而阻斷DNA降解酶DNase I對(duì)DNA的降解作用，使其不能被降解為< 200bp的彌散條帶。而未形成穩(wěn)定復(fù)合物的梯度中，DNA均被降解為< 200bp的彌散條帶?！と鐖D所示，polymerl:DNA ratio (W/W) >4:1時(shí)，可以形成穩(wěn)定的復(fù)合物。PoIymer2:DNA ratio (ff/ff) >2:1 時(shí),可以形成穩(wěn)定的復(fù)合物。PoIymer3:DNA ratio (ff/ff) >4:1 時(shí)，可以形成穩(wěn)定的復(fù)合物。實(shí)施例5復(fù)合物粒徑的測(cè)定和Zeta電位的測(cè)定按DNA:聚合物(質(zhì)量比)8: 1、4: 1、2: 1、1: 1、1: 2、1: 4、1: 8、1: 16
配置復(fù)合物，每組中DNA量均為5 μ g，復(fù)合物終體積為100 μ Lo渦旋振蕩30s混勻復(fù)合物，室溫下靜止20min。利用馬爾文粒徑及電位分析儀測(cè)定各復(fù)合物的粒徑(見圖4-1)和電位(見圖4-2)。如圖得知，當(dāng)聚合物1、2、3與DNA的質(zhì)量比為4: I及更高時(shí)，聚合物均可以壓縮DNA并形成穩(wěn)定的、直徑大小在150-250nm左右的復(fù)合物。并且隨著聚合物的質(zhì)量比的增大，復(fù)合物粒徑變小，當(dāng)質(zhì)量比達(dá)到16:1時(shí),粒徑可以達(dá)到150nm。在聚合物1、2、3形成的復(fù)合物中，聚合物2的粒徑最小，說明聚合物1、2、3均可以和DNA形成穩(wěn)定的復(fù)合物，其中聚合物2的對(duì)DNA的壓縮最為有效。實(shí)施例6體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)12孔板每孔接種50000個(gè)小鼠成纖維細(xì)胞NIH/3T3，37°C 5% C02培養(yǎng)24h。將質(zhì)粒DNA稀釋到合適濃度，使25 μ L的DNA溶液中含有2 μ gDNA。將聚合物稀釋到一定濃度，按DNA:聚合物(質(zhì)量比)1: 4、1: 8、1: 16、1: 32為梯度加入不同量的聚合物，使最終加入的聚合物體積為25 μ L ;將25 μ L聚合物加入到25 μ LDNA里面，吹打10次，以保證混合均勻；靜置30min。得到轉(zhuǎn)染復(fù)合物。取培養(yǎng)了 24h的細(xì)胞，吸除細(xì)胞培養(yǎng)上清，用PBS潤(rùn)洗兩遍，換上ImL無血清DMEM培養(yǎng)基；把復(fù)合物50 μ L加進(jìn)去，輕微晃動(dòng)，使復(fù)合物分散均勻；培養(yǎng)4個(gè)小時(shí)；吸除上清；用PBS潤(rùn)洗兩遍，然后換上全培養(yǎng)基培養(yǎng)24h。使用熒光顯微鏡觀察各孔的轉(zhuǎn)染效果。圖5中選取了 PE1、聚合物1、2、3較好轉(zhuǎn)染梯度:PEI/DNA =16: I (w/w)時(shí)，聚合物 1/DNA = 192: I (w/w)時(shí)，聚合物 2/DNA = 128: I (w/w)時(shí)，聚合物3/DNA = 64: I (w/w)時(shí)的轉(zhuǎn)染效果圖。有圖可知，PEI的毒性較大，在16: I時(shí)轉(zhuǎn)染效率最高，將PEI濃度再提高時(shí)，毒性過大，轉(zhuǎn)染效率下降。聚合物1、2、3的毒性較PEI小得多，圖中列出了聚合物1、2、3和DNA的質(zhì)量比達(dá)到192: 1、28: 1、64: I時(shí)的轉(zhuǎn)染效果，較PEI最佳的轉(zhuǎn)染效果好很多。說明本發(fā)明中聚合物在基因治療領(lǐng)域具有很好的應(yīng)用前景。另外，聚合物2的轉(zhuǎn)染效率最佳。說明聚合物2的結(jié)構(gòu)和支化程度最合適，既可以有效包裹DNA，又能有效釋放D N A，且細(xì)胞毒性也較低，是一個(gè)極具應(yīng)用的前景的聚合物。
權(quán)利要求
1.一種具有支化結(jié)構(gòu)的酸敏感陽離子聚合物基因載體，其特征是為該陽離子聚合物基因載體以乙二醇二縮水甘油醚和一種二元胺原酸酯單體(4，4’ - 二亞甲基氧-二-(2-氨基乙氧基-1，3-二氧戊烷))聚合而成。這種二元胺原酸酯單體的結(jié)構(gòu)為
2.如權(quán)利要求1所述的陽離子聚合物基因載體，其特征在于乙二醇二縮水甘油醚和一種二元胺原酸酯單體聚合而成，包含多胺及pH敏感原酸酯的結(jié)構(gòu)，具有微酸響應(yīng)和降解可控的特點(diǎn)；
3.如權(quán)利要求1所述的具有支化結(jié)構(gòu)的酸敏感陽離子聚合物基因載體的制備方法，其特征包括以下步驟:取乙二醇二縮水甘油醚溶于DMF中，向其中按摩爾比1: 1_2( 二元胺型酸敏感單體:乙二醇二縮水甘油醚)投入二元胺型酸敏感單體，攪拌均勻，無水無氧室溫條件下反應(yīng)48h ;將反應(yīng)產(chǎn)物裝入截止分子量為3000-4000的透析袋中，蒸餾水中(其中加入0.01%三乙胺)透析24-48h ;產(chǎn)物冷凍干燥后即得；
4.如權(quán)利要求3所述的具有支化結(jié)構(gòu)的酸敏感陽離子聚合物基因載體，其特征在于以乙二醇二縮水甘油醚和一種二元胺原酸酯單體聚合而成，并且乙二醇二縮水甘油醚和二元胺原酸酯單體在聚合時(shí)的比例不同，獲得的陽離子聚合物的結(jié)構(gòu)和支化程度便不同。當(dāng)二元胺型酸敏感單體(η = I)與乙二醇二縮水甘油醚摩爾比為1:1時(shí)，聚合物主要以線性形式存在；隨著乙二醇二縮水甘油醚的摩爾比增加，線性聚合物間開始交聯(lián)(支化)，從而形成網(wǎng)狀；當(dāng)二元胺型酸敏感單體和乙二醇二縮水甘油醚的摩爾比為1: 2，聚合物將形成三維立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；
5.權(quán)利要求1所述的具有支化結(jié)構(gòu)的酸敏感陽離子聚合物基因載體，其特征為用于非病 毒基因載體的用途；該載體為納米級(jí)，可以和基因藥物形成納米復(fù)合物，基因藥物包括DNA 或 RNA ；
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的納米級(jí)復(fù)合物的制備方法，其特征為:將權(quán)利要求1所述的陽離子聚合物和基因藥物(DNA/RNA)用去離子水溶解，混合，渦旋振蕩30s，室溫靜止30min,陽離子聚合物和DNA/RNA通過靜電結(jié)合自組裝成納米復(fù)合物；
7.如權(quán)利要求6所述的納米復(fù)合物，其特征在于用于將基因藥物有效遞送至細(xì)胞并有效釋放基因藥物。因?yàn)槠渚哂胁煌潭鹊闹ЩY(jié)構(gòu)，便于尋找不同基因藥物在傳遞和釋放兩方面的平衡點(diǎn)，從而滿足不同基因藥物的要求。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種以乙二醇二縮水甘油醚和一種二元胺原酸酯單體(4’-二亞甲基氧-二-(2-氨基乙氧基-1，3-二氧戊烷)為骨架，按摩爾比1∶1-2的比例聚合而成，不同比例聚合可以獲得不同支化程度的聚合物。此種聚合物具有支化結(jié)構(gòu)，酸敏感、降解可控，細(xì)胞毒性低、轉(zhuǎn)染效率高的特點(diǎn)。作為高效的基因載體在基因治療中具有廣泛的應(yīng)用前景。通過比較不同支化程度的聚合物的性質(zhì)(如DNA包裹能力和轉(zhuǎn)染效果)，為以后的基因載體研究提供了寶貴的經(jīng)驗(yàn)。
文檔編號(hào)A61K47/34GK103224610SQ201310150710
公開日2013年7月31日 申請(qǐng)日期2013年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月27日
發(fā)明者王睿, 唐汝培, 鞏凱 申請(qǐng)人:江南大學(xué)