用于治療過(guò)敏反應(yīng)的藥物組合物的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及藥物組合物，其由一種或多種制備物組成并包含生理學(xué)有效劑量的至少一種IL-4和/或IL-13抑制劑和至少一種過(guò)敏原，以及基質(zhì)，其中至少所述抑制劑是溶解或包埋于所述基質(zhì)上，或者至少所述抑制劑是包被的或吸附于所述基質(zhì)上，其中選擇所述基質(zhì)以使得所述抑制劑能夠延長(zhǎng)性釋放。
【專(zhuān)利說(shuō)明】用于治療過(guò)敏反應(yīng)的藥物組合物
發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及在體內(nèi)阻斷IL-4-和IL-13-介導(dǎo)途徑，和同時(shí)對(duì)T細(xì)胞進(jìn)行過(guò)敏原刺激以增加對(duì)過(guò)敏原臨床耐受的誘導(dǎo)的方法。
[0002]發(fā)明背景和現(xiàn)有技術(shù)
包括速發(fā)型(I型)超敏反應(yīng)在內(nèi)的過(guò)敏性疾病是由特定免疫系統(tǒng)的不平衡應(yīng)答導(dǎo)致的。在I型超敏反應(yīng)中，Th2細(xì)胞與過(guò)敏原呈遞細(xì)胞接觸后上調(diào)其表面上的⑶40配體。⑶40配體與B細(xì)胞上的⑶40的相互作用伴隨著Th2相關(guān)細(xì)胞因子如IL-4、IL-5和IL-13的產(chǎn)生，而且隨后免疫球蛋白的類(lèi)別轉(zhuǎn)換導(dǎo)致介導(dǎo)多種臨床癥狀的IgE抗體的產(chǎn)生。
[0003]但是，過(guò)敏原特異的Th2細(xì)胞的存在不足以使過(guò)敏反應(yīng)發(fā)生，因?yàn)檫@些細(xì)胞在健康個(gè)體中也存在。對(duì)于過(guò)敏反應(yīng)的發(fā)病機(jī)理來(lái)說(shuō)，重要的是能夠抑制Thl和Th2細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子表達(dá)，并能夠作用于抗原呈遞細(xì)胞(APC)的過(guò)敏原特異的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)的數(shù)量。
[0004]調(diào)節(jié)性T細(xì)胞被寬泛地分類(lèi)為自然T調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(nTreg)和誘導(dǎo)的或適應(yīng)性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(iTreg)。自然調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是自體抗原特異性的CD4+T細(xì)胞，其表達(dá)F0XP3轉(zhuǎn)錄因子和大量的CD24。它們?cè)谛叵僦斜贿x擇并在外周成為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。外周中的幼稚⑶4+Th細(xì)胞能夠發(fā)育成調(diào)節(jié)性T細(xì)胞并因此而被稱(chēng)為誘導(dǎo)的或適應(yīng)性調(diào)節(jié)T細(xì)胞。F0XP3轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)被認(rèn)為是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞誘導(dǎo)的關(guān)鍵因素。包括I型調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Trl)和Th3細(xì)胞的這些細(xì)胞能夠產(chǎn) 生IL-10或TGF-β或這二者，這些細(xì)胞通過(guò)它們行使其大部分抑制作用(其綜述參見(jiàn) Schmidt-Weber, 2005; Nandakumar 等，2009)。
[0005]調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對(duì)免疫應(yīng)答的抑制通過(guò)多種途徑發(fā)生(其綜述參見(jiàn)Schmidt-Weber,2005; Rouse, 2007; Nandakumar等，2009)。IL-10直接和間接地抑制肥大細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的活性。它還使IgG4升高。TGF-β是B細(xì)胞向IgA同種型的轉(zhuǎn)換和促進(jìn)因子，并因此控制外周耐受。最重要的是，TGF-β已被證明促進(jìn)F0XP3表達(dá)，并抑制Thl-驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)錄因子T-BET和Th2-驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)錄因子GATA-3。IL-10也被證明在體外促進(jìn)F0XP3表達(dá)，但是只有IL-4和IL-12被中和。這兩個(gè)細(xì)胞因子代表了 T-細(xì)胞分化的決定信號(hào)，且分別誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子GATA-3和T-BET。
[0006]通常，Treg-介導(dǎo)的抑制似乎是抗原特異性的，雖然負(fù)責(zé)的細(xì)胞因子被分泌并因此可能對(duì)于多種T細(xì)胞都是可用的。但是，最近的研究表明細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體可能成為APCs和T細(xì)胞之間形成的免疫突觸的一部分(其綜述參見(jiàn)Schmidt-Weber，2005)。因此，可溶性細(xì)胞因子可以以抗原特異性的方式穿梭到鄰近的細(xì)胞中，并且Tregs可以將特定的靶細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)應(yīng)答、無(wú)凋亡的狀態(tài)(無(wú)細(xì)胞免疫應(yīng)答)。
[0007]在促成過(guò)敏性炎癥發(fā)生的細(xì)胞因子中，IL-4和IL-13在哮喘和其它過(guò)敏性疾病的發(fā)病機(jī)理中起著關(guān)鍵作用。這兩個(gè)細(xì)胞因子代表著多效性細(xì)胞因子，并與IgE同種型轉(zhuǎn)換的誘導(dǎo)、通過(guò)B淋巴細(xì)胞的IgE的分泌，和通過(guò)上調(diào)B淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞上的IgE受體的IgE-介導(dǎo)應(yīng)答的增加相關(guān)。但是IL-4和IL-13還具有一些不同的不重疊的功能。例如，IL-4能夠驅(qū)動(dòng)幼稚Th細(xì)胞向Th2淋巴細(xì)胞分化，導(dǎo)致產(chǎn)生效應(yīng)物細(xì)胞因子例如IL-4、IL-5、IL-9和IL-13。IL-13對(duì)于上皮細(xì)胞的成熟、粘液的產(chǎn)生、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的生成、呼吸道平滑肌細(xì)胞收縮性的增加和嗜酸性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞的募集具有重要的作用。
[0008]IL-4通過(guò)與細(xì)胞表面特定的I型和II型受體相互作用行使其活性(其綜述參見(jiàn)Gessner 等，2000)。I 型受體包含 140 kDa 的結(jié)合鏈(Swiss Prot 登錄號(hào) P24394)、IL-4R α(也被稱(chēng)為⑶124)和由多個(gè)細(xì)胞因子受體共享的IL-2R的共用Y-鏈(Y。)。在沒(méi)有共用Y-鏈的情況下，IL-4可以使用II型IL-4受體，所述受體包含IL-4Rci和IL-13結(jié)合鏈，IL-13RQ I。這種受體復(fù)合物也是IL-13的功能性受體，并且這解釋了 IL-4和IL-13的大部分生物學(xué)效果的重疊，雖然這兩個(gè)細(xì)胞因子僅顯示出25%的同源性。I型受體復(fù)合物可以僅由IL-4形成，并似乎負(fù)責(zé)介導(dǎo)不表達(dá)IL-13Ra I的T細(xì)胞中的IL-4應(yīng)答。II型受體復(fù)合物可以由IL-4或IL-13形成并激活。I型受體復(fù)合物在造血細(xì)胞中占主導(dǎo)地位，而II型受體復(fù)合物在造血細(xì)胞和非造血細(xì)胞二者上表達(dá)。IL-4和IL-13與II型受體復(fù)合物的結(jié)合序列的不同之處在于，IL-4在結(jié)合第二亞基之前首先以高親和力與IL_4Ra結(jié)合，而IL-13首先以低親和力與IL-13Ra I結(jié)合，然后該復(fù)合物募集IL-4Ra形成高親和力的結(jié)合位點(diǎn)。
[0009]第二 IL-13結(jié)合蛋白，IL-13受體a 2 (IL-13Ra 2)，以高親和力結(jié)合IL-13，但不結(jié)合IL-4。但是，據(jù)信IL-13Ra 2是非信號(hào)傳導(dǎo)的，因此充當(dāng)誘餌受體。已證明用IFN-Y對(duì)上皮細(xì)胞的處理通過(guò)從胞內(nèi)儲(chǔ)存的轉(zhuǎn)移增加IL-13Ra 2的表面表達(dá)，表明IL_13Ra 2通過(guò)與IL-4Ra / IL-13Ra I復(fù)合物競(jìng)爭(zhēng)IL-13在應(yīng)答和調(diào)節(jié)Thl/Th2平衡中起著關(guān)鍵作用。
[0010]缺乏跨膜域和胞內(nèi)域的可溶性IL-4受體(sIL-4Ra )存在于生物流體中。然而sIL-4Ra的確切功能還有待闡明，它甚至可通過(guò)與細(xì)胞表面上的IL-13Ra I形成復(fù)合物來(lái)增強(qiáng)IL-13應(yīng)答，由此使IL-13和IL-13Ra I的弱相互作用穩(wěn)定。當(dāng)在支氣管成纖維細(xì)胞中進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，在對(duì)次優(yōu)劑量的IL-13的應(yīng)答中，sIL-4Ra的存在增加IL-13-刺激的嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子的產(chǎn)生。此外，sIL_4Ra可以作為載體蛋白，IL-4可以從其上隨時(shí)間解離。因此，sIL-4Ra可以為IL-4抵抗蛋白質(zhì)降解提供某種保護(hù)。
[0011]特異性免疫治療
特異性過(guò)敏原免疫治療(IT)是僅有的廣泛使用的療法，其能夠重建對(duì)于過(guò)敏原的臨床耐受，并與過(guò)敏原特異性Treg細(xì)胞的再誘導(dǎo)相關(guān)。對(duì)在健康個(gè)體對(duì)過(guò)敏原暴露的正常免疫應(yīng)答中的和在特異性免疫治療中的過(guò)敏原的外周耐受主要是足夠的Treg數(shù)量的結(jié)果。因此，在特應(yīng)性患者中，特異性免疫治療的主要原則是增加能夠控制過(guò)敏原特異性效應(yīng)物T細(xì)胞的Tregs的數(shù)量。
[0012]成功的IT伴隨著T細(xì)胞記憶由促過(guò)敏Th2表型向外周的產(chǎn)生IL-10的T細(xì)胞表型和除了 IL-10陽(yáng)性細(xì)胞之外也表現(xiàn)出F0XP3表達(dá)的局部表型的轉(zhuǎn)變。先前已證明免疫治療可以導(dǎo)致長(zhǎng)期受益，并且中斷后疾病緩解持續(xù)3年。然而，考慮到影響特異性免疫治療方法效果的各種因素，臨床結(jié)果在很大程度上有所不同并不令人驚訝。當(dāng)患者是針對(duì)季節(jié)性過(guò)敏原單獨(dú)致敏的，免疫治療有效，但是如果患者是特應(yīng)性的或者患者對(duì)長(zhǎng)期過(guò)敏原應(yīng)答，免疫治療則功效較低或無(wú)效。
[0013]一個(gè)問(wèn)題似乎是衍生自天然來(lái)源的過(guò)敏原提取物中的個(gè)別過(guò)敏原的量，這是因?yàn)樵谝恍┨崛∥镏?，重要的過(guò)敏原存在的量不夠。但是，成功的特異性免疫治療要求應(yīng)用高過(guò)敏原劑量以促進(jìn)已知作為IgE依賴性應(yīng)答的負(fù)反饋調(diào)節(jié)劑的低親和性的Fe ε RII (CD23)的結(jié)合。如果以足夠的量存在，則被施用的過(guò)敏原不僅被特異性IgE結(jié)合，還被其它免疫球蛋白類(lèi)別結(jié)合。在調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答和預(yù)防IgE-介導(dǎo)的應(yīng)答中，IgG與過(guò)敏原的復(fù)合物是重要的。已知存在三種類(lèi)型的Fe Y-受體。Fe YRI和Fe Y RIII，主要在髓系的細(xì)胞上表達(dá)，可以介導(dǎo)促炎性功能例如吞噬作用、抗體依賴性的細(xì)胞毒性和炎性介質(zhì)的釋放。Fe Y RII在髓細(xì)胞和淋巴細(xì)胞上表達(dá)，將抑制信號(hào)傳遞到細(xì)胞內(nèi)?；罨臉?shù)突細(xì)胞是強(qiáng)力的T-細(xì)胞刺激物，并表達(dá)抑制的和活化的Fe Y Rs 二者。鑒于這些事實(shí)，近來(lái)的進(jìn)展或用于特異性免疫治療的重組過(guò)敏原似乎是一種有前景的方法，因?yàn)樗鼈冊(cè)试S設(shè)計(jì)包含最適濃度的所有重要過(guò)敏原的過(guò)敏原組合物。此外，重組過(guò)敏原允許對(duì)它們的表面結(jié)構(gòu)進(jìn)行定點(diǎn)修飾以減少B細(xì)胞表位的密度。這種過(guò)敏原修飾的目的是減少過(guò)敏原性，同時(shí)保留其免疫原性。對(duì)具有大大降低的IgE反應(yīng)性的修飾的重組過(guò)敏原(其顯示線性T細(xì)胞表位的全譜，但與相應(yīng)的天然過(guò)敏原相比其表面結(jié)構(gòu)不同)的評(píng)價(jià)，證明這種分子能夠減少對(duì)天然過(guò)敏原的特異性的IgE發(fā)展(Niederberger 等，2004; Karamloo 等，2005)。
[0014]然而，盡管近來(lái)有所改進(jìn)，特異性免疫治療的效果還需要進(jìn)一步優(yōu)化。用于增加能夠控制過(guò)敏原特異性效應(yīng)物T細(xì)胞的Tregs的數(shù)量的合適方法還有待確定。因此本領(lǐng)域中需要確定影響Tregs誘導(dǎo)的關(guān)鍵因素，并需要設(shè)計(jì)更有效的過(guò)敏原耐受性治療。
[0015]本發(fā)明的技術(shù)問(wèn)題
因此，本發(fā)明的技術(shù)問(wèn)題是要提供用于治療過(guò)敏性反應(yīng)的方法，其中對(duì)過(guò)敏原的臨床耐受的誘導(dǎo)得到改善，特別是其中IL-3和/或IL-13抑制劑施用的系統(tǒng)性副作用被減少，并且與之結(jié)合，用于平衡特異性免疫系統(tǒng)應(yīng)答的T-細(xì)胞刺激被增強(qiáng)。特別是，該技術(shù)問(wèn)題是要提供藥物組合物，及其用途，制造這種組合物的方法以及實(shí)現(xiàn)這些目的的治療方法。 [0016]發(fā)明簡(jiǎn)述
為了解決這些技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了權(quán)利要求中所定義的主題。本發(fā)明在下面進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
[0017]在暴露于過(guò)敏原的健康個(gè)體的正常免疫應(yīng)答中以及在特異性免疫治療中，對(duì)過(guò)敏原的外周耐受主要由足夠的Treg數(shù)量導(dǎo)致。因此，特應(yīng)性患者中特異性免疫治療的主要原則是增加能夠控制過(guò)敏原特異性效應(yīng)物T細(xì)胞的Tregs的數(shù)量。在體外條件下，過(guò)敏原和缺乏Thl-或Th2-驅(qū)動(dòng)因子已被證明對(duì)于Tregs的誘導(dǎo)是必需的。由于IL-4和IL-13在過(guò)敏性炎癥的發(fā)展中具有重要的作用，本發(fā)明提供了在體內(nèi)同時(shí)抑制IL-4-和IL-13-介導(dǎo)效果，同時(shí)對(duì)T細(xì)胞進(jìn)行過(guò)敏原刺激以增加對(duì)過(guò)敏原的臨床耐受的誘導(dǎo)的方法。
[0018]優(yōu)選的適合于本發(fā)明方法的IL-4-和IL-13-介導(dǎo)效果抑制劑包括但不限于a)拮抗性IL-4和IL-13衍生物，b)可溶性11-4和IL-13受體構(gòu)建體，c)對(duì)IL-4和IL-13具有特異性能夠阻斷它們的生物學(xué)活性的單克隆抗體、其片段或其它蛋白質(zhì)構(gòu)建體，d)對(duì)IL-4和IL-13受體復(fù)合物具有特異性，能夠阻斷IL-4和IL-13與它們的受體亞基相互作用的單克隆抗體、其片段或其它蛋白質(zhì)構(gòu)建體，e)對(duì)IL-4和IL-13具有特異性能夠阻斷它們的生物學(xué)活性的適配體，和f)對(duì)IL-4和IL-13受體復(fù)合物具有特異性，能夠阻斷IL-4和IL-13與它們的受體亞基相互作用的適配體。
[0019]在一個(gè)實(shí)施方案中,本發(fā)明公開(kāi)了用于在過(guò)敏原呈遞部位對(duì)IL-4-和IL-13-介導(dǎo)效果進(jìn)行延長(zhǎng)性抑制并對(duì)過(guò)敏原進(jìn)行延長(zhǎng)性呈遞的方法。為了獲得在過(guò)敏原呈遞部位對(duì)IL-4-和IL-13-介導(dǎo)效果的有效的和延長(zhǎng)的抑制，本發(fā)明公開(kāi)了用于從位于過(guò)敏原呈遞部位的儲(chǔ)存庫(kù)持續(xù)釋放這種抑制劑或這種抑制劑的組合的方法。
[0020]在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明公開(kāi)了用于延長(zhǎng)性遞送T-細(xì)胞分化決定信號(hào)的抑制劑的基質(zhì)。優(yōu)選的基質(zhì)包括但不限于適合作為大量的這種抑制劑或抑制劑組合的儲(chǔ)存庫(kù)的生物可降解聚合物，其允許釋放足夠量的所述抑制劑或抑制劑組合以在延長(zhǎng)的一段時(shí)間中有效局部抑制IL-4-和IL-13-介導(dǎo)途徑，并且其與用于根據(jù)本發(fā)明方法的耐受性誘導(dǎo)的佐劑和一種或多種過(guò)敏原是化學(xué)和物理相容的。
[0021]在優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，生物可降解的可注射原位成型凝膠系統(tǒng)被用于IL-4-和IL-13-介導(dǎo)途徑抑制劑的控制釋放。這種原位成型凝膠系統(tǒng)(水凝膠)經(jīng)過(guò)溶膠-凝膠-溶膠的轉(zhuǎn)變，其在室溫下是是自由流動(dòng)的溶膠，并在體溫下是不流動(dòng)的凝膠。與其它生物可降解聚合物相比，可注射的熱膠凝聚合物具有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)，包括易于制備、對(duì)生物活性分子例如IL-4-和IL-13-介導(dǎo)途徑抑制劑的高封裝效率以及在制備過(guò)程中無(wú)有害的有機(jī)溶劑。
[0022]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明公開(kāi)了用于將IL-4-和IL-13-介導(dǎo)效果抑制劑的高局部濃度主要限制在過(guò)敏原呈遞部位以減少由于該抑制劑與遠(yuǎn)離過(guò)敏原呈遞部位的靶標(biāo)相互作用而引起的副作用。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，使用提供相對(duì)短的血清半衰期的IL-4-和IL-13-介導(dǎo)效果抑制劑，該血清半衰期足以使得該抑制劑在從位于過(guò)敏原呈遞部位的儲(chǔ)存庫(kù)釋放后有局部活性，且允許在從過(guò)敏原呈遞部位擴(kuò)散開(kāi)和運(yùn)送走的時(shí)候快速地從循環(huán)中被除去。提供這種特性的優(yōu)選的抑制劑包括但不限于a)具有< 15 kDa的分子量的拮抗性IL-4和IL-13衍生物，b)能夠抑制IL-4-和IL-13-介導(dǎo)效果的小抗體片段或其它蛋白質(zhì)構(gòu)建體，和c)能夠抑制IL-4-和IL-13-介導(dǎo)效果的小分子量適配體。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，使用的IL-4-和IL-13-介導(dǎo)效果抑制劑在它們從位于過(guò)敏原呈遞部位的儲(chǔ)存庫(kù)釋放后易于被內(nèi)源酶滅活，并且其可以根據(jù)本發(fā)明方法的需要被衍生化以調(diào)節(jié)它們對(duì)于酶失活的敏感性。提供這種特性的優(yōu)選的抑制劑包括但不限于適配體，其對(duì)于受內(nèi)源核酸酶降解的敏感性可以通過(guò)對(duì)堿基和骨架序列進(jìn)行化學(xué)修飾來(lái)調(diào)節(jié)。
[0023]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明公開(kāi)了適用于本發(fā)明方法的佐劑。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所使用的佐劑為要被施用的過(guò)敏原提供了儲(chǔ)存庫(kù)效果，且引發(fā)Th2-型免疫應(yīng)答。雖然主要引發(fā)Th2-型免疫應(yīng)答的佐劑可能干擾Tregs的誘導(dǎo)，在存在IL-4-和IL-13-介導(dǎo)途徑抑制劑的條件下，這種佐劑比那些主要引發(fā)Thl-型免疫應(yīng)答的佐劑更適合于本發(fā)明的治療目的。優(yōu)選的引發(fā)Th2-型免疫應(yīng)答的佐劑包括但不限于鋁鹽、Montanide乳劑(基于角鯊烯的油包水乳劑)和聚磷腈。引發(fā)組合的Thl-和Th2-型免疫應(yīng)答的佐劑也可用于本發(fā)明的方法，如果這些佐劑為包含一種或多種過(guò)敏原、佐劑、IL-4-和IL-13-介導(dǎo)途徑抑制劑和介導(dǎo)這些抑制劑的延長(zhǎng)性釋放的基質(zhì)的組合物提供了有利的性質(zhì)的話。引發(fā)組合的Thl-和Th2-型免疫應(yīng)答的佐劑包括但不限于基于角鯊烯的水包油乳劑、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)和基于菊粉和病毒顆粒的佐劑。
[0024] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明公開(kāi)了可用于本發(fā)明方法的疫苗組合物。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，疫苗組合物包含生物可降解的熱膠凝聚合物溶液，其含有一種或多種可溶性IL-4-和IL-13-介導(dǎo)途徑抑制劑。這種液體制劑在注射后，隨著制劑溫度上升至體溫，會(huì)自發(fā)地形成凝膠。因此，注射的凝膠形成不流動(dòng)的儲(chǔ)存庫(kù)，使一種或多種可溶的IL-4-和IL-13-介導(dǎo)途徑抑制劑從其中緩慢且持續(xù)地釋放幾天。組合物中IL-4-和IL-13-介導(dǎo)途徑抑制劑的量以這樣的方式平衡，在聚合物復(fù)合體(composit)在體溫下膠凝后，所釋放的抑制劑的量對(duì)于本發(fā)明方法的治療目的是足夠的。對(duì)于膠凝的聚合物復(fù)合體部位處的延長(zhǎng)性過(guò)敏原呈遞來(lái)說(shuō)，一種或多種過(guò)敏原或過(guò)敏原提取物被吸附到鋁鹽上或被乳化以形成基于角S烯的油包水乳劑(Montanide乳劑)，并被注射到膠凝的聚合物復(fù)合體附近。
[0025]在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，疫苗組合物包含生物可降解的熱膠凝聚合物溶液，該溶液含有一種或多種可溶性IL-4-和IL-13-介導(dǎo)途徑抑制劑和一種或多種過(guò)敏原(或過(guò)敏原提取物)，該過(guò)敏原(或過(guò)敏原提取物)被吸附到鋁鹽上、或被乳化以形成基于角鯊烯的油包水乳劑(Montanide乳劑)或與水溶性的聚磷腈聚合物佐劑預(yù)先混合。組合物中的每種組分的量以這樣的方式平衡:a)在注射到體內(nèi)后，該生物可降解的熱膠凝聚合物形成不流動(dòng)的凝膠，其它組分包埋于其中，以及b)在聚合物復(fù)合體在體溫下膠凝化之后，所釋放的組分的量對(duì)于本發(fā)明方法的治療目的是足夠的。
[0026]在又一個(gè)特定的技術(shù)方案中，疫苗組合物包含生物可降解的熱膠凝聚合物溶液，該溶液含有一種或多種過(guò)敏原(或過(guò)敏原提取物)、一種或多種可溶性佐劑(例如GM-CSF)和一種或多種可溶性IL-4-和IL-13-介導(dǎo)途徑抑制劑。組合物中的每種組分的量以這樣的方式平衡:a)在注射到體內(nèi)后，該生物可降解的熱膠凝聚合物形成不流動(dòng)的凝膠，其它組分包埋于其中，以及b)在聚合物復(fù)合體在體溫下膠凝化之后，所釋放的組分的量對(duì)于本發(fā)明方法的治療目的是足夠的。
[0027]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明公開(kāi)了用于將疫苗組合物摻入到適合于施用的藥物組合物中的方法。 [0028]在再一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明公開(kāi)了使用本發(fā)明的疫苗組合物誘導(dǎo)過(guò)敏原耐受的治療方法。
[0029]本發(fā)明的具體優(yōu)選實(shí)施方案隨著下面的更詳細(xì)描述和權(quán)利要求將會(huì)變得顯而易見(jiàn)。
[0030]發(fā)明詳述
基于現(xiàn)有的知識(shí)，過(guò)敏原耐受由外周誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞介導(dǎo)，如通過(guò)過(guò)敏患者外周血中產(chǎn)生過(guò)敏原特異性IL-1O的T細(xì)胞的不足所證明(其綜述參見(jiàn)Schmidt-Weber等，2005; Schmidt-Weber等，2006)。特應(yīng)性患者中特異性免疫治療的主要原則是增加能控制過(guò)敏原特異性效應(yīng)物T細(xì)胞的Tregs的數(shù)量。F0XP3轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)被認(rèn)為是誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的關(guān)鍵因素。我們和其它人已證明在人中TCR受體的觸發(fā)對(duì)于誘導(dǎo)F0XP3表達(dá)和抑制性T細(xì)胞是必需的(Schubert等，2001; Mantel等，2006)。我們證明由IL-4誘導(dǎo)的GATA3抑制F0XP3的表達(dá)，而F0XP3是誘導(dǎo)型Treg (iTreg)分化所需要的(Mantel等，2007)。我們已在體內(nèi)和體外證明了這種功能性拮抗作用，并且已確定了對(duì)此的機(jī)制基礎(chǔ)是GATA3以IL-4-依賴性的方式結(jié)合F0XP3啟動(dòng)子并隨后抑制F0XP3的轉(zhuǎn)錄。其結(jié)果是在產(chǎn)生過(guò)量IL-4的相關(guān)條件下，這種拮抗作用破壞對(duì)Tregs和耐受的誘導(dǎo)。
[0031]在體外條件下，抗原和Thl-或Th2_驅(qū)動(dòng)因子的缺乏已被證明對(duì)于Tregs的誘導(dǎo)是必需的。根據(jù)該觀察結(jié)果，已假設(shè)Tregs的產(chǎn)生代表了一種默認(rèn)途徑，其需要T-細(xì)胞受體活化，正如任何其它T-細(xì)胞分化那樣，但是需要缺少效應(yīng)物T細(xì)胞的決定信號(hào)。但是，已知在過(guò)敏原注射后，由于Th2記憶T細(xì)胞的活化，IL-4局部釋放，并且IL-4在接種過(guò)程中還會(huì)持續(xù)釋放。因此，在本發(fā)明中，所設(shè)計(jì)的方法在體內(nèi)阻斷IL-4-介導(dǎo)途徑和同時(shí)對(duì)T細(xì)胞進(jìn)行過(guò)敏原刺激，以增加對(duì)過(guò)敏原臨床耐受的誘導(dǎo)。
[0032]由于已知IL-13也與IgE同種型轉(zhuǎn)換的誘導(dǎo)、通過(guò)B淋巴細(xì)胞的IgE的分泌和IgE介導(dǎo)應(yīng)答的增強(qiáng)有關(guān)，本發(fā)明的方法還包括在體內(nèi)阻斷IL-13-介導(dǎo)途徑和同時(shí)對(duì)T細(xì)胞進(jìn)行過(guò)敏原刺激。雖然T細(xì)胞缺少I(mǎi)L-13結(jié)合受體成分且對(duì)IL-13不應(yīng)答，幾項(xiàng)研究表明IL-13的阻斷能進(jìn)一步增加對(duì)過(guò)敏原臨床耐受的誘導(dǎo)。
[0033]最重要的是，本發(fā)明公開(kāi)了用于延長(zhǎng)性抑制IL-4-和IL-13-介導(dǎo)效果并同時(shí)延長(zhǎng)過(guò)敏原呈遞的方法。由于T細(xì)胞分化以及由此的免疫記憶的發(fā)展需要T細(xì)胞受體(TCR)結(jié)合經(jīng)過(guò)12-48 h，并且長(zhǎng)期持續(xù)記憶可能甚至需要重復(fù)的暴露，因此過(guò)程的延長(zhǎng)是必要的。相應(yīng)地，對(duì)IL-4-和IL-13-介導(dǎo)效果的抑制需要至少在與過(guò)敏原從注射的過(guò)敏原-佐劑復(fù)合物中被釋放的時(shí)間相同的時(shí)間階段中，最有可能是與其一樣長(zhǎng)的時(shí)間中有效。否則，所釋放的過(guò)敏原分子可能誘導(dǎo)Th2-驅(qū)動(dòng)因子，從而抑制Tregs的誘導(dǎo)。本發(fā)明公開(kāi)了用于從位于過(guò)敏原呈遞部位的儲(chǔ)存庫(kù)中穩(wěn)定釋放IL-4-和IL-13-介導(dǎo)效果抑制劑的方法。
[0034]本發(fā)明還公開(kāi)了用于在過(guò)敏原呈遞部位建立高局部濃度的IL-4-和IL-13-介導(dǎo)效果抑制劑的方法，這與抑制劑的延長(zhǎng)的存在同樣重要。由于IL-4可以抗原特異性的方式穿梭到抗原呈遞細(xì)胞和T細(xì)胞之間形成的免疫突觸中，在免疫突觸微環(huán)境中對(duì)IL-4-介導(dǎo)效果的有效抑制需要高的局部抑制劑濃度。雖然T細(xì)胞不表達(dá)IL-13Ra 1，介導(dǎo)IL-13-誘導(dǎo)效果的II型受體復(fù)合物在與抗原呈遞細(xì)胞和T細(xì)胞之間形成的免疫突觸緊鄰的造血細(xì)胞和非造血細(xì)胞二者上表達(dá)。因此，可以假設(shè)對(duì)IL-13-介導(dǎo)效果的有效抑制也需要高的局部抑制劑濃度。
[0035]然而，抑制 劑的高局部濃度通過(guò)全身施用非常難以實(shí)現(xiàn)，而且大劑量的治療常常伴隨著增強(qiáng)的副作用。例如，IL-4突變蛋白IL-4/Y124D (位點(diǎn)124的酪氨酸替換為天冬氨酸)以與野生型IL-4同樣的親和力與IL-4Ra結(jié)合，但是僅有0.5%的激動(dòng)活性(Letzelter等，1998)。這種IL-4突變蛋白是IL-4-介導(dǎo)效果的強(qiáng)有力的抑制劑，但是在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中已證明IL-4/Y124D在全身施用后顯示出急性毒性，與野生型IL-4在猴中類(lèi)似。與野生型IL-4-和IL-4/Y124D-介導(dǎo)的毒性相關(guān)的細(xì)胞事件包括VCAM-1 (血管細(xì)胞黏附分子I)的上調(diào)、血清中MCP-1 (單核細(xì)胞趨化蛋白I)的上調(diào)、循環(huán)單核細(xì)胞的增加連同循環(huán)淋巴細(xì)胞的同時(shí)減少，和紅細(xì)胞壓積的增加(W0 97/47744)。在人中使用IL-4的臨床試驗(yàn)中已觀察到在全身施用后有類(lèi)似的細(xì)胞運(yùn)輸(Wong等，1992)。這些結(jié)果表明IL-4/Y124D的這些毒性是由除了 T細(xì)胞之外的細(xì)胞介導(dǎo)的激動(dòng)劑活性造成的。根據(jù)已知的IL-4對(duì)于內(nèi)皮細(xì)胞的效果，所觀察到的IL-4/Y124D的毒性表明這種IL-4突變蛋白與內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)的新的IL-4受體復(fù)合物之間有相互作用(W0 97/47744)。這個(gè)實(shí)例證明有必要將IL-4-和IL-13-介導(dǎo)效果抑制劑的高局部濃度主要限制在過(guò)敏原呈遞部位。
[0036]本發(fā)明的方法通過(guò)公開(kāi)使用具有相對(duì)短的半衰期的IL-4-和IL-13-介導(dǎo)效果抑制劑的方法解決該問(wèn)題。這種抑制劑在從過(guò)敏原呈遞部位的儲(chǔ)存庫(kù)釋放后具有局部活性，并在其從過(guò)敏原呈遞部位被擴(kuò)散開(kāi)和運(yùn)送走的時(shí)候從循環(huán)中被快速除去。例如，美國(guó)專(zhuān)利6，028，176和6，313，272公開(kāi)了具有強(qiáng)拮抗活性但是在體內(nèi)具有大約3_6小時(shí)的相對(duì)短的血漿半衰期的IL-4突變蛋白。
[0037]因此，本發(fā)明公開(kāi)的方法提供了在過(guò)敏原呈遞部位的延長(zhǎng)時(shí)間階段的高局部濃度的抑制劑，而且由于其快速清除，其伴隨從過(guò)敏原呈遞部位向外的有限半徑的抑制活性。因此，抑制劑介導(dǎo)的可能的副作用被顯著減少。
[0038]1.T-細(xì)胞分化決定信號(hào)的抑制劑
對(duì)于本發(fā)明來(lái)說(shuō)，用于IL-4和IL-13的效果的局部抑制的幾個(gè)方法(principles)是合適的(其綜述參見(jiàn)Long，2009)。優(yōu)選的方法包括但不限于拮抗性細(xì)胞因子衍生物、可溶性細(xì)胞因子受體構(gòu)建體、單克隆抗體、其片段或者對(duì)IL-4和IL-13或它們各自的受體具有特異性的其它蛋白質(zhì)構(gòu)建體、以及抗細(xì)胞因子和抗細(xì)胞因子受體的適配體的施用?？梢允褂萌魏巫鳛镮L-4、IL-13或IL-4/IL-13拮抗劑發(fā)揮作用并適合于根據(jù)本發(fā)明方法施用的化合物。拮抗劑不需要完全破壞IL-4-或IL-13-誘導(dǎo)的生物學(xué)活性才是有用的。更確切地說(shuō)，所給出的拮抗劑可以降低IL-4和/或IL-13的生物學(xué)活性。在本發(fā)明的方法和組合物中可以使用兩種或更多種拮抗劑的組合。
[0039]最優(yōu)選的IL-4和IL-13抑制劑是那些a)提供小到中等分子大小并在水性環(huán)境中具有高溶解性以快速擴(kuò)散到免疫突觸中的，b)可以大量包埋在適合于在延長(zhǎng)的時(shí)間中持續(xù)釋放抑制劑的基質(zhì)中的，c)可以從形成儲(chǔ)存庫(kù)的基質(zhì)中足量釋放以在過(guò)敏原呈遞部位提供高局部濃度的，和d)具有相對(duì)短的血漿半衰期以減少由于抑制劑和遠(yuǎn)離過(guò)敏原呈遞位點(diǎn)的靶標(biāo)的相互作用而導(dǎo)致的可能的副作用的抑制劑。
[0040]可用于本發(fā)明的治療目的的絕大部分抗IL-4和抗IL-13的方法(principles)已被公開(kāi)并在用于治 療哮喘的動(dòng)物模型和臨床試驗(yàn)中進(jìn)行評(píng)價(jià)(其綜述參見(jiàn)Long，2009)。但是，根據(jù)本發(fā)明方法的這些抑制劑的應(yīng)用還未被公開(kāi)。
[0041]許多IL-4-和IL-13-介導(dǎo)途徑抑制劑，包括拮抗性細(xì)胞因子衍生物、可溶性細(xì)胞因子受體構(gòu)建體、抗細(xì)胞因子和抗細(xì)胞因子受體的抗體，已被開(kāi)發(fā)以在哮喘患者中中斷或減少Th2依賴性的過(guò)敏性炎癥。治療的目的是使患者的免疫應(yīng)答向細(xì)胞毒性T-細(xì)胞-介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，例如以Thl-型免疫表型為特征的免疫應(yīng)答轉(zhuǎn)變。相反，本發(fā)明的治療目的不是由Th2-型免疫表型向Thl-型免疫表型轉(zhuǎn)變，而是在不含Thl-或Th2-驅(qū)動(dòng)因子的局部微環(huán)境中誘導(dǎo)Tregs，盡管存在引發(fā)Th2-型免疫應(yīng)答的過(guò)敏原和佐劑。
[0042]除了用于治療哮喘的應(yīng)用外，專(zhuān)利WO 2009/081 201 A2公開(kāi)了 IL_4Ra抑制劑的臨床應(yīng)用，其用于a)過(guò)敏反應(yīng)的治療以抑制IgE合成(包括例如特應(yīng)性皮炎和食物過(guò)敏)，
b)移植的治療以防止移植排斥，和c)抑制遲發(fā)型超敏反應(yīng)或接觸性超敏反應(yīng)。但是，所提出的臨床應(yīng)用的細(xì)節(jié)尚未被公開(kāi)。
[0043]通常，已公開(kāi)的IL-4抑制的應(yīng)用中的基本原理是患者的Th2_型免疫應(yīng)答向Thl-型免疫應(yīng)答的轉(zhuǎn)變。例如，IL-4-介導(dǎo)途徑抑制劑用于癌癥治療的應(yīng)用是基于這樣的設(shè)想，促進(jìn)Thl-型免疫應(yīng)答有時(shí)對(duì)于患者是有利的(W0 02/04009 A2)。而且，美國(guó)專(zhuān)利No2011/0002013 Al公開(kāi)了 IL-4拮抗劑可用作過(guò)敏反應(yīng)免疫治療的佐劑和疫苗的佐劑，特別是當(dāng)引導(dǎo)指向Thl應(yīng)答的免疫應(yīng)答對(duì)所討論的疾病的治療或預(yù)防將會(huì)有益時(shí)。所建議的IL-4拮抗劑作為過(guò)敏反應(yīng)免疫治療的佐劑的應(yīng)用的細(xì)節(jié)也未被公開(kāi)。
[0044]I1.白介素變體對(duì)T-細(xì)胞分化決定信號(hào)的抑制
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，能拮抗IL-4和IL-13活性的白介素變體被用作抑制劑?？梢允褂萌魏巫鳛镮L-4、IL-13或IL-4/IL-13拮抗劑發(fā)揮作用并適合用于根據(jù)本發(fā)明方法施用的白介素變體?；诎捉樗氐霓卓箘┎恍枰耆茐腎L-4-或IL-13-誘導(dǎo)的生物學(xué)活性才是有用的。更確切地說(shuō)，所給出的拮抗劑可以降低IL-4和/或IL-13的生物學(xué)活性。
[0045]拮抗性IL-4突變體已有描述(Kruse等，1992; Muller等，1994;美國(guó)專(zhuān)利6，028，176;美國(guó)專(zhuān)利5，723，118)。在人IL-4的四個(gè)螺旋束中，D螺旋上的酪氨酸(Y124)形成與共用Y-鏈(Y。)的重要接觸。當(dāng)Y124突變?yōu)樘於彼?Y124D)時(shí)，得到的分子以與野生型IL-4相同的親和性與IL-4Ra結(jié)合，但是僅具有0.5%的激動(dòng)活性(Letzelter等，1998)。類(lèi)似地，人IL-4的121位點(diǎn)的精氨酸與IL_13Ra I相互作用。R121突變產(chǎn)生的突變體可以結(jié)合IL-4Ra，但是是IL-4-和IL-13-誘導(dǎo)應(yīng)答二者的拮抗劑(Kruse等，1993)。但是，也可以考慮通過(guò)IL-4的其它突變或者額外突變產(chǎn)生適用于本發(fā)明方法的IL-4變體。例如，通過(guò)IL-4的125位點(diǎn)的絲氨酸的突變，產(chǎn)生能夠結(jié)合IL-4Ra的突變體，但是是IL-4-和IL-13-誘導(dǎo)應(yīng)答二者的拮抗劑(Kruse等，1993)。適用于本發(fā)明方法的是具有單突變、雙突變和三突變的拮抗性白介素-4變體，單突變包括但不限于氨基酸位點(diǎn)R121、Y124和S125 ;雙突變和三突變包括但不限于上列氨基酸位點(diǎn)的組合。優(yōu)選的是具有相對(duì)短的半衰期的拮抗性IL-4變體，以限制遠(yuǎn)離過(guò)敏原呈遞部位的副作用。
[0046]已證明當(dāng)皮下施用或通過(guò)霧化吸入施用時(shí)，人IL-4的雙突變體(R121D/Y124D)保護(hù)過(guò)敏性食蟹猴免于遭受過(guò)敏原誘導(dǎo)的呼吸道高反應(yīng)性。進(jìn)一步，將這種雙突變體在猴中皮下施用6周或更長(zhǎng)時(shí)間減少皮膚風(fēng)疫(wheal)反應(yīng)和過(guò)敏原特異性IgE的循環(huán)濃度。最近在臨床研究中已經(jīng)評(píng)價(jià)了 IL-4的雙突變體(R121D/Y124D)對(duì)于哮喘患者中對(duì)過(guò)敏原激發(fā)的晚期哮喘反應(yīng)的效果(Wenzel等，2007)。該研究證明對(duì)IL-4和IL-13的雙重抑制可以積極影響實(shí)驗(yàn)性過(guò)敏原激發(fā)之后的晚期哮喘反應(yīng)進(jìn)程。在患有特應(yīng)性哮喘或特應(yīng)性濕疹的參與者中，使用雙突變體進(jìn)行的治療幾乎不伴有不良事件，無(wú)論是通過(guò)皮下注射(至多30mg，進(jìn)行至多13周)還是通過(guò)吸入(至多60mg，進(jìn)行至多4周)施用。但是，應(yīng)當(dāng)強(qiáng)調(diào)，根據(jù)本發(fā)明方法的這種雙突變體在過(guò)敏反應(yīng)免疫治療中的應(yīng)用還未被公開(kāi)。
[0047]超過(guò)10年前，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明在體內(nèi)IL-4/I1-13受體系統(tǒng)的抑制可以完全消除對(duì)過(guò)敏原的體液免疫應(yīng)答和過(guò)敏癥狀的發(fā)生(Grunewald等，1999)。在用卵清蛋白(OVA)免疫小鼠之前和之后用小鼠IL-4突變體Q116D/Y119D (人IL-4雙突變體R121D/Y124D的小鼠等價(jià)物)處理BALB/c小鼠完全抑制OVA-特異性IgE和IgGl的合成。此外，特異性IgG2a、IgG2b和IgG3的合成被抑制，這可以指示對(duì)OVA的耐受的發(fā)生。通過(guò)在存在Alum作為佐劑的條件下腹腔注射10 μ g OVA進(jìn)行免疫。在第O天，在OVA免疫前和免疫后2小時(shí)通過(guò)腹腔注射施用小鼠IL-4突變體，每次劑量50 μ go從第I至8天，繼續(xù)每天兩次腹腔注射30 μ g突變體進(jìn)行處理。作者推斷小鼠IL-4突變體Q116D/Y119D在體內(nèi)抑制抗原特異性體液免疫應(yīng)答和由IgE或IgGl介導(dǎo)的過(guò)敏性癥狀，并且因此對(duì)于特應(yīng)性病癥和其它Th2-主導(dǎo)的疾病的治療應(yīng)當(dāng)是有利的。雖然該研究的結(jié)果接近于本發(fā)明的方法和治療目的，Grunewald等(1999)的研究沒(méi)有公開(kāi)如何在在過(guò)敏原呈遞部位在延長(zhǎng)時(shí)間階段內(nèi)提供高局部濃度的抑制劑，同時(shí)由于其快速清除，具有離開(kāi)過(guò)敏原呈遞部位的有限半徑的抑制活性。Grunewald等(1999)報(bào)道了通過(guò)在用OVA免疫之前開(kāi)始應(yīng)用小鼠IL-4突變體Q116D/Y119D從而對(duì)OVA過(guò)敏原耐受的明顯誘導(dǎo),這與對(duì)于已存在過(guò)敏反應(yīng)的患者的免疫治療不能相比。對(duì)于在具有Th2-型免疫表型的個(gè)體中對(duì)過(guò)敏原耐受的誘導(dǎo)來(lái)說(shuō)，僅有本發(fā)明的方法能提供了合適的方法，以確保在不含Thl-或Thr-驅(qū)動(dòng)因子的局部微環(huán)境中充分誘導(dǎo)Tregs ，盡管存在過(guò)敏原。[0048]可用于本發(fā)明方法的IL-13突變體包括但不限于IL-13突變體E13K，它是人IL-13的強(qiáng)有力的拮抗劑，并且還能部分抑制人IL-4的應(yīng)答(K1i等，2004)。IL-13第13位的谷氨酸與IL-4Ra結(jié)合，且將其突變?yōu)橘嚢彼峤档推渑cIL_4Ra的結(jié)合。雖然IL-13E13K防止IL-4Ra與IL_13Ra I結(jié)合，但由于可利用可選的IL-4R復(fù)合物，IL-4Ra: Y。，無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)IL-4應(yīng)答的完全抑制。
[0049]在優(yōu)選的實(shí)施方案中，人IL-4雙突變體R121D/Y124D被用于根據(jù)本發(fā)明的方法進(jìn)行對(duì)IL-4-和IL-13-介導(dǎo)途徑的抑制。人IL-4雙突變體能夠拮抗IL-4的活性以及IL-13的活性(Grunewald 等，1998; Tony 等，1994)。
[0050]II1.可溶性細(xì)胞因子受體構(gòu)建體對(duì)T-細(xì)胞分化決定信號(hào)的抑制
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，可溶性細(xì)胞因子受體構(gòu)建體被用于本發(fā)明的方法，以抑制IL-4-和IL-13-介導(dǎo)途徑。優(yōu)選的構(gòu)建體包括但不限于IL-4Rci的可溶性胞外域，及其保留有IL-4結(jié)合能力的變體、片段和衍生物。人以及小鼠IL-4受體和它們的核苷酸序列已有描述(美國(guó)專(zhuān)利 5，599，905; Idzerda 等，1990 (人 IL-4 受體);Mosley 等，1989 (小鼠IL-4受體))。編碼的人IL-4受體包含N-末端信號(hào)肽，后面接著是胞外域、相應(yīng)于氨基酸208-381的跨膜區(qū)域和相應(yīng)于氨基酸232-800的胞質(zhì)區(qū)。由可變mRNA構(gòu)建體，例如可以是由于轉(zhuǎn)錄后的不同mRNA剪接事件產(chǎn)生的構(gòu)建體，和產(chǎn)生能結(jié)合IL-4的多肽的構(gòu)建體，產(chǎn)生的IL-4受體多肽屬于本文所公開(kāi)的IL-4受體多肽。IL-4受體變體包括那些具有通過(guò)一個(gè)或多個(gè)取代、缺失或插入而不同于天然序列，但保留了 IL-4受體蛋白的生物學(xué)活性的氨基酸或核苷酸序列的變體。本發(fā)明還包括具有或不具有相關(guān)的天然糖基化模式的IL-4受體蛋白。糖基化模式可以根據(jù)用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞的類(lèi)型而有所不同。另一種選擇是通過(guò)定點(diǎn)突變使N-糖基化位點(diǎn)失活。IL-4受體蛋白的衍生物包括那些與天然蛋白相比顯示出不同結(jié)構(gòu)，具有衍生化氨基酸(例如通過(guò)交聯(lián)試劑，或聚乙二醇)的衍生物。
[0051]在另一個(gè)實(shí)施方案中，IL-4Ra的可溶性胞外域、其保留有結(jié)合IL_4能力的其變體、片段和衍生物與其它蛋白質(zhì)或多肽的N-末端或C-末端化學(xué)綴合或融合。優(yōu)選的IL-4受體融合蛋白或多肽包括但不限于利于純化(例如His-標(biāo)簽)或識(shí)別(例如Flag肽)的肽，和具有促進(jìn)寡聚化的性質(zhì)的蛋白質(zhì)或肽(例如亮氨酸拉鏈)。在優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，IL-4Ra的可溶性胞外域與任何同種型的人免疫球蛋白的Fe部分或選定的恒定域，或它們的能夠二聚化的片段融合。如果融合蛋白由抗體的重鏈和輕鏈二者組成，則可能形成IL-4受體的多達(dá)四個(gè)胞外域的寡聚物。優(yōu)選的構(gòu)建體還包括異源寡聚物，其中IL-4Ra的可溶性胞外域和IL_13Ra I的可溶性胞外域與能夠寡聚化的人蛋白或多肽融合。
[0052]在適用于本發(fā)明方法的基于細(xì)胞因子受體的抑制劑中，包含IL-4Rci的可溶性胞外域和IL-13Ra I的可溶性胞外域二者的異二聚體是最優(yōu)選的。競(jìng)爭(zhēng)性抑制IL-4與其受體結(jié)合的由人IL-4R-a鏈(shIL-4R)的胞外部分組成的可溶性IL-4受體片段在早期人的研究中似乎很有前景(Borish等，2001)。但是，隨后的大規(guī)模臨床試驗(yàn)表明這種試劑在哮喘中沒(méi)有臨床效果。這種欠佳的應(yīng)答可以是由于shIL-4R和IL-13Ra I在細(xì)胞表面形成復(fù)合物，由此使IL-13和IL-13Ra I的弱相互作用穩(wěn)定，導(dǎo)致增強(qiáng)的IL-13應(yīng)答所造成的。為了抑制IL-4-和IL-13-介導(dǎo)應(yīng)答二者，已產(chǎn)生了可溶的異二聚受體構(gòu)建體，其包含IL-4R a和IL-13Ra I的胞外域，二者與人IgGl的Fe部分融合(Economides等，2003)。這種異二聚構(gòu)建體以高親和力與IL-4和IL-13結(jié)合。IL-13以低親和力與未復(fù)合的IL_13Ra I結(jié)合，但I(xiàn)L-13Ra I和IL_4Ra的復(fù)合物形成對(duì)IL-13的高親和力結(jié)合位點(diǎn)，且IL-4甚至以高親和力與未復(fù)合的IL-4Ra結(jié)合(Andrews等，2006)。根據(jù)本發(fā)明方法的為IL-13和IL-4提供結(jié)合位點(diǎn)的異二聚構(gòu)建體在過(guò)敏反應(yīng)免疫治療中的應(yīng)用還未公開(kāi)。
[0053]IV.抗體對(duì)T-細(xì)胞分化決定信號(hào)的抑制
在另一個(gè)實(shí)施方案中，作為IL-4或IL-13拮抗劑的抗體被用于本發(fā)明的方法?？贵w優(yōu)選是單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段。有利地，使用人源化或嵌合單克隆抗體。最優(yōu)選的是人單克隆抗體。合適的抗體的實(shí)例是與IL-4或IL-13分別和IL-4受體或IL-13受體的結(jié)合相互作用的那些抗體。這些抗體，本文中稱(chēng)為阻斷抗體，可以針對(duì)細(xì)胞因子IL-4和IL-13或細(xì)胞因子受體IL-4Rci和IL-13Rci I產(chǎn)生，并且可以在常規(guī)測(cè)定中篩選其干擾IL-4和IL-13與它們各自的受體亞基結(jié)合的能力。這些抗體的抗原結(jié)合片段，包括Fab和F (ab’)2或人工抗體構(gòu)建體例如scFv或其它蛋白質(zhì)構(gòu)建體例如anticalins也適用于本發(fā)明的方法。其它實(shí)施方案包括嵌合抗體和其抗原結(jié)合片段，例如小鼠單克隆抗體的人源化形式，和人單克隆抗體及其抗原結(jié)合片段。
[0054]在優(yōu)選的實(shí)施方案中，具有對(duì)IL-4和IL-13的特異性能夠阻斷這兩種細(xì)胞因子的生物活性的兩種或更多種人源化或人單克隆抗體的組合被用于本發(fā)明的方法。根據(jù)本發(fā)明的方法，這兩個(gè)細(xì)胞因子的生物活性需要被阻斷，以在過(guò)敏原呈遞部位創(chuàng)造不含Th1-或Th2-驅(qū)動(dòng)因子的局部微環(huán)境。
[0055]能阻斷IL-4和IL-13的生物學(xué)活性的合適的單克隆抗體最近已有綜述(Holgate等，2008; Long, 2009)。例如,抗IL-4人源化單克隆抗體pascolizumab已被證明在體外有效阻斷IL-4應(yīng)答(Hart等，2002)。雖然這種抗體在對(duì)哮喘的治療中僅產(chǎn)生平常的結(jié)果，但它對(duì)于本 發(fā)明的方法來(lái)說(shuō)可能是一種有發(fā)展前景的候選物。IL-13與IL-4Ra的結(jié)合可以被完全人源化的單克隆IgGl抗體IMA-638有效阻斷，并且IL-13和IL_13Ra I的相互作用可以被完全人源化的單克隆IgGl抗體IMA-026抑制(Gauvreau等，2010)。這兩種抗體在食蟹猴的哮喘的治療中都表現(xiàn)出效果，但是只有IMA-638能夠在II期臨床研究中減少早期和晚期兩者的哮喘反應(yīng)(Gauvreau等，2010)。根據(jù)本發(fā)明方法的這些抗體，其片段和人工構(gòu)建體，以及其它抗細(xì)胞因子的蛋白質(zhì)構(gòu)建體在過(guò)敏反應(yīng)免疫治療中的應(yīng)用未曾被公開(kāi)。
[0056]在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，能夠使細(xì)胞因子受體失活的抗體被用于抑制IL-4-和IL-13-介導(dǎo)途徑。優(yōu)選的是對(duì)IL-4Ra具有特異性能夠阻斷IL-4和IL-13 二者的生物學(xué)活性的人源化或人單克隆抗體。例如，完全人的單克隆IgG2抗體AMG317以高親和力(Kd = 1.8 X 1^10 M)與IL-4Ra結(jié)合，且有力地阻斷IL-4和IL-13 二者的生物學(xué)活性(Corren等，2010)。而且，AMG317已被證明在體外對(duì)炎癥具有重要作用。雖然在II期研究中，在患有哮喘的患者中，AMG317未證明對(duì)于整個(gè)群體的患者具有臨床效果(Corren等，2010)，但對(duì)于本發(fā)明的方法來(lái)說(shuō)，該抗體提供了優(yōu)選的性質(zhì)。但是，應(yīng)當(dāng)強(qiáng)調(diào)，根據(jù)本發(fā)明方法的該抗體和其它抗細(xì)胞因子受體的抗體，其片段和人工構(gòu)建體，以及其它抗細(xì)胞因子受體的蛋白質(zhì)構(gòu)建體在過(guò)敏反應(yīng)免疫治療中的應(yīng)用未曾被公開(kāi)。
[0057]V.適配體對(duì)T-細(xì)胞分化決定信號(hào)的抑制
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，適配體被用于抑制IL-4-和IL-13-介導(dǎo)途徑。適配體是通過(guò)多輪體外選擇產(chǎn)生的核酸結(jié)合體(其綜述參見(jiàn)Famulok等，1999; Yan等，2005)。典型地，所選擇的適配體與其靶標(biāo)非常緊密地(通常是在低的納摩爾的范圍)和特異地結(jié)合。適配體還可以區(qū)別緊密相關(guān)的蛋白質(zhì)靶標(biāo)。適配體具有幾個(gè)關(guān)鍵特征，其使得它們非常適合作為本發(fā)明方法的試劑。首先，適配體相對(duì)較小并易于接近大分子難以靶向的位點(diǎn)，例如在抗原呈遞細(xì)胞和T細(xì)胞之間形成的免疫突觸。本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是有可能改造適配體對(duì)于降解核酸酶的穩(wěn)定性，由此確定它們的抑制活性的時(shí)間階段。未修飾的基于RNA-和DNA-的適配體在血清中可以在數(shù)分鐘內(nèi)開(kāi)始降解，然而包含修飾的堿基和硫代磷酸酯鍵的適配體對(duì)于降解核酸酶顯示出顯著增強(qiáng)的穩(wěn)定性。例如，2’ -氨基密啶-修飾的RNA已被證明在數(shù)天內(nèi)保持穩(wěn)定。而且，修飾還可以被應(yīng)用于適配體末端以使其具有更強(qiáng)的穩(wěn)定性。例如，可以加入3’-3’鍵以防止3’ -核酸外切酶降解?？梢酝ㄟ^(guò)Spiegelmer-技術(shù)(其綜述參見(jiàn)Famulok等，1999)或通過(guò)使用肽核酸(EP I 785 490 BI)產(chǎn)生穩(wěn)定的適配體。肽核酸(PM)代表了一類(lèi)核酸類(lèi)似物，其中帶電荷的脫氧核糖-磷酸二酯骨架被替換為含有N-(2-胺乙基)甘氨酸單體的肽鏈，具有核酸堿基腺嘌呤、胸腺嘧啶、鳥(niǎo)嘌呤和胞嘧啶鏈接到所述單體的α-碳上。由于它的人工特性，PNA提供對(duì)核酸酶和蛋白酶的完全抵抗力。
[0058]在優(yōu)選的實(shí)施方案中，兩個(gè)或更多個(gè)對(duì)IL-4和IL-13具有特異性能夠阻斷這兩個(gè)細(xì)胞因子的生物學(xué)活性的適配體 的組合被用于本發(fā)明的方法。
[0059]在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，能夠使細(xì)胞因子受體失活的適配體被用于抑制IL-4-和IL-13-介導(dǎo)途徑。優(yōu)選的是對(duì)IL-4Ra具有特異性能夠阻斷IL-4和IL-13 二者的生物學(xué)活性的適配體。
[0060]在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所使用的適配體提供對(duì)酶促降解的有限的抵抗，其足以在過(guò)敏原呈遞部位及其附近有效抑制IL-4-和IL-12-介導(dǎo)途徑，但是確保適配體從該部位擴(kuò)散開(kāi)的時(shí)候快速降解。在具體實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明方法的需要通過(guò)修飾其結(jié)構(gòu)調(diào)整抑制性適配體的穩(wěn)定性，所述修飾包括但不限于硫代磷酸酯鍵的引入，堿基修飾(例如通過(guò)2’ -氨基嘧啶的修飾)，以及向適配體末端添加3’ -3’鍵。
[0061]在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明方法的需要調(diào)整抑制性適配體的生理清除。在非常快速清除的情況下，抑制性適配體的血漿半衰期可以通過(guò)與脂類(lèi)或高分子量化合物例如40 kD聚乙二醇部分連接而被延長(zhǎng)。
[0062]V1.用于T-細(xì)胞分化決定信號(hào)抑制劑的延長(zhǎng)遞送的基質(zhì)
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于IL-4-和IL-13-介導(dǎo)途徑抑制劑的局部遞送的基質(zhì)a)可以作為大量抑制劑或抑制劑組合的儲(chǔ)存庫(kù)，b)允許釋放足夠量的抑制劑或抑制劑組合，以在延長(zhǎng)的時(shí)間階段內(nèi)(最佳地是幾天)有效局部抑制IL-4-和IL-13-介導(dǎo)途徑，c)是生物可降解的，以及d)與用于根據(jù)本發(fā)明方法進(jìn)行的耐受誘導(dǎo)的佐劑和一種或多種過(guò)敏原是化學(xué)和物理相容的。
[0063]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，生物可降解聚合物被用于IL-4-和IL-13-介導(dǎo)途徑抑制劑的控制遞送。優(yōu)選的被FDA批準(zhǔn)的并用于臨床試驗(yàn)中的生物可降解聚合物包括但不限于聚(D，L-乳酸)、聚乳酸羥基乙酸共聚物(PLGA)和L-丙交酯和D，L-丙交酯的共聚物。這些聚合物的重要特性是它們能夠被局部應(yīng)用，其允許維持抑制劑在病灶內(nèi)的濃度，而系統(tǒng)性毒副作用減到最小。所有被FDA批準(zhǔn)的聚合物都已被廣泛研究過(guò)其生物相容性、毒理學(xué)和降解動(dòng)力學(xué)。而且，這些聚合物已被證明在體外釋放包埋藥物幾小時(shí)至多40周，且在體內(nèi)幾周有效。例如，包含抗-VEGF RNA適配體EYE001的PLGA微球已被證明在20天的時(shí)間期間以持續(xù)的方式釋放適配體，具有平均速度為每天2 μ g(CarrasquiI1等，2003)。
[0064]在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，生物可降解的可注射的原位成型凝膠系統(tǒng)被用于IL-4-和IL-13-介導(dǎo)途徑抑制劑的控制遞送。優(yōu)選的原位成型凝膠系統(tǒng)(水凝膠)經(jīng)過(guò)溶膠-凝膠-溶膠的轉(zhuǎn)變，其在室溫下是自由流動(dòng)的溶膠，在體溫下是不流動(dòng)的凝膠。與其它生物可降解聚合物相比，可注射的熱膠凝聚合物具有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)，包括易于制備，對(duì)生物活性分子例如IL-4-和IL-13-介導(dǎo)途徑抑制劑的高封裝效率，以及在制備過(guò)程中不含有害的有機(jī)溶劑(Qiao等2005)。
[0065]在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所使用的生物可降解熱膠凝嵌段聚合物是基于單甲氧基聚(乙二醇)(MPEG)的，包括但不限于a)由MPEG和聚(ε -己內(nèi)酯)(PCL)組成的二嵌段共聚物(Hyun 等，2007)，b) MPEG4-(PCL-ra/?-PLLA) 二嵌段共聚物(Kang 等，2010)，和
c)由MPEG和PLGA組成的二嵌段共聚物(Peng等，2010)。包含PCL的MPEG共聚物提供的優(yōu)點(diǎn)是，與包含PLLA和PLGA的MPEG共聚物相反，它們?cè)谏锝到夂蟛恍纬伤嵝原h(huán)境(Hyun等，2007)。
[0066]在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所使用的生物可降解的熱膠凝三嵌段聚合物包括但不限于 a) PLGA-PEG-PLGA (Qiao 等，2005)，b) PEG-PLGA-PEG (Zhang 等，2006)，和 c)PEG-PCL-PEG (PECE) (Gong等，2009 a)。由PLGA和PEG制成的各種生物可降解熱膠凝三嵌段聚合物在專(zhuān)利申請(qǐng)WO 99/18142中公開(kāi)。在較低的溫度，在水溶液中，共聚物鏈的親水PEG段和水分子之間的氫鍵占主導(dǎo)地位，導(dǎo)致這些共聚物在水中溶解。隨著溫度升高，氫鍵連接變得較弱，而疏水段例如PLGA段的疏水作用力變得較強(qiáng)，導(dǎo)致溶膠-凝膠的轉(zhuǎn)變。PEG、PLGA和PCL是熟知的被FDA批準(zhǔn)的生物可降解的和生物相容的材料，其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域已被廣泛使用。 [0067]在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，使用生物可降解熱膠凝二嵌段和三嵌段共聚物，其由聚環(huán)氧乙烷(PEO)和生物可降解的聚酯例如聚-L-乳酸(PLLA)組成(Jeong等，1997)。但是，這些嵌段共聚物在較高溫度是自由流動(dòng)的溶膠，而在較低溫度形成凝膠。例如，PE0-PLLA-PE0 (Mr 5，000-2, 040-5，000)的 23% 水溶液在 45°C是溶膠，而在 37°C變?yōu)槟z。通過(guò)改變生物可降解嵌段長(zhǎng)度，可以操縱溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變溫度，例如，增加PLLA嵌段長(zhǎng)度使嵌段共聚物在水中聚集的傾向增加，導(dǎo)致凝膠-溶膠轉(zhuǎn)變曲線的斜率變得陡峭，并且在較低的濃度就開(kāi)始膠凝化。溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變溫度是嵌段聚合物濃度以及組成的函數(shù)。
[0068]在又一個(gè)具體實(shí)施方案中，使用泊洛沙姆(商品名Pluronics)。泊洛沙姆是非離子三嵌段共聚物，其由中間的聚環(huán)氧丙烷(PPO)疏水鏈和兩側(cè)的兩個(gè)聚(氧化乙烯)(PEO)的親水鏈組成(Gilbert等，1987)。泊洛沙姆在水溶液中也顯示出溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變的性質(zhì)，已被用于幾種治療劑的持續(xù)釋放。但是，泊洛沙姆不是生物可降解的，并可以在體內(nèi)積聚，其可導(dǎo)致毒副作用。因此，泊洛沙姆在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用受到很大限制。在最近的研究中，Pluronic F127 (100-單位的PEO鏈圍繞著一個(gè)65-單位的ΡΡ0)已被用于與PECE形成復(fù)合熱敏水凝膠(Gong等，2009-b)。根據(jù)該研究的結(jié)果,Pluronic F127/PECE復(fù)合水凝膠是生物相容的，具有低的細(xì)胞毒性，并且因此可以也適用于本發(fā)明的方法。
[0069]不同的生物可降解熱膠凝聚合物提供了不同的穩(wěn)定性特性。例如，泊洛沙姆三嵌段聚合物提供優(yōu)良的熱敏性，但是由于PPO嵌段的弱疏水性，這種共聚物形成快速溶蝕的凝膠，已有報(bào)道其在體內(nèi)最多堅(jiān)持幾個(gè)小時(shí)。在體外條件下將泊洛沙姆凝膠暴露于磷酸鹽緩沖液證明在2天之內(nèi)發(fā)生凝膠溶蝕(Hyun等，2007)。當(dāng)聚合物溶液被皮下注射到大鼠中的時(shí)候觀察到類(lèi)似的結(jié)果。2天后不能觀察到泊洛沙姆凝膠(Hyun等，2007)。用MPEG-PCL凝膠獲得了不同的結(jié)果。在體外條件下，MPEG-PCL凝膠保持其結(jié)構(gòu)完整性大于28天，且在皮下注射到大鼠中后，MPEG-PCL凝膠保持其結(jié)構(gòu)完整性大于30天。但是，MPEG-PCL凝膠的穩(wěn)定性也可產(chǎn)生問(wèn)題，這是由于與PLA、PGA或PLGA的降解速度相比，PCL在體內(nèi)的降解速度相當(dāng)?shù)?2-3年)(其綜述參見(jiàn)Sinha等，2004)。因此，在體內(nèi)在行使遞送IL-4-和IL-13-介導(dǎo)途徑抑制劑的功能之后，MPEG-PCL共聚物在生理?xiàng)l件下在體內(nèi)可保留不確定時(shí)間階段。因此，用于本發(fā)明方法的最優(yōu)選的生物可降解熱膠凝聚合物是其結(jié)構(gòu)完整性保持幾天但在體內(nèi)保留不超過(guò)一周的那些聚合物。
[0070]在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用生物可降解熱膠凝聚合物，其允許改變它們的降解動(dòng)力學(xué)。例如，PLLA段可以被摻入到MPEG-PCL共聚物的PCL段中，由于PLLA提供更好的水對(duì)PLLA的酯鍵的可接近性，由此增強(qiáng)了共聚物的水解降解(Kang等，2010)。得到的MPEG4- (PCL-ra/7-PLLA) 二嵌段共聚物通過(guò)改變PCL段中PLLA的量，提供從幾周到幾個(gè)月的可調(diào)節(jié)的治療窗(Kang等，2010)。在另一個(gè)實(shí)例中，PLGA-PEG-PLGA水凝膠溶蝕的速度可以通過(guò)改變PLGA段中DL-丙交酯/乙交酯的摩爾比來(lái)改變。DL-丙交酯分子比乙交酯分子更疏水。因此，通過(guò)增加PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物的PLGA段中DL-丙交酯/乙交酯的摩爾比，由于共聚物分子中更強(qiáng)的疏水作用而形成更穩(wěn)定的水凝膠(Qiao等2005)。
[0071]已經(jīng)分析了幾種生物可降解熱膠凝聚合物介導(dǎo)蛋白質(zhì)持續(xù)釋放的能力。雖然不同的蛋白質(zhì)例如細(xì)胞因子突變體、可溶性細(xì)胞因子受體構(gòu)建體和抗體有可能以各自的方式影響每種共聚物的釋放行為，對(duì)模式蛋白例如牛血清清蛋白(BSA)的釋放的表征提供了重要的信息。使用包含不同百分比的PECE和Pluronic F127的復(fù)合水凝膠，BSA的體外釋放行為證明是依賴于水凝膠組合物、初始BSA加樣量和水凝膠濃度的(Gong等，2009-b)。使用包含60% PECE和40% Pluronic F127的復(fù)合水凝膠，在存在30wt°/c^K凝膠的條件下加入4 mgBSA,實(shí)現(xiàn)了大于15天的BSA的持續(xù)釋放。使用MPEG-PCL共聚物，BSA的體外持續(xù)釋放結(jié)果是大于20天，且在體內(nèi)條件下(皮下注射到大鼠中后)，持續(xù)釋放持續(xù)了大于30天(Hyung等，2007)。
[0072] 雖然對(duì)于大部分臨床應(yīng)用來(lái)說(shuō)，治療藥物在幾周的時(shí)期中從生物可降解熱膠凝聚合物中的持續(xù)釋放是令人期望的，本發(fā)明的方法不需要IL-4-和IL-13-介導(dǎo)途徑抑制劑有這種延長(zhǎng)的持續(xù)釋放，因?yàn)槊庖哂洃浀陌l(fā)生需要T細(xì)胞受體(TCR)結(jié)合僅1-2天的時(shí)間階段。而且，IL-4-和IL-13-介導(dǎo)途徑抑制劑經(jīng)過(guò)幾周時(shí)間階段的延長(zhǎng)的持續(xù)釋放可產(chǎn)生局部副作用。因此，優(yōu)選的是在不超過(guò)一周的有限時(shí)間內(nèi)遞送IL-4-和IL-13-介導(dǎo)途徑抑制劑的生物可降解熱膠凝聚合物。
[0073]PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物代表了為本發(fā)明方法提供有利的降解和釋放動(dòng)力學(xué)的水凝膠的一個(gè)實(shí)例。如近期的研究中所證明的，胰島素從PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物中的釋放持續(xù)大約4天，在第一天中有最初的突釋效果(Choi等，2003)。最初的突釋效果在過(guò)敏原呈遞的初始階段對(duì)于IL-4-和IL-13-介導(dǎo)途徑的完全抑制可以是有利的。但是，可以通過(guò)與鋅的絡(luò)合降低IL-4-和IL-13-介導(dǎo)途徑抑制劑的溶解性從而改變釋放動(dòng)力學(xué)，如鋅-胰島素復(fù)合物所顯示的那樣(Choi等，2003)。
[0074]雖然泊洛沙姆凝膠不是生物可降解的，泊洛沙姆407 (商品名Pluronic F127)凝膠也代表了為本發(fā)明方法提供有利的降解和釋放動(dòng)力學(xué)的熱膠凝水凝膠的一個(gè)實(shí)例。雖然在體外條件下，證明BSA從泊洛沙姆407凝膠中的釋放幾乎在I天內(nèi)完成，BSA在體內(nèi)條件下(皮下注射到大鼠中后)的持續(xù)釋放持續(xù)了 3天(Hyung等，2007)。
[0075]VI1.佐劑
由于T細(xì)胞分化以及由此的免疫記憶的發(fā)生要求T細(xì)胞受體(TCR)結(jié)合大于12-48h，而且長(zhǎng)期持續(xù)記憶甚至可能需要反復(fù)暴露，因此抗原暴露的時(shí)間非常重要。佐劑例如油和alum提供了儲(chǔ)存效果，其延長(zhǎng)抗原的壽命，并由此延長(zhǎng)抗原對(duì)T細(xì)胞的刺激。但是，除了儲(chǔ)存效果，目前可用的佐劑觸發(fā)Thl-型或Th2-型免疫應(yīng)答或二者(其綜述參見(jiàn)Leroux-Roels, 2010; Nicholls等，2010)?；谶@樣的假設(shè):Tregs的產(chǎn)生代表了一種默認(rèn)途徑，其需要T-細(xì)胞受體激活但需要缺乏效應(yīng)物T細(xì)胞決定信號(hào)，目前可用的佐劑對(duì)于本發(fā)明的目的來(lái)說(shuō)不是最佳的。為本發(fā)明的方法所需要的佐劑促進(jìn)過(guò)敏原攝取和對(duì)T細(xì)胞的延長(zhǎng)的刺激，而不提供決定信號(hào)，由此誘導(dǎo)Treg增加。遺憾的是，提供所有期望性質(zhì)的佐劑仍未可得。
[0076]脂質(zhì)體，由脂質(zhì)層組成的合成納米微球，代表了一種經(jīng)典的其本身沒(méi)有活性的佐劑。它們主要的作用方式是通過(guò)抗原呈遞。脂質(zhì)體可以將過(guò)敏原封裝在其中并作為過(guò)敏原遞送媒介物。但是，脂質(zhì)體不適合于過(guò)敏原的緩慢釋放，而緩慢釋放對(duì)于延長(zhǎng)免疫刺激來(lái)說(shuō)是必需的。
[0077]在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，引發(fā)Th2_型免疫應(yīng)答的佐劑，包括但不限于鋁鹽、Montanide乳劑(基于角鯊烯的油包水乳劑)和聚磷腈被用于本發(fā)明的方法。雖然主要引發(fā)Th2-型免疫應(yīng)答的佐劑可能干擾Tregs的誘導(dǎo)，在存在IL-4-和IL-13-介導(dǎo)途徑抑制劑的條件下，這種佐劑比那些主要引發(fā)Thl-型免疫應(yīng)答的佐劑更適用于本發(fā)明的治療目的。在存在IL-4-和IL-13-介 導(dǎo)途徑抑制劑的條件下，引發(fā)Th2-型免疫應(yīng)答的佐劑的反作用活性(contra-productive activity)顯著減少或甚至被破壞,而Thl-型促進(jìn)佐劑的活性可以不受影響。因此，Thl-型細(xì)胞因子會(huì)干擾Tregs的誘導(dǎo)。
[0078]在一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，含鋁佐劑，典型地是磷酸鋁或氫氧化鋁凝膠(通常被稱(chēng)為alum)被用于本發(fā)明的方法。一種作用機(jī)理是由于它使免疫分子在體內(nèi)停留在特定部位，允許它們可以緩慢釋放并因此有延長(zhǎng)的免疫應(yīng)答，即所謂的儲(chǔ)存效果。alum也似乎是通過(guò)將抗原保持為顆粒(而不是溶解)形式行使其佐劑活性，從而增強(qiáng)APCs對(duì)抗原的吞噬作用。樹(shù)突細(xì)胞(DC)能夠攝取溶解的抗原和吸附在含鋁佐劑上的抗原。而且，已經(jīng)清楚alum能夠直接激活免疫細(xì)胞。Alum可以誘導(dǎo)單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞成熟化為DC-樣細(xì)胞。這個(gè)過(guò)程依賴于NLRP3 (N0D-樣受體家族，含熱蛋白結(jié)構(gòu)域的蛋白3)的激活，NLRP3是引起促炎性細(xì)胞因子例如IL-1 β和IL-18產(chǎn)生的炎性體的一部分。首先，alum引發(fā)Th2應(yīng)答，包括IL-4和IL-5的產(chǎn)生以及B細(xì)胞產(chǎn)生IgGl和IgE (其綜述參見(jiàn)Nicolls等，2010)。
[0079]過(guò)敏原與含鋁佐劑溫育后，過(guò)敏原通過(guò)靜電相互作用以及磷酸基團(tuán)和羥基基團(tuán)之間的交換被部分或完全吸附到佐劑上。幾項(xiàng)研究已證明吸附到含鋁佐劑上可防止過(guò)敏原的快速酶促降解，但是吸附過(guò)程也可能誘導(dǎo)結(jié)構(gòu)變化，導(dǎo)致熱穩(wěn)定性降低(其綜述參見(jiàn)Clapp等，2011)。一種提高疫苗熱穩(wěn)定性的方法是使用緩沖液的組合來(lái)改變含鋁佐劑的表面化學(xué)和控制過(guò)敏原氨基酸側(cè)鏈的離子化狀態(tài)。另一個(gè)方法是鑒別使溶液狀態(tài)的一種或多種過(guò)敏原穩(wěn)定的條件，并使用該條件作為使一種或多種過(guò)敏原的吸附誘導(dǎo)的熱不穩(wěn)定作用的程度最小化的指導(dǎo)。但是，實(shí)際上穩(wěn)定方法可以被忽略，這是因?yàn)榭乖?包括過(guò)敏原)向含鋁佐劑的吸附對(duì)于免疫應(yīng)答的重要性在近期的研究中受到質(zhì)疑(其綜述參見(jiàn)Clapp等，2011)。例如，針對(duì)母雞卵清溶菌酶在兔中引發(fā)的免疫應(yīng)答與吸附在含鋁佐劑上的抗原級(jí)分無(wú)關(guān)(Chang等，2001)。但是，為了使免疫應(yīng)答達(dá)到最大，某種程度的吸附或者至少抗原和佐劑的接近似乎是重要的。
[0080]在另一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，聚磷腈(水溶聚合物)被用于本發(fā)明的方法。聚[二(羧酸苯氧基)磷腈](PCPP)已被證明增強(qiáng)抗體應(yīng)答，同時(shí)具有可忽略不計(jì)的反應(yīng)原性(Nicolls 等，2010)。
[0081]在又一個(gè)具體實(shí)施方案中，基于角鯊烯的油包水乳劑(Montanide乳劑)被用于本發(fā)明的方法。Montanide乳劑與不完全弗氏佐劑類(lèi)似，但它們是生物可降解的，并因此具有顯著較小的毒性，并且已被用在幾項(xiàng)臨床試驗(yàn)中(Nicolls等，2010)。
[0082]在另一個(gè)實(shí)施方案中，引發(fā)組合的Thl-和Th2_型免疫應(yīng)答的佐劑被用于本發(fā)明的方法。雖然引發(fā)組合的Thl-和Th2-型免疫應(yīng)答的佐劑有可能在一定程度上干擾Tregs的誘導(dǎo)，但這種佐劑可以為組合物提供有利的性質(zhì)，其可能對(duì)本發(fā)明的方法是有益的。引發(fā)組合的Thl-和Th2-型免疫應(yīng)答的佐劑包括但不限于基于角鯊烯的水包油乳劑、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)和基于菊粉和病毒顆粒的佐劑(其綜述參見(jiàn)Nicholls 等,2010)。
[0083]VII1.包含IL-4-和IL-13-介導(dǎo)途徑抑制劑、介導(dǎo)這種抑制劑的延長(zhǎng)性遞送的基質(zhì)、過(guò)敏原和佐劑的疫苗組合物。
[0084]為了實(shí)現(xiàn)一種或多種過(guò)敏原的延長(zhǎng)的呈遞以及在過(guò)敏原呈遞部位對(duì)IL-4-和IL-13-介導(dǎo)效果的延長(zhǎng)的抑制，一種或多種過(guò)敏原和一種或多種抑制劑二者以限制這些組分從過(guò)敏原呈遞部位擴(kuò)散開(kāi)的方式共同施用?？捎糜诒景l(fā)明的有用的擴(kuò)散限制技術(shù)包括但不限于將組分吸附到含鋁材料上，用組分制備油包水或水包油乳劑，以及將組分摻入到生物可降解聚合物包括生物可降解熱膠凝聚合物中。
[0085]對(duì)于某些組分來(lái)說(shuō)，為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的治療目的組合兩種或更多種擴(kuò)散限制技術(shù)是有用的。本發(fā)明方法的一個(gè)重要方面是治療組合物中組分的相容性。例如，將過(guò)敏原和IL-4-和IL-13-介導(dǎo)途徑抑制劑吸附到含鋁材料上提供了過(guò)敏原的延長(zhǎng)的呈遞連同Th2-型佐劑的效果，但是問(wèn)題是一種或多種抑制劑的延遲釋放是否足以在過(guò)敏原呈遞期間有效抑制IL-4-和IL-13-介導(dǎo)途徑。將抑制劑摻入到快速降解聚合物中提供了更好的機(jī)會(huì)以實(shí)現(xiàn)在過(guò)敏原呈遞期間對(duì)IL-4-和IL-13-介導(dǎo)途徑的有效抑制。因此，這兩種技術(shù)的組合比任一種單獨(dú)的技術(shù)更有可能保證較好的治療效果。類(lèi)似的考慮適用于油包水或水包油乳劑作為IL-4-和IL-13-介導(dǎo)途徑抑制劑的擴(kuò)散限制技術(shù)的使用，因?yàn)橐种苿倪@種乳劑釋放的動(dòng)力學(xué)可能不足以滿足本發(fā)明方法的需要。但是，生物可降解聚合物具有潛力以提供足以滿足本發(fā)明方法需要的延長(zhǎng)的過(guò)敏原呈遞和IL-4-和IL-13-介導(dǎo)途徑抑制劑的持續(xù)釋放。近期的研究已證明與抗原一同包埋在生物可降解水凝膠中的可溶性佐劑是引發(fā)免疫應(yīng)答的強(qiáng)有力的組合物。使用由MPEG-PLGA組成的二嵌段共聚物進(jìn)行乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和GM-SCF的水凝膠共遞送，可能引發(fā)高HBsAg-特異性抗體和T-輔助細(xì)胞應(yīng)答，甚至是在由于其H-2單體型對(duì)現(xiàn)有的HBsAg疫苗不應(yīng)答的小鼠品系中(Chou等，2010)。
[0086]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，疫苗組合物包含生物可降解熱膠凝聚合物，所述生物可降解熱膠凝聚合物含有一種或多種部分或完全吸附到含鋁佐劑上的過(guò)敏原或者過(guò)敏原提取物，以及一種或多種可溶性IL-4-和IL-13-介導(dǎo)途徑抑制劑。通過(guò)在生物可降解熱膠凝聚合物為自由流動(dòng)的溶膠的溫度(例如室溫)下將所有組分混合制備該組合物。組合物中每種組分的量以這樣的方式平衡:a)在注射后，該生物可降解熱膠凝聚合物形成不流動(dòng)的凝膠，其它組分包埋于其中，以及b)在聚合物復(fù)合體在體溫下膠凝化之后，所釋放的組分的量對(duì)于本發(fā)明方法的治療目的是足夠的。
[0087]在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，聚合物包埋的IL-4-和IL-13-介導(dǎo)途徑抑制劑和alum-吸附的過(guò)敏原(或過(guò)敏原提取物)在同一部位，但作為單獨(dú)的制備物注射。聚合物復(fù)合體在注射部位膠凝化之后，將alum-吸附的過(guò)敏原(或過(guò)敏原提取物)注射到凝膠的聚合物復(fù)合體附近。所述聚合物復(fù)合體包含生物可降解的熱膠凝聚合物和一種或多種可溶性IL-4-和IL-13-介導(dǎo)途徑抑制劑，并且通過(guò)在生物可降解熱膠凝聚合物為自由流動(dòng)的溶膠的溫度(例如室溫)下將所有組分混合來(lái)制備。組合物中每種組分的量以這樣的方式平衡:a)在注射后，該生物可降解熱膠凝聚合物形成不流動(dòng)的凝膠，其它組分包埋于其中，以及b)聚合物復(fù)合體在體溫下膠凝化之后，所釋放的組分的量對(duì)于本發(fā)明方法的治療目的是足夠的。
[0088]在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，疫苗組合物包含生物可降解熱膠凝聚合物，該生物可降解熱膠凝聚合物含有一種或多種與由基于角鯊烯的油包水乳劑(Montanide乳劑)組成的佐劑或水溶性聚磷腈聚合物預(yù)混的過(guò)敏原或過(guò)敏原提取物，和一種或多種可溶性IL-4-和IL-13-介導(dǎo)途徑抑制劑。通過(guò)在生物可降解熱膠凝聚合物為自由流動(dòng)的溶膠的溫度(例如室溫)下將所有組分混合制備該組合物。組合物中每種組分的量以這樣的方式平衡:a)在注射后，該生物可降解熱膠凝聚合物形成不流動(dòng)的凝膠，其它組分包埋于其中，以及b)在聚合物復(fù) 合體在體溫下膠凝化之后，所釋放的組分的量對(duì)于本發(fā)明方法的治療目的是足夠的。
[0089]在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，聚合物包埋的IL-4-和IL-13-介導(dǎo)途徑抑制劑和包埋在Montanide乳劑中或與水溶性聚磷腈聚合物混合的過(guò)敏原(或過(guò)敏原提取物)在同一部位，但以單獨(dú)的制備物注射。聚合物復(fù)合體在注射部位膠凝化之后，將包埋在Montanide乳劑中或與水溶性聚磷腈聚合物混合的過(guò)敏原(或過(guò)敏原提取物)注射到膠凝化的聚合物復(fù)合體附近。所述聚合物復(fù)合體包含生物可降解的熱膠凝聚合物和一種或多種可溶性IL-4-和IL-13-介導(dǎo)途徑抑制劑，并且通過(guò)在生物可降解熱膠凝聚合物為自由流動(dòng)的溶膠的溫度(例如室溫)下將所有組分混合來(lái)制備。組合物中每種組分的量以這樣的方式平衡:a)在注射后，該生物可降解熱膠凝聚合物形成不流動(dòng)的凝膠，其它組分包埋于其中，以及b)在聚合物復(fù)合體在體溫下膠凝化之后，所釋放的組分的量對(duì)于本發(fā)明方法的治療目的是足夠的。
[0090]在本發(fā)明的又一優(yōu)選的實(shí)施方案中，疫苗組合物包含生物可降解熱膠凝聚合物，所述生物可降解熱膠凝聚合物含有一種或多種過(guò)敏原或過(guò)敏原提取物、一種或多種引發(fā)組合的Thl-和Th2-型免疫應(yīng)答的可溶性佐劑(例如GM-CSF)、和一種或多種可溶性IL-4-和IL-13-介導(dǎo)途徑抑制劑。通過(guò)在生物可降解熱膠凝聚合物為自由流動(dòng)的溶膠的溫度(例如室溫)下將所有組分混合制備該組合物。組合物中每種組分的量以這樣的方式平衡:a)在注射后，該生物可降解熱膠凝聚合物形成不流動(dòng)的凝膠，其它組分包埋于其中，以及b)在聚合物復(fù)合體在體溫下膠凝化之后，所釋放的組分的量對(duì)于本發(fā)明方法的治療目的是足夠的。
[0091]IX.治療方法
如本文所使用的，對(duì)蛋白質(zhì)過(guò)敏原敏感的個(gè)體的T細(xì)胞應(yīng)答的降低或改變被定義為在個(gè)體中對(duì)蛋白質(zhì)過(guò)敏原的癥狀的減少，如通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)臨床操作確定(參見(jiàn)例如Brit.Med.J.1990; 302: 265)。如本文中所提及的，對(duì)過(guò)敏原癥狀的減少包括在使用如本文所述的多肽進(jìn)行的治療方案之后，個(gè)體對(duì)于過(guò)敏原的過(guò)敏反應(yīng)的任何減少。這種癥狀上的減少可以主觀確定(例如患者在暴露于過(guò)敏原時(shí)感覺(jué)更舒適)，或者臨床確定，例如進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)皮膚測(cè)試。
[0092]為進(jìn)行免疫治療，包含一種或多種過(guò)敏原、一種或多種佐劑、一種或多種IL-4-和IL-13-介導(dǎo)途徑抑制劑和介導(dǎo)這種抑制劑的延長(zhǎng)性遞送的基質(zhì)的本發(fā)明的疫苗組合物，以多個(gè)公開(kāi)的免疫治療方案中所定義的時(shí)間間隔重復(fù)施用。疫苗組合物中一種或多種過(guò)敏原的劑量逐漸增加到有效減少個(gè)體對(duì)一種或多種過(guò)敏原的過(guò)敏反應(yīng)的程度。在具體實(shí)施方案中，未包埋的IL-4-和IL-13-介導(dǎo)途徑抑制劑可以和疫苗組合物共同施用以增強(qiáng)施用部位的抑制效果。施用途徑的優(yōu)選實(shí)施例包括但不限于皮膚內(nèi)和皮下施用?？梢哉{(diào)整給藥方案以提供最佳的治療反應(yīng)。例如，可以每天進(jìn)行幾次分次劑量的施用。
[0093]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，應(yīng)用聚合物包埋的IL-4-和IL-13-介導(dǎo)途徑抑制劑和alum-吸附的過(guò)敏原以用于免疫治療。首先，皮下注射含有一種或多種可溶性IL-4-和IL-13-介導(dǎo)途徑抑制劑的生物可降解熱膠凝聚合物溶液。聚合物包埋的抑制劑的量取決于生物可降解熱膠凝聚合物的釋放動(dòng)力學(xué)，且被調(diào)整為確保在3-5天的時(shí)間階段中進(jìn)行治療有效劑量的連續(xù)釋放的水平。在第二步中，在膠凝化的聚合物復(fù)合體的部位皮下注射alum-吸附的過(guò) 敏原。alum-吸附的過(guò)敏原的量將根據(jù)例如個(gè)體對(duì)一種或多種過(guò)敏原的敏感度、個(gè)體年齡、性別和體重、組合物在個(gè)體中誘導(dǎo)對(duì)一種或多種過(guò)敏原的耐受的能力這些因素的不同而不同。在隨后的步驟中，首先注射聚合物包埋的抑制劑，然后在膠凝化的聚合物復(fù)合體部位注射alum-吸附的過(guò)敏原。雖然聚合物包埋的抑制劑的量保持不變，alum-吸附的過(guò)敏原的量逐漸增加到有效減少個(gè)體對(duì)過(guò)敏原的過(guò)敏反應(yīng)的程度。聚合物包埋的抑制劑和alum-吸附的過(guò)敏原以多個(gè)公開(kāi)的免疫治療方案中定義的時(shí)間間隔重復(fù)施用，直到實(shí)現(xiàn)過(guò)敏原耐受。
[0094]治療有效劑量的確定在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)。治療有效劑量可以最初在動(dòng)物模型，通常是小鼠、大鼠、兔、狗、豬或非人靈長(zhǎng)動(dòng)物中進(jìn)行估計(jì)。動(dòng)物模型還可以用于確定合適的施用濃度范圍和施用途徑。這些信息然后可以用于確定人中的施用有效劑量和施用途徑。
[0095]Z藥物制劑
在一個(gè)實(shí)施方案中，疫苗組合物被摻入到適合于施用的藥物組合物中。這種組合物典型地包含疫苗組合物和藥學(xué)可接受的載體。如本文所使用的，“藥學(xué)可接受的載體”意在包括任何的和所有的溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗細(xì)菌和抗真菌試劑、等滲系統(tǒng)等，它們與疫苗組合物和藥物施用(pharmaceutical administrat1n)的組分相容。這種介質(zhì)和試劑用于藥物活性物質(zhì)的用途在本領(lǐng)域是熟知的。補(bǔ)充的活性化合物也可以摻入到所述組合物中。
[0096]用于腸胃外、皮內(nèi)或皮下施用的溶液或懸液可以包括下述組分:無(wú)菌稀釋劑例如注射用水、鹽溶液、不揮發(fā)油、聚乙烯醇、丙三醇、丙二醇或其它合成溶劑，抗氧化劑例如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉，螯合劑例如乙二胺四乙酸，緩沖劑例如醋酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽以及用于調(diào)節(jié)毒性的試劑例如氯化鈉或右旋葡萄糖?？梢杂盟峄驂A，例如鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH。在許多情況下，優(yōu)選在組合物中包括等滲試劑，例如糖、多元醇例如甘露醇、山梨醇、氯化鈉。組合物應(yīng)當(dāng)是易于注射的流體?？梢岳缤ㄟ^(guò)使用包衣例如卵磷脂，通過(guò)在分散的情況下保持所需的粒徑以及通過(guò)使用表面活性劑保持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性。組合物在制造和儲(chǔ)存條件下必須是穩(wěn)定的，并且其保存必須能抵抗微生物例如細(xì)菌和真菌的污染作用?？梢酝ㄟ^(guò)各種抗細(xì)菌和抗真菌試劑例如對(duì)羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酹、抗壞血酸、thimoseral等實(shí)現(xiàn)對(duì)微生物作用的預(yù)防。在所有的情況下，組合物必須是無(wú)菌的。無(wú)菌注射液可以通過(guò)過(guò)濾滅菌制備。制備物可以封裝在安瓿瓶、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多劑量小瓶中。對(duì)于用于制備無(wú)菌注射液的無(wú)菌粉末，優(yōu)選的制備方法是由其之前的無(wú)菌過(guò)濾溶液通過(guò)真空干燥和凍干產(chǎn)生活性成分加任何其它所需成分的粉末。實(shí)際上，應(yīng)當(dāng)記住鋁吸附疫苗對(duì)冷凍敏感，因此不能凍干。
[0097]引用的并且通過(guò)引用的方式合并入本文的參考文獻(xiàn)
【權(quán)利要求】
1.藥物組合物，其由一種或多種制備物組成，且包含生理學(xué)有效劑量的至少一種IL-4和/或IL-13抑制劑和至少一種過(guò)敏原，以及基質(zhì)，其中至少所述抑制劑是溶解的或包埋于所述基質(zhì)中，或者至少所述抑制劑包被或吸附于所述基質(zhì)上，其中選擇所述基質(zhì)以使得所述抑制劑能夠延長(zhǎng)性釋放。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中所述抑制劑選自拮抗性IL-4和/或IL-13衍生物、對(duì)IL-4和/或IL-13和/或它們的前體具有特異性的可溶性細(xì)胞因子受體構(gòu)建體、對(duì)IL-4和/或IL-13和/或它們的前體和/或它們的受體具有特異性的單克隆抗體、這些抗體的結(jié)合片段、對(duì)IL-4和/或IL-13和/或它們的前體和/或它們的受體具有特異性的蛋白質(zhì)構(gòu)建體以及對(duì)IL-4和/或IL-13和/或它們的前體和/或它們的受體具有特異性的適配體組成的組。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的組合物，其中包含至少兩種不同的抑制劑，其中至少一種抑制劑抑制IL-4且至少一種其它抑制劑抑制IL-13，或者其中包含至少一種抑制IL-4和IL-13二者的抑制劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3之一的組合物，其中所述抑制劑具有小于7天的血漿半衰期，優(yōu)選小于I天，最優(yōu)選小于6或5個(gè)小時(shí)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4之一的組合物，其中所述抑制劑是具有一至三個(gè)突變的人IL-4突變體，優(yōu)選在位置R121、Y124和S125的至少一個(gè)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5之一的組合物，其中所述基質(zhì)是生物可降解的或非生物降解的有機(jī)聚合物，優(yōu)選生物可降解的，更優(yōu)選熱膠凝的，特別是選自基于苯乙烯-異丁烯的嵌段共聚物、烯烴聚合物、聚乙烯、聚丙烯、聚環(huán)氧乙烷(PEO)、聚環(huán)氧丙烷(PPO)、聚氯乙烯、聚四氟乙烯、氟化乙烯丙 烯共聚物、聚乙酸乙烯酯、聚苯乙烯、聚對(duì)苯二甲酸乙二酯(poly(ethylene teraphthalate))、聚氨酯、聚脲、娃橡膠、聚酰胺、聚碳酸酯、聚醒、天然橡膠、聚酯共聚物、苯乙烯-丁二烯共聚物乙烯乙酸乙烯酯、聚原酸酯、聚亞胺基碳酸酯、脂肪族聚碳酸酯、聚己酸內(nèi)酯(PCL)、聚-D，L-乳酸(PDLLA)、聚-L-乳酸(PLLA)、所述乳酸的丙交酯、聚磷腈聚環(huán)氧乙燒、聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯(PET) (polyethylene teraphtholate)、聚對(duì)苯二甲酸丁二醇酯(PBT)、PEBAX、Nylon、聚原酸酯、聚乳酸、聚乙醇酸、白蛋白、單甲氧基聚(乙二醇)(MPEG)或上述任一種的共聚物或混合物，包括聚乳酸羥基乙酸共聚物(PLGA)、L-丙交酯和D, L-丙交酯的共聚物、由MPEG和PCL，MPEG和(PCL_ran_PLLA)，MPEG和PLGA組成的二嵌段共聚物、由PLGA-PEG-PLGA，PEG-PLGA-PEG，PEG-PCL-PEG組成的三嵌段共聚物、由PEO和PLLA組成的二嵌段和三嵌段共聚物、泊洛沙姆。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的組合物，其中所述聚合物是熱膠凝的，且其中高于其開(kāi)始膠凝的膠凝溫度在20°C和40°C之間，優(yōu)選在25°C和30°C之間。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7之一的組合物，其中在體內(nèi)環(huán)境中聚合物90重量-%的降解和/或抑制劑從聚合物中90重量-%的釋放在1-10天內(nèi)完成，優(yōu)選在1-2天內(nèi)完成。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8之一的組合物，其中另外包含佐劑，其中所述佐劑優(yōu)選選自脂質(zhì)體、鋁鹽、Montanide乳劑、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、基于胰島素的佐劑、病毒顆粒和聚磷腈，最優(yōu)選選自磷酸鋁或氫氧化鋁凝膠。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-5之一的組合物，其中所述基質(zhì)是根據(jù)權(quán)利要求9的佐劑。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10之一的組合物，其中:所有組分混合作為單一的制備物，或者 所述基質(zhì)和所述抑制劑混合作為第一制備物，且所述過(guò)敏原和佐劑混合作為第二制備物。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-11之一的組合物，其中所述組合物制備為適合于用于通過(guò)皮下注射施用的蓋倫制劑。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-12之一的組合物在制備用于治療免疫病癥，特別是過(guò)敏反應(yīng)的藥物中的用 途，優(yōu)選其中所述藥物以治療有效劑量施用給需要治療免疫病癥的人。
14.制造根據(jù)權(quán)利要求1-12之一的藥物組合物的方法，其中所述組分以生理有效量彼此混合，以獲得根據(jù)權(quán)利要求11的組合物，其中任選地蓋侖化合物與所述制劑另外混合。
15.用于治療免疫病癥，特別是過(guò)敏反應(yīng)的方法，其中根據(jù)權(quán)利要求1-12之一的組合物以治療有效劑量施用給需要治療的人。
【文檔編號(hào)】A61K9/00GK104039349SQ201280057730
【公開(kāi)日】2014年9月10日 申請(qǐng)日期:2012年11月23日 優(yōu)先權(quán)日:2011年11月23日
【發(fā)明者】T.格倫瓦爾德, C.B.施密特-韋伯 申請(qǐng)人:Pls設(shè)計(jì)有限責(zé)任公司, 慕尼黑赫姆霍茲環(huán)境和健康研究中心有限責(zé)任公司