專利名稱：用于預防或抗過敏反應的桑寄生提取物,含它的藥物組合物及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于預防或抗過敏反應的桑寄生提取物，含它的藥物組合物，桑寄生提取物在制備用于抗過敏反應的藥物中的用途，及桑寄生提取物的制備方法。
I型變態(tài)反應或稱速發(fā)型過敏反應，是臨床上常見的變態(tài)反應，發(fā)病率較高。中國約有過敏病人一千萬左右。過敏性疾病包括1、藥物與血清引起的過敏性休克，表現(xiàn)為胸悶、氣急、呼吸困難等呼吸道癥狀，以及出冷汗、面色蒼白、脈細速、血壓下降等循環(huán)衰竭癥狀，嚴重者可因過敏性休克而迅速死亡；2、呼吸道過敏反應，典型疾病是支氣管哮喘和過敏性鼻炎，前者支氣管平滑肌痙攣和肺部血管擴張、通透性增強出現(xiàn)哮喘和呼吸困難，后者鼻粘膜水腫，分泌增加，出現(xiàn)流涕、打噴嚏等癥狀。3、食物過敏癥(消化道變態(tài)反應)，由于胃腸道的異常吸收，引起尋麻疹、腹痛、腹瀉、嘔吐等癥狀，嚴重者亦可出現(xiàn)過敏性休克。4、皮膚過敏反應，表現(xiàn)為濕疹、尋麻疹和血管神經(jīng)性水腫。
I-型變態(tài)反應由過敏原引起，發(fā)病分為三個階段，即致敏階段、發(fā)敏階段和效應階段。
致敏階段過敏原亦稱變應原通過呼吸道、消化道或皮膚粘膜等進入機體，刺激機體產(chǎn)生抗體，IgE類抗體引起I-型變態(tài)反應。
發(fā)敏階段相同的過敏原再次進入機體時，可以與肥大細胞膜上的IgE結合，導致脫顆粒反應，釋出多種介質。過敏病人的細胞膜上結合的IgE密集，過敏原有可能落于相鄰的IgE的Fab段上，形成“橋聯(lián)”?！皹蚵?lián)”導致迅猛地釋放存儲的顆粒，同時又有一系列的繼發(fā)介質被合成出來，與此同時還有一些酶被釋放出來。在發(fā)敏階段的早期，F(xiàn)cR聚集會引起一系列的變化，特別是蛋白激酶C的激活和蛋白激酶A的抑制。
效應階段發(fā)敏階段使肥大細胞脫顆粒，釋放出多種介質，包括組胺、白三烯類化合物、激肽和前列腺素等，由于過敏病人釋放介質過猛、過多，使機體產(chǎn)生一系列的癥狀。過敏反應主要靠藥物治療，這些藥物基本有三類a.抑制介質釋放的藥物色甘酸鈉可以穩(wěn)定肥大細胞膜，防止脫顆粒釋放介質。腎上腺素、麻黃素、氨茶堿可以提高細胞c-AMP，抑制脫顆粒作用；b.介質的拮抗劑苯海拉明、異丙嗪等抗組胺藥。腎上腺素收縮外周血管，擴張支氣管，用于搶救藥物過敏性休克；c.其它糖皮質激素、葡萄糖酸鈣、氯化鈣用于減輕毛細管擴張和降低通透性。臨床主要使用異丙嗪類藥物，它的缺點是嗜睡。色甘酸鈉由于藥效差基本不使用。桑寄生在中藥中屬抗風濕藥類，未見有抗過敏的報道。
本發(fā)明人現(xiàn)發(fā)現(xiàn)桑寄生具有抑制蛋白激酶C和提高細胞c-AMP的含量能力，而且桑寄生本身就具有c-AMP樣作用，可以激活蛋白激酶A。與此同時它可以穩(wěn)定肥大細胞膜，控制介質的釋放并具有色甘酸鈉與氨茶堿兩類藥物的作用，因此可以更好地抑制過敏反應的發(fā)敏階段，本發(fā)明基于上述發(fā)現(xiàn)得以完成。
本發(fā)明目的是尋找并開發(fā)中藥桑寄生的新醫(yī)藥用途。
本發(fā)明第一方面涉及用于預防或抗過敏反應的桑寄生提取物。
本發(fā)明再一方面涉及用于預防或抗過敏反應的藥物組合物，其包括桑寄生提取物及藥用載體或賦形劑。
本發(fā)明再一方面涉及桑寄生提取物在制備用于預防或抗過敏反應的藥物中用途。
本發(fā)明還涉及預防或抗過敏反應的方法，其包括將預防或治療有效量的桑寄生提取物給予需預防或治療過敏反應的患者。
本發(fā)明還涉及桑寄生提取物的制備方法，其包括i)將粉狀桑寄生用選自石油醚、乙烷、二氯甲烷、氯仿、苯或甲苯的有機溶劑提取，去除脂溶性物質，過濾，棄去濾液，保留濾餅，ii)將i)中濾餅用選自醇或酮的有機溶劑提取，過濾，棄去濾餅，濾液減壓濃縮，得桑寄生提取物，或先進行ii)所述提取，再進行i)所述提取，得所要桑寄生提取物；iii)如需要，將上面得到的桑寄生提取物通過大孔吸附樹脂和纖維素柱純化。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明純化前的桑寄生提取物含有生物堿(通過碘化鉍鉀反應證明)，純化后的桑寄生提取物僅含有生物堿。進一步講，本發(fā)明僅含生物堿的桑寄生提取物的甲醇溶液的紫外吸收光譜顯示，其峰值位于278nm(見

圖1，桑寄生提取物的紫外光譜)，僅含生物堿的桑寄生提取物的甲醇溶液20μl的高壓液相分析(C-18反向柱，檢測波長254nm)顯示其保留時間為2.56分鐘(見圖2，桑寄生提取物的高壓液相圖譜)。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明所述“過敏反應”指I型變態(tài)反應或速發(fā)型過敏反應。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明方法中所用“醇”可例如是甲醇，乙醇或丙醇等；所用“酮”可例如是丙酮，甲乙酮等。
本發(fā)明因此還涉及含有作為活性成份的有效劑量的桑寄生提取物以及常規(guī)藥物賦形劑或輔劑的藥物組合物。通常本發(fā)明藥物組合物含有0.1-90重量％的桑寄生提取物。藥物組合物可根據(jù)本領域已知的方法制備。用于此目的時，如果需要，可將桑寄生提取物與一種或多種固體或液體藥物賦形劑和/或輔劑結合，制成可作為人用的適當?shù)氖┯眯问交騽┝啃问健?br> 本發(fā)明的桑寄生提取物或含有它的藥物組合物可以單位劑量形式給藥，給藥途徑可為腸道或非腸道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮膚、腹膜或直腸等。給藥劑型例如片劑、膠囊、滴丸、氣霧劑、丸劑、粉劑、溶液劑、混懸劑、乳劑、顆粒劑、脂質體、透皮劑、口含片、栓劑、凍干粉針劑等?？梢允瞧胀ㄖ苿?、緩釋制劑、控釋制劑及各種微粒給藥系統(tǒng)。為了將單位給藥劑型制成片劑，可以廣泛使用本領域公知的各種載體。關于載體的例子是，例如稀釋劑與吸收劑，如淀粉、糊精、硫酸鈣、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化鈉、葡萄糖、尿素、碳酸鈣、白陶土、微晶纖維素、硅酸鋁等；濕潤劑與粘合劑，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉漿、糊精、糖漿、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯膠漿、明膠漿、羧甲基纖維素鈉、紫膠、甲基纖維素、磷酸鉀、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解劑，例如干燥淀粉、海藻酸鹽、瓊脂粉、褐藻淀粉、碳酸氫鈉與枸櫞酸、碳酸鈣、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸鈉、甲基纖維素、乙基纖維素等；崩解抑制劑，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氫化油等；吸收促進劑，例如季銨鹽、十二烷基硫酸鈉等；潤滑劑，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸鹽、硼酸、液體石蠟、聚乙二醇等。還可以將片劑進一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、腸溶包衣片，或雙層片和多層片。為了將給藥單元制成丸劑，可以廣泛使用本領域公知的各種載體。關于載體的例子是，例如稀釋劑與吸收劑，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氫化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、Gelucire、高嶺土、滑石粉等；粘合劑如阿拉伯膠、黃蓍膠、明膠、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解劑，如瓊脂粉、干燥淀粉、海藻酸鹽、十二烷基磺酸鈉、甲基纖維素、乙基纖維素等。為了將給藥單元制成栓劑，可以廣泛使用本領域公知的各種載體。關于載體的例子是，例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高級醇、高級醇的酯、明膠、半合成甘油酯等。為了將給藥單元制成膠囊，將有效成分桑寄生提取物與上述的各種載體混合，并將由此得到的混合物置于硬的明明膠囊或軟膠囊中。也可將有效成分桑寄生提取物制成微囊劑，混懸于水性介質中形成混懸劑，亦可裝入硬膠囊中或制成注射劑應用。為了將給藥單元制成注射用制劑，如溶液劑、乳劑、凍干粉針劑和混懸劑，可以使用本領域常用的所有稀釋劑，例如，水、乙醇、聚乙二醇、1，3-丙二醇、乙氧基化的異硬脂醇、多氧化的異硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，為了制備等滲注射液，可以向注射用制劑中添加適量的氯化鈉、葡萄糖或甘油，此外，還可以添加常規(guī)的助溶劑、緩沖劑、pH調(diào)節(jié)劑等。
此外，如需要，也可以向藥物制劑中添加著色劑、防腐劑、香料、矯味劑、甜味劑或其它材料。
本發(fā)明桑寄生提取物的給藥劑量取決于許多因素，例如所要預防或治療過敏反應疾病的性質和嚴重程度，患者或動物的性別、年齡、體重及個體反應，所用的具體化合物，給藥途徑及給藥次數(shù)等。上述劑量可以單一劑量形式或分成幾個，例如二、三或四個劑量形式給藥。
下面的實施例及生物活性實驗用來進一步說明本發(fā)明，但這并不意味著對本發(fā)明的任何限制。實施例1桑寄生提取物的制備1kg桑寄生粉，加入3倍量的二氯甲烷浸泡，脫脂，浸泡反復數(shù)次，去除脂溶物質。過濾，棄去濾液，保留濾餅。
濾餅用三倍量的乙醇浸泡數(shù)次，抽濾，濾餅棄去，濾液減壓濃縮至干，得桑寄生粗提品120克。
桑寄生粗提物40克，溶于蒸餾水中，通過大孔吸附樹脂，分去雜質，用乙醇解吸附，收集洗脫液，減壓蒸干，得產(chǎn)品桑寄生提取物3.4克。
將上述提取物溶于甲醇，通過纖維素柱，用0.05M的磷酸三鈉洗脫，收集第二個色帶，洗脫液除去磷酸三鈉，得到精制的桑寄生提取物0.33克。
桑寄生1kg，得到粗提品120g，第一步純化得11.2g，第二步純化得到1g，總收率0.1％。
生物活性一桑寄生提取物抑制細胞蛋白激酶C的活性桑寄生提取物抑制紅白血病K-562細胞的發(fā)泡反應將K-562細胞培養(yǎng)在96孔培養(yǎng)板上，用蛋白激酶C激活劑佛波醇酯激活時，細胞膜出現(xiàn)囊泡，蛋白激酶C的抑制劑可以抑制囊泡的形成，結果見表1，由表1中數(shù)據(jù)可看到桑寄生提取物可以顯著地抑制K-562細胞受佛波醇酯刺激形成的囊泡。因此，桑寄生提取物是蛋白激酶C的抑制劑。
用人白血病細胞HL-60的PKC分析系統(tǒng)檢查桑寄生提取物的活性，結果見表2，由表2可看到桑寄生提取物對HL-60細胞的蛋白激酶C也有明顯的抑制作用，抑制率達68％。
二桑寄生提取物提高細胞蛋白激酶A的活性1.桑寄生提取物可提高紅白血病K-562細胞的c-AMP的含量6.94倍。具體結果見表3。
2.桑寄生提取物在無細胞的情況下，可以表現(xiàn)出c-AMP的活性，結果見表4，表4說明桑寄生提取物本身就具有″c-AMP″樣作用。
3.桑寄生提取物對人白血病HL-60細胞中蛋白激酶A的活性有顯著增強作用，結果見表5，表5中數(shù)據(jù)說明桑寄生提取物80μg/ml可以提高蛋白激酶A活性4.22倍。
三.桑寄生提取物抑制大鼠肥大細胞脫顆粒桑寄生提取物能提高細胞內(nèi)c-AMP水平，激活蛋白激酶A，同時能抑制細胞內(nèi)蛋白激酶C的活性，說明它可以穩(wěn)定細胞膜。肥大細胞脫顆粒反應，是過敏反應的重要環(huán)節(jié)。穩(wěn)定肥大細胞的細胞膜的藥物可用于過敏的防治。
1.桑寄生提取物可以顯著地抑制大鼠肥大細胞的脫顆粒反應，且呈劑量依賴關系，結果見表6，由表6可看到桑寄生提取物半數(shù)抑制濃度為10.28μg/ml。
2.桑寄生提取物抑制脫顆粒的能力明顯優(yōu)于陽性對照藥色甘酸鈉，在相同的劑量下，是色甘酸鈉的1.9倍。結果見表7。表1 桑寄生提取物對佛波醇酯誘導的K-562胞囊泡形成的影響組別 對照細胞細胞＋佛波醇酯細胞＋桑寄生提取物+佛波醇酯細胞數(shù) 104104104目測評價 - +++++表2 桑寄生提取物對HL-60胞的PKC活性的影響組別 總PKC活性 抑制(％)(pmol/min)對照細胞 0.2448 -桑寄生提取物(80μg/ml)0.0773 68.42桑寄生提取物(40μg/ml)0.1460 40.36表3桑寄生提取物對K-562細胞內(nèi)c-AMP濃度的影響組別c-AMP 增減倍數(shù)pmol/40ul對照0.209-桑寄生提取物組 1.456.93色甘酸鈉組 0.163 0.78表4桑寄生提取物的″c-AMP樣″作用桑寄生提取物劑量 與結合蛋白結合的量 與結合蛋白結合的量(mg/ml) (增加30ul標準c-AMP)0.125 1.26 2.330.25 2.30 5.970.50 4.36 10.671.00 10.914.14注1桑寄生提取物與c-AMP相似，能與酶蛋白結合，且呈劑量依賴關系。
注2增加標準c-AMP可以增加與酶蛋白結合，且出現(xiàn)飽和現(xiàn)象。
表5桑寄生提取物對人白血病細胞HL-60的蛋白激酶A(PKA)的影響組別 相對活性 增加的倍數(shù)對照組11.17桑寄生提取物(80μg/ml)47.14 4.22桑寄生提取物(40μg/ml)34.94 3.13表6桑寄生提取物對大鼠肥大細胞(Con A激活)脫顆粒的影響組別劑量組胺釋放 抑制率μg/ml (發(fā)射光讀數(shù)) ％對照組 - 36.0259.25 74桑寄生提取物 12.5 15.2 586.25 23.45 353.125 29.4 18劑量與抑制率的關系抑制率＝0.0014[濃度]2＋0.0635[濃度]半數(shù)抑制濃度為10.28μg/ml。
表7桑寄生提取物與色甘酸鈉抑制肥大細胞脫顆粒的比較組別 劑量 組胺釋放 抑制率Pμg/ml (發(fā)射光讀數(shù)) ％對照組 - 39.35+/-1.350色甘酸鈉組 2524.15+/-1.27438.63桑寄生提取物2510.26+/-1.04073.93＜0.000權利要求
1.用于預防或抗過敏反應的桑寄生提取物。
2.用于預防或抗過敏反應的藥物組合物，其包括桑寄生提取物及藥用載體或賦形劑。
3.權利要求1的桑寄生提取物，其中過敏反應指I型變態(tài)反應或速發(fā)型過敏反應。
4.權利要求2的藥物組合物，其中過敏反應指I型變態(tài)反應或速發(fā)型過敏反應。
5.桑寄生提取物在制備用于預防或抗過敏反應的藥物中用途。
6.權利要求5的用途，其中過敏反應是I型變態(tài)反應或速發(fā)型過敏反應。
7.桑寄生提取物的制備方法，其包括i)將粉狀桑寄生用選自石油醚、乙烷、二氯甲烷、氯仿、苯或甲苯的提取，去除脂溶脂物質，過濾，棄去濾液，保留濾餅，ii)將i)中濾餅用選自醇或酮的有機溶劑提取，過濾，棄去濾餅，濾液減壓濃縮，得桑寄生提取物，或先進行ii)中處理，再進行i)處理，得所要桑寄生提取物；iii)如需要，將上面得到的桑寄生提取物通過大孔吸附樹脂和纖維素柱純化。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于預防或抗過敏反應的桑寄生提取物,含它的藥物組合物,桑寄生提取物在制備用于抗過敏反應的藥物中的用途,及桑寄生提取物的制備方法。
文檔編號A61P37/00GK1329899SQ0011930
公開日2002年1月9日 申請日期2000年6月27日 優(yōu)先權日2000年6月27日
發(fā)明者許津, 馬瑜, 徐榕, 姚晨, 張煒, 張秀敏 申請人:中國醫(yī)學科學院醫(yī)藥生物技術研究所