專(zhuān)利名稱(chēng)：腦炎病毒蛋白及其編碼基因與一種應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種腦炎病毒蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腦炎是由病毒直接侵犯或由病毒或其他異種蛋白引發(fā)的超敏反應(yīng)所致的大腦急性炎癥性疾病。腦炎可以是病毒性感染原發(fā)的臨床表現(xiàn)，或者是繼發(fā)的臨床表現(xiàn)，引起原發(fā)的腦炎的病毒有脊髓灰質(zhì)炎病毒，?？刹《?、柯薩奇病毒等流行性病毒，或散發(fā)性的通過(guò)蚊子、蝶等節(jié)肢動(dòng)物傳播的黃病毒屬的森林腦炎和批膜病毒科甲病毒屬的東方馬腦炎病毒 坐寸o甲病毒為披膜病毒科(Togaviridae)甲病毒屬(Alphavirus)成員，以蚊蝶等吸血昆蟲(chóng)為傳播媒介，可引起多種人畜共患傳染病。近年來(lái)，國(guó)外已對(duì)多株甲病毒部分或全部序列測(cè)序。國(guó)內(nèi)對(duì)這類(lèi)病毒的分子生物學(xué)研究亦取得一定的結(jié)果。已有的研究結(jié)果表明該病毒屬中和抗體決定簇主要集中在結(jié)構(gòu)蛋白El和E2等糖蛋白上，其中E2蛋白上所占比例更高。加之近年來(lái)腺病毒載體因具有安全性好、宿主范圍廣、感染效率高等多種優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于基因治療和基因工程疫苗研究，為此我們分析比較了多株甲病毒核苷酸序列，人工合成了同源性較高的3kb的核苷酸，利用腺病毒載體構(gòu)建重組基因工程疫苗，為預(yù)防和治療疾病奠定了基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種與腦炎病毒疫苗相關(guān)蛋白及其編碼基因。本發(fā)明提供的蛋白QE，人工合成，是如下I)或2)的蛋白I)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白；2)將序列2的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由I)衍生的蛋白質(zhì)。序列表中的序列2由982個(gè)氨基酸殘基組成，所述一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過(guò)10個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。上述蛋白質(zhì)QE的編碼基因也是本發(fā)明保護(hù)的范圍，所述編碼基因?yàn)槿缦?)-4)中任一所示的基因I)序列表中序列I所示的DNA分子；2)序列表中序列I自5’末端第1-2946位核苷酸所示的DNA分子；3)在嚴(yán)格條件下與I)或2)限定的DNA分子雜交且具有相同功能的DNA分子；4)與I)或2)限定的DNA序列至少具有90%同源性且具有相同功能的DNA分子。含有上述編碼基因的重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、重組菌、表達(dá)盒或重組病毒也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。所述重組載體為pAdeasy-1和重組穿梭質(zhì)粒經(jīng)過(guò)同源重組得到的；所述重組穿梭質(zhì)粒是在載體PShuttle-CMV的KpnI和HindIII酶切位點(diǎn)間插入所述編碼基因得到的。所述重組病毒為重組腺病毒；所述重組腺病毒為將上述蛋白的編碼基因轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞獲得的重組腺病毒。所述宿主細(xì)胞為真核細(xì)胞，優(yōu)選為離體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，尤其優(yōu)選為HEK-293細(xì)胞。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種疫苗。
本發(fā)明提供的疫苗，其活性成分為如下任意一種I)所述的蛋白；2)所述編碼基因；3)所述重組腺病毒。上述重組腺病毒在制備疫苗中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。所述疫苗為腦炎病毒疫苗。上述重組腺病毒在制備提高IFN-Y活性的增強(qiáng)劑中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，從腦炎病毒克隆出QE通過(guò)轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞而組裝成攜帶有目標(biāo)抗原基因的重組腺病毒vAd-QE。重組腺病毒vAd-QE感染293細(xì)胞能有效表達(dá)目的蛋白；通過(guò)滴鼻途徑接種BalB/C小鼠，利用間接免疫熒光技術(shù)檢測(cè)特異性抗體水平，結(jié)果表明，所構(gòu)建的重組腺病毒雖然產(chǎn)生特異性抗體的時(shí)間和維持的水平有所不同，但均產(chǎn)生了較好體液免疫反應(yīng)，為進(jìn)一步開(kāi)展免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)提供了重要的數(shù)據(jù)支持。由于病毒在機(jī)體內(nèi)極微量的蛋白表達(dá)即可激起免疫反應(yīng)，因此構(gòu)建的攜帶有腦炎病毒結(jié)構(gòu)基因的重組腺病毒vAd-QE，有希望成為腦炎基因工程疫苗的候選疫苗株。


圖1為pAdtrack-QE酶切鑒定2為重組質(zhì)粒Pac I酶切和PCR鑒定
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。東部馬腦炎病毒(EasternEquine Encepha lomyelitis virus)(HE Jing;CHANGGuoHui;WU Jin Song;LI ZhongDuo;ZHU QingYu Cloning and expression of E2gene ofeastern equine encephalomyelitis virus.Bulletin of The Academy of Mili taryMedical Sciences. 2002. 02.公眾可從中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所獲得。)HEK-293細(xì)胞(Invitrogen公司產(chǎn)品，Cat. No. R750-07);實(shí)驗(yàn)所需限制性?xún)?nèi)切酶分別購(gòu)自TaKaRa和Biolabs公司；脂質(zhì)體Lipofectamin2000購(gòu)自Invitrogen公司；Platinum pfx Taqase 購(gòu)自 Invitrogen 公司。實(shí)施例1、重組腺病毒(vAd-QE)的獲得1、含有目的基因pAdtrack-QE的構(gòu)建及鑒定
根據(jù)東部馬腦炎病毒(EasternEquine Encephalomyelitis virus) (NC-001547)的基因組序列，突變序列中的多個(gè)位點(diǎn)，設(shè)計(jì)出序列表中的序列I，人工合成出序列I。設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增編碼QE蛋白的基因，引物序列(引物分別含有KpnI和Hindi II酶切位點(diǎn))見(jiàn)下QE-F: 5，ACGGggtaccATGGCATCACTAGTGACCACCATGTGT-3，QE-R: 5，ACCCaagcttTGCCAATTGCTGCTGTATTC-3，以人工合成出序列I的DNA為模板，利用QE-F和QE-R引物對(duì)進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，得到了預(yù)期大小一致的片段，約為3Kb。經(jīng)測(cè)序，該P(yáng)CR產(chǎn)物具有序列表中的序列I自5’末端第1-2967位核苷酸，將該P(yáng)CR產(chǎn)物的基因命名QE，其OFR為序列I的自5’末端第1-2946位核苷酸，該基因編碼的蛋 白命名為QE，該蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2，序列2由982個(gè)氨基酸殘基組成。回收PCR產(chǎn)物，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行加“A”處理，處理后的PCR樣品與pMD_18T載體(TaKaRa公司產(chǎn)品，Code:D101A. Lot CK3201A)相連，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性菌落提取質(zhì)粒后測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果為該質(zhì)粒為將序列表中序列I的自5’末端第1-2967位核苷酸插入pMD-18T得到的，命名為pTQE。用KpnI 和 HindIII 雙酶切重組質(zhì)粒 pTQE 和質(zhì)粒 pShuttle-CMV (Invitrogen公司產(chǎn)品，Catalog#240007),酶切產(chǎn)物分別用凝膠回收試劑盒切膠回收，并在T4DNA連接酶作用下于16°C連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHlOB (Invitrogen公司產(chǎn)品，Cat.No. 18290-015)后挑選陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果為該質(zhì)粒為將序列表中序列I的自5’末端第1-2967位核苷酸插入pShuttle-CMV的KpnI和HindIII酶切位點(diǎn)間得到的載體，命名為 pAdtrack-QE。將pAdtrack-QE進(jìn)行酶切驗(yàn)證，酶切產(chǎn)物經(jīng)過(guò)1%DNA凝膠電泳。結(jié)果見(jiàn)圖1 所示，其中 1、DL2000 (Marker 條帶分別為 2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp 和 IOObp ;2、KpnI+Hindlll 消化 pAdtrack-QE ;3、EcoRII+EcoRV 消化pAdtrack-QE ;4、SalI+XbaI 消化 pShuttle-CMV ;5、DL15000 (Marker 條帶分別為 15000bp、10000bp、7500bp、2500bp、IOOObp和250bp)，從圖中看出，泳道I酶切后的產(chǎn)物顯示兩條電泳帶一條為質(zhì)粒載體帶，大小9Kb，另一條為克隆的目的基因帶，大小約為3Kb，與相應(yīng)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小一致，進(jìn)一步表明已成功的將QE基因(序列表中的序列I自5’末端第1-2967位核苷酸)克隆至質(zhì)粒pShuttle-CMV得到pAdtrack-QE。2、重組腺病毒載體的構(gòu)建菌BJ5183購(gòu)自上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司，貨號(hào)為GMS12223. 2。將腺病毒骨架質(zhì)粒pAdeasy-1 (Invitrogen 公司產(chǎn)品，Catalog#240005,含有 GFP報(bào)告基因)經(jīng)過(guò)PacI (購(gòu)自Biolabs公司，貨號(hào)為R05647S)酶切后，轉(zhuǎn)入宿主菌BJ5183中，得到含有腺病毒骨架質(zhì)粒pAdeasy-1的宿主菌BJ5183。將上述pAdtrack-QE和穿梭質(zhì)粒pShuttle-CMV分別用PmeI (購(gòu)自Biolabs公司，貨號(hào)為R0560S)經(jīng)37°C充分消化，使用Gel Extraction kit試劑盒(購(gòu)自O(shè)MGEA公司，貨號(hào)為D2500-01)回收線(xiàn)性化的 pAdtrack-QE 和 pShuttle-CMV。將線(xiàn)性化的質(zhì)粒pAdtrack-QE電轉(zhuǎn)化到含有腺病毒骨架質(zhì)粒pAdeasy-1的宿主菌BJ5183感受態(tài)細(xì)胞中，由于大腸桿菌BJ5183具有Sm抗性，pAdeasy-1具有Amp抗性，而重組質(zhì)粒pAdtrack-QE和穿梭載體質(zhì)粒pShuttle-CMV具有Kan抗性,在重組過(guò)程中穿梭質(zhì)粒上的Kan抗性取代了 pAdeasy-1上的Amp抗性，因此根據(jù)Kan和Sm雙重抗性來(lái)篩選陽(yáng)性克隆，得到的陽(yáng)性克隆。提取轉(zhuǎn)入線(xiàn)性化的質(zhì)粒pAdtrack-QE的陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒進(jìn)行Pac I酶切鑒定，1%DNA凝膠電泳結(jié)果見(jiàn)圖2A所示，其中1:DL15000Marker2 pAdTrack-QE3 :陽(yáng)性克隆質(zhì)粒4 pShuttle-CMV5 :pAdeaSy-l。從圖中可以看出，泳道3酶切后產(chǎn)生兩個(gè)片度，小片度大小為4. 5Kb左右，含有復(fù)制子和卡那霉素抗性基因，大片度為含有目的基因QE的病毒骨架，大小約36Kb (病毒骨架大小約33. 5Kb而目的基因QE3Kb)，將該重組質(zhì)粒命名為重組質(zhì)粒pAd-QE;泳道2重組穿梭質(zhì)粒pAdTack-QE經(jīng)過(guò)Pac I酶切后，產(chǎn)生2個(gè)片段，其中一個(gè)含有目的基因QE約9Kb，另一個(gè)片段含有穿梭質(zhì)粒pShuttle-CMV上的復(fù)制子和卡那霉素抗性基因大小約3Kb。 提取轉(zhuǎn)入線(xiàn)性化的質(zhì)粒pAdtrack-QE的陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，引物為QE-F、QE-R (請(qǐng)核實(shí))，結(jié)果見(jiàn)圖 2B :1 DL15000Marker2 pShuttle-CMV3 pAdTrack-QE4 pAd-QE5 :pAdeasy_l,可以看出，重組質(zhì)粒pAd_QE可擴(kuò)增出與預(yù)期的目的片度3Kb,進(jìn)一步說(shuō)明已經(jīng)成功構(gòu)建攜帶有目的基因QE的重組腺病毒骨架質(zhì)粒pAd-QE。3、組裝成重組腺病毒將HEK-293細(xì)胞接種到6孔板中，37 °C培養(yǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)至60%_70%，用脂質(zhì)體Lipofectamin2000 (購(gòu)自Invitrogen公司)介導(dǎo)重組腺病毒骨架質(zhì)粒pAd-QE轉(zhuǎn)染入細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染完成7-10天后，收集細(xì)胞，經(jīng)3輪反復(fù)凍融，離心收集上清液，即為含有目的基因的重組腺病毒vAd-QE。轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，培養(yǎng)7-10天，定期在熒光顯微鏡下檢測(cè)是否產(chǎn)生熒光，判斷轉(zhuǎn)染是否成功，由于該重組病毒上含有綠色熒光蛋白(GFP)的報(bào)告基因，因此可以說(shuō)明一旦有熒光就表示轉(zhuǎn)染成功。4、重組腺病毒vAd-QE的擴(kuò)增及目的蛋白的表達(dá)I)重組腺病毒vAd-QE的擴(kuò)增將上述3獲得的轉(zhuǎn)染完成7-10天后，收集細(xì)胞，經(jīng)3輪反復(fù)凍融，離心收集上清液，即為重組腺病毒vAd-QE，進(jìn)行下一代擴(kuò)增，連續(xù)擴(kuò)增3代，第二次收集上清液，比第一次
數(shù)量增多。2)目的蛋白的表達(dá)取200ul上述獲得的第二次收集的上清液(重組腺病毒vAd-QE，病毒的濃度為L(zhǎng)gTCID5tlA). 2ml=8. 0)感染5xl06的HEK-293細(xì)胞，4天后，收集細(xì)胞。細(xì)胞經(jīng)處理后進(jìn)行SDS-PAGE電泳。結(jié)果經(jīng)SDS電泳，得到大小為110KD的蛋白(QE蛋白)，與預(yù)期蛋白的大小一致。說(shuō)明重組腺病毒有效的介導(dǎo)QE在細(xì)胞中表達(dá)。采用同樣的方法將上述線(xiàn)性化的pShuttle-CMV和pAdeasy-1共同轉(zhuǎn)入宿主菌BJ5183感受態(tài)細(xì)胞中，得到重組腺病毒載體，記作pAd-GFP ;將pAd_GFP轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞，獲得陰性對(duì)照腺病毒vAd-GFP。對(duì)照腺病毒vAd-GFP中無(wú)QE蛋白表達(dá)；實(shí)施例2、重組腺病毒(vAd-QE)的滴鼻接種中和抗體測(cè)定6-7周齡的BALB/c小鼠隨機(jī)分為3組，分別為vAd_GFP對(duì)照組、vAd-QE免疫組和PBS對(duì)照組，每組20只小鼠。vAd-GFP對(duì)照組拭鼻方式感染20ul由實(shí)施例1獲得對(duì)照腺病毒vAd-GFP(108pfu)ovAd-QE免疫組拭鼻方式感染20ul由實(shí)施例1獲得的重組腺病毒(vAd_QE)(108pfu)oPBS對(duì)照組拭鼻方式感染20ulPBS溶液(0. 01M/L pH7. 2)一、血清和淋巴細(xì)胞檢測(cè)將3個(gè)小組在第一次免疫后的第4周加強(qiáng)免疫一次。在免疫后每間隔一周時(shí)間通過(guò)尾靜脈采集小鼠血液，離心后分別收集血清和淋巴細(xì)胞沉淀。
1、間接免疫熒光試驗(yàn)測(cè)定免疫小鼠血清中病毒的抗體反應(yīng)用東部馬腦炎病毒(EasternEquine Encephalomyelitis virus)感染的HEK-293制備抗原片，制備的方法如下所述實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備把抗原片擺放在抗原架上，每個(gè)架上排放2排，I排4個(gè)，完畢后用罩子蓋上防止灰塵的進(jìn)入。之后按照下面步驟進(jìn)行I)待75cm2方瓶的HEK-293細(xì)胞生長(zhǎng)至80%左右的時(shí)候，用東部馬腦炎病毒2ml感染細(xì)胞I小時(shí)后，吸出吸附液，補(bǔ)加新鮮的細(xì)胞維持液，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；2)當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變的時(shí)候(約25% — 50%)，按照細(xì)胞傳代的方法消化細(xì)胞，用適量體積的培養(yǎng)液(含有10%胎牛血清的DMEM細(xì)胞生長(zhǎng)液，具體配方向500mlDMEM液體中加入 50ml 胎牛血清、100X Antibiotic-Antimycotic、100X NEAA> IOOul HEPES,之后用實(shí)驗(yàn)室配制的經(jīng)過(guò)0. 22um濾膜過(guò)濾除菌的7. 5% (質(zhì)量百分含量)NaHCO3調(diào)節(jié)溶液的pH值至7. 0—7. 2，上述液體均為GIBCO公司產(chǎn)品);3ml)懸浮細(xì)胞，每個(gè)抗原孔加入40ul細(xì)胞懸液，蓋上蓋子后放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)8小時(shí)；3)取一燒杯內(nèi)盛PBS溶液(0. 01mol/L pH=7. 2)，將吸附后的抗原片緩緩放入溶液中，浸泡Imin左右,取出放在工作臺(tái)內(nèi)晾干,約需30min ；4)將抗原片放入盛有丙酮(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司分析純濃度99. 5%)的燒杯中，-20 0C 30min或者過(guò)夜；5)取出晾干后保存于低溫(_40°C以下)冰箱中備用。間接免疫熒光法采集小鼠全血后放置于37°C培養(yǎng)箱孵育30min，經(jīng)SOOrpm離心15min后吸取上清得到血清。之后將血清按照實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行稀釋后進(jìn)行間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)，具體實(shí)驗(yàn)步驟如下I)從冰箱中取出抗原片，肉眼觀察上面的細(xì)胞是否脫落，如果有脫落孔，放棄不用；2)在抗原片上用蠟筆在吸附有抗原的畫(huà)圈周?chē)鷦澮蝗?，防止所加樣品溢流?)根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需要稀釋所檢測(cè)的血清后加樣，每孔20-25ul，一般需要做復(fù)孔，故需要50ul，根據(jù)需要做倍比稀釋?zhuān)皇诐舛劝凑?:10，故需要加入IOul血清+90ul抗體稀釋液，在漩渦混合器上充分混勻后取出50ull:10稀釋液+50ul血清稀釋液(1: 20)，依此稀釋下去，一般稀釋至1:160 ；4)把已經(jīng)加樣的抗原片放入鋪有塑料板的飯盒中，放入37°C、5%C02培養(yǎng)箱中孵育30min ；5)取出抗原片，放入洗板槽內(nèi)，向里面加入洗滌液(0. 005M PBS+0. 02%(體積百分含量)Tween20)，在水平振蕩器上洗滌5min，重復(fù)3次；
6)待抗原片完全風(fēng)干后，加入1:50稀釋的滅光抗體25ul/孔，放入飯盒后在37 C、5%C02培養(yǎng)箱中孵育30min ；熒光抗體的稀釋取出針對(duì)所加入血清來(lái)源的適量熒光抗體，用0. 02%(質(zhì)量百分含量)伊文斯蘭溶液按照1:50稀釋抗體，該實(shí)驗(yàn)所使用的抗體為FITC-conjugate-GoatAnt1-Human IgG 購(gòu)自 Sigma 公司。7)重復(fù)步驟5);8)風(fēng)干后，滴加無(wú)菌水在熒光顯微鏡下觀察熒光情況并記錄結(jié)果。利用間接免疫熒光試驗(yàn)測(cè)，結(jié)果顯示在首 次免疫I周后小鼠血清抗體水平開(kāi)始升高，血清效價(jià)為1:20，在首免2周后血清效價(jià)達(dá)至1:80，3周后降至較低水平；血清效價(jià)為1:30。加強(qiáng)免疫后，抗體水平再次迅速升高，升高幅度比首次免疫整體要高，血清效價(jià)達(dá)到I 160。對(duì)照組vAd-GFP和PBS始終未檢測(cè)出特異性抗體(小于1:10)。2、流式分析淋巴細(xì)胞中⑶/、⑶/數(shù)流式分析淋巴細(xì)胞中⑶/、⑶/數(shù)，結(jié)果如下免疫小鼠中，vAd-QE免疫I周后⑶/淋巴細(xì)胞占總淋巴細(xì)胞的10%，2周以后恢復(fù)至正常水平約占5%，加強(qiáng)免疫后，vAd-QE免疫組⑶/淋巴細(xì)胞開(kāi)始持續(xù)升高，占總淋巴細(xì)胞的10%并在加免4周后達(dá)至30%，而PBS對(duì)照組⑶/淋巴細(xì)胞一直占總淋巴細(xì)胞的5%。免疫組小鼠中，vAd-QE免疫I周后達(dá)至高峰，⑶8+淋巴細(xì)胞占總淋巴細(xì)胞的16%，隨后恢復(fù)至正常水平約占2%，在首免后3周⑶/淋巴細(xì)胞數(shù)量再次升高占總淋巴細(xì)胞的3% ；加強(qiáng)免疫后，vAd-QE免疫組OT8+淋巴細(xì)胞開(kāi)始持續(xù)升高，在免疫I周后達(dá)至峰值約占總淋巴細(xì)胞的12%，隨后緩慢下降至正常水平2%，3周后又緩慢升至較高水平約占8%。vAd-GFP對(duì)照組在首免后CD8+淋巴細(xì)胞數(shù)量變化則不明顯。PBS對(duì)照組則無(wú)顯著變化。二、利用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)(ELISP0T)對(duì)細(xì)胞因子生成細(xì)胞進(jìn)行定量加強(qiáng)免疫4周后，每組隨機(jī)挑選4只小鼠，處死后立即無(wú)菌采取脾臟，加入IOml含有10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液(含有10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液向500ml RPMIMEDIUM1640 液體中加入 50ml 胎牛血清、100X Antibiotic-AntimycoticUOOX NEAAUOOuIHEPES，之后用實(shí)驗(yàn)室配置的經(jīng)過(guò)過(guò)濾除菌的7. 5% NaHCO3(質(zhì)量百分比)調(diào)節(jié)溶液的pH值為7. 0—7. 2 ;上述 RPMI MEDIUM1640、胎牛血清、100X Antibiotic-AntimycoticUOOX NEAA,HEPES均為GIBCO公司產(chǎn)品；RPMI MEDIUM1640GIBC0公司產(chǎn)品，L0T:8109086)，將脾組織通過(guò)200目銅網(wǎng)制成細(xì)胞懸液,收集到無(wú)菌的離心管中，15000rpm/min離心5min,棄上清液后用1640培養(yǎng)基離心洗滌細(xì)胞兩次，最后將脾細(xì)胞稀釋成2 X IO7個(gè)/ml，制成細(xì)胞懸液備用。以細(xì)胞培養(yǎng)的東部馬腦炎病毒作為特異刺激因子(將2 X IO7個(gè)/ml個(gè)脾細(xì)胞IO8Pfu的東部馬腦炎病毒混合，共同孵育48小時(shí)，按照ELISP0T實(shí)驗(yàn)的操作，脾細(xì)胞與特異的刺激因子要分別加入到孔中，之后在孔內(nèi)反應(yīng)，不能在孔外混合后加入其內(nèi))，利用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)(ELISP0T)對(duì)細(xì)胞因子生成細(xì)胞進(jìn)行定量。具體的實(shí)驗(yàn)步驟1. Coating antibody (包被抗體)無(wú)菌條件下進(jìn)行用Coating buffer (I XPBS pH7. 2)稀釋 capture 抗體(200 倍)，終濃度 5ug/ml 包被板子，每孔加IOOul稀釋的capture抗體4°C過(guò)夜。2. Blocking (封閉)無(wú)菌條件下進(jìn)行
吸干孔中包被液，洗板子，每孔加入200ul Blocking溶液，洗孔一次。(在滅菌吸水紙上扣干)3. CellActivation (刺激細(xì)胞)無(wú)菌條件下進(jìn)行3.1棄Blocking溶液，準(zhǔn)備刺激用的抗原，用組織完全培養(yǎng)基稀釋適宜濃度50ug/ml，每孔加入IOOul ；(不要拍板子)3. 2準(zhǔn)備I X IO6個(gè)脾細(xì)胞懸液，每孔加入IOOul ；(注避免震動(dòng))3. 3蓋上蓋子，板子放置37°C，5%C02, 99%濕度的培養(yǎng)箱根據(jù)細(xì)胞情況培養(yǎng)48小時(shí)。(注時(shí)刻避免碰撞)
4. Detection antibody (檢測(cè)抗體)4.1在無(wú)菌條件下吸去細(xì)胞懸液，用去離子水(冰冷的去離子水，低滲法裂解細(xì)胞)洗2遍，每遍浸泡3-5min，以下實(shí)驗(yàn)操作可以拿到超凈工作臺(tái)外進(jìn)行；4. 2 每孔用 200ul wash buffer I 洗 3 遍，棄 wash buffer I (最后一遍后拍干)4. 3 稀釋 Detection 抗體，用稀釋 buffer (I XPBS+10%FBS) 250 倍稀釋?zhuān)K濃度2ug/ml。每孔加入 IOOul ；4. 4蓋上蓋子，室溫培養(yǎng)2小時(shí)。5.加入酶連抗體5.1棄Detection抗體溶液，每孔用200ul wash buffer I洗3遍。(最后一遍拍干);5. 2 用稀釋 buffer 稀釋 Streptavidin-HRP (用稀釋 buffer (I XPBS+10%FBS)稀釋100倍。現(xiàn)用現(xiàn)配，用完多余的棄之)每孔加IOOul ；5. 3蓋上蓋子，室溫培養(yǎng)I小時(shí)。6.結(jié)果檢測(cè):6.1 棄 Streptavidin-HRP 溶液，每孔用 200ul wash buffer I 洗 4 遍；6. 2 每孔用 200ul wash buffer II洗 2 遍(最后一遍拍干)；6. 3加入底物AEC，每孔加IOOul (注意避光)?？刂瓢唿c(diǎn)形成約需要15min ；6. 4用去離子水(洗2遍)終止底物反應(yīng)；6.5室溫避光空氣吹干板子2小時(shí)-過(guò)夜，至板子全干，避光保存板子待檢測(cè)。注不要將板子放到烤箱中，防止膜發(fā)脆、破裂。)結(jié)果ELISP0T的結(jié)果是通過(guò)最后的板子出斑的數(shù)目來(lái)確定，通過(guò)分析可以看到vAd-QE免疫組出斑數(shù)目明顯增加，說(shuō)明經(jīng)東部馬腦炎病毒的刺激后，vAd-QE免疫組小鼠脾細(xì)胞分泌IFN-Y活性明顯增高，抗原刺激后vAd-QE免疫組小鼠脾細(xì)胞分泌IFN- y活性是對(duì)照vAd-GFP組的5倍，是PBS對(duì)照組的19倍(根據(jù)出斑數(shù)目來(lái)統(tǒng)計(jì)倍數(shù))。三、攻毒實(shí)驗(yàn)1、發(fā)病和存活狀況加強(qiáng)免疫4周后，vAd-GFP對(duì)照組、vAd-QE免疫組和PBS對(duì)照組的每組處死后剩余的小鼠在BSL-3實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)，再將8只小鼠為一組，分為兩組vAd-GFP對(duì)照組A :腹腔注射215個(gè)LD5tl (半數(shù)致死劑量)東部馬腦炎病毒vAd-GFP對(duì)照組B :腹腔注射21個(gè)LD5tl東部馬腦炎病毒vAd-QE免疫組A :腹腔注射215個(gè)LD5tl (半數(shù)致死劑量)東部馬腦炎病毒
vAd-QE免疫組B :腹腔注射21個(gè)LD5tl東部馬腦炎病毒PBS對(duì)照組A :腹腔注射215個(gè)LD5tl (半數(shù)致死劑量)東部馬腦炎病毒PBS對(duì)照組B :腹腔注射21個(gè)LD5tl東部馬腦炎病毒持續(xù)4周觀察小鼠發(fā)病和存活狀況。結(jié)果為加強(qiáng)免疫4周后，215個(gè)LD50的東部馬腦炎病毒攻擊后，vAd_QE免疫組A的保護(hù)效率為87. 5% (8只小鼠死亡I只小鼠)；21個(gè)LD50東部馬腦炎病毒攻擊后，vAd-QE免疫組B的保護(hù)率為100% (無(wú)小鼠死亡);對(duì)照組(vAd-GFP對(duì)照組A、vAd-GFP對(duì)照組B、PBS對(duì)照組A、PBS對(duì)照組B)均無(wú)保護(hù)作用(8只小鼠都死亡)。保護(hù)率是最后存活小鼠的數(shù)量 與其攻毒前小鼠的數(shù)量比值。2、利用BHK細(xì)胞單層測(cè)定小鼠血清中和抗體收集上述攻毒后的各組小鼠的血清，利用BHK細(xì)胞(Invitrogen公司產(chǎn)品，Cat.No. R760-07)單層測(cè)定小鼠血清中和抗體。先將免疫小鼠血清適當(dāng)稀釋后，置56°C水浴中處理30min，破壞其中的補(bǔ)體和其他不耐熱的非特異性毒性因子，然后以維持液(含有2%(體積百分比)胎牛血清的細(xì)胞維持液的配置方法向500ml DMEM液體中加入IOml胎牛血清、100X Antibiotic-AntimycoticUOOX NEAA、IOOul HEPES，之后用實(shí)驗(yàn)室配置的經(jīng)過(guò)過(guò)濾除菌的7. 5%NaHC03 (質(zhì)量百分比)調(diào)節(jié)溶液的pH值為7. 0—7. 2 ;上述DMEM、胎牛血清、100XAntibiotic-AntimycoticUOOX NEAA,HEPES均為GIBCO公司產(chǎn)品)在無(wú)菌離心管中進(jìn)行2倍連續(xù)稀釋。取100個(gè)TCID5tl東部馬腦炎病毒病毒液和等體積不同稀釋度的血清，充分混勻后置37°C孵育lh，中間上下顛倒離心管混勻液體1-2次，I小時(shí)后取出96孔板，其內(nèi)的BHK細(xì)胞已鋪滿(mǎn)單層，吸去細(xì)胞單層上的培養(yǎng)基，加入作用過(guò)的病毒-抗體混合液(即上述孵育過(guò)的混勻液體)，培養(yǎng)板上同時(shí)設(shè)陽(yáng)性和陰性對(duì)照孔(陽(yáng)性對(duì)照為用細(xì)胞維持液稀釋為100個(gè)TCID5tl的東部馬腦炎病毒病毒液，陰性對(duì)照為用細(xì)胞維持液稀釋的不同濃度的血清，空白對(duì)照為細(xì)胞維持液)。放入含有5%C02的37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察和記錄細(xì)胞病變的情況。中和實(shí)驗(yàn)檢測(cè)血清效價(jià)，具體方法如下通過(guò)顯微鏡觀察細(xì)胞的病變情況(病變時(shí)細(xì)胞膨大變圓聚集)，當(dāng)孔內(nèi)細(xì)胞病變達(dá)到90%以上記為++++，細(xì)胞病變達(dá)到75%以上記為+++，細(xì)胞病變達(dá)到50%以上記為++，細(xì)胞病變達(dá)到25%以上記為+，無(wú)細(xì)胞病變記為一，最后用Reed-Muench法計(jì)算血清的中和指數(shù)。結(jié)果接種病毒前vAd-QE免疫組A和vAd-QE免疫組B小鼠血清效價(jià)均為1:120，攻毒4周后，接種21個(gè)LD50的東部馬腦炎病毒攻擊后的vAd-QE免疫組B存活小鼠的血清效價(jià)為1:360，215個(gè)LD50東部馬腦炎病毒攻擊后的vAd-QE免疫組A的存活小鼠血清效價(jià)則為1:600。而對(duì)照組(vAd-GFP對(duì)照組A、vAd-GFP對(duì)照組B、PBS對(duì)照組A、PBS對(duì)照組B)均無(wú)特異性抗體的產(chǎn)生。結(jié)果表明，所構(gòu)建的重組腺病毒vAd-QE產(chǎn)生了較好體液免疫反應(yīng)，為進(jìn)一步開(kāi)展免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)提供了重要的數(shù)據(jù)支持。
權(quán)利要求
1.含有蛋白的編碼基因的重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、重組菌或表達(dá)盒； 所述蛋白，是如下I)或2)的蛋白 1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白； 2)將序列2的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由I)衍生的蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、重組菌或表達(dá)盒，其特征在于所述編碼基因?yàn)槿缦耡l) _a4)中任一所示的基因 al)序列表中序列I所不的DNA分子； a2)序列表中序列I自5’末端第1-2946位核苷酸所不的DNA分子； a3)在嚴(yán)格條件下與al)或a2)限定的DNA分子雜交且具有相同功能的DNA分子； a4)與al)或a2)限定的DNA序列至少具有90%同源性且具有相同功能的DNA分子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的重組載體，其特征在于所述重組載體為pAdeasy-1和重組穿梭質(zhì)粒經(jīng)過(guò)同源重組得到的；所述重組穿梭質(zhì)粒是將權(quán)利要求2中所述編碼基因插入到載體pShuttle-CMV的多克隆位點(diǎn)間得到的質(zhì)粒。
4.一種疫苗,它的活性成分為如下任意一種 a)蛋白； b)所述蛋白的編碼基因； 所述蛋白，是如下I)或2)的蛋白 1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白； 2)將序列2的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由I)衍生的蛋白； 所述蛋白的編碼基因?yàn)槿缦耡l)-a4)中任一所示的基因 al)序列表中序列I所不的DNA分子； a2)序列表中序列I自5’末端第1-2946位核苷酸所不的DNA分子； a3)在嚴(yán)格條件下與al)或a2)限定的DNA分子雜交且具有相同功能的DNA分子； a4)與al)或a2)限定的DNA序列至少具有90%同源性且具有相同功能的DNA分子。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種與腦炎病毒疫苗相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明提供的蛋白是如下1)或2)的蛋白1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白；2)將序列2的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明獲得的重組腺病毒vAd-QE有希望成為腦炎基因工程疫苗的候選疫苗。
文檔編號(hào)A61K39/12GK103014044SQ20121055301
公開(kāi)日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2010年10月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月9日
發(fā)明者常國(guó)輝, 林磊, 吳曉燕, 戶(hù)義, 張雨, 柳洪濤, 李靖, 羅彥軍, 孫偉, 康曉平, 楊銀輝, 祝慶余 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所