專利名稱：HMG-CoA還原酶抑制劑氟伐他汀在制備抗淋巴瘤藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明特別涉及HMG-CoA還原酶抑制劑氟伐他汀在制備抗淋巴瘤藥物中的應(yīng)用，屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
近年來，我國惡性淋巴瘤發(fā)病率逐年上升，在男性十大高發(fā)性惡性腫瘤中已經(jīng)上升至第9位，女性則上升至第10位，進(jìn)入十大高發(fā)腫瘤行列。在我國，惡性淋巴瘤的發(fā)病率約為7/10萬，每年新發(fā)病患者約5萬人，每年死亡人數(shù)超過2萬人，已經(jīng)成為嚴(yán)重影響國人生命安全與健康質(zhì)量的重要疾病之一。最新研究發(fā)現(xiàn)，惡性淋巴瘤細(xì)胞中由于促凋亡與抗凋亡系統(tǒng)的平衡被破壞以及促細(xì)胞生存信號(hào)通路被上調(diào)等因素的存在，從而對(duì)臨床常用的 放射療法及化學(xué)療法產(chǎn)生嚴(yán)重的抗性。因此，能夠延長淋巴瘤患者生命并能最終達(dá)到有效治療目的的替代療法與藥物是目前國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)與前沿。他汀類藥物是羥甲基戊二酰輔酶A (HMG-CoA)還原酶抑制劑，通過競爭性抑制內(nèi)源性膽固醇合成限速酶(HMG-CoA還原酶)，阻斷細(xì)胞內(nèi)羥甲戊酸代謝途徑，使細(xì)胞內(nèi)膽固醇合成減少，是目前臨床上最為經(jīng)典和有效的降脂藥物，廣泛應(yīng)用于高脂血癥的治療。近年研究發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物除具有良好的降脂作用外，其在抗腫瘤方面的應(yīng)用是目前國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)與前沿(Xu-Feng Qi, Dong-HeuiKim, Yang-Suk Yoon, Soo-Ki Kim, Dong-QingCaij Yung-Chien Tengj Kwang-YongShimj Kyu-Jae Lee. Involvement of oxidative stressin simvastatin-induced apoptosisof murine CT26 colon carcinoma cells.ToxicolLett, 2010，199(3) :277-287.)。氟伐他汀是第一個(gè)人工合成的HMG-CoA還原酶抑制劑，除具有良好的降血脂功能外，還具有良好的免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤活性。然而，氟伐他汀對(duì)淋巴瘤的調(diào)控作用與潛在分子機(jī)制仍然不清楚，目前未見相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供HMG-CoA還原酶抑制劑氟伐他汀在制備抗淋巴瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)=HMG-CoA還原酶抑制劑氟伐他汀在制備抗淋巴瘤藥物中的應(yīng)用；所述的氟伐他汀的劑型為氟伐他汀鈉鹽，其分子式為=C24H25FNNaO4 ；所述的氟伐他汀可通過誘導(dǎo)細(xì)胞核凝固、濃縮及DNA斷裂，促使膜磷脂酰絲氨酸(PS)外翻，下調(diào)線粒體膜電位水平，增強(qiáng)促凋亡相關(guān)蛋白如CaSpaSe3、PARP、Bax的活性，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的活性，激活P38MAPK信號(hào)通路，抑制Akt及Erk信號(hào)通路，上調(diào)細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平，抑制甲羥戊酸途徑等多種不同途徑而引起淋巴瘤細(xì)胞的凋亡；所述的氟伐他汀誘導(dǎo)淋巴瘤細(xì)胞凋亡的有效濃度為I. 25 20 μ M0本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果本發(fā)明提供了 HMG-CoA還原酶抑制劑氟伐他汀的新的用途，首次揭示并量化分析了氟伐他汀多方面的誘導(dǎo)淋巴瘤細(xì)胞凋亡的活性，提供了對(duì)氟伐他汀抗淋巴瘤新功能的認(rèn)識(shí)，并表明氟伐他汀的使用將為淋巴瘤的治療提供一種新的治療策略。


圖I是氟伐他汀對(duì)淋巴瘤細(xì)胞活性及細(xì)胞死亡的影響圖；其中，A為不同濃度的氟伐他汀對(duì)小鼠B淋巴瘤A20細(xì)胞株作用24h的細(xì)胞活性圖；B為不同濃度的氟伐他汀對(duì)小鼠T淋巴瘤EL4細(xì)胞株作用24h的細(xì)胞活性圖；C為不同濃度的氟伐他汀對(duì)小鼠B淋巴瘤A20細(xì)胞株作用48h的細(xì)胞活性圖；D為不同濃度的氟伐他汀對(duì)小鼠T淋巴瘤EL4細(xì)胞株作用48h的細(xì)胞活性圖；E為不同濃度的氟伐他汀對(duì)小鼠B淋巴瘤A20細(xì)胞株影響的細(xì)胞死亡率圖；F為不同濃度的氟伐他汀對(duì)小鼠T淋巴瘤EL4細(xì)胞株影響的細(xì)胞死亡率圖。
圖2是用Η0/ΡΙ雙染與激光共聚焦顯微鏡分析氟伐他汀誘導(dǎo)淋巴瘤細(xì)胞凋亡的結(jié)果圖。圖3是用Annexin V/PI雙染檢測氟伐他汀誘導(dǎo)小鼠B淋巴瘤A20細(xì)胞株的流式細(xì)胞儀檢測圖。圖4是用Annexin V/PI雙染檢測氟伐他汀誘導(dǎo)小鼠T淋巴瘤EL4細(xì)胞株的流式細(xì)胞儀檢測圖。圖5是統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果圖，其中，A為對(duì)圖3的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果圖，B為對(duì)圖4的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果圖。圖6是用流式細(xì)胞儀檢測氟伐他汀誘導(dǎo)淋巴瘤細(xì)胞產(chǎn)生的凋亡峰的結(jié)果圖，其中=A為氟伐他汀對(duì)淋巴瘤細(xì)胞A20細(xì)胞周期中凋亡峰(即sub-Gl峰)產(chǎn)生的影響圖；B為圖A的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果圖；C為氟伐他汀對(duì)淋巴瘤細(xì)胞EL4細(xì)胞周期中凋亡峰(即sub-Gl峰)產(chǎn)生的影響圖；D為圖C的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果圖。圖7是氟伐他汀促進(jìn)淋巴瘤細(xì)胞核濃縮和凝聚實(shí)驗(yàn)的結(jié)果圖，其中A為DAPI染色及熒光顯微鏡觀察實(shí)驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果圖；B為透射電鏡觀察的照片圖。圖8是氟伐他汀誘導(dǎo)淋巴瘤細(xì)胞DNA片段化實(shí)驗(yàn)的結(jié)果圖；其中A為不同濃度的氟伐他汀處理A20細(xì)胞24小時(shí)的電泳圖；B為不同濃度的氟伐他汀處理EL4細(xì)胞24小時(shí)的電泳圖；泳道I為O μ M ;泳道2為O. 625 μ M ;泳道3為I. 25 μ M ;泳道4為2. 5 μ M ;泳道5 為 5 μ M ;泳道 6 為 10 μ Μ,泳道 M 為 lOObpPlus DNA Ladder, Bioneer, Korea。圖9是氟伐他汀促進(jìn)淋巴瘤細(xì)胞的線粒體膜電位降低的結(jié)果圖；其中A為氟伐他汀處理的A20細(xì)胞的JC-I染色及流式細(xì)胞儀分析的典型結(jié)果圖；B為細(xì)胞凋亡的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果圖；C為JC-I聚合體(紅色熒光)與其單體(綠色熒光)比值的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果圖。圖10是氟伐他汀對(duì)凋亡相關(guān)蛋白活性及生存相關(guān)信號(hào)通路的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；其中A為氟伐他汀介導(dǎo)淋巴瘤細(xì)胞中促凋亡蛋白CaSpaSe3活性的時(shí)間效應(yīng)圖；B為氟伐他汀影響A20細(xì)胞中Caspase3、PARP, Bax、Bcl2等凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的結(jié)果圖；C為氟伐他汀介導(dǎo)A20細(xì)胞中促凋亡蛋白Caspase3活性的劑量效應(yīng)圖；D為氟伐他汀影響A20細(xì)胞中Akt、p38、Erk等蛋白激酶活性的結(jié)果圖。圖11是通過DCFH-DA染色及流式細(xì)胞儀分析氟伐他汀影響淋巴瘤細(xì)胞中活性氧水平的結(jié)果圖。
圖12是外源性甲羥戊酸途徑相關(guān)產(chǎn)物及抗氧化物對(duì)氟伐他汀誘導(dǎo)淋巴瘤細(xì)胞凋亡的影響結(jié)果圖，其中=A為Mev、FPP、GGPP, NAC抑制氟伐他汀介導(dǎo)的Caspase3、Akt、p38、Erk等蛋白激酶的活性圖；BSMev、FPP、GGPP、NAC可抑制氟伐他汀誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞死亡圖；C為Mev、FPP、GGPP、NAC可抑制氟伐他汀誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞DNA片段化的結(jié)果圖，其中，泳道I為氟伐他汀；泳道2為氟伐他汀+Mev ;泳道3為氟伐他汀+FPP ;泳道4為氟伐他汀+GGPP ；泳道5為氟伐他汀+NAC。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。以下實(shí)施例所使用的氟伐他汀均指氟伐他汀鈉鹽(C24H25FNNa04)。用于實(shí)驗(yàn)的淋巴瘤細(xì)胞為小鼠B淋巴瘤A20細(xì)胞株(美國ATCC)與小鼠T淋巴瘤 EL4細(xì)胞株(美國ATCC )。實(shí)施例I :氟伐他汀抑制淋巴瘤細(xì)胞的存活并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡為檢測氟伐他汀對(duì)淋巴瘤細(xì)胞生長與活性的影響，首先用EZ-CyToxCellViability Assay Kit (Daeil Lab Service Co. Ltd.，Seoul, Korea)檢測了氟伐他汀對(duì)淋巴瘤細(xì)胞A20與EL4活性的影響。具體實(shí)驗(yàn)方法為A20細(xì)胞與EL4細(xì)胞分別用含有體積百分比為10%的胎牛血清、100U · mL—1青霉素、100 μ g · mL—1鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基(BioWhittaker Inc.，Walkersville, MD, USA)接種到 96 孔板中，在 37°C、含有 5%C02 細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至80%左右的融合，更換為含體積百分比為2%胎牛血清的培養(yǎng)基，在不同濃度氟伐他汀(O 5 μ Μ)存在的情況下將細(xì)胞再培養(yǎng)2天，在每個(gè)孔中加入10 μ L的檢測試劑(試劑盒自帶)，37°C繼續(xù)培養(yǎng)2小時(shí)，于460nm波長處用酶標(biāo)儀檢測吸光值，細(xì)胞活性按照試劑盒的說明書進(jìn)行計(jì)算。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，氟伐他汀呈時(shí)間和劑量依賴性地顯著抑制淋巴瘤細(xì)胞的活性(圖IA D)。接著，用臺(tái)盼藍(lán)(Trypan blue)染色實(shí)驗(yàn)主要檢測了氟伐他汀對(duì)淋巴瘤細(xì)胞死亡的影響，具體實(shí)驗(yàn)方法為離心收集細(xì)胞并計(jì)數(shù)，取O. Iml細(xì)胞懸液加入O. Iml新鮮配制的質(zhì)量百分比O. 4%的臺(tái)盼藍(lán)染液，室溫下染色3 5分鐘；取20μ I染色的細(xì)胞懸液置血球計(jì)數(shù)板上，加蓋玻片后放在高倍鏡下觀察，死亡的細(xì)胞著淺藍(lán)色并膨大，無光澤，活細(xì)胞不著色并保持正常形態(tài)，有光澤；按照血球計(jì)數(shù)板的操作要求統(tǒng)計(jì)四個(gè)角上和中間的共5個(gè)中格內(nèi)的染色細(xì)胞和總細(xì)胞數(shù)，計(jì)算細(xì)胞死亡率。結(jié)果表明氟伐他汀可呈劑量依賴性地促進(jìn)淋巴瘤細(xì)胞的死亡(圖IE F)。實(shí)施例2 :氟伐他汀促進(jìn)淋巴瘤細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)用Hoechst 33342 (HO) /Propidium iodide (碘化丙唳，PI)雙染檢測了氟伐他汀介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞死亡。具體實(shí)驗(yàn)方法為細(xì)胞用Iyg 的HO或的PI在37°C、5%C02的條件下避光培養(yǎng)15分鐘，離心收集細(xì)胞，用質(zhì)量百分比4%的甲醛固定，4°C預(yù)冷的的PBS (O. 01M, pH7.4)洗滌，重懸，取適量細(xì)胞懸液涂于載玻片上，風(fēng)干，用VECTASH1ELDS固封劑封片，用DMI 4000熒光顯微鏡拍照觀察。將完整的淡藍(lán)色細(xì)胞核(Η0+/ΡΙ-)、濃縮或斷裂的深藍(lán)色細(xì)胞核(HP++/PI-)、濃縮或斷裂的粉紅色細(xì)胞核(Η0++/ΡΙ++)、完整的粉紅色細(xì)胞核(Η0+/ΡΙ++)分別定義為存活、早期凋亡、晚期凋亡、壞死細(xì)胞。每組實(shí)驗(yàn)取四個(gè)不同視野的共500個(gè)細(xì)胞進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。HO/PI雙染實(shí)驗(yàn)表明，氟伐他汀可顯著誘導(dǎo)淋巴瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡(圖2)。為進(jìn)一步確認(rèn)氟伐他汀介導(dǎo)的淋巴瘤細(xì)胞凋亡，用Annexin V-FITCApoptosisDetection Kit I (BD Pharmingen, San Diego, CA, USA)檢測了細(xì)胞凋亡情況,具體實(shí)驗(yàn)方法參照試劑盒說明書進(jìn)行。結(jié)果表明，氟伐他汀可以劑量依賴性地促進(jìn)A20細(xì)胞及EL4細(xì)胞發(fā)生凋亡。上述研究結(jié)果表明，氟伐他汀可通過誘導(dǎo)凋亡而發(fā)揮對(duì)A20細(xì)胞被及EL4細(xì)胞的直接殺傷效應(yīng)(圖3 5)。因?yàn)榧?xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，會(huì)在細(xì)胞周期的G0/G1期前面出現(xiàn)一個(gè)凋亡峰，即sub-Gl。因此，進(jìn)一步用PI染色及流式細(xì)胞儀分析了氟伐他汀處理對(duì)淋巴瘤細(xì)胞周期分布情況的影響。具體實(shí)驗(yàn)方法為收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌，用體積百分比75%的乙醇在-20°c固定過夜，PBS 洗漆，用 RNase A (25 μ g *mL \ BioBasic Inc.，Markham, Ontario, Canada)在 37°C孵育30分鐘，PBS洗滌后用碘化丙啶(Propidium Iodide，50 μ g .mL-1)在室溫下避光孵育30分鐘，將細(xì)胞重新懸浮于500 μ L PBS中，用流式細(xì)胞儀(CytomicsTM FC500, BeckmanCoulter)分析,細(xì)胞凋亡比例用sub-Gl期細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的比值來表示。結(jié)果表明，氟伐他汀可呈劑量依賴性地促進(jìn)sub-Gl期的細(xì)胞數(shù)量，即促進(jìn)淋巴瘤細(xì)胞的凋亡(圖6)。實(shí)施例3 :氟伐他汀可促進(jìn)淋巴瘤細(xì)胞核濃縮、凝固及DNA片段化細(xì)胞核濃縮與凝固是細(xì)胞凋亡的另一重要特征，因此，利用DAPI (V，6_ 二脒基-2-苯基吲哚)染色及熒光顯微鏡技術(shù)進(jìn)一步分析了氟伐他汀對(duì)淋巴瘤細(xì)胞核形態(tài)的影響。具體實(shí)驗(yàn)方法為2種淋巴瘤細(xì)胞(A20和EL4)分別用不同濃度的氟伐他汀(O 10 μ Μ)孵育24小時(shí)，離心收集細(xì)胞，PBS洗滌，然后用10 μ g/mL的DAPI在室溫下避光培養(yǎng)15分鐘，離心收集細(xì)胞，用質(zhì)量百分比4%的甲醛固定，預(yù)冷的PBS洗滌，重懸，取適量細(xì)胞懸液涂于載玻片上，風(fēng)干，用VECTASHIELD固封劑封片，用DMI 4000熒光顯微鏡拍照觀察。將完整的藍(lán)色細(xì)胞核、濃縮或凝聚的亮藍(lán)色細(xì)胞核分別定義為存活與凋亡細(xì)胞。每組實(shí)驗(yàn)取四個(gè)不同視野的共200個(gè)細(xì)胞進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。DAPI染色實(shí)驗(yàn)表明，氟伐他汀可顯著誘導(dǎo)淋巴瘤細(xì)胞的細(xì)胞核發(fā)生濃縮、凝聚及碎裂，即發(fā)生凋亡(圖7A)。此外，還用TEM技術(shù)進(jìn)一步分析了氟伐他汀所介導(dǎo)的淋巴瘤細(xì)胞核濃縮與凝固。具體實(shí)驗(yàn)方法為2種淋巴瘤細(xì)胞分別用不同濃度的氟伐他汀(O 10 μ M)孵育24小時(shí)，離心收集細(xì)胞，PBS洗滌，然后用體積百分比2. 5%的戊二醛(SigmaCo.，Ltd.，USA)固定24小時(shí)，用0. 1M、ρΗ7· 4的PBS洗滌，再用質(zhì)量百分比1%的四氧化鋨(PolyscienceCo.，Ltd.，USA)固定，隨后用低濃度(質(zhì)量百分比50%)到高濃度(質(zhì)量百分比95%)的酒精進(jìn)行脫水，用 prophylene oxide (環(huán)氧丙燒，Merck-Schuchardt Inc.，Hohenbrunn, Germany)浸泡后，再用環(huán)氧樹脂包埋液進(jìn)行包埋，上述樣品先用亞甲藍(lán)染色，再用乙酸鈾酰與檸檬酸鉛雙染，最后用透射電子顯微鏡(JEM-1200EXII，JE0L, Japan)進(jìn)行觀察拍照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，氟伐他汀可顯著誘導(dǎo)淋巴瘤細(xì)胞的細(xì)胞核發(fā)生濃縮、凝聚及碎裂，說明凋亡現(xiàn)象的發(fā)生(圖 7B)。通過DNA fragmentation實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測DNA片段化是否參與了氟伐他汀所介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。具體實(shí)驗(yàn)方法為離心收集細(xì)胞，PBS洗滌，用400 μ L裂解液(IOmM Tris pH8. OUOmM NaClUOmM EDTA、質(zhì)量百分百比 1% 的 SDS 和 100 μ g · ml/1 的蛋白酶 K)在 65°C孵育過夜，加入75 μ L乙酸鉀(濃度為8Μ)并在4°C孵育15分鐘，加入750 μ L氯仿，劇烈震蕩后用12000Xg在室溫離心10分鐘，將上清液轉(zhuǎn)入新的離心管中，并加入750 μ L乙醇在-20°C孵育過夜，12000Xg離心10分鐘獲得DNA沉淀，干燥后溶解于50 μ L TE緩沖液(IOmM Tris-HClUmM EDTA, pH 8. O)，用質(zhì)量百分比2. 0%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明氟伐他汀可呈劑量依賴性地導(dǎo)致A20細(xì)胞及EL4細(xì)胞的DNA片段化(圖8)。實(shí)施例4 :氟伐他汀可降低淋巴瘤細(xì)胞的線粒體膜電位為進(jìn)一步闡明線粒體功能失調(diào)是否參與了氟伐他汀所介導(dǎo)的淋巴瘤細(xì)胞的凋亡過程，將淋巴瘤細(xì)胞(A20)用氟伐他汀(O 20μΜ)培養(yǎng)48小時(shí)，用JC-I (熒光染料)染色及流式細(xì)胞術(shù)檢測了氟伐他汀對(duì)淋巴瘤細(xì)胞中線粒體膜電位的影響。具體實(shí)驗(yàn)方法為JC-I粉末用二甲基亞砜溶解成5mg · ml/1的存儲(chǔ)液，將淋巴瘤細(xì)胞用I μ g · mL—1的JC-I在37°C避光孵育15分鐘，洗滌，重新懸浮于500 μ L PBS中，將細(xì)胞用流式細(xì)胞儀(Cytomics FC500, Beckman Coulter)分析,線粒體膜電位用紅色突光與綠色突光的比值來表示。結(jié)果表明，氟伐他汀能夠劑量依賴性地降低淋巴瘤細(xì)胞的線粒體膜電位(圖9)。 實(shí)施例5 :氟伐他汀調(diào)控淋巴瘤細(xì)胞凋亡及生存相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)通路的實(shí)驗(yàn)為了進(jìn)一步檢測氟伐他汀誘導(dǎo)淋巴瘤細(xì)胞凋亡的內(nèi)在分子機(jī)制，用Westerblotting技術(shù)檢測了凋亡及生存相關(guān)蛋白分子的活性。具體實(shí)驗(yàn)方法請(qǐng)參照文獻(xiàn)(Xu-Feng Qi, Dong-Heui Kim, Yang-Suk Yoon,Jian-Hong Li, Soon-Bong Song, DanJin, Xue-Zhu Huang, Yung-Chien Teng, Kyu-Jae Lee. The adenylylcyclase-cAMP systemsuppresses TARC/CCL 17and MDC/CCL22productionthrough p38MAPK and NF-κ B inHaCaT keratinocytes. Mol Immunol, 2009, 46 (10) : 1925-1934.)執(zhí)行。而且，我們用colorimetric assay kit (Sigma)檢測了 Caspase-3的活性，具體實(shí)驗(yàn)方法為用細(xì)胞刮收集細(xì)胞，離心收集細(xì)胞沉淀，用100 μ L細(xì)胞裂解液(試劑盒自帶)裂解細(xì)胞，取25 μ L裂解產(chǎn)物2倍體積的檢測液(試劑盒自帶)稀釋，并和Caspase-3的底物(Ac_DEVD-pNA)共同孵育(37°C) 2 小時(shí)，其中釋放的 p-nitroanilide 用 DTX-880 型酶標(biāo)儀(Beckman CoulterInc. , Fullerton, CA, USA)在405nm出檢測吸收波長。Caspase-3的活性用吸收波長/毫克蛋白來表示。結(jié)果表明氟伐他汀(5μΜ)可呈時(shí)間依賴性地(O 24h)促進(jìn)淋巴瘤細(xì)胞中促凋亡蛋白Caspase-3的活性(圖10A);氟伐他汀(O 10 μ M)處理24小時(shí)可顯著增強(qiáng)Caspase-3、PARP、Bax等促凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平,并明顯抑制抗凋亡蛋白Bcl_2的表達(dá)水平(圖10B);氟伐他汀(O 20μΜ)處理24小時(shí)可顯著增強(qiáng)Caspase-3蛋白的活性(圖10C);氟伐他汀(5μΜ)可呈時(shí)間依賴性地(O 24h)促進(jìn)淋巴瘤細(xì)胞中P38MAPK蛋白的活性，并顯著抑制蛋白激酶Akt及Erk的活性(圖10D)。實(shí)施例6 :氟伐他汀顯著增強(qiáng)淋巴瘤細(xì)胞內(nèi)ROS的水平活性氧(ROS)是細(xì)胞內(nèi)重要的功能信號(hào)之一，適量的ROS水平對(duì)于維持細(xì)胞正常的生理功能具有重要的調(diào)控作用，但過量的ROS卻引起細(xì)胞損傷及凋亡的發(fā)生。本發(fā)明利用熒光染色劑DCFH-DA染色及流式細(xì)胞儀技術(shù)進(jìn)一步分析了氟伐他汀對(duì)淋巴瘤細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響。具體實(shí)驗(yàn)方法為用含有不同濃度氟伐他汀(O 20μΜ)的培養(yǎng)基將淋巴瘤細(xì)胞Α20及EL4處理3小時(shí)，去除培養(yǎng)基，PBS洗滌，用含有DCFH-DA (10 μ Μ)的無血清培養(yǎng)基將細(xì)胞在37°C避光孵育30分鐘，用無血清培養(yǎng)基將細(xì)胞洗滌3次，胰酶消化并收集細(xì)胞，PBS洗滌2次，重新懸浮于500 μ L PBS中，將細(xì)胞用流式細(xì)胞儀(Cytomics FC500，BeckmanCoulter)分析，用FLl通道檢測綠色熒光的強(qiáng)度。細(xì)胞內(nèi)的ROS水平用綠色熒光強(qiáng)度來表示。結(jié)果表明，氟伐他汀能夠劑量依賴性地促進(jìn)淋巴瘤細(xì)胞內(nèi)的ROS水平(圖11)。實(shí)施例7 :外源性甲羥戊酸途徑相關(guān)產(chǎn)物及抗氧化物能有效逆轉(zhuǎn)氟伐他汀誘導(dǎo)的淋巴瘤細(xì)胞凋亡為了進(jìn)一步分析和驗(yàn)證氟伐他汀誘導(dǎo)淋巴瘤細(xì)胞凋亡的內(nèi)在分子機(jī)制，本發(fā)明進(jìn)一步檢測了外源性甲羥戊酸途徑相關(guān)產(chǎn)物，如甲羥戊酸(mevalonate，Mev)及其代謝產(chǎn)生的類異戍二烯中間產(chǎn)物(farnesyl pyrophosphate ammoniumsalt, FPP; geranylgeranylpyrophosphate ammonium salt, GGPP),以及抗氧化物乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine, NAC)對(duì)氟伐他汀介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡及相關(guān)信號(hào)通路的影響。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為A20 細(xì)胞分別用氟伐他汀(5 μ M)、Mev (200 μ M)、FPP (10 μ M)、GGPP (10 μ Μ)或 NAC (5mM)單獨(dú)處理，或?qū)⒎ニ》謩e與另外四種試劑共同處理Α20細(xì)胞24小時(shí)。用Western blotting技術(shù)檢測腫瘤細(xì)胞中Caspase_3、Akt、p38、Erk等蛋白激酶的活性，具體實(shí)驗(yàn)方法請(qǐng)參照文獻(xiàn)(Xu-Feng Qi, Dong-Heui Kim, Yang-SukYoon, Jian-HongLi，Soon—Bong Song,Dan Jinj Xue-Zhu Huang,Yung-Chien Tengj Kyu-Jae Lee.The adeny Iy I eyelase-cAMP system suppresses TARC/CCL17 andMDC/CCL22production through p38MAPK and NF-κ B in HaCaT keratinocytes.MolImmunol, 2009, 46 (10) : 1925-1934.)執(zhí)行。結(jié)果表明，類異戊二烯化合物及乙酰半胱氨酸不僅能有效抑制氟伐他汀所激活的Caspase-3及p38蛋白激酶的活性,并能有效恢復(fù)氟伐他汀所抑制的Akt及Erk蛋白激酶的活性(圖12A)。另外，本發(fā)明用EZ-CyTox Cell Viability Assay Kit檢測了淋巴瘤細(xì)胞A20的細(xì)胞活性，具體實(shí)驗(yàn)方法參照試劑盒說明書進(jìn)行。結(jié)果表明，類異戊二烯化合物及乙酰半胱氨酸均能有效恢復(fù)氟伐他汀所介導(dǎo)的細(xì)胞死亡(圖12B)。為了進(jìn)一步檢測DNA的片段化情況,進(jìn)行了 DNA fragmentation實(shí)驗(yàn)。具體實(shí)驗(yàn)方法同上。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，類異戊二烯化合物及乙酰半胱氨酸均能有效抑制氟伐他汀所介導(dǎo)的淋巴瘤細(xì)胞的DNA片段化及凋亡現(xiàn)象(圖12C)。上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.HMG-CoA還原酶抑制劑氟伐他汀在制備抗淋巴瘤藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的HMG-CoA還原酶抑制劑氟伐他汀在制備抗淋巴瘤藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述的氟伐他汀的劑型為氟伐他汀鈉鹽，其分子式為C24H25FNNa04。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的HMG-CoA還原酶抑制劑氟伐他汀在制備抗淋巴瘤藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述的氟伐他汀誘導(dǎo)淋巴瘤細(xì)胞凋亡的有效濃度為I. 25 20μΜ。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的HMG-CoA還原酶抑制劑氟伐他汀在制備抗淋巴瘤藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述的氟伐他汀通過誘導(dǎo)細(xì)胞核凝固、濃縮及DNA斷裂，促使膜磷脂酰絲氨酸外翻，下調(diào)線粒體膜電位水平，增強(qiáng)促凋亡相關(guān)蛋白的活性，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的活性，激活P38MAPK信號(hào)通路，抑制Akt及Erk信號(hào)通路，上調(diào)細(xì)胞內(nèi)活性氧水平，抑制甲羥戊酸途徑等多種不同途徑而引起淋巴瘤細(xì)胞的凋亡。
全文摘要
本發(fā)明公開了HMG-CoA還原酶抑制劑氟伐他汀在制備抗淋巴瘤藥物中的應(yīng)用。該HMG-CoA還原酶抑制劑為分子式是C24H25FNNaO4的氟伐他汀鈉鹽。藥理學(xué)及細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，氟伐他汀可有效促進(jìn)淋巴瘤細(xì)胞核濃縮、凝聚及DNA片段化，明顯下調(diào)線粒體膜電位水平，顯著抑制細(xì)胞活性并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本發(fā)明提供了氟伐他汀的新的用途，首次揭示并量化分析了氟伐他汀多方面的誘導(dǎo)淋巴瘤細(xì)胞凋亡的活性，提供了對(duì)氟伐他汀抗淋巴瘤的新功能的認(rèn)識(shí)，并表明氟伐他汀可以用于制備靶向淋巴瘤的抗腫瘤藥物。
文檔編號(hào)A61K31/405GK102961376SQ20121043973
公開日2013年3月13日 申請(qǐng)日期2012年11月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月6日
發(fā)明者齊緒峰, 金壽起, 李奎在, 蔡冬青, 秦俊文, 禹艷紅, 武征 申請(qǐng)人:暨南大學(xué)