專利名稱：篩選醛糖還原酶抑制劑的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于分析化學領域，具體涉及一種篩選醛糖還原酶抑制劑的方法。
背景技術：
醛糖還原酶主要存在于晶狀體、血管、神經(jīng)、紅細胞以及腎臟等組織中，屬于還原型輔酶II (NADPH)依賴的醛-酮還原酶超家族。它是體內(nèi)多元醇代謝途徑的限速酶，可以催化多種親水性的醛還原為相應的醇。在體內(nèi)，醛糖還原酶催化底物葡萄糖還原生成山梨醇。

在糖尿病病人體內(nèi)的高血糖生理環(huán)境下，醛糖還原酶被激活引發(fā)多元醇通路，山梨醇的細胞膜通透性較差造成組織內(nèi)山梨醇聚積，引發(fā)白內(nèi)障、視網(wǎng)膜病變、腎臟病變等慢性并發(fā)癥。目前，由日本Ono制藥公司1992年上市的依帕司他(Epalrestat)作為醒糖還原酶抑制劑被批準使用于臨床，用于治療糖尿病性神經(jīng)病變，但是它還沒有獲得美國食品藥物管理局(Food and Drug Administration, FDA)的批準。所以尋找醒糖還原酶抑制劑和研究醛糖還原酶抑制劑在臨床中的應用對于開發(fā)新藥有著非常重要的意義。現(xiàn)有醛糖還原酶抑制劑的篩選一般使用紫外光譜法，其是以DL-甘油醛為底物，利用輔酶NAD(P)H在340nm處有特征吸收這一特點，根據(jù)反應體系在340nm處吸光度的變化進行抑制劑的篩選(Chihiro Nishimura, Takashi Yamaoka, MasakazuMizutani, Kamejiro Yamashita, Tai Akera, Tsuyoshi Tanimoto. Purificationand characterization of the recombinant human aldose reductase expressed inbaculovirus system. Biochimica et Biophysica Acta, 1991， 1078， 171-178)。光譜法篩選酶抑制劑使用DL-甘油醛為底物，與人體葡萄糖環(huán)境有較大差異，且由于在溶液中NAD(P)H自然氧化引起吸光度的變化，使得光譜法靈敏度低，且在340nm處吸光度容易受外界干擾，引起假陽性和假陰性結果(Arjen R. de Boer, Henk Lingeman,Wilfried M. A. Niessen, Hubertus Irth. Mass spectrometry-based biochemicalassays for enzyme—inhibitor screening. Trends in Analytical Chemistry, 2007,26，867-883.)?，F(xiàn)代質譜儀的高精確度和靈敏度為我們提供了不受干擾的分子指紋圖譜，串聯(lián)質譜高度特異性和精確性揭示待分析化合物的結構信息，且質譜方法可以同時檢測和定量多種組分，近年來在藥物篩選中得到了廣泛的應用(Gejing Deng, GautamSanyal. Applications of mass spectrometry in early stages of target baseddrug discovery. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2006, 40,528-538)。但現(xiàn)有技術中還未有用質譜檢測方法篩選醛糖還原酶抑制劑的方法。酶促反應緩沖液中往往含有不揮發(fā)的鹽和為保持酶活性穩(wěn)定的添加物，鹽和添加物可能會污染質譜儀的離子源并導致離子化抑制，樣品進入質譜前使用高效液相色譜進行分離可以避免反應體系中的鹽和添加物對檢測的影響(Arjen R. de Boer, ThomasLetzel, Danny A. van Elswijk, Henk Lingeman, Wilfried M. A. Niessen, HubertusIrth. On-Line Coupling of High-Performance Liquid Chromatography toa Continuous-Flow Enzyme Assay Based on Electrospray Ionization MassSpectrometry. Anal. Chem. 2004，76，3155-3161)。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決現(xiàn)有篩選醛糖還原酶抑制劑技術中，光譜法靈敏度低、容易受外界干擾的技術問題，本發(fā)明提供一種篩選醛糖還原酶抑制劑的方法，應用本發(fā)明篩選醛糖還原酶抑制劑精確度高、特異性好。本發(fā)明提供的篩選醛糖還原酶抑制劑的方法，包括以下步驟(I)酶促反應緩沖液的配制 緩沖液為pH值為6. 0-6. 4的醋酸銨水溶液；
(2)標準品的配制將山梨醇分別配成濃度為0. I微摩爾/升、0. 2微摩爾/升、0. 5微摩爾/升、I微摩爾/升、2微摩爾/升、5微摩爾/升、10微摩爾/升、20微摩爾/升、50微摩爾/升的標準品溶液，且每個濃度的標準品溶液均含I微摩爾/升的木糖醇作為內(nèi)標；(3)空白樣品和樣品的酶促反應空白樣品反應總體積200微升,含有體積為30微升的醛糖還原酶、終濃度5毫摩爾/升的2-巰基乙醇、終濃度150微摩爾/升的NADPH、終濃度10毫摩爾/升的底物葡萄糖，其余以緩沖液補足；樣品反應總體積200微升,含有體積為30微升的醛糖還原酶、終濃度5毫摩爾/升的2-巰基乙醇、終濃度150微摩爾/升的NADPH、終濃度0. 1-50微摩爾/升的待測物、終濃度10毫摩爾/升的底物葡萄糖，其余以緩沖液補足；空白樣品和樣品在25-37攝氏度反應15-40分鐘，分別加入甲醇或乙腈終止反應，分別加入終濃度為I微摩爾/升的內(nèi)標木糖醇；(4)標準品、空白樣品和樣品的檢測對(2)中標準品進行超高效液相色譜和質譜檢測，從總離子流圖中提取山梨醇和木糖醇的色譜圖，分別積分求峰面積，以標準品濃度為橫坐標，以山梨醇與木糖醇峰面積比值為縱坐標，或以標準品濃度為縱坐標，以山梨醇與木糖醇的峰面積比值為橫坐標，得到山梨醇濃度的線性方程；對空白樣品、樣品溶液進行超高效液相色譜和質譜檢測；所述的超高效液相色譜的檢測條件色譜柱WatersACQUITY UPLC BEH C18 2. I X 50 毫米，I. 7 微米；流動相甲醇和水；等度洗脫程序0-2分鐘，20%甲醇，所指的百分比均為體積百分比；流速0. 2毫升/分鐘；進樣量3微升；所述的質譜檢測條件毛細管電壓3000伏特；去溶劑氣氮氣溫度350攝氏度；
錐孔電壓14伏特；去溶劑氣氮氣流速800升/小時；錐孔氣氮氣流速60升/小時；碰撞氣IS氣流速0. 15毫升/分鐘；(5)待測物對醛糖還原酶的抑制率分別計算空白樣品、樣品中山梨醇峰面積和內(nèi)標木糖醇峰面積的比值，根據(jù)(4)得到的線性方程，求得空白樣品和樣品中山梨醇的濃度，計算出待測物對醛糖還原酶的抑制率。優(yōu)選的是，所述的緩沖液的pH值為6. 2。 優(yōu)選的是，所述的緩沖液由醋酸銨和醋酸配制而成，緩沖液的濃度為100毫摩爾/升。優(yōu)選的是，步驟(2)中，所述的標準品溶液是由緩沖液和甲醇配制而成的，或由緩沖液和乙腈配制而成的。優(yōu)選的是，步驟(3)中，所述的樣品中待測物的終濃度為10-50微摩爾/升。優(yōu)選的是，步驟(3)中，所述的空白樣品和樣品在37攝氏度反應25分鐘。優(yōu)選的是，步驟(3)中，所述的甲醇或乙腈的體積為800-1000微升；更有優(yōu)選的是，所述的甲醇或乙腈的體積為800微升。本發(fā)明的有益效果(I)葡萄糖在醛糖還原酶的作用下，產(chǎn)生山梨醇，醛糖還原酶抑制劑抑制醛糖還原酶的活性，從而導致酶促反應產(chǎn)物山梨醇生成量減少，通過產(chǎn)物山梨醇含量的變化可以計算待測物對醛糖還原酶的抑制率；(2)本發(fā)明篩選醛糖還原酶抑制劑，樣品檢測準確、快速，線性方程相關系數(shù)高達
0.999，避免了光譜法篩選醛糖還原酶抑制劑使用DL-甘油醛為底物，在溶液中由于NAD(P)H自然氧化引起吸光度的變化，導致靈敏度低，且篩選中容易出現(xiàn)的假陽性和假陰性結果的問題；(3)本發(fā)明可用于分析天然產(chǎn)物提取物、單體及合成類醛糖還原酶抑制劑對醛糖還原酶的體外抑制率，進而篩選出醛糖還原酶抑制劑；本發(fā)明還可用于醛糖還原酶的動力學研究(生物化學(第三版)上冊，351-381，王鏡巖，朱圣庚，徐長法，主編)。


圖I為實施例I中10微摩爾/升的標準品山梨醇和內(nèi)標木糖醇的的總離子流色譜圖；圖2為實施例I中內(nèi)標木糖醇的提取色譜圖；圖3為實施例I中10微摩爾/升的標準品山梨醇的的提取色譜圖；圖4為實施例I中不同濃度山梨醇標準品的標準曲線；圖5為實施例I中空白樣品中內(nèi)標木糖醇的提取色譜圖；圖6為實施例I中空白樣品中山梨醇的提取色譜圖；圖7為實施例I中樣品中內(nèi)標木糖醇的提取色譜圖；圖8為實施例I中樣品中山梨醇的提取色譜圖9為實施例2中樣品中內(nèi)標木糖醇的提取色譜圖；圖10為實施例2中樣品中山梨醇的提取色譜圖；圖11為實施例3中樣品中內(nèi)標木糖醇的提取色譜圖；圖12為實施例3中樣品中山梨醇的提取色譜圖；圖13為實施例4中樣品中內(nèi)標木糖醇的提取色譜圖；圖14為實施例4中樣品中山梨醇的提取色譜圖。
具體實施例方式本發(fā)明提供的篩選醛糖還原酶抑制劑的方法，包括以下步驟 (I)酶促反應緩沖液的配制緩沖液為醋酸銨溶液，用醋酸調(diào)節(jié)pH值為6. 0-6. 4，緩沖液濃度為100毫摩爾/升;(2)標準品的配制將山梨醇分別配成濃度為0. I微摩爾/升、0. 2微摩爾/升、0. 5微摩爾/升、I微摩爾/升、2微摩爾/升、5微摩爾/升、10微摩爾/升、20微摩爾/升、50微摩爾/升的標準品溶液，且每個濃度的標準品溶液均含I微摩爾/升的木糖醇作為內(nèi)標；(3)空白樣品和樣品的酶促反應空白樣品反應總體積200微升,含有體積為30微升的醛糖還原酶、終濃度5毫摩爾/升的2-巰基乙醇、終濃度150微摩爾/升的NADPH、終濃度10毫摩爾/升的底物葡萄糖，其余以緩沖液補足；樣品反應總體積200微升，含有體積為30微升的醛糖還原酶、終濃度5毫摩爾/升的2-巰基乙醇、終濃度150微摩爾/升的NADPH、終濃度0. 1-50微摩爾/升的待測物、終濃度10毫摩爾/升的底物葡萄糖，其余以緩沖液補足；空白樣品和樣品在25-40攝氏度反應15-40分鐘，分別加入800-1000微升的甲醇或乙腈終止反應，分別加入終濃度為I微摩爾/升的內(nèi)標木糖醇；空白樣品和樣品中的酶是同一種酶；(4)標準品、空白樣品和樣品的檢測對(2)中的標準品進行超高效液相色譜和質譜檢測，從總離子流圖中提取山梨醇和木糖醇的色譜圖，分別積分求峰面積，以所述的標準品濃度為橫坐標，以山梨醇與木糖醇峰面積比值為縱坐標，或以標準品濃度為縱坐標，以山梨醇與木糖醇的峰面積比值為橫坐標，在所述的標準品濃度為0. I微摩爾/升至50微摩爾/升范圍內(nèi)，使用儀器的軟件MassLynx4. I或微軟公司(Microsoft)的Excel軟件得到山梨醇濃度的線性方程y=ax+b式中，y為所述的標準品山梨醇與內(nèi)標木糖醇峰面積比值；x為標準品山梨醇的濃度，量綱為微摩爾/升；a、b為計算得到的常數(shù)；同時計算得到相關系數(shù)R2 ；對空白樣品、樣品溶液進行超高效液相色譜和質譜檢測；所述的超高效液相色譜的檢測條件超高效液相色譜儀Waters ACQUITY ；色譜柱WatersACQUITY UPLC BEH C18 2. 1X50 毫米，I. 7 微米；
流動相甲醇和水；等度洗脫程序0-2分鐘，20%甲醇，所指的百分比均為體積百分比；流速0. 2毫升/分鐘；進樣量3微升；所述的質譜檢測條件質譜儀WatersXevo TQ ；離子源電噴霧電離源(ESI)正離子模式；毛細管電壓3000伏特； 錐孔電壓14伏特；去溶劑氣氮氣溫度350攝氏度；去溶劑氣氮氣流速800升/小時；錐孔氣氮氣流速60升/小時；碰撞氣IS氣流速0. 15毫升/分鐘；所述質譜條件在檢測山梨醇和內(nèi)標木糖醇時是相同的；碎裂能量和選擇的碎片離子在檢測山梨醇和內(nèi)標木糖醇時是不同的檢測山梨醇時碎裂能量是12，碎片離子是68. 94 ;檢測內(nèi)標木糖醇時碎裂能量是10，碎片離子是56. 95 ；(5)待測物對醛糖還原酶的抑制率分別計算空白樣品、樣品中山梨醇峰面積和內(nèi)標木糖醇峰面積，得到空白樣品、樣品中山梨醇峰面積和內(nèi)標木糖醇峰面積的比值，根據(jù)(4)得到的線性方程，求得空白樣品和樣品中山梨醇的濃度，待測物對醛糖還原酶的抑制率按照以下公式計算I 樣品=(I-C樣品 / C 空白)X 100%式中，I#s為待測物對醛糖還原酶的抑制率；C#s為根據(jù)線性方程求得的樣品中山梨醇濃度，量綱為微摩爾/升；Cse為根據(jù)線性方程求得的空白樣品中山梨醇濃度，量綱為微摩爾/升。優(yōu)選的是，所述的緩沖液的pH值為6. 2。優(yōu)選的是，步驟(2)中，所述的標準品溶液是由緩沖液和甲醇配制而成的，或由緩沖液和乙腈配制而成的。優(yōu)選的是，步驟(3)中，所述的樣品中待測物的終濃度為10-50微摩爾/升。優(yōu)選的是，步驟(3)中，所述的空白樣品和樣品在37攝氏度反應25分鐘。優(yōu)選的是，步驟(3)中，所述的甲醇或乙腈的體積為800微升。根據(jù)步驟(5)計算出的待測物的抑制率，可以篩選醛糖還原酶抑制劑抑制率高，說明待測物對醛糖還原酶的抑制效果好，可以作為醛糖還原酶抑制劑；抑制率低，說明待測物對醛糖還原酶的抑制效果差，不適合作為醛糖還原酶抑制劑。本發(fā)明的醛糖還原酶可以是商購，也可以是實驗室制備，其制備方法為4°C條件下進行，取新鮮牛晶狀體，經(jīng)勻漿、離心、鹽析、超濾后得到酶的粗提取液，分裝，儲藏于-80 °C 冰箱中備用(Anjana Basak Haider, M. James C. Crabbe. Bovine lensaldehyde reductase (aldose reductase). Biochemical Journal, 1984, 219, 33-39)。本發(fā)明的其他材料均可以通過商購途徑獲得。
為使本領域技術人員更好的理解本發(fā)明的技術方案，下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步詳細描述。實施例I結 合圖1-8說明實施例I篩選醛糖還原酶抑制劑的方法，步驟如下(I)酶促反應緩沖液的配制緩沖液為醋酸銨溶液，用醋酸調(diào)pH值為6. 2，緩沖液濃度為100毫摩爾/升；(2)標準品的配制用緩沖液和甲醇將山梨醇分別配成濃度為0. I微摩爾/升、0. 2微摩爾/升、0. 5微摩爾/升、I微摩爾/升、2微摩爾/升、5微摩爾/升、10微摩爾/升、20微摩爾/升、50微摩爾/升的標準溶液，且每個濃度的標準品溶液均含I微摩爾/升的木糖醇作為內(nèi)標；(3)空白樣品和樣品的酶促反應空白樣品反應總體積200微升，含有體積為30微升的醛糖還原酶、終濃度5毫摩爾/升的2-巰基乙醇、終濃度150微摩爾/升的NADPH、終濃度10毫摩爾/升的底物葡萄糖，其余以緩沖液補足；樣品反應總體積200微升，含有體積為30微升的醛糖還原酶、終濃度5毫摩爾/升的2-巰基乙醇、終濃度150微摩爾/升的NADPH、終濃度10微摩爾/升的依帕司他、終濃度10毫摩爾/升的底物葡萄糖，其余以緩沖液補足；37攝氏度反應25分鐘，分別加入800微升甲醇終止反應，分別加入終濃度為I微摩爾/升的內(nèi)標木糖醇；(4)標準品、空白樣品和樣品的檢測對標準品檢測米用木糖醇為內(nèi)標，以內(nèi)標法定量，對(2)中的標準品進行超聞效液相色譜和質譜檢測，從總離子流圖中提取山梨醇m/z=68. 94和木糖醇m/z=56. 95的色譜圖，分別積分求峰面積，以所述的標準品濃度為橫坐標，以山梨醇與木糖醇峰面積比值為縱坐標，在所述的標準品濃度為0. I微摩爾/升至50微摩爾/升范圍內(nèi)，使用微軟公司(Microsoft)的Excel軟件得到山梨醇濃度的線性方程y=0. 7221x+0. 1992式中，y為所述的標準品山梨醇與內(nèi)標木糖醇峰面積比值；x為標準品山梨醇的濃度，量綱為微摩爾/升；計算得到相關系數(shù)R2=O. 9998 ；對空白樣品、樣品溶液進行超高效液相色譜和質譜檢測；所述的超高效液相色譜的檢測條件超高效液相色譜儀Waters ACQUITY ；色譜柱WatersACQUITY UPLC BEH C18 (2. 1X50 毫米，I. 7 微米);流動相甲醇(A)和水(B)；等度洗脫程序0-2分鐘，20%A，所指的百分比均為體積百分比；流速0. 2毫升/分鐘；進樣量3微升；所述的質譜檢測條件質譜儀WatersXevo TQ ；
離子源電噴霧電離源(ESI)正離子模式；毛細管電壓3000伏特；去溶劑氣氮氣溫度350攝氏度；錐孔電壓14伏特；去溶劑氣氮氣流速800升/小時；
·
錐孔氣氮氣流速60升/小時；碰撞氣IS氣流速0. 15毫升/分鐘；第一個四極桿的低端分辨率為2. 82 ;高端分辨率為15. 2 ;離子能量為0. 4 ；第二個四極桿的低端分辨率為2. 80 ;高端分辨率為14. 8 ;離子能量為0. 5 ；以上所述質譜條件在檢測山梨醇和內(nèi)標木糖醇時是相同的；碎裂能量和選擇的碎片離子在檢測山梨醇和內(nèi)標木糖醇時是不同的檢測山梨醇時碎裂能量是12，碎片離子是68. 94 ;檢測內(nèi)標木糖醇時碎裂能量是10，碎片離子是56. 95 ；(5)待測物對醛糖還原酶的抑制率分別計算空白樣品、樣品中山梨醇和內(nèi)標木糖醇的峰面積比值，根據(jù)⑷得到的線性方程，求得空白樣品和樣品中山梨醇濃度，待測物對醛糖還原酶的抑制率按照以下公式計算I 樣品=(1_C樣品 / C空白)X 100%式中，I#s為待測物對醛糖還原酶的抑制率；(#@為根據(jù)線性方程求得的樣品中山梨醇濃度，量綱為微摩爾/升；Cse為根據(jù)線性方程求得的空白樣品中山梨醇濃度，量綱為微摩爾/升。圖I為實施例I中10微摩爾/升的標準品山梨醇和I微摩爾/升的內(nèi)標木糖醇的總離子流色譜圖，信號強度為4. 54X IO4 ；圖2為實施例I中I微摩爾/升的內(nèi)標木糖醇的提取色譜圖，信號強度為
2.68 X IO4 ；圖3為實施例I中10微摩爾/升的標準品山梨醇的提取色譜圖，信號強度為
I.97 X IO5 ；圖4為實施例I中不同濃度山梨醇標準品的標準曲線，標準曲線為y=0. 7221x+0. 1992，R2=O. 9998 ；圖5為實施例I中空白樣品中I微摩爾/升的內(nèi)標木糖醇的提取色譜圖，信號強度為 2. 87 X IO4 ；圖6為實施例I中空白樣品中山梨醇的提取色譜圖，信號強度為5. OOXlO4 ；圖7為實施例I中樣品中I微摩爾/升的內(nèi)標木糖醇的提取色譜圖，信號強度為
3.48 X IO4 ；圖8為實施例I中樣品中山梨醇的提取色譜圖，信號強度為6. 32X 103。由圖1-8經(jīng)計算得到10微摩爾/升依帕司他對醛糖還原酶的抑制率為90%。實施例2結合圖9、圖10說明實施例2篩選醛糖還原酶抑制劑的方法，步驟如下
(I)酶促反應緩沖液的配制緩沖液為醋酸銨溶液,用醋酸調(diào)pH值為6. 2，濃度為100毫摩爾/升；(2)標準品的配制用緩沖液和乙腈將標準品分別配成濃度為0. I微摩爾/升、0. 2微摩爾/升、0. 5微摩爾/升、I微摩爾/升、2微摩爾/升、5微摩爾/升、10微摩爾/升、20微摩爾/升、50微摩爾/升的標準溶液，且每個濃度的標準品溶液均含I微摩爾/升的木糖醇作為內(nèi)標；(3)空白樣品和樣品的酶促反應空白樣品反應總體積200微升,含有體積為30微升的醛糖還原酶、終濃度5毫摩爾/升的2-巰基乙醇、終濃度150微摩爾/升的NADPH、終濃度10毫摩爾/升的底物葡萄糖，其余以緩沖液補足；
樣品反應總體積200微升,含有體積為30微升的醛糖還原酶、終濃度5毫摩爾/升的2-巰基乙醇、終濃度150微摩爾/升的NADPH、終濃度10微摩爾/升的槲皮苷標準品、終濃度10毫摩爾/升的底物葡萄糖，其余以緩沖液補足；37攝氏度反應30分鐘，分別加入800微升乙腈終止反應，分別加入終濃度為I微摩爾/升的內(nèi)標木糖醇；其余的同實施例I。圖9為實施例2中樣品中I微摩爾/升的內(nèi)標木糖醇的提取色譜圖，信號強度為3. 46 X IO4 ；圖10為實施例2中樣品中山梨醇的提取色譜圖，信號強度為2. 79 X IO40按照實施例I的檢測步驟檢測并計算得到10微摩爾/升槲皮苷標準品對醛糖還原酶的抑制率為54%。實施例3結合圖11、圖12說明實施例3篩選醛糖還原酶抑制劑的方法，步驟如下(I)酶促反應緩沖液的配制緩沖液為醋酸銨溶液,用醋酸調(diào)pH值為6. 2，濃度為100毫摩爾/升；(2)標準品的配制用緩沖液和乙腈將標準品分別配成濃度為0. I微摩爾/升、0. 2微摩爾/升、0. 5微摩爾/升、I微摩爾/升、2微摩爾/升、5微摩爾/升、10微摩爾/升、20微摩爾/升、50微摩爾/升的標準溶液，且每個濃度的標準品溶液均含I微摩爾/升的木糖醇作為內(nèi)標；(3)空白樣品和樣品的酶促反應空白樣品反應總體積200微升,含有體積為30微升的醛糖還原酶、終濃度5毫摩爾/升的2-巰基乙醇、終濃度150微摩爾/升的NADPH、終濃度10毫摩爾/升的底物葡萄糖，其余以緩沖液補足；樣品反應總體積200微升，含有體積為30微升的醛糖還原酶、終濃度5毫摩爾/升的2-巰基乙醇、終濃度150微摩爾/升的NADPH、終濃度40微摩爾/升的蘆丁標準品、終濃度10毫摩爾/升的底物葡萄糖，其余以緩沖液補足；37攝氏度反應25分鐘，分別加入800微升乙腈終止反應，分別加入終濃度為I微摩爾/升的內(nèi)標木糖醇；
其余的同實施例I。圖11為實施 例3中樣品中I微摩爾/升的內(nèi)標木糖醇的提取色譜圖，信號強度為3. 04 X IO4 ；圖12為實施例3中樣品山梨醇的提取色譜圖，信號強度為2. 19X104。按照實施例I的檢測步驟檢測并計算得到40微摩爾/升蘆丁標準品對醛糖還原酶的抑制率為59%。實施例4結合圖13、圖14說明實施例4篩選醛糖還原酶抑制劑的方法，步驟如下(I)酶促反應緩沖液的配制緩沖液為醋酸銨溶液,用醋酸調(diào)pH值為6. 2，濃度為100毫摩爾/升；(2)標準品的配制用緩沖液和甲醇將標準品分別配成濃度為0. I微摩爾/升、0. 2微摩爾/升、0. 5微摩爾/升、I微摩爾/升、2微摩爾/升、5微摩爾/升、10微摩爾/升、20微摩爾/升、50微摩爾/升的標準溶液，且每個濃度的標準品溶液均含I微摩爾/升的木糖醇作為內(nèi)標；(3)空白樣品和樣品的酶促反應空白樣品反應總體積200微升,含有體積為30微升的醛糖還原酶、終濃度5毫摩爾/升的2-巰基乙醇、終濃度150微摩爾/升的NADPH、終濃度10毫摩爾/升的底物葡萄糖，其余以緩沖液補足；樣品反應總體積200微升,含有體積為30微升的醛糖還原酶、終濃度5毫摩爾/升的2-巰基乙醇、終濃度150微摩爾/升的NADPH、終濃度50微摩爾/升的金絲桃苷標準品、終濃度10毫摩爾/升的底物葡萄糖，其余以緩沖液補足；37攝氏度反應25分鐘，分別加入800微升甲醇終止反應，分別加入終濃度為I微摩爾/升的內(nèi)標木糖醇；其余的同實施例I。圖13為實施例4中樣品中I微摩爾/升的內(nèi)標木糖醇的提取色譜圖，信號強度為
3.21 X IO4 ；圖14為實施例4中樣品中山梨醇的提取色譜圖，信號強度為2. 73X 104。按照實施例I的檢測步驟檢測并計算得到50微摩爾/升的金絲桃苷標準品對醛糖還原酶的抑制率為51%。實施例5篩選醛糖還原酶抑制劑的方法，步驟如下(I)酶促反應緩沖液的配制緩沖液為醋酸銨溶液,用醋酸調(diào)pH值為6. 0,濃度為100毫摩爾/升；(2)標準品的配制用緩沖液和和甲醇將標準品分別配成濃度為0. I微摩爾/升、0. 2微摩爾/升、0. 5微摩爾/升、I微摩爾/升、2微摩爾/升、5微摩爾/升、10微摩爾/升、20微摩爾/升、50微摩爾/升的標準溶液，且每個濃度的標準品溶液均含I微摩爾/升的木糖醇作為內(nèi)標；(3)空白樣品和樣品的酶促反應
空白樣品反應總體積200微升,含有體積為30微升的醛糖還原酶、終濃度5毫摩爾/升的2-巰基乙醇、終濃度150微摩爾/升的NADPH、終濃度10毫摩爾/升的底物葡萄糖，其余以緩沖液補足；樣品如下反應總體積200微升,含有體積為30微升的醛糖還原酶、終濃度5毫摩爾/升的2-巰基乙醇、終濃度150微摩爾/升的NADPH、終濃度10微摩爾/升的大豆苷元標準品、終濃度10毫摩爾/升的底物葡萄糖，其余以緩沖液補足；25攝氏度反應40分鐘，分別加入1000微升乙腈終止反應，分別加入終濃度為I微摩爾/升的內(nèi)標木糖醇；其余的同實施例I。按照實施例I的檢測步驟檢測并計算得到10微摩爾/升的大豆苷元標準品對醛糖還原酶的抑制率為27%。 實施例6篩選醛糖還原酶抑制劑的方法，步驟如下(I)酶促反應緩沖液的配制緩沖液為醋酸銨溶液，用醋酸調(diào)pH值為6. I,濃度為100毫摩爾/升；(2)標準品的配制用緩沖液和乙腈將標準品分別配成濃度為0. I微摩爾/升、0. 2微摩爾/升、0. 5微摩爾/升、I微摩爾/升、2微摩爾/升、5微摩爾/升、10微摩爾/升、20微摩爾/升、50微摩爾/升的標準溶液，且每個濃度的標準品溶液均含I微摩爾/升的木糖醇作為內(nèi)標；(3)空白樣品和樣品的酶促反應空白樣品反應總體積200微升,含有體積為30微升的醛糖還原酶、終濃度5毫摩爾/升的2-巰基乙醇、終濃度150微摩爾/升的NADPH、終濃度10毫摩爾/升的底物葡萄糖，其余以緩沖液補足；樣品反應總體積200微升,含有體積為30微升的醛糖還原酶、終濃度5毫摩爾/升的2-巰基乙醇、終濃度150微摩爾/升的NADPH、終濃度20微摩爾/升的黃芩素標準品、終濃度10毫摩爾/升的底物葡萄糖，其余以緩沖液補足；40攝氏度反應30分鐘，分別加入850微升甲醇終止反應，分別加入終濃度為I微摩爾/升的內(nèi)標木糖醇；其余的同實施例I。按照實施例I的檢測步驟檢測并計算得到20微摩爾/升的黃芩素標準品對醛糖還原酶的抑制率為20%。實施例7篩選醛糖還原酶抑制劑的方法，步驟如下(I)酶促反應緩沖液的配制緩沖液為醋酸銨溶液,用醋酸調(diào)pH值為6. 4,濃度為100毫摩爾/升；(2)標準品的配制用緩沖液和甲醇將標準品分別配成濃度為0. I微摩爾/升、0. 2微摩爾/升、0. 5微摩爾/升、I微摩爾/升、2微摩爾/升、5微摩爾/升、10微摩爾/升、20微摩爾/升、50微摩爾/升的標準溶液，且每個濃度的標準品溶液均含I微摩爾/升的木糖醇作為內(nèi)標；
(3)空白樣品和樣品的酶促反應空白樣品反應總體積200微升,含有體積為30微升的醛糖還原酶、終濃度5毫摩爾/升的2-巰基乙醇、終濃度150微摩爾/升的NADPH、終濃度10毫摩爾/升的底物葡萄糖，其余以緩沖液補足； 樣品反應總體積200微升,含有體積為30微升的醛糖還原酶、終濃度5毫摩爾/升的2-巰基乙醇、終濃度150微摩爾/升的NADPH、終濃度0. I微摩爾/升的葛根素、終濃度10毫摩爾/升的底物葡萄糖，其余以緩沖液補足；29攝氏度反應25分鐘，分別加入1000微升甲醇終止反應，分別加入終濃度為I微摩爾/升的內(nèi)標木糖醇；(4)標準品、空白樣品和樣品的檢測對(2)中的標準品進行超高效液相色譜和質譜檢測，從總離子流圖中提取山梨醇和木糖醇的色譜圖，分別積分求峰面積，以所述的標準品濃度為橫坐標，以山梨醇與木糖醇峰面積比值為縱坐標，在所述的標準品濃度為0. I微摩爾/升至50微摩爾/升范圍內(nèi)，使用儀器的軟件MassLynX4. I得到山梨醇濃度的線性方程y=0. 7221x+0. 1992式中，y為所述的標準品山梨醇與內(nèi)標木糖醇峰面積比值；x為標準品山梨醇的濃度，量綱為微摩爾/升；計算得到相關系數(shù)R2=O. 9998 ；對空白樣品、樣品溶液進行超高效液相色譜和質譜檢測；其余的同實施例I。按照實施例I的檢測步驟檢測并計算得到0. I微摩爾/升的葛根素對醛糖還原酶的抑制率為17%。實施例8篩選醛糖還原酶抑制劑的方法，步驟如下(I)酶促反應緩沖液的配制緩沖液為醋酸銨溶液,用醋酸調(diào)pH值為6. 4,濃度為100毫摩爾/升；(2)標準品的配制用緩沖液和甲醇將標準品分別配成濃度為0. I微摩爾/升、0. 2微摩爾/升、0. 5微摩爾/升、I微摩爾/升、2微摩爾/升、5微摩爾/升、10微摩爾/升、20微摩爾/升、50微摩爾/升的標準溶液，且每個濃度的標準品溶液均含I微摩爾/升的木糖醇作為內(nèi)標；(3)空白樣品和樣品的酶促反應空白樣品反應總體積200微升,含有體積為30微升的醛糖還原酶、終濃度5毫摩爾/升的2-巰基乙醇、終濃度150微摩爾/升的NADPH、終濃度10毫摩爾/升的底物葡萄糖，其余以緩沖液補足；樣品反應總體積200微升,含有體積為30微升的醛糖還原酶、終濃度5毫摩爾/升的2-巰基乙醇、終濃度150微摩爾/升的NADPH、終濃度50微摩爾/升的金絲桃苷標準品、終濃度10毫摩爾/升的底物葡萄糖，其余以緩沖液補足；37攝氏度反應15分鐘，分別加入900微升乙腈終止反應，分別加入終濃度為I微摩爾/升的內(nèi)標木糖醇；其余的同實施例I。
按照實施例I的檢測步驟檢測并計算得到50微摩爾/升的金絲桃苷標準品對醛糖還原酶 的抑制率為55%。
權利要求
1.篩選醛糖還原酶抑制劑的方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)酶促反應緩沖液的配制 緩沖液是PH值為6. 0-6. 4的醋酸銨水溶液； (2)標準品的配制 將山梨醇分別配成濃度為0. I微摩爾/升、0. 2微摩爾/升、0. 5微摩爾/升、I微摩爾/升、2微摩爾/升、5微摩爾/升、10微摩爾/升、20微摩爾/升、50微摩爾/升的標準品溶液，且每個濃度的標準品溶液均含I微摩爾/升的木糖醇作為內(nèi)標； (3)空白樣品和樣品的酶促反應 空白樣品反應總體積200微升，含有體積為30微升的醛糖還原酶、終濃度5毫摩爾/升的2-巰基こ醇、終濃度150微摩爾/升的NADPH、終濃度10毫摩爾/升的底物葡萄糖，其余以緩沖液補足； 樣品反應總體積200微升，含有體積為30微升的醛糖還原酶、終濃度5毫摩爾/升的2-巰基こ醇、終濃度150微摩爾/升的NADPH、終濃度0. 1-50微摩爾/升的待測物、終濃度10毫摩爾/升的底物葡萄糖，其余以緩沖液補足； 空白樣品和樣品在25-40攝氏度反應15-40分鐘，分別加入甲醇或こ腈終止反應，分別加入終濃度為I微摩爾/升的內(nèi)標木糖醇； (4)標準品、空白樣品和樣品的檢測 對(2)中的標準品進行超高效液相色譜和質譜檢測，從總離子流圖中提取山梨醇和木糖醇的色譜圖，分別積分求峰面積，以標準品濃度為橫坐標，以山梨醇與木糖醇峰面積比值為縱坐標，或以標準品濃度為縱坐標，以山梨醇與木糖醇的峰面積比值為橫坐標，得到山梨醇濃度的線性方程； 對空白樣品、樣品溶液進行超高效液相色譜和質譜檢測； 所述的超高效液相色譜的檢測條件 色譜柱Waters ACQUITY UPLC BEH C18 2. 1X50 毫米，I. 7 微米； 流動相甲醇和水； 等度洗脫程序0_2分鐘，20%甲醇，所指的百分比均為體積百分比； 流速0. 2暈升/分鐘； 進樣量3微升； 所述的質譜檢測條件 毛細管電壓3000伏特； 去溶劑氣氮氣溫度350攝氏度； 錐孔電壓14伏持； 去溶劑氣氮氣流速800升/小時； 錐孔氣氮氣流速60升/小吋； 碰撞氣IS氣流速0. 15毫升/分鐘； (5)待測物對醛糖還原酶的抑制率 分別計算空白樣品、樣品中山梨醇峰面積和內(nèi)標木糖醇峰面積的比值，根據(jù)(4)得到的線性方程，求得空白樣品和樣品中山梨醇的濃度，計算出待測物對醛糖還原酶的抑制率。
2.根據(jù)權利要求I所述的篩選醛糖還原酶抑制劑的方法，其特征在于，所述的緩沖液的pH值為6.2。
3.根據(jù)權利要求I所述的篩選醛糖還原酶抑制劑的方法，其特征在于，所述的緩沖液由醋酸銨和醋酸配制而成，緩沖液濃度為100毫摩爾/升。
4.根據(jù)權利要求I所述的篩選醛糖還原酶抑制劑的方法，其特征在于，步驟(2)中，所述的標準品溶液是由緩沖液和甲醇配制而成的，或由緩沖液和こ腈配制而成的。
5.根據(jù)權利要求I所述的篩選醛糖還原酶抑制劑的方法，其特征在于，步驟(3)中，所述的樣品中待測物的終濃度為10-50微摩爾/升。
6.根據(jù)權利要求I所述的篩選醛糖還原酶抑制劑的方法，其特征在于，步驟(3)中，所述的空白樣品和樣品在37攝氏度反應25分鐘。
7.根據(jù)權利要求I所述的篩選醛糖還原酶抑制劑的方法，其特征在于，步驟(3)中，所述的甲醇或こ腈的體積為800-1000微升。
全文摘要
篩選醛糖還原酶抑制劑的方法，解決了現(xiàn)有技術中光譜法易受背景干擾，引起假陽性和假陰性結果的問題。本發(fā)明以葡萄糖為底物，醛糖還原酶在25-37攝氏度催化葡萄糖生成山梨醇，用超高效液相色譜和質譜聯(lián)用對山梨醇進行定量，進一步計算出天然產(chǎn)物提取物、單體及合成類的醛糖還原酶抑制劑對醛糖還原酶的抑制率。本發(fā)明的篩選方法快速、準確，線性方程相關系數(shù)達到0.999，可用于醛糖還原酶抑制劑的篩選及醛糖還原酶的動力學研究。
文檔編號G01N30/02GK102796802SQ20121028480
公開日2012年11月28日 申請日期2012年8月10日 優(yōu)先權日2012年8月10日
發(fā)明者宋鳳瑞, 侯廣月, 劉舒, 皮子鳳, 劉志強, 劉淑瑩 申請人:中國科學院長春應用化學研究所