可防治流感的siRNA及其藥物組合物、醫(yī)藥用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種可防治流感的靶向ST6GAL1和ST3GAL4基因的siRNA，所述siRNA為以下至少一種：siST6GAL1_001，siST6GAL1_002，siST3GAL4_001，siST3GAL4_002。本發(fā)明還提供活性成份為所述siRNA的藥物組合物；本發(fā)明還提供了所述siRNA在制備可防治流感病毒的藥物組合物、藥物以及預(yù)防制劑中的應(yīng)用。采用本發(fā)明，可以抑制人呼吸道上皮細(xì)胞表面的人源甲型流感病毒唾液酸受體以及禽源甲型流感病毒唾液酸受體的表達(dá)，從而可以有效地減少人源及禽源甲型流感病毒的吸附與感染。且在呼吸道上皮細(xì)胞系，所述siRNA有效率達(dá)80%以上。
【專利說明】可防治流感的siRNA及其藥物組合物、醫(yī)藥用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種可防治流感的siRNA及其藥物組合物、醫(yī)藥用途。
【背景技術(shù)】
[0002]流行性感冒病毒簡(jiǎn)稱流感病毒，是一種造成人類及動(dòng)物患流行性感冒的RNA病毒；流感病毒可依據(jù)其中的核蛋白(NP)和基質(zhì)蛋白(M)分為四個(gè)屬:甲型(A)、乙型(B)、丙型(C)和類托高土病毒屬。甲型流感廣泛存在于人類及其他動(dòng)物中，其感染范圍廣，呈流行形式出現(xiàn)，危害也最嚴(yán)重；乙型僅存在于人類，常引起流感的局部爆發(fā)；丙型流感存在于人類和豬中，極少流行。
[0003]流感病毒主要通 過感染人類呼吸道上皮細(xì)胞而進(jìn)入宿主體內(nèi)，導(dǎo)致各種全身癥狀，甚至嚴(yán)重的并發(fā)癥！呼吸道上皮細(xì)胞表面的唾液酸分子則作為流感病毒吸附的受體而與流感病毒感染密切相關(guān)。人源的流感病毒偏向于識(shí)別α 2，6唾液酸鏈接作為受體，而禽源的流感病毒則偏向于α 2，3唾液酸鏈接作為受體。
[0004]唾液酸分子鏈接在細(xì)胞表面的糖蛋白和糖脂的末端，在各組生物學(xué)進(jìn)程(如免疫原識(shí)別、病毒感染和細(xì)胞吸附等)中起重要作用。唾液酸轉(zhuǎn)移酶是一類主要的調(diào)節(jié)細(xì)胞表面的唾液酸分子含量的酶類。人類基因組編碼大約20多種涉及糖蛋白和糖脂唾液酸化的唾液酸轉(zhuǎn)移酶。最新的研究證實(shí)，β -半乳糖α 2，6唾液酸轉(zhuǎn)移酶I (ST6GAL I)負(fù)責(zé)將α 2，6唾液酸加到糖蛋白類聚糖的N-鏈接和一些O-鏈接的GALi3 l-4GlcNAc (一種二糖)上；而β -半乳糖α 2，3唾液酸轉(zhuǎn)移酶IV (ST3GAL IV)則主要負(fù)責(zé)α 2，3唾液酸加到糖蛋白類聚糖的N-鏈接和一些O-鏈接的GAL β l-4GlcNAc上。編碼ST6GAL I和ST3GAL IV的基因在人類呼吸道高表達(dá)，這提示這兩種酶與流感病毒主要感染人類呼吸道的機(jī)制相關(guān)，并有可能成為預(yù)防和治療流感病毒的靶點(diǎn)。目前已公開的有關(guān)研究中，尚未見利用制備靶向ST6GAL1和ST3GAL4基因的siRNA用于抑制多種流感病毒亞型，尤其是減少流感病毒吸附而減少感染的報(bào)道。
[0005]小干擾RNA (siRNA)是一類長(zhǎng)度約為21bp的雙鏈RNA，當(dāng)其被導(dǎo)入細(xì)胞后，會(huì)介導(dǎo)與其序列相對(duì)應(yīng)的mRNA降解，從而起到特異性抑制靶基因表達(dá)，這種現(xiàn)象稱作RNA干擾機(jī)制。近年來，RNA干擾技術(shù)飛速發(fā)展，被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域，包括抗病毒療法方面，例如，已有研究證實(shí)針對(duì)各類病毒的基因(包括HIV、脊髓灰質(zhì)炎病毒、丙型肝炎病毒、西尼羅河病毒和流感病毒)設(shè)計(jì)特異靶向的siRNA可在體內(nèi)外起到有效抗病毒作用。但是針對(duì)流感病毒感染所必需的、宿主本身的基因而設(shè)計(jì)的siRNA進(jìn)行抗病毒的研究則較少報(bào)道。
[0006]目前可用于治療和預(yù)防流感病毒的抗病毒藥物主要有神經(jīng)氨酸酶抑制劑(NAI)，如奧司他韋和扎那米韋；以及M2離子通道抑制劑金剛烷胺類，包括金剛烷胺和金剛乙胺。但以上兩類化合藥物有著各種副作用以及局限性，如易產(chǎn)生耐藥性等，這也成為臨床治療及新藥開發(fā)的重要問題。[0007]終上所述，研發(fā)新型的特異性更高、不易產(chǎn)生耐藥性的抗流感藥物成為業(yè)內(nèi)亟待解決的問題。同時(shí)，針對(duì)流感病毒感染所必需的基因，設(shè)計(jì)特異性強(qiáng)的靶向型藥物，并進(jìn)行研究和應(yīng)用也成為業(yè)內(nèi)的迫切需要。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0008]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明設(shè)計(jì)靶向ST6GALI和ST3GAL4基因的s iRNA，明確其抗病毒效果及其作用機(jī)制，為開發(fā)新型的靶向性的siRNA抗流感病毒藥物提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
[0009]本發(fā)明的目的之一是提供一種雙鏈siRNA，其可以抑制人呼吸道上皮細(xì)胞表面的人源甲型流感病毒唾液酸受體(SAa2，6GAL)的表達(dá)，從而減少人源甲型流感病毒的吸附與感染。
[0010]本發(fā)明的另一目的是提供一種雙鏈siRNA，其可以抑制人呼吸道上皮細(xì)胞表面的禽源甲型流感病毒唾液酸受體(SAa2，3GAL)的表達(dá)，從而減少禽源甲型流感病毒的吸附與感染。
[0011]本發(fā)明的另一目的是提供了其活性成份為上述siRNA序列的藥物組合物，用于減少多種流感病毒亞型的吸附而抑制感染。
[0012]本發(fā)明的另一目的是提供了所述siRNA的醫(yī)藥用途，用于制備可防治流感病毒的藥物組合物、藥物以及預(yù)防制劑。
[0013]針對(duì)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案:
本發(fā)明提供了靶向ST6GAL1和ST3GAL4基因的siRNA，所述siRNA為以下至少一種: siST6GALl_001:正義鏈堿基組成為SEQ ID N0.1，反義鏈堿基組成為SEQ ID N0.2; siST6GALl_002:正義鏈堿基組成為SEQ ID N0.3，反義鏈堿基組成為SEQ ID N0.4; siST3GAL4_001:正義鏈堿基組成為SEQ ID N0.5，反義鏈堿基組成為SEQ ID N0.6; siST3GAL4_002:正義鏈堿基組成為SEQ ID N0.7，反義鏈堿基組成為SEQ ID N0.8。
[0014]作為上述方案的改進(jìn)，所述siRNA的每條鏈的3 ‘端修飾有懸垂堿基。
[0015]所述siRNA的鏈包括正義鏈和反義鏈。
[0016]作為上述方案的改進(jìn)，所述懸垂堿基由dA、dT、dG、dC中任意一個(gè)或多個(gè)脫氧核糖核苷酸組成。
[0017]作為上述方案的改進(jìn)，所述懸垂堿基由dA、dT、dG、dC中任意兩個(gè)脫氧核糖核苷酸組成。
[0018]作為上述方案的改進(jìn)，所述siRNA經(jīng)過磷酸化、甲氧基化、硫代、膽固醇、Cy3、Cy5、生物素、維生素、葉酸、膽酸、PEG中的任意一個(gè)或多個(gè)的修飾。
[0019]作為上述方案的改進(jìn)，所述siRNA還經(jīng)過為2’ -O-甲基核糖核苷和/或2’ -氟代的修飾。
[0020]作為上述方案的改進(jìn)，所述siRNA為siST6GALl_001和siST3GAL4_001兩種的混合，siST6GALl_001 和 siST3GAL4_002 兩種的混合，siST6GALl_002 和 siST3GAL4_001 兩種的混合，或siST6GALl_002和siST3GAL4_002兩種的混合。
[0021]相應(yīng)地，本發(fā)明還提供了一種可防治流感的藥物組合物，其活性成份為上述SiRNA0[0022]相應(yīng)地，本發(fā)明還提供了上述siRNA的醫(yī)藥用途，用于制備可防治流感病毒的藥物組合物、藥物以及預(yù)防制劑。
[0023]實(shí)施本發(fā)明實(shí)施例，具有如下有益效果:
本發(fā)明提供了可防治流感的靶向ST6GALI和ST3GAL4基因的siRNA，可以抑制人呼吸道上皮細(xì)胞表面的人源甲型流感病毒唾液酸受體(SAa2，6GAL)以及禽源甲型流感病毒唾液酸受體(SAa2，3GAL)的表達(dá)，從而可以有效地減少人源以及禽源甲型流感病毒的吸附與感染。在呼吸道上皮細(xì)胞系(A549、HBE和HEp-2)，通過分析病毒滴度，所述siRNA有效率達(dá)80%以上。
[0024]本發(fā)明還提供了可防治流感的藥物組合物，其活性成分為靶向ST6GAL1和ST3GAL4基因的siRNA，用于抑制多種流感病毒亞型的吸附而減少感染。
[0025]本發(fā)明還提供了靶向ST6GAL1和ST3GAL4基因的siRNA的應(yīng)用，尤其在制備可防治流感病毒的藥物組合物、藥物以及預(yù)防制劑中的應(yīng)用。本發(fā)明siRNA類抗流感藥物組合物、藥物和預(yù)防制劑具有特異性高、不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)。并可配合特殊的載體，可通過呼吸道吸入給藥，在治療呼吸道病毒感染性疾病具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0026]圖1A和圖1B是實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)所述siRNA對(duì)ST6GAL1和ST3GAL4基因的抑制效率圖；
圖2A和圖2B是western blot在蛋白水平檢測(cè)所述siRNA對(duì)唾液酸轉(zhuǎn)移酶ST6GAL I和ST3GAL IV表達(dá)的抑制效率圖；
圖3A、圖3B、圖3C、圖3D、圖3E和圖3F是免疫熒光檢測(cè)所述siRNA對(duì)細(xì)胞表面唾液酸受體分子的抑制作用效果 圖；
圖4A和圖4B是流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)所述siRNA對(duì)細(xì)胞表面唾液酸受體分子表達(dá)的抑制作用效果圖；
圖5是MTT試驗(yàn)檢測(cè)所述siRNA對(duì)細(xì)胞正常生長(zhǎng)曲線的影響示意圖；
圖6A、圖6B、圖6C、圖6D、圖6E和圖6F是免疫熒光檢測(cè)所述siRNA減少流感病毒吸附細(xì)胞表面的作用示意圖；
圖7 A、圖7B是定量RT-PCR檢測(cè)感染4小時(shí)內(nèi)所述siRNA減少進(jìn)入轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)的流感病毒基因數(shù)量的示意圖；
圖8 A、圖8B是所述siRNA對(duì)流感病毒多復(fù)制周期侵染呼吸道上皮的抑制作用示意
圖；
圖9 A、圖9B是所述siRNA序列的藥物組合物對(duì)多種流感病毒亞型感染的抑制作用示意圖；
圖10是ELISA檢測(cè)所述siRNA在呼吸道上皮細(xì)胞系誘導(dǎo)INF-α表達(dá)的結(jié)果示意圖?！揪唧w實(shí)施方式】
[0027]為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步地詳細(xì)描述。
[0028]本發(fā)明屬于醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地，本發(fā)明涉及一種可防治流感病毒的SiRNA及其藥物組合物。本發(fā)明還涉及所述siRNA在制備藥物組合物、抗流感病毒的藥物、預(yù)防制劑的用途。本發(fā)明還涉及治療流感病毒引起的疾病及與其并發(fā)的疾病、障礙或者病癥的方法。
[0029]為設(shè)計(jì)出高效的靶向ST6GAL1和ST3GAL4基因的siRNA，我們對(duì)GenBank上ST6GAL1和ST3GAL4基因的序列進(jìn)行分析，設(shè)計(jì)出候選siRNA并合成。然后應(yīng)用實(shí)時(shí)定量RT-PCR (Reverse Transcription—Polymerase Chain Reaction,逆轉(zhuǎn)錄 PCR)、westernblot (蛋白質(zhì)印跡)、免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)等方法優(yōu)選出高效、高特異性的siRNA。
[0030]通過導(dǎo)入候選siRNA到呼吸道上皮細(xì)胞系，然后用人源及禽源流感病毒感染，實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定所述siRNA通過抑制細(xì)胞表面的唾液酸受體分子的表達(dá)而減少病毒吸附與感染。在呼吸道上皮細(xì)胞系(A549、HBE和H印-2)，通過分析病毒滴度，所述siRNA有效率達(dá)80%以上。
[0031]本發(fā)明所述的siRNA可用于制備防治流感的藥物制劑，所述藥物制劑可以是脂質(zhì)組合物，也可以是以納米顆粒形式的組合物。所述藥物制劑是由生物相容性分子和/或生物可降解分子組成。
[0032]本發(fā)明所述的siRNA可經(jīng)胃腸外給藥。所述的胃腸外給藥是局部給藥、支氣管給藥、氣管內(nèi)給藥、鼻內(nèi)給藥、吸入給藥或者滴注給藥。
[0033]下面結(jié)合具體實(shí)施例來對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述更為清楚。但是這些實(shí)施例僅是范例性的。并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或者替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0034]實(shí)施例一:靶向ST6GAL1和ST3GAL4基因siRNA的篩選
從GenBank數(shù)據(jù)庫查找到ST6GAL1和ST3GAL4基因序列，并通過生物信息學(xué)技術(shù)確定合適的靶序列；針對(duì)找出的靶序列`設(shè)計(jì)siRNA，這些siRNA序列如下:
序列名稱:siST6GALl_001
siRNA 正義鏈:5 ‘ CAGCCAACUUCCAACAAGAdTdT 3 ‘(SEQ ID N0.1)
siRNA 反義鏈:3 ‘ dTdT ⑶CGGUUGAAGGUUGUUCU 5 ‘(SEQ ID N0.2)
序列名稱:siST6GALl_002
siRNA 正義鏈:5 ‘ GUACCAGAAUCCGGAUUAU dTdT 3 ‘(SEQ ID N0.3)
siRNA 反義鏈:3 ‘ dTdT CAUGGUCUUAGGCCUAAUA 5 ‘(SEQ ID N0.4)
序列名稱:s i ST3GAL4_001
siRNA 正義鏈:5 ‘ GGUCAUCAGAUUGAACAAU dTdT 3 ‘(SEQ ID N0.5)
siRNA 反義鏈:3 ‘ dTdT CCAGUAGUCUAACUUGUUA 5 ‘(SEQ ID N0.6)
序列名稱:siST3GAL4_002
siRNA 正義鏈:5 ‘ GCAGACCAUUCACUACUAU dTdT 3 ‘(SEQ ID N0.7)
siRNA 反義鏈:3 ‘ dTdT CGUCUGGUAAGUGAUGAUA 5 ‘(SEQ ID N0.8)
實(shí)施例二、所述siRNA對(duì)ST6GAL1和ST3GAL4基因表達(dá)的抑制效率這些合成并修飾的siRNA分子通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法，轉(zhuǎn)染入具有代表性的呼吸道上皮細(xì)胞株A549、HBE和HEp_2細(xì)胞，轉(zhuǎn)染方法簡(jiǎn)述為先分別用Opt1-MEM稀釋siRNA及脂質(zhì)體，然后將兩者混在一起，室溫靜置20min，待脂質(zhì)體包裹siRNA后加至細(xì)胞中完成轉(zhuǎn)染。48小時(shí)后，采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)和western blot在蛋白水平檢測(cè)ST6GAL1和ST3GAL4基因的表達(dá)情況，從而評(píng)估不同siRNA的沉默效果(圖1A和圖1B、圖2A和圖2B)。[0035]結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染靶向siRNA的呼吸道上皮細(xì)胞的ST6GAL1和ST3GAL4的相對(duì)表達(dá)量明顯降低，所述siRNA對(duì)靶基因的抑制效率都在80%以上。具體如下:
圖1A是實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)所述siRNA對(duì)ST6GAL1基因的抑制效率圖。圖1A顯示了候選 siRNA (s1-ST6GALl-001 ；s1-ST6GALl-002 ； s1-ST6GALl-003 ； s1-ST6GALl_004)、轉(zhuǎn)染無祀點(diǎn)siRNA (Non-specific siRNA)、以及正常對(duì)照組(Normal cells)分別在A549、HBE和HEp-2三種呼吸道上皮細(xì)胞系中對(duì)ST6GAL1基因的相對(duì)表達(dá)量。由圖1A顯示的結(jié)果可知，候選的轉(zhuǎn)染siRNA的呼吸道上皮細(xì)胞的ST6GAL1相對(duì)表達(dá)量明顯降低，所述siRNA對(duì)靶基因的抑制效率都在80%以上。
[0036]需要說明的是，圖1A中的候選siRNA與轉(zhuǎn)染無靶點(diǎn)siRNA在三種呼吸道上皮細(xì)胞系中對(duì)ST6GAL1基因的相對(duì)表達(dá)量具有顯著性差異，* P < 0.05。
[0037]圖1B是實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)所述siRNA對(duì)ST3GAL4基因的抑制效率圖。圖1B顯示了候選 siRNA(s1-ST3GAL4-001 ；s1-ST3GAL4-002 ；s1-ST3GAL4-003 ； s1-ST3GAL4_004)、轉(zhuǎn)染無祀點(diǎn)siRNA (Non-specific siRNA)、以及正常對(duì)照組(Normal cells)分別在A549、HBE和HEp-2三種呼吸道上皮細(xì)胞系中ST3GAL4基因的相對(duì)表達(dá)量。由圖1B顯示的結(jié)果可知，候選的轉(zhuǎn)染siRNA的呼吸道上皮細(xì)胞的ST3GAL4相對(duì)表達(dá)量明顯降低，所述siRNA對(duì)靶基因的抑制效率都在80%以上。
[0038]需要說明的是，圖1B中的候選siRNA與轉(zhuǎn)染無靶點(diǎn)siRNA在三種呼吸道上皮細(xì)胞系中對(duì)ST3GAL4基因的相對(duì)表達(dá)量具有顯著性差異，* P < 0.05。
[0039]圖2A是western blot在蛋白水平檢測(cè)所述siRNA對(duì)唾液酸轉(zhuǎn)移酶ST6GAL I表達(dá)的抑制效率圖。圖2A顯示了，以β -Actin為參照，候選siRNA (s1-ST6GALl_001 ；s1-ST6GALl-002)干擾48h時(shí)，唾液酸轉(zhuǎn)移酶ST6GAL I的表達(dá)量明顯降低。
[0040]其中，圖2A的1、2、3、4實(shí)驗(yàn)組分別代表:1、空白對(duì)照(Blank control) ;2、轉(zhuǎn)染無靶點(diǎn) siRNA (Non-specific siRNA ) ;3、s1-ST6GALl_001 ;4、s1-ST6GALl_002。
[0041]圖2B是western blot在蛋白水平檢測(cè)所述siRNA對(duì)唾液酸轉(zhuǎn)移酶ST3GAL IV表達(dá)的抑制效率圖。圖2B顯示了，以β -Actin為參照，候選siRNA (s1-ST3GAL4_001 ；s1-ST3GAL4-002)干擾48h時(shí)，唾液酸轉(zhuǎn)移酶ST3GAL IV的表達(dá)量明顯降低。
[0042]其中，圖2B的1、2、3、4實(shí)驗(yàn)組分別代表:1、空白對(duì)照(Blank control) ;2、轉(zhuǎn)染無靶點(diǎn) siRNA (Non-specific siRNA ) ;3、s1-ST3GAL4_001 ； 4、s1-ST3GAL4_002。
[0043]還需要說明的是，Opt1-MEM為改進(jìn)的Eagle MEM培養(yǎng)基，含有HEPES (4_羥乙基哌嗪乙磺酸；N-(2-羥乙基)哌嗪-N’ -2-乙烷磺酸)和碳酸氫鈉緩沖液，并添加了次黃嘌呤、胸腺嘧啶、丙酮酸鈉、L-谷氨酰胺、微量元素和生長(zhǎng)因子。酚紅的濃度低至1.1 mg/L。
[0044]實(shí)施例三、所述siRNA對(duì)細(xì)胞表面唾液酸受體分子表達(dá)的抑制作用
將所述siRNA導(dǎo)入呼吸道上皮細(xì)胞，方法同實(shí)施例二，56小時(shí)后，免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)siRNA對(duì)細(xì)胞表面唾液酸受體分子的抑制作用。如圖3A、圖3B、圖3C、圖3D、圖3E、圖3F，和圖4A、圖4B所示，結(jié)果顯示，siRNA對(duì)細(xì)胞表面唾液酸受體分子表達(dá)的有明顯的抑制作用，抑制效率都在80%以上，具體如下:
圖3A是免疫熒光檢測(cè)未轉(zhuǎn)染靶向siRNA和轉(zhuǎn)染了靶向ST6GALl—siRNA分別對(duì)HBE細(xì)胞表面唾液酸受體分子SAa2，6GAL的抑制作用效果圖。圖3A中左側(cè)的一列為未轉(zhuǎn)染靶向siRNA對(duì)HBE細(xì)胞表面唾液酸受體分子SAa2，6GAL的抑制作用效果圖，而右側(cè)的一列為轉(zhuǎn)染了靶向ST6GALl—siRNA細(xì)胞對(duì)HBE細(xì)胞表面唾液酸受體分子SAa2，6GAL的抑制作用效果圖。在激光共聚焦顯微鏡下觀察:未轉(zhuǎn)染靶向siRNA的HBE細(xì)胞(左)表面見較多SAa2，6GAL的表達(dá)；而轉(zhuǎn)染了靶向ST6GALl—siRNA的HBE細(xì)胞(右)表面的SAa2，6GAL明顯減少。
[0045]由圖3A顯示的結(jié)果可知，轉(zhuǎn)染了靶向ST6GALl—siRNA對(duì)HBE細(xì)胞表面唾液酸受體分子SAa2，6GAL表達(dá)的有明顯的抑制作用，抑制效率都在80%以上。
[0046]圖3A中各組附圖采用如下的標(biāo)記方式，a、SNA-FITC，b、DAPI，C、Merge ;d、SNA-FITC, e、DAPI，f、Merge。具體如下:
(l)a, d組采用熒光標(biāo)記植物凝集素SNA-FITC標(biāo)記，即采用特異性識(shí)別唾液酸受體的異硫氰酸熒光素標(biāo)記的接骨木凝集素作用于各組細(xì)胞，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞表面SAa2, 6GAL含量，以平均突光強(qiáng)度fluorescence intensity, MFI表示細(xì)胞表面SAa2, 6GAL 含量。
[0047]需要說明的是,生物凝集素Sambucus Nigra Lectin (SNA)能特異地和細(xì)胞表面的SAa2，6GAL結(jié)合，從而起到分子探針的作用，所以采用FITC標(biāo)記的SNA檢測(cè)經(jīng)候選siRNA轉(zhuǎn)染或未轉(zhuǎn)染的呼吸道上皮細(xì)胞。
[0048](2)b、e組采用了 DAPI標(biāo)記，DAPI即4’，6_ 二脒基_2_苯基吲哚(4’, 6-diamidino-2-pheny I indole),是一種能夠與DNA強(qiáng)力結(jié)合的突光染料,可用于活細(xì)胞和固定細(xì)胞核的染色。
[0049](3)c、f組采用了 Merge標(biāo)記，即c組熒光標(biāo)記圖片為a組熒光標(biāo)記圖片和b組熒光標(biāo)記圖片的合并置加，而f組滅光標(biāo)記圖片為d組滅光標(biāo)記圖片和e組滅光標(biāo)記圖片的合并疊加。
[0050]圖3B是免疫熒光檢測(cè)未轉(zhuǎn)染靶向siRNA和轉(zhuǎn)染了靶向ST3GAL4—siRNA分別對(duì)HBE細(xì)胞表面唾液酸受體分子SAa2，3GAL的抑制作用效果圖。圖3B中左側(cè)的一列為未轉(zhuǎn)染靶向siRNA對(duì)HBE細(xì)胞表面唾液酸受體分子SAa2，3GAL的抑制作用效果圖，而右側(cè)的一列為轉(zhuǎn)染了靶向ST3GAL4—siRNA細(xì)胞對(duì)HBE細(xì)胞表面唾液酸受體分子SAa2，3GAL的抑制作用效果圖。在激光共聚焦顯微鏡下觀察:未轉(zhuǎn)染靶向siRNA的HBE細(xì)胞(左)表面見較多SAa2, 3GAL的表達(dá)；而轉(zhuǎn)染了靶向ST3GAL4—siRNA的HBE細(xì)胞(右)表面的SAa2，3GAL明顯減少。
[0051]由圖3B顯示的結(jié)果可知，轉(zhuǎn)染了靶向ST3GAL4—siRNA對(duì)HBE細(xì)胞表面唾液酸受體分子SAa2，3GAL表達(dá)的有明顯的抑制作用，抑制效率都在80%以上。
[0052]圖3B中各組附圖采用如下的標(biāo)記方式，a、MAA_FITC，b、DAPI，C、Merge ;d、MAA-FITC, e、DAPI，f、Merge。具體如下:
(I) a、d組采用熒光標(biāo)記植物凝集素MAA-FITC標(biāo)記，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞表面SAa2, 3GAL含量，以平均突光強(qiáng)度fluorescence intensity, MFI表示細(xì)胞表面SAa2, 3GAL 含量。
[0053]需要說明的是,生物凝集素Maackia Amurensis Lectin (MAA)能特異地和細(xì)胞表面的SAa2，3GAL結(jié)合，從而起到分子探針的作用，所以采用FITC標(biāo)記的MAA檢測(cè)經(jīng)候選siRNA轉(zhuǎn)染或未轉(zhuǎn)染的呼吸道上皮細(xì)胞。
[0054](2)b、e組采用了 DAPI標(biāo)記，DAPI即4’，6_ 二脒基_2_苯基吲哚(4’, 6-diamidino-2-pheny I indole),是一種能夠與DNA強(qiáng)力結(jié)合的突光染料,可用于活細(xì)胞和固定細(xì)胞核的染色。
[0055](3)c、f組采用了 Merge標(biāo)記，即c組熒光標(biāo)記圖片為a組熒光標(biāo)記圖片和b組熒光標(biāo)記圖片的合并置加，而f組滅光標(biāo)記圖片為d組滅光標(biāo)記圖片和e組滅光標(biāo)記圖片的合并疊加。
[0056]圖3C是免疫熒光檢測(cè)未轉(zhuǎn)染靶向siRNA和轉(zhuǎn)染了靶向ST6GALl—siRNA分別對(duì)HEp-2細(xì)胞表面唾液酸受體分子SAa2，6GAL的抑制作用效果圖。圖3C中左側(cè)的一列為未轉(zhuǎn)染靶向siRNA對(duì)HEp-2細(xì)胞表面唾液酸受體分子SAa2，6GAL的抑制作用效果圖，而右側(cè)的一列為轉(zhuǎn)染了靶向ST6GALl—siRNA細(xì)胞對(duì)HEp_2細(xì)胞表面唾液酸受體分子SAa2，6GAL的抑制作用效果圖。在激光共聚焦顯微鏡下觀察:未轉(zhuǎn)染靶向siRNA的HEp-2細(xì)胞(左)表面見較多SAa2，6GAL1的表達(dá)；而轉(zhuǎn)染了靶向ST6GALl—siRNA的HEp-2細(xì)胞(右)表面的SAa2, 6GAL明顯減少。
[0057]由圖3C顯示的結(jié)果可知，轉(zhuǎn)染了靶向ST6GALl—siRNA對(duì)HEp_2細(xì)胞表面唾液酸受體分子SAa2，6GAL表達(dá)的有明顯的抑制作用，抑制效率都在80%以上。
[0058]圖3C中各組附圖采用如下的標(biāo)記方式，a、SNA-FITC, b、DAPI，c、Merge ； d、SNA-FITC, e、DAPI，f、Merge。進(jìn)一步，圖3C中:a、d組，b、e組，c、f組的標(biāo)記方式與圖3A相同，在此不再贅述。
[0059]圖3D是免疫熒光檢測(cè)未轉(zhuǎn)染靶向siRNA和轉(zhuǎn)染了靶向ST3GAL4—siRNA分別對(duì)HEp-2細(xì)胞表面唾液酸受體分子SAa2，3GAL的抑制作用效果圖。圖3D中左側(cè)的一列為未轉(zhuǎn)染靶向siRNA對(duì)HEp-2細(xì)胞表面唾液酸受體分子SAa2，3GAL的抑制作用效果圖，而右側(cè)的一列為轉(zhuǎn)染了靶向ST3GAL4—siRNA細(xì)胞對(duì)HEp-2細(xì)胞表面唾液酸受體分子SAa2，3GAL的抑制作用效果圖。在激光共聚焦顯微鏡下觀察:未轉(zhuǎn)染靶向siRNA的HEp-2細(xì)胞(左)表面見較多SAa2，3GAL的表達(dá)；而轉(zhuǎn)染了靶向ST3GAL4—siRNA的HEp-2細(xì)胞(右)表面的SAa2, 3GAL明顯減少。
[0060]由圖3D顯示的結(jié)果可知，轉(zhuǎn)染了靶向ST3GAL4—siRNA對(duì)HEp_2細(xì)胞表面唾液酸受體分子SAa2，3GAL表達(dá)的有明顯的抑制作用，抑制效率都在80%以上。
[0061]圖3D中各組附圖采用如下的標(biāo)記方式，a、MAA_FITC，b、DAPI，c、Merge; d、MAA-FITC, e、DAPI，f、Merge。進(jìn)一步，圖3D中:a、d組，b、e組，c、f組的標(biāo)記方式與圖3B相同，在此不再贅述。
[0062]圖3E是免疫熒光檢測(cè)未轉(zhuǎn)染靶向siRNA和轉(zhuǎn)染了靶向ST6GALl—siRNA分別對(duì)A549細(xì)胞表面唾液酸受體分子SAa2，6GAL的抑制作用效果圖。圖3E中左側(cè)的一列為未轉(zhuǎn)染靶向siRNA對(duì)A549細(xì)胞表面唾液酸受體分子SAa2，6GAL的抑制作用效果圖，而右側(cè)的一列為轉(zhuǎn)染了靶向ST6GALl—siRNA細(xì)胞對(duì)A549細(xì)胞表面唾液酸受體分子SAa2，6GAL的抑制作用效果圖。在激光共聚焦顯微鏡下觀察:未轉(zhuǎn)染靶向siRNA的A549細(xì)胞(左)表面見較多SAa2, 6GAL的表達(dá)；而轉(zhuǎn)染了靶向ST6GALl—siRNA的A549細(xì)胞(右)表面的SAa2, 6GAL明顯減少。
[0063]由圖3E顯示的結(jié)果可知，轉(zhuǎn)染了靶向ST6GALl—siRNA對(duì)A549細(xì)胞表面唾液酸受體分子SAa2，6GAL表達(dá)的有明顯的抑制作用，抑制效率都在80%以上。
[0064]圖3E中各組附圖采用如下的標(biāo)記方式，a、SNA_FITC，b、DAPI，c、Merge; d、SNA-FITC, e、DAPI，f、Merge。進(jìn)一步，圖3E中:a、d組，b、e組，C、f組的標(biāo)記方式與圖3A相同，在此不再贅述。
[0065]圖3F是免疫熒光檢測(cè)未轉(zhuǎn)染靶向siRNA和轉(zhuǎn)染了靶向ST3GAL4—siRNA分別對(duì)A549細(xì)胞表面唾液酸受體分子SAa2，3GAL的抑制作用效果圖。圖3F中左側(cè)的一列為未轉(zhuǎn)染靶向siRNA對(duì)A549細(xì)胞表面唾液酸受體分子SAa2，3GAL的抑制作用效果圖，而右側(cè)的一列為轉(zhuǎn)染了靶向ST3GAL4—siRNA細(xì)胞對(duì)A549細(xì)胞表面唾液酸受體分子SAa2，3GAL的抑制作用效果圖。在激光共聚焦顯微鏡下觀察:未轉(zhuǎn)染靶向siRNA的A549細(xì)胞(左)表面見較多SAa2, 3GAL的表達(dá)；而轉(zhuǎn)染了靶向ST3GAL4—siRNA的A549細(xì)胞(右)表面的SAa2, 3GAL明顯減少。
[0066]由圖3F顯示的結(jié)果可知，轉(zhuǎn)染了靶向ST3GAL4—siRNA對(duì)A549細(xì)胞表面唾液酸受體分子SAa2，3GAL表達(dá)的有明顯的抑制作用，抑制效率都在80%以上。
[0067]圖3F中各組附圖采用如下的標(biāo)記方式，a、MAA_FITC，b、DAPI，c、Merge ; d、MAA-FITC, e、DAPI，f、Merge。進(jìn)一步，圖3F中:a、d組，b、e組，c、f組的標(biāo)記方式與圖3B相同，在此不再贅述。
[0068]圖4A是流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)正常對(duì)照組和靶向siRNA處理組對(duì)細(xì)胞表面唾液酸受體分子SAa2，6GAL的抑制作用效果圖。圖4A顯示了流式細(xì)胞術(shù)定量檢測(cè)細(xì)胞表面的SAa2, 6GAL受體的表達(dá)，左側(cè)為正常對(duì)照組，平均熒光強(qiáng)度(MFI=Il0.47 ±6.28)，而右側(cè)靶向siRNA處理組的平均熒光強(qiáng)度明顯減低(MFI=21.35±3.002)。
[0069]由圖4A顯示的結(jié)果可知，靶向siRNA處理組對(duì)細(xì)胞表面唾液酸受體分子SAa2, 6GAL具有明顯的抑制作用，抑制效率都在80%以上。
[0070]需要說明的是，圖4A采用熒光標(biāo)記植物凝集素SNA-FITC標(biāo)記。
`[0071]圖4B是流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)正常對(duì)照組和靶向siRNA處理組對(duì)細(xì)胞表面唾液酸受體分子SAa2，3GAL的抑制作用效果圖。圖4B顯示了流式細(xì)胞術(shù)定量檢測(cè)細(xì)胞表面的SAa2, 3GAL受體的表達(dá)，左側(cè)為正常對(duì)照組，平均熒光強(qiáng)度(MFI=120.69±10.68)，而右側(cè)靶向siRNA處理組的平均熒光強(qiáng)度明顯減低(MFI=25.81 ±4.62)
由圖4B顯示的結(jié)果可知，靶向siRNA處理組對(duì)細(xì)胞表面唾液酸受體分子SAa2，3GAL具有明顯的抑制作用，抑制效率都在80%以上。
[0072]需要說明的是，圖4B采用熒光標(biāo)記植物凝集素MAA-FITC標(biāo)記。
[0073]綜上所述，圖3和圖4的結(jié)果顯示，靶向ST6GAL1和ST3GAL4基因的siRNA對(duì)細(xì)胞表面唾液酸受體分子表達(dá)的有明顯的抑制作用，抑制效率都在80%以上。
[0074]實(shí)施例四、檢測(cè)siRNA對(duì)細(xì)胞正常生長(zhǎng)的影響
將所述siRNA導(dǎo)入呼吸道上皮細(xì)胞，方法同實(shí)施例二，應(yīng)用MTT試驗(yàn)檢測(cè)siRNA對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線的影響(如圖5所示)。結(jié)果顯示，在siRNA的有效濃度(5nM)內(nèi)對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)無明顯影響。
[0075]實(shí)施例五、siRNA對(duì)流感病毒吸附細(xì)胞表面的影響
將所述siRNA導(dǎo)入呼吸道上皮細(xì)胞，方法同實(shí)施例二，轉(zhuǎn)染72小時(shí)后加入人流感病毒HlNl和禽流感病毒H9N2，并以未轉(zhuǎn)染細(xì)胞及轉(zhuǎn)染無靶點(diǎn)siRNA作為對(duì)照。2小時(shí)后，免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示:所述siRNA處理組細(xì)胞表面吸附的病毒顆粒明顯減少(如圖6所示)。
[0076]圖6A是免疫熒光檢測(cè)所述siRNA對(duì)新甲流HlNl流感病毒吸附A549細(xì)胞表面的作用示意圖。圖6A中左側(cè)的一列為轉(zhuǎn)染非靶向siRNA對(duì)新甲流HlNl流感病毒吸附A549細(xì)胞表面的作用示意圖，而右側(cè)的一列為轉(zhuǎn)染靶向ST6GAL1基因的siRNA細(xì)胞對(duì)新甲流HlNl流感病毒吸附A549細(xì)胞表面的作用示意圖。
[0077]在激光共聚焦顯微鏡下觀察:轉(zhuǎn)染非靶向siRNA的新甲流HlNl流感病毒吸附A549細(xì)胞(左)表面見大量的病毒顆粒吸附；而轉(zhuǎn)染靶向ST6GAL1基因的siRNA的新甲流HlNl流感病毒吸附A549細(xì)胞(右)表面只見很少量的病毒顆粒吸附。
[0078]由圖6A顯示的結(jié)果可知，靶向ST6GAL1基因的siRNA對(duì)新甲流HlNl流感病毒吸附A549細(xì)胞表面具有明顯的抑制作用。與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞及轉(zhuǎn)染無靶點(diǎn)siRNA相比，靶向ST6GAL1基因的siRNA處理組細(xì)胞表面吸附的病毒顆粒明顯減少。
[0079]圖6A中各組附圖采用如下的標(biāo)記方式:a、Anti_HA, b、DAPI, c>Merge, d> Zoom ;e、Ant1-HA, f、DAPI, g、Merge, h、Zoom,具體如下:
(I )a、e組采用抗流感病毒血凝素蛋白抗體(Ant 1-HA )標(biāo)記，做免疫熒光實(shí)驗(yàn)。Ant 1-HA為高純度的小鼠單克隆抗體。
[0080](2)b、f組采用了 DAPI標(biāo)記，DAPI即4’，6_ 二脒基_2_苯基吲哚(4’, 6-diamidino-2-pheny I indole) ,是一種能夠與DNA強(qiáng)力結(jié)合的突光染料,可用于活細(xì)胞和固定細(xì)胞核的染色。
[0081](3)c、g組采用了 Merge標(biāo)記，即c組熒光標(biāo)記圖片為a組熒光標(biāo)記圖片和b組熒光標(biāo)記圖片的合并置加，而g組滅光標(biāo)記圖片為e組滅光標(biāo)記圖片和f組滅光標(biāo)記圖片的合并疊加。
[0082](3) d、h組為分別在C、g組的基礎(chǔ)上做圖像電子放大(Zoom)處理。
[0083]圖6B是免疫熒光檢測(cè)所述siRNA對(duì)禽流感H9N2病毒吸附A549細(xì)胞表面的作用示意圖。圖6B中左側(cè)的一列為轉(zhuǎn)染非靶向siRNA對(duì)禽流感H9N2病毒吸附A549細(xì)胞表面的抑制作用示意圖，而右側(cè)的一列為轉(zhuǎn)染靶向ST3GAL4基因的siRNA細(xì)胞對(duì)禽流感H9N2病毒吸附A549細(xì)胞表面的抑制作用示意圖。
[0084]在激光共聚焦顯微鏡下觀察:轉(zhuǎn)染非靶向siRNA的禽流感H9N2病毒吸附A549細(xì)胞(左)表面見大量的病毒顆粒吸附；而轉(zhuǎn)染靶向ST3GAL4基因的siRNA的禽流感H9N2病毒吸附A549細(xì)胞(右)表面只見很少量的病毒顆粒吸附。
[0085]由圖6B顯示的結(jié)果可知，靶向ST3GAL4基因的8丨1?應(yīng)對(duì)禽流感!19吧病毒吸附A549細(xì)胞表面具有明顯的抑制作用。與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞及轉(zhuǎn)染無靶點(diǎn)siRNA相比，靶向ST3GAL4基因的siRNA處理組細(xì)胞表面吸附的病毒顆粒明顯減少。
[0086]圖6B中各組附圖采用如下的標(biāo)記方式:a、Anti_HA, b、DAPI, c>Merge, d> Zoom ;e、Ant1-HA, f、DAPI, g、Merge, h、Zoom,其標(biāo)記方式與圖6A相同,在此不再贅述。
[0087]圖6C是免疫熒光檢測(cè)所述siRNA對(duì)新甲流HlNl流感病毒吸附HBE細(xì)胞表面的作用示意圖。圖6C中左側(cè)的一列為轉(zhuǎn)染非靶向siRNA對(duì)新甲流HlNl流感病毒吸附HBE細(xì)胞表面的抑制作用示意圖，而右側(cè)的一列為轉(zhuǎn)染靶向ST6GAL1基因的siRNA細(xì)胞對(duì)新甲流HlNl流感病毒吸附HBE細(xì)胞表面的抑制作用示意圖。
[0088]在激光共聚焦顯微鏡下觀察:轉(zhuǎn)染非靶向siRNA的新甲流HlNl流感病毒吸附HBE細(xì)胞(左)表面見大量的病毒顆粒吸附；而轉(zhuǎn)染靶向ST6GAL1基因的siRNA的新甲流HlNl流感病毒吸附HBE細(xì)胞(右)表面只見很少量的病毒顆粒吸附。[0089]由圖6C顯示的結(jié)果可知，靶向ST6GAL1基因的siRNA對(duì)新甲流HlNl流感病毒吸附HBE細(xì)胞表面具有明顯的抑制作用。與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞及轉(zhuǎn)染無靶點(diǎn)siRNA相比，靶向ST6GAL1基因的siRNA處理組細(xì)胞表面吸附的病毒顆粒明顯減少。
[0090]圖6C中各組附圖采用如下的標(biāo)記方式:a、Ant1-HA, b、DAPI, C、Merge, ;d、Ant1-HA, e、DAPI, f、Merge,其標(biāo)記方式同圖6A所述,在此不再贅述。
[0091]圖6D是免疫熒光檢測(cè)所述siRNA對(duì)禽流感H9N2病毒吸附HBE細(xì)胞表面的作用示意圖。圖6D中左側(cè)的一列為轉(zhuǎn)染非靶向siRNA對(duì)禽流感H9N2病毒吸附HBE細(xì)胞表面的抑制作用示意圖，而右側(cè)的一列為轉(zhuǎn)染靶向ST3GAL4基因的siRNA細(xì)胞對(duì)禽流感H9N2病毒吸附HBE細(xì)胞表面的抑制作用示意圖。
[0092]在激光共聚焦顯微鏡下觀察:轉(zhuǎn)染非靶向siRNA的禽流感H9N2病毒吸附HBE細(xì)胞(左)表面見大量的病毒顆粒吸附；而轉(zhuǎn)染靶向ST3GAL4基因的siRNA的禽流感H9N2病毒吸附HBE細(xì)胞(右)表面只見很少量的病毒顆粒吸附。
[0093]由圖6D顯示的結(jié)果可知，靶向ST3GAL4基因的siRNA對(duì)禽流感H9N2病毒吸附HBE細(xì)胞表面具有明顯的抑制作用。與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞及轉(zhuǎn)染無靶點(diǎn)siRNA相比，靶向ST3GAL4基因的siRNA處理組細(xì)胞表面吸附的病毒顆粒明顯減少。
[0094]圖6D中各組附圖采用如下的標(biāo)記方式:a、Ant1-HA, b、DAPI, c、Merge, ;d、Ant1-HA, e、DAPI, f、Merge,其標(biāo)記方式同圖6A所述,在此不再贅述。
[0095]圖6E是免疫熒光檢測(cè)所述siRNA對(duì)新甲流HlNl流感病毒吸附HEp_2細(xì)胞表面的作用示意圖。圖6E中左側(cè)的一列為轉(zhuǎn)染非靶向siRNA對(duì)新甲流HlNl流感病毒吸附HEp_2細(xì)胞表面的抑制作用示意圖，而右側(cè)的一列為轉(zhuǎn)染靶向ST6GAL1基因的siRNA細(xì)胞對(duì)新甲流HlNl流感病毒吸附HEp-2細(xì)胞表面的抑制作用示意圖。
`[0096]在激光共聚焦顯微鏡下觀察:轉(zhuǎn)染非靶向siRNA的新甲流HlNl流感病毒吸附HEp-2細(xì)胞(左)表面見大量的病毒顆粒吸附；而轉(zhuǎn)染靶向ST6GAL1基因的siRNA的新甲流HlNl流感病毒吸附HEp-2細(xì)胞(右)表面只見很少量的病毒顆粒吸附。
[0097]由圖6E顯示的結(jié)果可知，靶向ST6GAL1基因的siRNA對(duì)新甲流HlNl流感病毒吸附HEp-2細(xì)胞表面具有明顯的抑制作用。與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞及轉(zhuǎn)染無靶點(diǎn)siRNA相比，靶向ST6GAL1基因的siRNA處理組細(xì)胞表面吸附的病毒顆粒明顯減少。
[0098]圖6E中各組附圖采用如下的標(biāo)記方式:a、Ant1-HA, b、DAPI, c、Merge, ;d、Ant1-HA, e、DAPI, f、Merge,其標(biāo)記方式同圖6A所述,在此不再贅述。
[0099]圖6F是免疫熒光檢測(cè)所述siRNA對(duì)禽流感H9N2病毒吸附HEp_2細(xì)胞表面的作用示意圖。圖6F中左側(cè)的一列為轉(zhuǎn)染非靶向siRNA對(duì)禽流感H9N2病毒吸附HEp_2細(xì)胞表面的抑制作用示意圖，而右側(cè)的一列為轉(zhuǎn)染靶向ST3GAL4基因的siRNA細(xì)胞對(duì)禽流感H9N2病毒吸附HEp-2細(xì)胞表面的抑制作用示意圖。
[0100]在激光共聚焦顯微鏡下觀察:轉(zhuǎn)染非靶向siRNA的禽流感H9N2病毒吸附HEp_2細(xì)胞(左)表面見大量的病毒顆粒吸附；而轉(zhuǎn)染靶向ST3GAL4基因的siRNA的禽流感H9N2病毒吸附HEp-2細(xì)胞(右)表面只見很少量的病毒顆粒吸附。
[0101]由圖6F顯示的結(jié)果可知，靶向ST3GAL4基因的siRNA對(duì)禽流感H9N2病毒吸附HEp-2細(xì)胞表面具有明顯的抑制作用。與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞及轉(zhuǎn)染無靶點(diǎn)siRNA相比，靶向ST3GAL4基因的siRNA處理組細(xì)胞表面吸附的病毒顆粒明顯減少。[0102]圖6F中各組附圖采用如下的標(biāo)記方式:a、Ant1-HA, b、DAPI, c、Merge, ;d、Ant1-HA, e、DAPI, f、Merge,其標(biāo)記方式同圖6A所述,在此不再贅述。
[0103]綜上所述，靶向ST6GAL1和ST3GAL4基因的siRNA處理組對(duì)呼吸道上皮細(xì)胞系(A549、HBE和HEp-2細(xì)胞)的表面具有明顯的抑制作用，所述細(xì)胞表面吸附的病毒顆粒明顯減少。
[0104]實(shí)施例六、感染4小時(shí)內(nèi)所述siRNA對(duì)流感病毒進(jìn)入轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)的影響 將所述siRNA導(dǎo)入呼吸道上皮細(xì)胞，方法同實(shí)施例二，轉(zhuǎn)染72小時(shí)后加入人流感病毒
HlNl和禽流感病毒H9N2，并以未轉(zhuǎn)染細(xì)胞及轉(zhuǎn)染無靶點(diǎn)siRNA作為對(duì)照。接種病毒4小時(shí)內(nèi)，定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示:所述siRNA處理組細(xì)胞內(nèi)的病毒基因數(shù)量明顯減少(如圖7A、圖7B所示)。
[0105]圖7A是定量RT-PCR檢測(cè)感染4小時(shí)內(nèi)所述siRNA進(jìn)入轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)的人流感病毒HlNl基因數(shù)量的示意圖。圖7A顯示了與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞及轉(zhuǎn)染無祀點(diǎn)siRNA相比，轉(zhuǎn)染s1-ST6GALl-001和s1-ST6GALl_002的siRNA處理組的A549細(xì)胞內(nèi)的病毒基因數(shù)量明顯減少，其人流感病毒HlNl基因數(shù)量大致減少了 70~80%;轉(zhuǎn)染s1-ST6GALl-001和s1-ST6GALl-002的siRNA處理組的HBE細(xì)胞內(nèi)的病毒基因數(shù)量明顯減少，其人流感病毒HlNl 基因數(shù)量大致減少了 70~80% ;轉(zhuǎn)染 s1-ST6GALl-001 和 s1-ST6GALl_002 的 siRNA 處理組的HEp-2細(xì)胞內(nèi)的病毒基因數(shù)量明顯減少，其人流感病毒HlNl基因數(shù)量大致減少了70~80%。
[0106]由圖7A顯示的結(jié)果可知，靶向ST6GAL1基因的siRNA能明顯減少新甲流HlNl病毒進(jìn)入呼吸道上皮細(xì)胞。
[0107]需要說明的是，圖7A中的轉(zhuǎn)染s1-ST6GALl-001、s1-ST6GALl-002的siRNA處理組與轉(zhuǎn)染無靶點(diǎn)siRNA處理組細(xì)胞內(nèi)的HlNl基因數(shù)量具有顯著性差異，* P < 0.05。
[0108]圖7B是定量RT-PCR檢測(cè)感染4小時(shí)內(nèi)所述siRNA進(jìn)入轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)的禽流感病毒H9N2基因數(shù)量的示意圖。由圖7B可知，與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞及轉(zhuǎn)染無靶點(diǎn)siRNA相比，轉(zhuǎn)染s1-ST3GAL4-001和s1- ST3GAL4-002的siRNA處理組的A549細(xì)胞內(nèi)的病毒基因數(shù)量明顯減少，其禽流感病毒H9N2基因數(shù)量大致減少了 70-80%;轉(zhuǎn)染s1-ST3GAL4-001和si_ST3GAL4-002的siRNA處理組的HBE細(xì)胞內(nèi)的病毒基因數(shù)量明顯減少，其禽流感病毒H9N2基因數(shù)量大致減少了 70~80% ;轉(zhuǎn)染s1-ST3GAL4-001和s1- ST3GAL4-002的siRNA處理組的HEp-2細(xì)胞內(nèi)的病毒基因數(shù)量明顯減少，其禽流感病毒H9N2基因數(shù)量大致減少了 70~80%。
[0109]由圖7B顯示的結(jié)果可知，靶向ST3GAL4基因的siRNA能明顯減少禽流感H9N2病毒進(jìn)入呼吸道上皮細(xì)胞。
[0110]需要說明的是，圖7B 中的轉(zhuǎn)染 S1-ST3GAL4-001、s1- ST3GAL4-002 的 siRNA 處理組與轉(zhuǎn)染無靶點(diǎn)siRNA處理組細(xì)胞內(nèi)的H9N2基因數(shù)量具有顯著性差異，* P < 0.05。
[0111]綜上所述，靶向ST6GAL1和ST3GAL4基因的siRNA處理組細(xì)胞內(nèi)的HlNl和H9N2病毒基因數(shù)量明顯減少，靶向ST6GAL1和ST3GAL4基因的siRNA能明顯減少感染初期HlNl和H9N2病毒進(jìn)入呼吸道上皮細(xì)胞。
[0112]實(shí)施例七、所述siRNA對(duì)流感病毒多復(fù)制周期侵染呼吸道上皮的抑制作用 將所述siRNA導(dǎo)入呼吸道上皮細(xì)胞，方法同實(shí)施例二，轉(zhuǎn)染72小時(shí)后加入人流感病毒
HlNl或禽流感病毒H9N2，并以未轉(zhuǎn)染細(xì)胞及轉(zhuǎn)染無靶點(diǎn)siRNA作為對(duì)照。分別于感染后不同時(shí)間點(diǎn)，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清作TCID50 (Tissue culture infective dose)試驗(yàn)。結(jié)果顯示，所述siRNA干擾目的基因后可有效抑制病毒對(duì)呼吸道上皮細(xì)胞的侵染(如圖8 A、圖SB所示)。
[0113]圖8A是所述siRNA對(duì)人流感病毒HlNl多復(fù)制周期侵染呼吸道上皮的抑制作用示意圖。圖8A顯示了轉(zhuǎn)染s1-ST6GALl的siRNA處理組細(xì)胞在感染HlNl后不同時(shí)間點(diǎn)所測(cè)量的HlNl病毒滴度(Log TCID5tl),由圖可知，在感染HlNl的36小時(shí)后，轉(zhuǎn)染si_ST6GALl的siRNA處理組細(xì)胞的HlNl病毒滴度(Log TCID5tl)明顯較未轉(zhuǎn)染細(xì)胞及轉(zhuǎn)染無靶點(diǎn)siRNA處理組低。
[0114]由圖8A顯示的結(jié)果可知，靶向ST6GAL1基因的siRNA對(duì)新甲流HlNl病毒有長(zhǎng)時(shí)間抑制作用。
[0115]需要說明的是，圖8A中的轉(zhuǎn)染si_ST6GALl的siRNA處理組與轉(zhuǎn)染無靶點(diǎn)siRNA處理組細(xì)胞的HlNl病毒滴度具有顯著性差異，* P < 0.05。
[0116]圖8B是所述siRNA對(duì)禽流感H9N2多復(fù)制周期侵染呼吸道上皮的抑制作用示意圖。圖8B顯示了轉(zhuǎn)染s1-ST3GAL4的siRNA處理組細(xì)胞在感染H9N2后不同時(shí)間點(diǎn)所測(cè)量的H9N2病毒滴度(Log TCID5tl),由圖可知，在感染H9N2的36小時(shí)后，轉(zhuǎn)染s1- ST3GAL4的siRNA處理組細(xì)胞的H9N2病毒滴度(Log TCID50)明顯較未轉(zhuǎn)染細(xì)胞及轉(zhuǎn)染無靶點(diǎn)siRNA處理組低。
[0117]由圖8B顯示的結(jié)果可知，靶向ST3GAL4基因的siRNA對(duì)禽流感H9N2病毒有長(zhǎng)效抑制作用。
[0118]需要說明的是，圖8B中的轉(zhuǎn)染si_ST3GAL4的siRNA處理組與轉(zhuǎn)染無靶點(diǎn)siRNA處理組細(xì)胞的H9N2病毒滴度具有顯著性差異，* P < 0.05。
`[0119]綜上所述，靶向ST6GAL1和ST3GAL4基因的處理組可長(zhǎng)時(shí)間、有效地抑制HlNl和H9N2病毒對(duì)呼吸道上皮細(xì)胞的侵染。
[0120]實(shí)施例八、所述siRNA序列的藥物組合物抑制多種流感病毒亞型的效果
將特異性的 siRNA 聯(lián)合用藥(siST6GALl-001+siST3GAL4-001、siST6GALl-001+siST3GAL4-002、siST6GALl-002+siST3GAL4-001、siST6GALl-002+siST3GAL4-002)以5nM濃度轉(zhuǎn)呼吸道上皮細(xì)胞，轉(zhuǎn)染方法同實(shí)施例二，檢測(cè)方法同實(shí)施例五、六。結(jié)果顯示，聯(lián)合給藥組siRNA對(duì)人源和禽源流感病毒均達(dá)到明顯抑制(如圖9A和圖9B所示)。
[0121]圖9A是所述siRNA序列的藥物組合物對(duì)人流感病毒HlNl亞型感染的抑制作用示意圖。圖9A顯示了:與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞及轉(zhuǎn)染無祀點(diǎn)siRNA相比，
(1)s1-ST6GALl-001+ s1-ST3GAL4_001 藥物組合物、s1-ST6GALl_001 +s1- ST3GAL4-002 藥物組合物、s1-ST6GALl-002+ s1-ST3GAL4-001 藥物組合物、s1-ST6GALl-002+ s1-ST3GAL4_002藥物組合物處理組的A549細(xì)胞內(nèi)的人流感病毒HlNl病毒滴度(Log TCID50)明顯降低；
(2)s1-ST6GALl-001+ s1-ST3GAL4_001 藥物組合物、s1-ST6GALl_001 +s1- ST3GAL4-002 藥物組合物、s1-ST6GALl-002+ s1-ST3GAL4-001 藥物組合物、s1-ST6GALl-002+ s1- ST3GAL4-002藥物組合物處理組的HBE細(xì)胞內(nèi)的人流感病毒HlNl病毒滴度(Log TCID50)明顯降低；(3) s1-ST6GALl-001+ s1-ST3GAL4_001 藥物組合物、s1-ST6GALl_001 +s1- ST3GAL4-002 藥物組合物、s1-ST6GALl-002+ s1-ST3GAL4-001 藥物組合物、s1-ST6GALl-002+ s1- ST3GAL4-002藥物組合物處理組的HEp-2細(xì)胞內(nèi)的人流感病毒HlNl病毒滴度(Log TCID50)明顯降低；
由圖9A顯示的結(jié)果可知，靶向ST6GAL1和ST3GAL4的siRNA組合對(duì)新甲流HlNl病毒亞型感染具有明顯抑制作用。
[0122]需要說明的是，圖9A中的siRNA序列的藥物組合物處理組與轉(zhuǎn)染無靶點(diǎn)siRNA處理組細(xì)胞的HlNl病毒滴度具有顯著性差異，* P < 0.05。
[0123]圖9B是所述siRNA序列的藥物組合物對(duì)禽流感H9N2亞型感染的抑制作用示意圖。圖9B顯示了:與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞及轉(zhuǎn)染無靶點(diǎn)siRNA相比，
(1)s1-ST6GALl-001+s1-ST3GAL4_001 藥物組合物、s1-ST6GALl_001+s1- ST3GAL4-002 藥物組合物、s1-ST6GALl-002+ s1-ST3GAL4-001 藥物組合物、s1-ST6GALl-002+ s1-ST3GAL4_002藥物組合物處理組的A549細(xì)胞內(nèi)的禽流感H9N2病毒滴度(Log TCID50)明顯降低；
(2)s1-ST6GALl-001+ s1-ST3GAL4_001 藥物組合物、s1-ST6GALl_001 +s1- ST3GAL4-002 藥物組合物、s1-ST6GALl-002+ s1-ST3GAL4-001 藥物組合物、s1-ST6GALl-002+ s1-ST3GAL4_002藥物組合物處理組的HBE細(xì)胞內(nèi)的禽流感H9N2病毒滴度(Log TCID50)明顯降低；
(3)s1-ST6GALl-001+ s1-ST3GAL4_001 藥物組合物、s1-ST6GALl_001 +s1- ST3GAL4-002 藥物組合物、s1-ST6GALl-002+ s1-ST3GAL4-001 藥物組合物、s1-ST6GALl-002+ s1- ST3GAL4-002藥物組合物處理組的HEp-2細(xì)胞內(nèi)的禽流感H9N2病毒滴度(Log TCID50)明顯降低；
由圖9B顯示的結(jié)果可知，靶向ST6GAL1和ST3GAL4的siRNA組合物對(duì)禽流感H9N2病毒亞型感染具有明顯的抑制作用。
[0124]需要說明的是，圖9B中的siRNA序列的藥物組合物處理組與轉(zhuǎn)染無靶點(diǎn)siRNA處理組細(xì)胞的H9N2病毒滴度具有顯著性差異，* P < 0.05。
[0125]綜上所述，靶向ST6GAL1和ST3GAL4基因的的siRNA組合對(duì)HlNl和H9N2病毒亞型感染均達(dá)到明顯抑制。
[0126]實(shí)施例九、所述SiRNA序列對(duì)導(dǎo)入細(xì)胞產(chǎn)生干擾素-α的影響
考慮到部分siRNA會(huì)引起細(xì)胞產(chǎn)生干擾素-α (INF-α )而起到非特異的抗病毒作用，因此應(yīng)用ELISA法(enzyme-linked immunosorbent assay,酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法)檢測(cè),轉(zhuǎn)染方法同實(shí)施例二，轉(zhuǎn)入48小時(shí)后，收集細(xì)胞上清做檢測(cè)(如圖10所示)。結(jié)果顯示，所述siRNA均未引起非特異性的INF-α的產(chǎn)生。
[0127]以上所述是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種可防治流感的siRNA，其特征在于，所述SiRNA為以下至少一種: siST6GALl_001:正義鏈堿基組成為SEQ ID N0.1，反義鏈堿基組成為SEQ ID N0.2; siST6GALl_002:正義鏈堿基組成為SEQ ID N0.3，反義鏈堿基組成為SEQ ID N0.4; siST3GAL4_001:正義鏈堿基組成為SEQ ID N0.5，反義鏈堿基組成為SEQ ID N0.6; siST3GAL4_002:正 義鏈堿基組成為SEQ ID N0.7，反義鏈堿基組成為SEQ ID N0.8。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的siRNA，其特征在于，所述siRNA的每條鏈的3‘端修飾有懸垂堿基。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的siRNA，其特征在于，所述懸垂堿基由dA、dT、dG、dC中一個(gè)或多個(gè)脫氧核糖核苷酸組成。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的siRNA,其特征在于,所述懸垂堿基由dA、dT、dG、dC中任意兩個(gè)脫氧核糖核苷酸組成。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的siRNA，其特征在于，所述siRNA經(jīng)過磷酸化、甲氧基化、硫代、膽固醇、Cy3、Cy5、生物素、維生素、葉酸、膽酸、PEG中的一個(gè)或多個(gè)的修飾。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的siRNA，其特征在于，所述siRNA還經(jīng)過為2’_0_甲基核糖核苷和/或2’ -氟代的修飾。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的siRNA，其特征在于，所述siRNA為siST6GALl_001和 siST3GAL4_001 兩種的混合，siST6GALl_001 和 siST3GAL4_002 兩種的混合，siST6GALl_002 和 siST3GAL4_001 兩種的混合，或 siST6GALl_002 和 siST3GAL4_002 兩種的混合。
8.一種可防治流感的藥物組合物，其特征在于，其活性成份為權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的siRNA。
9.權(quán)利要求f7任一項(xiàng)所述的siRNA的醫(yī)藥用途，其特征在于，用于制備可防治流感病毒的藥物組合物、藥物以及預(yù)防制劑。
【文檔編號(hào)】A61P31/16GK103667285SQ201210336876
【公開日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2012年9月12日 優(yōu)先權(quán)日:2012年9月12日
【發(fā)明者】鐘南山, 吳東, 楊子峰, 周榮, 關(guān)文達(dá), 王玉濤, 李海濤, 秦笙, 李潤(rùn)峰, 招惠珊, 伍時(shí)冠 申請(qǐng)人:廣州呼吸疾病研究所, 吳東