Neoechinuline B的抗流感用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及了 Neoechinuline B的新用途，即其在預防或治療流感尤其是甲型流 感中的藥學用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 流行性感冒（流感）是由流感病毒引起的一種急性呼吸道傳染病，傳染性強，發(fā)病 率高，容易引起爆發(fā)流行或大流行。根據(jù)其內(nèi)部核蛋白（NP)和基質(zhì)蛋白（M)的抗原性不同， 流感病毒可分為A型、B型和C型。A型（又稱甲型）流感病毒大規(guī)模流行可引起極高的發(fā)病 率和死亡率，嚴重威脅著人類的健康（W. H. 0. 2003 ;Coleman2007)。A型流感病毒在二十世 紀主要引起了三次大型流感，即1918年的H1N1，1957年的H2N2以及1968年的H3N2,共造成 約 5000 萬人死亡（Kilboume2006 ;Taubenberger，Hultin et &1.2007)。2009 年甲型流感也 是由H1N1 流感病毒引起（Dawood，Jain et al. 2009 ；Zimmer and Burke 2009)，其傳播之迅 速，引起了世界的關(guān)注。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，每年北半球有超過一億人感染流感，并且有 30-50萬人死于流感，造成的經(jīng)濟損失超過百億美元。目前，臨床上應用的抗流感藥物的主 要作用靶點包括血凝素、RNA聚合酶、M2離子通道、核蛋白以及神經(jīng)氨酸酶，如RNA聚合酶抑 制劑T-705, M2離子通道阻斷劑金剛烷胺以及神經(jīng)氨酸酶抑制劑扎那米韋、奧斯他韋、帕拉 米韋以及達菲等。由于流感病毒表面抗原能經(jīng)常不斷地發(fā)生變異，使本來有效的流感病毒 疫苗很快失效。美國疾病預防控制中心抽樣調(diào)查發(fā)現(xiàn)，2008/2009年的H3N2毒株和2009年 大流行H1N1病毒中，100 %的毒株對金剛烷類藥物都具有耐藥性；99. 6%的季節(jié)性H1N1流 感病毒對達菲具有耐藥性(http://www. cdc. R〇v/flu/weekly/weeklyarchives2008-2009/ weekly35. htm)。我國人口基數(shù)大、密度高，流感的潛在威脅性極高。因此，新型多靶點抗 流感病毒藥物的研發(fā)，對于保障人民生命安全、提高國民生活質(zhì)量具有重要的意義。
[0003] Neoechinuline B屬于異戊二烯-吲哚二酮哌嗪生物堿，該類生物堿最早發(fā)現(xiàn)于 曲霉（Quilicol943)，后人們從 Aspergillus, Penicillium，Eurotium 等屬真菌中陸續(xù)發(fā) 現(xiàn)了數(shù)十余個該類生物堿同系物。因具有多種生物活性，包括：抗腫瘤、抗氧化、抗菌，以 及抑制蛋白激酶等活性，異戊二烯-吲哚二酮哌嗪生物堿引起了藥物化學工作者的廣泛 興趣。專利發(fā)明者通過前期研究，從一株深海真菌Eurotium rubrum固體發(fā)酵物中分離 得到了 Neoechinuline B等一系列該類型生物堿，并通過抗流感病毒活性篩選，首次發(fā)現(xiàn) Neoechinuline B具有顯著的抗H1N1活性。通過深入作用機制研究，發(fā)現(xiàn)Neoechinuline B主要作用于H1N1的HA (血凝素）蛋白，在感染初期阻礙H1N1進入細胞，并能一定程度的 抑制NA (神經(jīng)氨酸酶），從而發(fā)揮抗H1N1功效。實驗結(jié)果表明，Neoechinuline B具有進一 步開發(fā)成新型抗流感藥物的潛力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)的主要目的在于提供Neoechinuline B及其藥學上可接受的鹽的新用途，用 于制備藥物，所述藥物用于預防或治療流感。
[0005] 本發(fā)明通過如下方法評價了化合物抑制流感病毒進入細胞的生物活性：
[0006] 1.細胞病變（CPE)抑制試驗。
[0007] 流感病毒感染細胞后會導致細胞病變，使得細胞活力降低。如果藥物能夠抑制流 感病毒復制，則會降低細胞病變數(shù)量，提高細胞活力。具體來說：
[0008] 1)將犬腎上皮細胞（MDCK)以1 : 3的比例傳代到白色的96孔板中，在37°C細胞 培養(yǎng)箱中用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24h。
[0009] 2)將流感病毒（A/WSN/33 (H1N1)，感染復數(shù)（Μ0Ι) = 1)與一定濃度的待檢化合物 加入到100 μ L含有2 μ g/mL TPCK處理的胰酶、1 % FBS的DMEM中，充分混勻?；衔锏?陰性對照為1% DMS0(稀釋化合物所用的溶劑）。同時設立一組只加各化合物不加病毒實 驗組，用來檢測化合物對細胞活力的影響。
[0010] 3)將96孔板中的MDCK細胞的培養(yǎng)基吸出，將混合有病毒和化合物的培養(yǎng)基加入 到MDCK細胞中，37°C細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。每個樣品三個復孔。
[0011] 4)用CellTiter-Glo熒光細胞活性檢測試劑盒（Cat.G7571，Promega)檢測細 胞活力。首先將細胞和CellTiter-Glo檢測試劑放于室溫環(huán)境，待其溫度平衡至室溫，將 100 μ L/孔的CellTiter-Glo檢測試劑加入到細胞的培養(yǎng)上清中，震動2min后，避光靜置 lOmin。用儀器 Tecan Infinite M2〇OOPROTM 檢測細胞活力。
[0012] 5)EC50的計算方法：首先對化合物進行濃度系列稀釋，然后利用上述方法測定 出細胞活力?；衔飳毎∽兊谋Ｗo率=l〇〇X(l_(Test compound-Median Virusl)/ (Median Cells-Median Virus2)).其中Test compound表不只加待檢化合物不加病毒組的 細胞活力；Median Virusl表示加了待檢化合物和病毒組的細胞活力；Median Cells表示 只加入1 % DMS0組的細胞活力；Median Virus2表示加入1 % DMS0和病毒組的細胞活力。 將化合物濃度和相應的保護率輸入到軟件Prism，即可計算EC5。。此方法已被廣泛應用于抗 病毒藥物篩選領(lǐng)域（Noah，Severson et al. 2007)。
[0013] 6)CC5。的計算方法：CellTiter-Glo也可以用來檢測化合物對細胞的毒性。首先 對化合物進行濃度系列稀釋，然后將其加入到細胞中，方法同2)-4)，但不加入病毒。培養(yǎng) 48h后，測定細胞活力。然后將對照組細胞活力（1 % DMS0)定義為100%，將其他各化合物 組細胞活力標準化，除以對照組1% DMS0的細胞活力，再乘以100%。將化合物的濃度和相 應的標準化的細胞活力輸入到軟件Prism，即可計算出CC5。。
[0014] 2.噬斑抑制實驗。
[0015] 利用噬斑抑制實驗進一步印證化合物的抗病毒效果。具體方法如下：
[0016] 1)將MDCK細胞傳代到12孔板中，在37°C細胞培養(yǎng)箱中用含10% FBS的DMEM培 養(yǎng)基培養(yǎng)24h。使細胞密度達到0.4X106細胞/孔。用PBS清洗細胞一次。
[0017] 2)將A/WSN/33(H1N1)病毒（100PFU/孔）與系列稀釋的化合物混合，稀釋液為 2 μ g/mL TPCK處理胰酶的DMEM。將混合液加入MDCK細胞中，置于37°C細胞培養(yǎng)箱中吸附 lh〇
[0018] 3)將病毒液吸出，用PBS清洗細胞三次，除去未吸附的病毒。
[0019] 4)用lmL含有1. 5%低熔點瓊脂糖、待檢化合物、2 μ g/mL TPCK處理胰酶的無酚紅 DMEM覆蓋細胞。注意溫度不能過高，以免將細胞燙死。
[0020] 5)待4°C瓊脂糖凝固后（10_15min)倒置放于在37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)。3-4天后對噬 斑進行計數(shù)，計算病毒滴度。如果化合物對病毒有抑制作用，則噬斑數(shù)量會減少。
[0021] 3.加藥時間點實驗。
[0022] 用以分析化合物作用于病毒感染細胞的哪一階段。具體步驟：
[0023] 1)將MDCK細胞傳代到六孔板中，在37°C細胞培養(yǎng)箱中用含10% FBS的DMEM培養(yǎng) 基培養(yǎng)24h。
[0024] 2)將A/WSN/33 (H1N1)病毒（Μ0Ι = 1)稀釋到不含血清的DMEM中，感染MDCK細 胞。
[0025] 3)流感病毒從吸附到子代病毒粒子釋放，其復制周期約為6_8h。故在以下時間段 將藥物加入到細胞培養(yǎng)基中：〇-1〇、〇-2、2-5、5-8或8-10h。
[0026] 4)感染10h后，用冰預冷的PBS清洗細胞一次，用200 μ 1/孔的PIPA裂解液裂解 細胞。用細胞刮將細胞刮下，吸入1.5mL ΕΡ管中，置于冰上15min。以12,000rpm4°C離心 lOmin，將上清液轉(zhuǎn)移到另一個1. 5mL EP管中。
[0027] 5)吸取30 μ 1樣品與等體積的2X蛋白上樣緩沖液混合，KKTC煮樣lOmin。
[0028] 6)將煮好的樣品各20 μ L加入到12%的蛋白質(zhì)凝膠加樣孔中，進行SDS-PAGE電 泳。
[0029] 7)用免疫印跡法（Western blotting)檢測流感病毒的ΝΡ蛋白的表達水平（以此 來檢測病毒在細胞內(nèi)的復制情況）；同時以細胞蛋白GAPDH作為細胞內(nèi)參（也可用于驗證 藥物對細胞的毒性）
[0030] 4.血凝抑制試驗
[0031] 此方法用來檢測藥物是否影響病毒與細胞受體之間的結(jié)合。具體方法：
[0032] 1)制備1 % (v/v)的雞紅細胞懸液。選1-2只健康雞，將血液采集到等量抗凝液中 混勻，置4°C冰箱保存。以800-1000rpm離心5分鐘，用吸管吸去上清液和紅細胞上層的白 細胞薄膜，將沉淀的紅細胞加生理鹽水，慢慢混合均勻，再在離心機中800rpm離心5分鐘， 棄去上清液，再加生理鹽水混勻，如此反復離心4-5次，最后一次離心后的紅細胞，棄去上 清液。放入4°C冰箱中可保存2-3d。使用時用lmL吸管吸取0. lmL紅細胞，然后加入9.9mL 的生理鹽水，此即1 %紅細胞懸液。
[0033] 2)確定病毒的血凝效價。將WSN流感病毒以2倍梯度做倍比稀釋，稀釋液為PBS。
[0034] 3)將病毒液與1 %紅細胞懸液等體積（各50 μ L)混合加入到V底的96孔板中。 置于微量振蕩器上振蕩lmin，室溫靜置孵育30min。
[0035] 4)將反應板傾斜成45°C，沉于孔底的紅細胞沿著傾斜面向下呈線狀流動者為沉 淀，表明紅細胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的紅細