專利名稱：莽草酸的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從西藏八角(Illicium griffitii)的果實(shí)(種子和果皮)中提取高純度的(3R，4S，5R)-(-)-3，4，5-三羥基-I-環(huán)己烯羧酸(L-莽草酸)的方法。本發(fā)明還涉及一種制備高純度莽草酸的方法，所述莽草酸可用于生產(chǎn)禽流感藥物達(dá)菲(奧塞米韋)。更具體地，本發(fā)明涉及通過使用溶劑再結(jié)合使用醇(例如甲醇、乙醇或丙醇)的結(jié)晶技術(shù)從西藏八角(Illicium griffithii)的果實(shí)中分離天然左旋L-莽草酸,所述西藏八角產(chǎn)自印度東北部阿魯納恰爾邦(Arunachal Pradesh),所述溶劑選自己燒、石油醚、氯仿、二氯甲烷、1，2-二氯乙烷、乙酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸丙酯、甲醇、乙醇、丙醇、丁醇或兩種或更多種溶劑的組合。任選地而不是必需地，有機(jī)酸例如乙酸也可用于重結(jié)晶目的。
背景技術(shù)：
·莽草酸可用作抗菌劑、抗真菌劑、除草劑的原料以及作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。最初，從日本大茴香(Japanese star anise)(植物名稱-八角茴香(Illicium anise)八角茴香科)中分離痕量的莽草酸。后來，發(fā)現(xiàn)在許多植物中產(chǎn)生極痕量的莽草酸。然后，發(fā)現(xiàn)莽草酸是植物和微生物普通或莽草酸鹽/酯途徑中的中間代謝物。然而，發(fā)現(xiàn)世界上僅兩種植物物種累積更多量的這種多羥基芳族酸，即大茴香(植物名稱八角茴香，八角茴香科)和楓香樹(植物名稱-北美楓香(Liquidambar styracifIu))的種子中。盡管有42種八角屬的物種是天然可獲得的，但僅有一種物種(即八角茴香)可用于制備莽草酸，且產(chǎn)率最大為7% w/w。西藏八角(Hook. f. & Thoms.)屬于八角茴香科,且是世界上最常見的八角屬物種之一。在阿魯納恰爾邦，當(dāng)?shù)厝藢⑵浞Q為‘Lissi’。其是一種小型到中型的樹，生長(zhǎng)于西卡門縣(West Kameng)、達(dá)旺(Tawang)、洛西特縣(Lohit)和下蘇班西里縣(Lower Subansiri)地區(qū)的亞熱帶和溫帶闊葉林，在西卡門縣(West Kameng)地區(qū)的邦迪拉(Bomdila)分布廣泛。西藏八角的果實(shí)在香料工業(yè)中使用。(參考文獻(xiàn)R. Duchok, K. Kent, A. DeviKhumbongmayum, A. Paul和M. L. Khan;阿魯納恰爾邦溫帶闊葉林的與干擾梯度有關(guān)的人口結(jié)構(gòu)和藥用樹西藏八角的再生狀態(tài)(Population structure and regeneration statusof medicinal tree Illicium griffithii in relation to disturbance gradients intemperate broad-leaved forest of Arunachal Pradesh);《現(xiàn)代科學(xué)》，第 89 卷，第 4期，2005年8月25日，第673頁(yè))。參考美國(guó)專利3，546，072，其中Araki等公開了可通過在培養(yǎng)基(發(fā)酵液)中培養(yǎng)產(chǎn)生5-脫氫莽草酸的棒狀桿菌屬的微生物來制備5-脫氫莽草酸,所述培養(yǎng)基包含碳源、氮源、無機(jī)材料和營(yíng)養(yǎng)素。將制得的并累積的5-脫氫莽草酸從培養(yǎng)基中分離，過濾后通過調(diào)節(jié)pH并加入活性碳，以除去微生物細(xì)胞。所述活性炭吸收所述5-脫氫莽草酸，并用98%的乙醇洗脫。該洗脫物在減壓條件下濃縮，然后產(chǎn)物從乙醇中沉淀出來。該參考文獻(xiàn)沒有暗示或揭示使用有機(jī)酸例如乙酸來促進(jìn)高純度莽草酸晶體從水性發(fā)酵液中沉淀出來。參考美國(guó)專利4，769，061，其中Comai揭示了轉(zhuǎn)基因植物，植物的基因組中包括了變異的草甘膦抗5-烯醇式丙酮酰-3-磷酸莽草酸合酶的編碼基因。該文獻(xiàn)沒有暗示如何從這種轉(zhuǎn)基因植物的組織中分離莽草酸。參考美國(guó)專利5，214，165,其中Sutherland等涉及了具有抗菌活性、抗真菌活性和除草活性的6-氟莽草酸衍生物。該文獻(xiàn)沒有暗示使用轉(zhuǎn)基因微生物或使用草甘膦加入發(fā)酵過程以增加莽草酸的產(chǎn)出。該文獻(xiàn)也沒有暗示使用有機(jī)酸以輔助從發(fā)酵液中分離莽草酸。然而，該文獻(xiàn)揭示了一類可用于該發(fā)明方法的PCCA。參考美國(guó)專利5，605，818，其中Katsumata等揭示了一種通過使用培養(yǎng)在介質(zhì)中的棒狀桿菌屬或短桿菌屬的突變菌株來制備芳族氨基酸(例如色氨酸)的方法。這些突變菌株能夠產(chǎn)生需要的芳族氨基酸，并且還具有比親本菌株更高的轉(zhuǎn)酮酶(transketolase)活性。所需的芳族氨基酸在培養(yǎng)過程中累積并由此回收。該文獻(xiàn)沒有暗示使用有機(jī)酸從肉湯中分離所需的PCCA。該文獻(xiàn)揭示了多種可產(chǎn)生發(fā)酵液的微生物，所述發(fā)酵液可用于該發(fā)明。
參考題為“使用溫度浮動(dòng)變化復(fù)合化提取和轉(zhuǎn)移反提取回收莽草酸”("Recoveryof shikimic acid using temperature-swing complexation extraction anddisplacement back extraction”)的文章，該文章發(fā)表于《分離與純化》(Isolation &Purification), 1994年,第2卷,第75-82頁(yè),其中Miles等揭示了一種從水溶液中除去莽草酸的方法。該Miles等人的方法的完成是通過使用溶解于正庚醇或正丁醇的三月桂胺進(jìn)行溶劑提取并使用油酸反提取至水中，以從有機(jī)相中將莽草酸轉(zhuǎn)移出來。該文獻(xiàn)著重于開發(fā)一種通用的從發(fā)酵液中回收代謝酸的方法。然而，其沒有揭示使用乙酸(其被添加至濃縮的發(fā)酵液)以促進(jìn)莽草酸從發(fā)酵液中沉淀出來。1993年2月的《合成》(Synthesis)第179-193頁(yè)Campbell等的題為“莽草酸、分支酸及相關(guān)化合物的生物合成與合成”(〃The Biosynthesis and Synthesis of ShikimicAcid, Chorismic Acid and Related Compounds")的文章揭不了不同于草甘勝的化合物可干擾莽草酸途徑。該文章還良好地描述了葡萄糖衍生的莽草酸途徑和各種困難的化學(xué)合成莽草酸的方法。該文章沒有暗示關(guān)于通過使用濃縮的乙酸、乳酸和/或丙酸從反應(yīng)混合物中分離高純度的PCCA。參考雜志題為“化學(xué)合成莽草酸及其類似物”("Chemical Synthesis of ShikimicAcid and Its Analogues"),發(fā)表于四面體報(bào)導(dǎo)(Tetrahedron Report),第 54 卷第 449 期(1998年)，第4697-4753頁(yè)，其中，Jiang等揭示了該復(fù)合物及合成莽草酸及其類似物的艱難任務(wù)。Jiang等人與Campbell等人一樣,沒有揭示本發(fā)明。參考美國(guó)專利6，794，164，其中Malmberg等公開了一個(gè)發(fā)明，其涉及利用在酸(例如乙酸、乳酸和丙酸)中結(jié)晶，以從低純度水溶液中獲得高純度多羥基環(huán)狀羧酸(PCCA)。優(yōu)選的PCCA是莽草酸，優(yōu)選的結(jié)晶酸是乙酸。本發(fā)明方法特別適合于從發(fā)酵液中分離莽草酸?？蓞⒖济绹?guó)專利申請(qǐng)20030138920，其中Malmberg等公開了一個(gè)題為“多羥基環(huán)狀羧酸的分離方法”的發(fā)明。該發(fā)明涉及使用結(jié)晶酸(例如乙酸、乳酸和丙酸)以從低純度水溶液中獲得高純度多羥基環(huán)狀羧酸(PCCA)。優(yōu)選的PCCA是莽草酸，優(yōu)選的結(jié)晶酸是乙酸。本發(fā)明方法特別適合于從發(fā)酵液中分離莽草酸。在網(wǎng)上的百科全書www. en. wikipedia. com中公開的一份報(bào)告中，從中國(guó)大茴香中提取莽草酸通常的產(chǎn)率為3-7%。在同一份報(bào)告中還發(fā)現(xiàn)，莽草酸的另一個(gè)來源是在北美大量發(fā)現(xiàn)的楓香樹果實(shí)的種子，從該來源得到的莽草酸的產(chǎn)率僅為I. 5%。還可參考公開的報(bào)告〔Shende Jiang和Gurdial Singh,莽草酸及其類似物的化學(xué)合成，四邊形報(bào)告(Tetrahedron report)第449期，四邊形(Tetrahedron)54 (1998) 4697-4753〕，其中描述了化學(xué)合成莽草酸及其類似物的各種方法。然而，這些方法因?yàn)榈彤a(chǎn)率和高生產(chǎn)成本而不適合。在制藥工業(yè)中，從中國(guó)大茴香中獲得的莽草酸幾乎是僅有的用于生產(chǎn)達(dá)菲(奧塞米韋)的基底材料。達(dá)菲是可用于治療禽流感病毒H5N1弓I起的禽流感疾病的唯一廉價(jià)的藥物。目前達(dá)菲是根據(jù)瑞士的羅氏公司的技術(shù)以莽草酸為開始原料生產(chǎn)的。目前，由于近來禽流感的爆發(fā)，達(dá)菲在全球65個(gè)國(guó)家都有需求。據(jù)估計(jì)，每年所需的達(dá)菲將價(jià)值11億至12億瑞士法郎。(David Bradley,控制流感大流行中細(xì)菌的明星角色？ (Star role forbacteria in controlling flu pandemic )自然綜述藥物發(fā)現(xiàn)(Nature Reviews Drug Discovery) , 2005, 4 (12), 945-946.)。據(jù)報(bào)道，三?；Р菟嵫苌锟赏ㄟ^影響花生四烯酸的代謝而抑制血小板聚集和血栓(F. Huang;Q. Xiu; J. G Sun;H. Enrique;在大鼠中三乙?；Р菟岬目寡“搴涂寡ㄐ纬勺饔?Anti-platelet and anti-thrombotic effects of triacetyl shikimic acidin rats);心血管藥理學(xué)學(xué)報(bào)(Journal of cardiovascular pharmacology) , 2002,第 39卷，第2期，第262-270頁(yè))。根據(jù)http://en.wikipedia. org/wiki/Shikimic acid中的一份報(bào)告，在制藥工業(yè)中，從中國(guó)大茴香中獲得的莽草酸是用作生產(chǎn)達(dá)菲(奧塞米韋)的原料。盡管莽草酸存在于大部分自養(yǎng)生物中，但它是一個(gè)生物合成中間體，并通常以極低的濃度發(fā)現(xiàn)。從中國(guó)大茴香中獲得莽草酸的低分離產(chǎn)率是2005年奧塞米韋短缺的原因。還可從楓香樹果實(shí)(北美楓香)的種子中提取莽草酸，所述楓香樹在北美豐富，產(chǎn)率約為1.5%，因此僅4kg的楓香樹種子就足以獲得14包達(dá)菲。相比之下，已報(bào)道大茴香產(chǎn)出3-7%莽草酸。近來大腸桿菌的生物合成途徑已得到增強(qiáng)，使得生物體可以積累足夠的材料用于商業(yè)(David Bradley,控制流感大流行中細(xì)菌的明星角色(Star role for bacteria in controlling flu pandemic)自然綜述藥物發(fā)現(xiàn)(Nature Reviews Drug Discovery) , 2005, 4 (12), 945-946.)根據(jù)www. livemint. com網(wǎng)站上公開的一份報(bào)告，中國(guó)政府目前已實(shí)施限制出口莽草酸。據(jù)報(bào)道，使用GC、GC/MS和13C-NMR譜圖對(duì)從越南收獲的一種類型的西藏八角(短花絮梗)的幾個(gè)部分中得到的精油的化學(xué)組成進(jìn)行研究。這些精油主要包含氧合苯丙素，主要為黃樟素(51.6-65.3%)和4-甲氧基黃樟素(19. 6%,根皮油)。來自地上部分的油和樹根皮的油區(qū)別顯著(精油研究學(xué)報(bào)JE0R(Journal of Essential Oil Research:JE0R),一月 / 月，2005,由 Tam, Nguyen Thi, An, Ha Lai, Bighelli, Ange, Muselli, Alain, Casanova, Joseph)。莽草酸(3，4，5-三羥基-I-環(huán)己烯-I-羧酸)有三個(gè)手性中心，這使得可能存在六種不同的光學(xué)異構(gòu)體。根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)的一種優(yōu)選的產(chǎn)物是如結(jié)構(gòu)式I的天然左旋L-莽、草酸。
權(quán)利要求
1. 一種從西藏八角的果實(shí)中提取高純度L-莽草酸的方法，所述方法包括以下步驟 1.使用風(fēng)力研磨機(jī)將西藏八角的果實(shí)粉末化； 使用索式抽提器或索式抽提器類型的裝置、用有機(jī)溶劑對(duì)步驟(i)中所得的粉末狀果實(shí)進(jìn)行提取，以獲得脫脂的植物材料； iii.用溶劑對(duì)步驟(ii)中所得的脫脂植物材料再次進(jìn)行提取，以獲得脫脂的且經(jīng)過溶劑提取的植物材料； iv.用極性溶劑對(duì)步驟(iii)中所得的脫脂的且經(jīng)過溶劑提取的植物材料進(jìn)行提取，以獲得溶劑提取物； V.在壓力為10-100毫巴、溫度為30-100°C的條件下對(duì)步驟(iv)中所得的溶劑提取物進(jìn)行蒸餾，以獲得粗莽草酸； vi.將步驟(V)中所得的粗莽草酸溶解于醇中； vii.在溫度范圍為25°C至醇的沸點(diǎn)，或至90°C的條件下，加熱并攪拌步驟(vi)中所得的漿液10-120分鐘； viii.在溫度范圍為O至-10°C的條件下冷卻步驟(vii)中所得的溶液，并保溫2-6小時(shí)； ix.對(duì)步驟(viii)中所得的冷卻的溶液進(jìn)行過濾，然后用甲醇水溶液或乙酸水溶液進(jìn)行重結(jié)晶，以獲得純的晶體莽草酸。
2.如權(quán)利要求I的步驟(ii)所述的方法，其特征在于，所述用于使果實(shí)脫脂的有機(jī)溶劑是己烷或石油醚。
3.如權(quán)利要求I的步驟(iii)所述的方法，其特征在于，所述用于從果實(shí)中除去半極性化合物的溶劑選自下組乙醚、氯仿、二氯甲烷、1，2-二氯乙烷或氯化烴溶劑，更優(yōu)選為氯仿。
4.如權(quán)利要求I的步驟(iv)所述的方法，其特征在于，所用的極性溶劑選自下組乙酸甲酯、乙酸乙酯、類似的脂肪酸酯、甲醇、乙醇、丙醇或它們的組合。
5.如權(quán)利要求I的步驟(vi)所述的方法，其特征在于，所用的醇選自下組甲醇、乙醇、丙醇、丁醇或它們的組合。
6.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，高純度的L-莽草酸的產(chǎn)率范圍為12-18%w/wo
7.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，L-莽草酸可用于生產(chǎn)禽流感藥物達(dá)菲(奧塞米韋)，并可作為抗菌劑、抗真菌劑、除草劑的原料以及作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。
8.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，通過以下步驟將L-莽草酸從干燥的粉末狀西藏八角的果實(shí)中分離使粉末狀的果實(shí)脫脂，用甲醇、乙醇或丙醇進(jìn)行提取，從提取溶液中除去所述溶劑，并用氯仿清洗粗固體，然后在真空條件下對(duì)粗固體莽草酸進(jìn)行干燥。
9.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，L-莽草酸通過以下步驟進(jìn)行制備使用任意的超臨界萃取儀、用超臨界二氧化碳(CO2)對(duì)西藏八角的果實(shí)進(jìn)行提取，從提取物中除去CO2，用己烷或石油醚和氯仿清洗固體提取物，再用氯仿清洗以除去脂肪和油類物質(zhì)，然后在真空條件下使固體莽草酸干燥，并從甲醇水溶液或乙酸水溶液中重結(jié)晶，得到純的莽草酸。
10.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，L-莽草酸通過以下步驟進(jìn)行制備用沸水對(duì)西藏八角的果實(shí)進(jìn)行提取，用己烷或石油醚清洗水提取物，再用氯仿清洗以除去脂肪和 油類物質(zhì)，然后在減壓、50-70°C的條件下通過蒸餾除去水，并從甲醇的水溶液中重結(jié)晶。
全文摘要
本發(fā)明涉及從西藏八角果實(shí)中獲得的莽草酸的制備。本發(fā)明方法特別適合于從西藏八角果實(shí)(種子和果皮)中分離莽草酸。產(chǎn)率為12-18%w/w。莽草酸可用作生產(chǎn)治療禽流感的奧塞米韋(達(dá)菲)的原料。據(jù)報(bào)道，其三酰基衍生物還可通過影響花生四烯酸的代謝而抑制血小板聚集和血栓。至今已知的從大茴香(八角茴香)和楓香樹(北美楓香)的果實(shí)中制備莽草酸的商業(yè)方法，分別僅得到3-7％和1.5％的產(chǎn)率。國(guó)際市場(chǎng)上莽草酸的價(jià)格在45.00-1000.00美元每千克之間根據(jù)需求而變化。另外，根據(jù)www.livemint.com網(wǎng)站上公開的一份報(bào)告，中國(guó)政府目前已實(shí)施限制出口莽草酸。
文檔編號(hào)C07C62/32GK102791671SQ201180013675
公開日2012年11月21日 申請(qǐng)日期2011年3月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月12日
發(fā)明者D·K·羅伊, J·博拉, M·博爾多羅伊, N·C·巴魯阿, P·G·拉奧, S·C·杜塔 申請(qǐng)人:科學(xué)工業(yè)研究委員會(huì)