專利名稱：雞膽汁來源的胞外體提取方法及其在免疫學上的應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫學，具體涉及一種從雞膽汁中提取的胞外體的方法及其在免疫學上的應用。
背景技術(shù)：
胞外體,又稱“外源體” (Exosomes),是一種來源于晚期內(nèi)涵體的直徑20_170nm的小囊泡。1987年，Johnstone研究網(wǎng)織紅細胞最后成熟為紅細胞的實驗中，將在體外培養(yǎng)的綿羊的網(wǎng)織紅細胞釋放的小囊泡命名為胞外體。1996年Raposo等發(fā)現(xiàn)B細胞分泌的胞外體能誘導抗原特異性T淋巴細胞反應，Zitvogel等用樹突狀細胞來源胞外體成功誘導CD8+T淋巴細胞發(fā)揮很強的抗腫瘤效應，近年來研究者對胞外體的免疫作用給予了高度的關(guān)注，成為非細胞性腫瘤疫苗研究的熱點。胞外體的來源及特征除了網(wǎng)織紅細胞以外，多種細胞均分泌胞外體，如B細胞(Raposo G，1996)、肥大細胞(Skokos D，2001)、不成熟樹突狀細胞(ne) (Thery C，2001)、血小板、纖維母細胞、上皮細胞(Wolfers J，2001)、腫瘤細胞、T淋巴細胞(Blanchard N，2002)等。各種細胞來源的胞外體的分子組成不盡相同，但一般而言，不同類型細胞分泌的胞外體大小均在20-170nm，浮力密度為I. 12-1. 21g/mL (Smalheiser，2007)，主要含有以下幾種物質(zhì)主要組織相容復合物 I (major histocompatibility complex I ,MHC I )類和 / 或II類分子、熱休克蛋白、整合素、四跨膜蛋白、細胞骨架蛋白以及一些生物酶類。在胞外體的發(fā)現(xiàn)之初，人們認為胞外體的作用只是在紅細胞成熟中移除無用的蛋白，但現(xiàn)在看來它的功能更加復雜。每種胞外體的生物學功能與其來源密切相關(guān)。在大量研究的基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)，胞外體的主要作用包括以下幾個方面移除無用蛋白；作為細胞間交流的媒介；誘導免疫耐受；在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，包括免疫激活或免疫抑制。胞外體作為自體成分，有易吸收，無排斥反應等優(yōu)點，目前作為多種腫瘤藥物的載體應用于腫瘤治療的研究中。膽汁中的胞外體膽汁是在膽道中流動的一種特殊的體液，由肝臟分泌產(chǎn)生。膽汁的生成過程非常復雜，膽汁由約75%肝細胞生成，25%由膽管細胞和膽囊上皮細胞生成，。膽汁有兩大作用，一是作為消化液，幫助脂肪在腸內(nèi)的消化和吸收；二是將某些代謝產(chǎn)物從肝臟排出。雞膽汁是一種資源豐富、作用廣泛、價格低廉的天然中藥。雞膽汁性味苦寒，無毒，具有清熱解毒、止咳平喘、消炎、利膽明目等功能。膽汁中的胞外體，是由肝細胞、上皮細胞分泌和釋放后匯集于膽囊的蛋白囊泡，最終釋放到小腸內(nèi)。由于表面攜帶有大量的抗原肽和淋巴細胞共刺激因子等，在機體內(nèi)，膽汁中的胞外體對維持腸道免疫系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)和肝臟免疫反應起著重要作用。胞外體作為自體成分，有易吸收，無排斥反應等優(yōu)點，目前作為多種腫瘤藥物的載體應用于腫瘤治療的研究中。膽汁中的胞外體可以定向作用于肝臟和腸道，可以作為治療肝臟和腸道疾病的重要工具。現(xiàn)階段的研究與應用前景目前，鼠類上進行的胞外體的應用實驗取得了豐富的研究成果，并為人藥研究提供了很好的參考。在人醫(yī)方面，成熟樹突狀細胞分泌胞外體由于其可以有效誘導免疫激活反應在其基礎(chǔ)上研究的藥物已進入二期臨床階段；胞外體作為載體的制備和應用在我國已于2005年申請專利(CN200510082604)。禽源膽汁胞外體的研究在國內(nèi)外未見報道。但是禽源膽汁來源豐富、作用廣泛、價格低廉，具有清熱解毒、止咳平喘、消炎、利膽明目等功能，在我國中醫(yī)學列入天然中藥。雞膽汁中的胞外體如果應用于禽的腫瘤性疾病的治療中，可能能夠改變腫瘤性疾病一旦感染就必須淘汰的現(xiàn)狀，這將是養(yǎng)禽業(yè)的福音；作為抗應激藥物，可以有效防止長途運輸?shù)扔捎趹ぴ斐傻奈改c道疾病，將為養(yǎng)殖業(yè)挽回大量損失。再者，雞常作為腫瘤、動脈粥樣硬代的動物模型，禽源膽汁的研究成果對于人醫(yī)很高的參考價值。

發(fā)明內(nèi)容
為了提高雞膽汁中胞外體的提取效率，以及擴展胞外體在免疫學上的應用，本發(fā)明的發(fā)明人提供了一種新的由雞肝臟、膽囊和膽管上皮細胞分泌和釋放的胞外體，且公開了其制備的方法，該胞外體中含有C-反應蛋白(C-reactive protein)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Aspartate aminotransferase)、玻連蛋白(Vitronectin)等肝源性的蛋白成分,上皮細胞源性的粘蛋白(Mucin)以及免疫球蛋白(Immunoglobulin)等免疫反應相關(guān)蛋白，可以作為研究肝臟疾病的生物指標以及作為免疫反應佐劑，參與免疫調(diào)節(jié)，還可以作為載體，應用于治療肝臟、膽囊和腸道疾病的治療。
本發(fā)明提供胞外體具有典型杯狀結(jié)構(gòu)的雙層脂質(zhì)膜，含有肝源性的蛋白成分，所述的肝源性的蛋白成分為C-反應蛋白或天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶或玻連蛋白或其混合物；所述的胞外體是膽汁中正常存在的成分，由肝臟(約占75%)、膽管和膽囊上皮細胞(約占25%) 分泌和釋放。且該膽汁為各個品系的肉雞、蛋雞等禽類均可獲得的膽汁。本發(fā)明的發(fā)明人對禽源胞外體蛋白組分的研究發(fā)現(xiàn)，其表面攜帶有多種獨特蛋白，其中的C-反應蛋白，由肝細胞產(chǎn)生，是急性期反應蛋白，作為炎癥反應的標志具有重要意義；玻連蛋白，其表達的差異常作為判斷肝細胞癌的標準，表明禽源胞外體可以作為判定；粘蛋白由上皮細胞產(chǎn)生，起到潤滑及細胞信號的傳導等多種功能，可以形成化學屏障； 大量免疫球蛋白的存在，說明了胞外體在免疫應答信息傳遞中具有重要作用。所獲得的胞外體直徑在30-150nm，質(zhì)量密度范圍為I. 13-1. 19g/cm3。該胞外體表面上呈遞有MHC I分子或可與MHC I分子結(jié)合的抗原肽，或帶有淋巴細胞共刺激分子，或上述物質(zhì)共存。其中上述的MHC I分子在免疫反應中具有正相關(guān)性，較之以往都是呈現(xiàn)MHC II 相關(guān)性具有顯著不同，因此在免疫學應用上有著全新的突破。制備上述胞外體的方法，具體步驟如下將從健康雞膽囊離體4h內(nèi)抽取的膽汁，在4°C低溫條件下經(jīng)逐級離心去細胞碎片取上清，經(jīng)濾膜過濾，4°C 110, OOOg離心2h沉淀用PBS重懸，然后4°C 110, OOOg離心90min 后用PBS溶解沉淀，即為提取的胞外體。其中所述的逐級離心為1000 2000g 15 20min，3000 4000g 20 30min， 7000 8000g 45 50min，10000 15000g 40 60min。更進一步的優(yōu)選釆用逐級離心為2000gl5min，4000g30min,8000g45min, 15000g 60mino
為了達到更好的效果,所述經(jīng)過4°C 110, OOOg離心90min后的沉淀通過30wt%、45wt%、60wt%的鹿糖溶液進行密度梯度離心,這樣就可以進一步的分離出胞外體,提高胞外體的均一度。具體方法為現(xiàn)有技術(shù)，可以采用在一個離心管中通過現(xiàn)有技術(shù)形成3層密度不同度的鹿糖梯度，從下到上依次是60wt%、45wt%、30wt%,最上層是樣品沉淀,經(jīng)離心后樣品層分離，滲入到其密度所在層，實現(xiàn)依密度的不同的分離。采用上述分級離心與過濾相結(jié)合的制備方法，可以有效去除膽汁中的殘渣及大分子物質(zhì)，較單一的離心或過濾的方法，更為可行。存在以下優(yōu)越性
I.提取過程耗時短，易于保持胞外體的生物活性，形態(tài)保持良好，均一度較高。2.胞外體的產(chǎn)量高，Iml膽汁可以分離到蘭14 g胞外體。除此之外，經(jīng)過本發(fā)明所采用的分級離心和過濾后的產(chǎn)品其大小均勻度較低一些，可能含有一些多胞體，主要包括大囊泡或者包裹囊泡(MVB)，其內(nèi)部可能含有多個胞外體個體，為了將上述的多胞體進一步出去，而達到我們要求的標準30-150nm單個囊泡，發(fā)明人又適時的進行了密度梯度離心，從而確保最終獲得的胞外體的均一度。通過上述方法獲得的胞外體，除了具備正常的胞外體功能外，還具有下述的作用，可以在免疫學和藥物學上有更好的應用該種胞外體所攜帶的的特殊蛋白的變化可以作為研究肝臟疾病的生物指標。所述胞外體表面含有C-反應蛋白和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶等蛋白。C-反應蛋白由肝細胞合成,是第一個被認為是急性時相反應蛋白，在急性創(chuàng)傷和感染時其血濃度急劇升高。天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶是肝功能檢查中的一項，一般用來來檢驗肝組織是否受損。因此，胞外體上所攜帶的特殊蛋白的成分變化可以作為肝臟生理功能變化的標志用來檢測肝臟疾病。該種胞外體可以在體內(nèi)外免疫反應中的應用。通過研究發(fā)現(xiàn)，膽汁中的胞外體可以特異性的刺激⑶4+T淋巴細胞的增值，并且呈現(xiàn)MHC I正相關(guān)性。⑶4+T能夠促進其他T細胞亞群的成熟與B細胞產(chǎn)生抗體，因此,膽汁中的胞外體可以通過使CD4+T的增值作用激活體內(nèi)外的免疫反應?；蛘咦鳛槊庖叻磻魟?，參與免疫調(diào)節(jié)，作為抗應激類藥物的應用。所述胞外體還可以作為載體，應用于治療肝臟、膽囊和腸道疾病，特別是腫瘤性疾病的治療。膽汁中的胞外體作為自體成分，具有易吸收、無排斥等的優(yōu)點；因其雙層脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)可以保護藥物，減少有效成分丟失；膽汁中的胞外體定向作用于肝臟或腸淋巴細胞，這種特殊的靶向作用使藥物可以定向作用。此外，膽汁中的外源體的含量高(14y g/ml以上)，均一度好，作為藥物載體具有良好的應用前景。綜上所述，本發(fā)明提供了雞肝細胞和上皮細胞分泌和釋放的胞外體的提取方法，且公開了其制備的方法及其應用，為胞外體的進一步研究及其在免疫學和藥物學上的應用提供了新的前景和技術(shù)啟示。


圖I為雞膽汁胞外體的透射電鏡照片；圖中箭頭所示雞膽汁胞外體形態(tài)為直徑30_150nm的具有典型杯狀結(jié)構(gòu)的小囊泡；圖2為SPF雞肝臟超薄切片照片；
圖中A箭頭所示為肝臟狄氏腔內(nèi)的胞外體；圖中B箭頭所示為肝臟小膽管中的胞外體；圖中C箭頭所示為肝細胞內(nèi)的多胞體以及分泌出的胞外體；圖中D所示為膽管微絨毛，箭頭所示為膽管微絨毛上皮細胞胞外體的分泌釋放， 由微絨毛邊緣有胞外體分泌出；圖3為雞膽汁中胞外體的SDS-PAGE結(jié)果以及高效液相純化圖；圖中A所示為雞膽汁中胞外體的SDS-PAGE結(jié)果；圖中B所示為雞膽汁中胞外體的高效液相純化圖；圖4為質(zhì)譜分析鑒定膽汁胞外體的主要蛋白種類列表；
圖5為磁珠檢測雞膽汁中胞外體的表面標志(MHC I /MHC II)流式細胞圖；圖中，膽汁中的胞外體只連接磁珠表現(xiàn)為圖A，95. 42%的胞外體呈現(xiàn)MHC I相關(guān)， 僅有3. 78%表現(xiàn)出MHC II相關(guān)，因此，膽汁中的胞外體主要攜帶MHC I相關(guān)分子；圖6為雞膽汁中胞外體接種肝臟白細胞的流式細胞圖；圖中A為流式細胞分析的結(jié)果，統(tǒng)計分析后可知在適當時間和適宜的劑量下，膽汁中的胞外體對肝臟CD4+T細胞的分化具有明顯的激活作用(如B所示)，并呈現(xiàn)MHC I相關(guān)性(如C所示)，可見本發(fā)明所提供的胞外體具有明顯的CD4+T增殖作用。圖7為雞膽汁中胞外體接種脾臟、胸腺白細胞的結(jié)果，由圖可知雞膽汁中胞外體接種脾臟、胸腺細胞增殖的作用不顯著，(統(tǒng)計結(jié)果如圖 7A&B所示)，而加入胞外體可以提高脾臟⑶4+T、⑶8+T以及單核細胞和MHC I類細胞的存活率，延長細胞的存活時間(如圖7C&D所示)，可見本發(fā)明所提供的胞外體具有明顯的提高細胞的存活率和延長存活時間的作用。
具體實施例方式下述實施例中的試驗方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。實施例I、雞膽汁中胞外體的分離純化I.雞膽汁中胞外體的提取從SPF雞膽囊離體4h內(nèi)抽取膽汁，與PBS緩沖液等量混勻，在4°C低溫條件下經(jīng)2000g離心15min, 4000g離心30min, 8000g離心45min, 15000g離心60min,除去細胞碎片,取上清經(jīng)濾膜過濾(依次通過雙層濾紙,5 μ m濾膜，I. 2 μ m濾膜， O. 22 μ m濾膜)，4°C 110，OOOg離心2h，沉淀用PBS重懸，然后4°C 110，OOOg離心90min后用 PBS溶解沉淀，即為提取的胞外體。該方法中，4°C 110, OOOg離心90min后的沉淀可以進一步通過30wt%、45wt%、60wt% 蔗糖溶液進行密度梯度離心進一步分離，提高胞外體的均一度。具體方法為采用在一個離心管中通過現(xiàn)有技術(shù)形成3層密度不同度的蔗糖梯度，從下到上依次是60wt%、45wt%、 30wt%，最上層是樣品沉淀，經(jīng)離心后樣品層分離，滲入到其密度所在層，即可實現(xiàn)依密度的不同的分離。2.蛋白定量(BCA法)采用BCA蛋白濃度測定試劑盒按50體積BCA試劑A加I 體積BCA試劑B (50 I)配制適量BCA工作液，充分混勻；完全溶解蛋白標準品，取10 μ L 用PBS稀釋至100 μ L,使終濃度為O. 5mg/mL ;將標準品按0、1、2、4、8、12、16和20 μ L加到96孔板的標準品孔中,加標準品稀釋液補足到20 μ L ;加10 μ L胞外體樣品到96孔板的樣品空中，加標準品稀釋液到20ii L ;各孔加入200 ii L BCA工作液，37°C放置30min ;測定A562nm波長，根據(jù)標準曲線計算出胞外體濃縮液的蛋白濃度。 雞膽汁中的胞外體的蛋白含量約為14ii g/ml以上。實施例2、雞膽汁中胞外體的鑒定I.胞外體形態(tài)觀察取10 L胞外體原液于載樣銅網(wǎng)上，于室溫靜置Imin ;用濾紙從側(cè)面吸干液體，滴加1%醋酸雙氧鈾約10 ii L于銅網(wǎng)上,室溫負染Imin ;用濾紙吸干負染液，四蒸水洗漆一次，在白熾燈下烤干，于透射電鏡下觀察、照相。如圖IA飛中所示，雞膽汁中的胞外體形態(tài)為直徑30_150nm的具有典型杯狀結(jié)構(gòu)
的小囊泡。2.胞外體分泌和釋放的觀察(I)樣品處理取SPF雞離體Imin內(nèi)的肝臟組織，修剪成ImmX ImmX 2mm大小的長條。(2)前固定將肝臟組織取出后立即置于預冷的2. 5%戊二醛中固定4h以上，0. lmol/L磷酸緩沖液清洗3次，IOmin/次。(3)后固定1%鋨酸固定lh，0. lmol/L磷酸緩沖液清洗2次，IOmin/次。(4)脫水采用梯度乙醇脫水法，濃度為50%、70%、90%、95%、100%，再用I : I液即100%無水丙酮100%無水乙醇脫水2次,標本在每級濃度內(nèi)停留時間15 20min。(5)浸透與包埋梯度浸透法，用環(huán)氧樹脂Epon812和815混合包埋劑與丙酮I : 1、2 : I濃度浸透樣品，每種濃度內(nèi)2h，隨著時間的延長，丙酮逐漸揮發(fā)，包埋劑純度增力口。然后再將肝臟組織縱向包埋入純包埋劑中，溫箱中聚合37°C 12h，60°C 24h。(6)定位用Leica_UC6型超薄切片機半薄切片,厚I 2 ii m,經(jīng)甲苯胺藍染色約IOs,普通顯微鏡下觀察定位。(7)超薄切片及染色選用超薄切片機切片，切片速度25mm/s，厚度70 80nm，用100目帶膜銅網(wǎng)撈取4 5張大的切片，再經(jīng)醋酸雙氧鈾枸櫞酸鉛雙重染色，即可在電鏡下觀察。圖2中A箭頭所示為肝臟狄氏腔內(nèi)的胞外體；圖2中B箭頭所示為肝臟小膽管中的胞外體；圖2中C箭頭所示為肝細胞內(nèi)的多胞體以及分泌出的胞外體；圖2中D所示為膽管微絨毛，箭頭所示為膽管微絨毛上皮細胞胞外體的分泌釋放，由微絨毛邊緣有胞外體分泌出；3. SDS-PAGE 電泳取胞外體懸液10 U L,加入10 ii L2X上樣緩沖液，100°C煮沸3min，上樣于120g/L的聚丙烯酰胺分離膠，電泳結(jié)束后行考馬斯亮蘭染色，脫色后拍照。如圖3所示，雞膽汁中胞外體的電泳條帶主要有四條，分別在26KD、34KD、43KD和72KD。4.胞外體所含蛋白分析將SDS-PAGE電泳后考染的膠條及膽汁胞外體濃縮液送上海中科新生命生物科技有限公司檢測蛋白。利用ESI-MS質(zhì)譜儀，由于MS/MS具有結(jié)構(gòu)分析功能，可以獲得檢測到的每一肽段的序列。根據(jù)一級質(zhì)譜(MS)測得的精確分子質(zhì)量和串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)所得的序列信息，通過蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的檢索鑒定蛋白質(zhì)種類。通過鑒定共分析出196種蛋白，主要的蛋白成分如圖4所示，其中既包括胞外體標志性蛋白，也存在膽汁胞外體的特異蛋白，如HSP70，C-反應蛋白，玻連蛋白，粘蛋白等和大量免疫球蛋白。HSP70蛋白家族常作為胞外體的標志性蛋白作為認定胞外體的依據(jù)；C-反應蛋白，由肝細胞產(chǎn)生，是急性期反應蛋白，作為炎癥反應的標志具有重要意義；玻連蛋白，其表達的差異常作為判斷肝細胞癌的標準，表明禽源胞外體可以作為判定；粘蛋白由上皮細胞產(chǎn)生，起到潤滑及細胞信號的傳導等多種功能，可以形成化學屏障；大量免疫球蛋白的存在，說明了胞外體在免疫應答信息傳遞中具有重要作用。實施例3、胞外體MHC相關(guān)性檢測I.前處理 取胞外體懸液置于4mm乙醒/硫酸鹽磁珠乳液(購自Invitrogen公司)100 ii I中，孵育20°C 15min，再加入PBS緩沖液后在搖床上溫和搖動2h，最后用lOOmmol/L甘氨酸
終止反應。2.流式細胞儀分析(I)將連接磁珠的胞外體離心2000rpm5min,(2)用 ImlFacs Buffer 將細胞吹打散開，離心 2000rpm5min,將 buffer 倒掉，(3)每管加入 100 微升 Facs Buffer(4)從各管中各取出一定量樣品形成三管對照(5)離心 2000rpm5min,(6)使用雞抗體 CD4+T-FITC/CD8+T-PE，MHC I -FITC/M0N-PE 等抗體 4°C避光染色30mino(7) ImlFacs Buffer 沖洗，離心 2000rpm5min(8)各管加入200微升多聚甲醛固定(9)流式細胞儀觀察結(jié)果如圖5所示，膽汁中的胞外體只連接磁珠表現(xiàn)為圖A，95. 42%的胞外體呈現(xiàn)MHC I相關(guān)，僅有3. 78%表現(xiàn)出MHC II相關(guān)。因此，膽汁中的胞外體主要攜帶MHC I相關(guān)分子。實施例4、雞膽汁胞外體對脾臟、胸腺、肝臟白細胞的影響I.無菌取出胸腺、肝和脾健康SPF雞(4-6周齡)無菌打開腹腔取肝和脾，剖開頸部皮膚取胸腺，并稱重。2 脾臟白細胞分離培養(yǎng)(I)在冰盒內(nèi)放置滅菌平皿，將一小塊脾，于細胞篩上輕輕研磨，以少量預冷的PBS沖洗細胞篩，將研磨液收集到15ml管中。(2)離心后加入ImlPBS重懸后，視細胞量加入紅細胞裂解液，裂解lOmin。(3)加入PBS洗滌后用1640培養(yǎng)基重懸，分裝至24孔板中，設置陰性對照(normal)、IgG、胞外體三組。(6)置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)3h后取出。3.胸腺白細胞分離培養(yǎng)
(I)先將胸腺上連帶的脂肪完全去除干凈，在冰盒內(nèi)放置滅菌平皿，將每一塊胸腺于細胞篩上輕輕研磨，以預冷PBS沖洗細胞篩,最后一起收集到15ml管中。(2)無菌取出的胸腺細胞1500r離心5min，棄上清。(3)加入PBS重懸后，視細胞量加入紅細胞裂解液，裂解lOmin。(4)PBS洗滌后用1640培養(yǎng)基吹開沉淀，分裝至24孔板中，設置陰性對照(normal)、IgG、胞外體三組。(5)置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)3h后取出。3.肝臟白細胞的分離
(I)在冰盒內(nèi)放置滅菌燒杯，將肝剪成大小約Icm3的小塊，把每一小塊肝于細胞篩上研磨，以預冷PBS沖洗細胞篩，收集細胞液到50ml離心管中。(2)靜置5min后，傾出上清，棄沉淀，將上清裝在50ml離心管中。(3) 4°C 1500rpm 離心 8min,棄上清。(4)用雞淋巴細胞分離液分離肝臟白細胞，20°C 2500rpm離心20min。(5)取上層，用PBS洗滌后用1640培養(yǎng)基吹開沉淀，取兩個24孔板，用1640培養(yǎng)基吹開沉淀，分裝，設置陰性對照(normal)、IgG、胞外體三組。(7)置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)3h后取出。4 流式細胞儀分析前處理(I)將培養(yǎng)的細胞取出離心2000rpm 5min ；(2)用ImlFacs Buffer將細胞吹打散開,離心2000rpm 5min,棄上清；(3)每管加入 100 微升 Facs Buffer ；(4)從各管中各取出一定量樣品形成三管對照；(5)離心 2000rpm5min ;(6)使用雞抗體 CD4+T-FITC/CD8+T-PE，MHC I -FITC/M0N-PE 等抗體 4°C避光染色30mino(7) ImlFacs Buffer 沖洗，離心 2OOOrpm5Iiiin,棄上清；(8)各管加入200微升多聚甲醛固定；(9)流式細胞儀檢測。根據(jù)實驗結(jié)果顯示，膽汁中的胞外體對不同來源的細胞作用不同，對脾臟和胸腺來源的細胞沒有明顯促進增殖的作用，而對肝臟CD4+T淋巴細胞的作用顯著。結(jié)果如圖6所示，在適當時間和適宜的劑量下，膽汁中的胞外體對肝臟CD4+T淋巴細胞分化具有明顯的激活作用(圖B)，并呈現(xiàn)MHC I相關(guān)性(圖C)?？梢姳景l(fā)明所提供的胞外體具有明顯的⑶4+T增殖作用。圖7A&B所示，膽汁胞外體對脾臟、胸腺細胞的增殖作用不明顯，但是如圖7C&D所示，加入胞外體可以延長脾臟CD4+T、CD8+T以及單核細胞和MHC I類細胞的存活時間，提高存活率(即細胞的起始濃度相同，在持續(xù)培養(yǎng)的各個時間點比較淋巴細胞量，加入胞外體比不加胞外體組的細胞量都要高)，可見本發(fā)明所提供的胞外體具有明顯的提高細胞的存活率和延長存活時間的作用。同時由于胞外體的雙層脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)，通過常規(guī)技術(shù)試驗比對可知，這種雙層的脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)可以很好的保護藥物，因此可以將其作為載體使用到藥物的加工過程中。
權(quán)利要求
1.一種從雞膽汁中提取的胞外體，其特征在于該胞外體具有典型杯狀結(jié)構(gòu)的雙層脂質(zhì)膜，含有肝源性和上皮細胞源性的蛋白成分，所述的肝源性的蛋白成分為C-反應蛋白或天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶或玻連蛋白或其混合物；所述的上皮細胞源性的蛋白成分為粘蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求I或所述的胞外體，其特征在于該胞外體還攜帶免疫球蛋白或多聚免疫球蛋白受體或其混合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的胞外體，其特征在于所述胞外體直徑在30-150nm，質(zhì)量密度范圍為I. 13-1. 19g/cm3。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的胞外體，其特征在于該胞外體表面上呈遞有MHCI分子或可與MHC I分子結(jié)合的抗原肽，或帶有淋巴細胞共刺激分子，或上述物質(zhì)共存。
5.制備如權(quán)利要求I所述的胞外體的方法，其特征在于具體步驟如下 將從SPF雞或其他經(jīng)過常規(guī)免疫的商品禽類膽嚢，離體4h內(nèi)抽取的膽汁，膽汁在4°C低溫條件下經(jīng)逐級離心去細胞碎片取上清，經(jīng)濾膜過濾，依次4°C 110, OOOg離心2h沉淀用PBS重懸，然后4°C 110，OOOg離心90min后用PBS溶解沉淀，所得溶液中即包含雞膽汁胞外體； 其中所述的逐級離心為1000 2000g 15 20min，3000 4000g 20 30min，7000 8000g 45 50min，10000 15000g 40 60min。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法,其特征在于所述經(jīng)過4°C110, OOOg離心90min后的沉淀通過30wt%、45wt%、60wt%的蔗糖溶液進行密度梯度離心。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于所述的逐級離心為2000gl5min，4000g30min,8000g45min,15000g 60min。
8.如權(quán)利要求I所述的胞外體，在用于激活體內(nèi)外免疫反應或作為免疫反應佐劑，參與免疫調(diào)節(jié)，作為抗應激類藥物的應用。
9.如權(quán)利要求I所述的胞外體，作為載體在制備治療肝臟或膽囊或腸道疾病藥物上的應用。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子免疫學領(lǐng)域，具體涉及一種由雞肝臟、膽囊和膽管上皮細胞分泌和釋放的胞外體，且公開了其制備方法，該胞外體中含有C-反應蛋白(C-reactive protein)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Aspartate aminotransferase)、玻連蛋白(Vitronectin)等肝源性的蛋白成分、上皮細胞源性的粘蛋白(Mucin)以及免疫球蛋白(Immunoglobulin)等免疫反應相關(guān)蛋白，可以作為研究肝臟疾病的生物指標以及作為免疫反應佐劑，參與免疫調(diào)節(jié)，還可以作為載體，應用于治療肝臟、膽囊和腸道疾病的治療。
文檔編號A61P1/16GK102697812SQ201210169289
公開日2012年10月3日 申請日期2012年5月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月28日
發(fā)明者于琳琳, 姜艷萍, 張利, 成子強, 王桂花, 王玥, 王真真 申請人:山東農(nóng)業(yè)大學