專利名稱：鼠源epor胞外區(qū)與人源nok胞內(nèi)區(qū)嵌合受體及編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種鼠源EPOR胞外區(qū)與人源NOK胞內(nèi)區(qū)嵌合受體及編碼基因與應(yīng)用，特別涉及一種鼠源EPOR(紅細(xì)胞生成素受體)胞外區(qū)與人源NOK(帶激酶功能域的新型癌基因)胞內(nèi)區(qū)嵌合受體及編碼基因與可表達(dá)該受體的細(xì)胞系。
背景技術(shù)：
蛋白酪氨酸激酶受體(PTKR)在各種細(xì)胞調(diào)控水平及肌體不同發(fā)育階段中起著重要作用，比如參與細(xì)胞的增殖、分化及抗凋亡等過程。典型的PTKR結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為細(xì)胞脂質(zhì)雙分子層上的單跨膜蛋白，分為胞外區(qū)、跨膜區(qū)及胞內(nèi)區(qū)。胞外區(qū)具有相應(yīng)配體的特異性識別位點，在結(jié)合配體過程中起重要作用。胞內(nèi)區(qū)含有酪氨酸激酶功能域，參與胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及受體、銜接蛋白的磷酸化過程，特別是有絲分裂原的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。PTKR在細(xì)胞內(nèi)的異常表達(dá)常會導(dǎo)致遺傳疾病及腫瘤。因此，PTKR蛋白的表達(dá)在肌體內(nèi)受到嚴(yán)格調(diào)控。目前為止，至少有18種PTKR與腫瘤轉(zhuǎn)化有關(guān)，可作為癌基因。重要的實例包括成纖維生長因子受體(FGFR)、表皮生長因子受體(EGFR)、血小板來源的生長因子受體(PDGFR)、胰島素受體(InsR)和肝細(xì)胞生長因子受體(Met)等。
研究顯示部分PTKR異常剪接變異體與腫瘤的發(fā)生相關(guān)。比如從人骨肉瘤及乳腺癌細(xì)胞可分離到缺少全部跨膜區(qū)的可溶性FGFR3分子。而在胃癌細(xì)胞中，一種符合蛋白編碼的49氨基酸的缺失可導(dǎo)致Ron酪氨酸受體的組成性激活。最近從腦垂體腫瘤中人們分離到一種新型FGFR4剪接變異體，被稱做ptd-FGFR4。這種剪接變異體缺少幾乎全部的FGFR4受體胞外區(qū)，并且不包含信號肽，導(dǎo)致該成熟蛋白僅在胞漿表達(dá)。過量表達(dá)ptd-FGFR4可導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)化。通過轉(zhuǎn)基因方式在小鼠體內(nèi)進行組織特異性表達(dá)可形成垂體瘤。另外，利用N端和C端特異性抗體，人們發(fā)現(xiàn)部分惡性肌骨骼瘤臨床病人樣品中也有N端缺失的Met受體表達(dá)。
紅細(xì)胞生成素(EPO)及其受體(EPOR)在正常的骨髓紅系祖細(xì)胞的增殖與分化過程中起關(guān)鍵作用。EPOR是一個典型的I類細(xì)胞因子受體超家族成員。這類分子胞外區(qū)的氨基端通常有四個半胱氨酸殘基，而胞外區(qū)的的羧基端近跨膜區(qū)位置通常有一個色氨酸-絲氨酸-X-色氨酸-絲氨酸基序(WSXWS motif)。該基序在特異性配體識別過程中起重要作用。該類受體胞內(nèi)區(qū)近跨膜區(qū)常有保守的脯氨酸富含功能域，簡稱為Box1，而遠(yuǎn)跨膜區(qū)位置常有不保守的Box2功能域。EPOR的活化通常需要形成同源二聚體，并通過Boxl和Box2激活胞漿內(nèi)的銜接蛋白如JAK2等，使STAT5等轉(zhuǎn)錄因子磷酸化，作用于靶基因啟動子從而調(diào)控下游基因的表達(dá)。目前，人們在研究新型細(xì)胞因子受體的功能過程中，常把EPOR的胞外區(qū)與新型受體的胞內(nèi)區(qū)進行融合。該嵌合受體的優(yōu)勢在于可以利用EPO配體及其受體的特異性作用來研究未知受體胞內(nèi)的功能，特別是嵌合受體的活化可以激活哪些胞內(nèi)信號通路。
發(fā)明創(chuàng)造內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種鼠源EPOR胞外區(qū)與人源NOK胞內(nèi)區(qū)嵌合受體及其編碼基因。
鼠源EPOR胞外區(qū)與人源NOK胞內(nèi)區(qū)嵌合受體名稱為EPOR/NOK，它是具有序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列或?qū)EQ ID №2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID №2相同活性的由SEQ ID№2衍生的蛋白質(zhì)。
序列表中SEQ ID №2的蛋白質(zhì)由650個氨基酸殘基組成。在實際應(yīng)用中，為了便于檢測，其羧基端還帶有FLAG標(biāo)簽，該帶FLAG標(biāo)簽的EPOR/NOK的氨基酸序列如序列表中的序列4所示，序列4由658個氨基酸殘基組成，自氨基端第651位-658位氨基酸殘基為FLAG標(biāo)簽。
鼠源EPOR胞外區(qū)與人源NOK胞內(nèi)區(qū)嵌合受體EPOR/NOK編碼基因，具有下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)編碼序列表中SEQ ID №2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
序列表中的SEQ ID №1由1953個堿基組成，其開放閱讀框架為自5′端第1位-1953位堿基；自5′端第1位-750位堿基為鼠源EPOR胞外區(qū)編碼序列；自5′端第751位-758位堿基為外源NotI酶切位點；自5′端第759位-1950位堿基為NOK基因跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)的編碼序列。
其中，人源帶激酶功能域的新型癌基因NOK基因(NovelOncogene withKinase-domain，NOK)是由本發(fā)明人克隆得到的新基因，它是具有序列表中序列5所示的DNA序列。序列5由1269個堿基組成，其開放閱讀框架為自5′端第1位-1269位堿基。
在實際應(yīng)用中，為了便于檢測，在其3′端還帶有FLAG標(biāo)簽的編碼基因，該帶FLAG標(biāo)簽的編碼基因的核苷酸序列如序列表中的序列3所示，序列3由1977個堿基組成，自5′端第1951位-1977位堿基為FLAG標(biāo)簽的編碼基因。
含有鼠源EPOR胞外區(qū)與人源NOK胞內(nèi)區(qū)嵌合受體EPOR/NOK編碼基因的載體和細(xì)胞系，如pcDNA3(EPOR/NOK-H)和于2004年5月9日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)、保藏號為CGMCC №1144的BaF3-EPOR/NOK細(xì)胞系，均屬于本發(fā)明的保護范圍。
實驗證明，EPOR/NOK基因在BaF3細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)導(dǎo)致該細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化，使BaF3細(xì)胞由白細(xì)胞介素3(IL-3)依賴性轉(zhuǎn)化為非依賴性；EPOR/NOK穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系BaF3-EPOR/NOK皮下接種裸鼠后，可導(dǎo)致接種部位腫瘤生成及遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移，表現(xiàn)為惡性腫瘤特點。BaF3-EPOR/NOK接種裸鼠可作為研究腫瘤發(fā)生與轉(zhuǎn)移機制，以及篩選抗腫瘤生成與轉(zhuǎn)移藥物的模型動物。BaF3-EPOR/NOK可作為細(xì)胞水平的模型工具用于篩選抗腫瘤生成與轉(zhuǎn)移藥物，將在抗腫瘤藥物篩選及抗腫瘤藥物的藥效檢測中發(fā)揮重要作用。


圖1為從扁桃體腫瘤總RNA中經(jīng)RT-PCR擴增得到的NOK基因產(chǎn)物圖2為DAS跨膜區(qū)預(yù)測軟件分析EPOR/NOK嵌合受體圖3為EPOR/NOK蛋白酪氨酸激酶功能域分析結(jié)果圖4為用鼠源FLAG抗體檢測BaF3-p3及BaF3-EPOR/NOK穩(wěn)定細(xì)胞中EPOR/NOK蛋白的表達(dá)圖5為在饑餓條件下BaF3-EPOR/NOK的增殖曲線圖6為BaF3-EPOR/NOK細(xì)胞在沒有血清及WEHI-3B的半固體培養(yǎng)基中形成集落的照片圖7為BaF3-EPOR/NOK皮下接種裸鼠成瘤照片圖8BaF3-EPOR/NOK皮下接種裸鼠后，腫瘤細(xì)胞遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移的HE染色結(jié)果示意圖具體實施方式
實施例1、EPOR/NOK編碼基因的獲得用引物5′-TATAGCGATATCATGGACAAACTCAGGGTGCC-3′和5′-TATAGCGCGGCCGCGAGAGGGTCCAGGTCGCTA-3′，以pMX-EPOR(pBabe-EPO-R)為模板(PNAS，Vol.93，p8324-8328，August 1996)，在如下的反應(yīng)體系50ng模板DNA，100pmol每種引物，1×擴增緩沖液，200μmol/L每種dNTP，1單位高保真Taq酶；循環(huán)程序下94℃5分鐘，94℃30秒，55℃30秒，72℃1分鐘，35個循環(huán)，72℃10分鐘延伸，擴增鼠紅細(xì)胞生成素受體(EPOR)胞外區(qū)，將得到的片段利用EcoRV和NotI亞克隆到pcDNA3(購自Invitrogen公司)的EcoRV和NotI位點之間，得到質(zhì)粒pcDNA3(EPOR)。
NOK全長cDNA從人扁桃體腫瘤總RNA中經(jīng)RT-PCR獲得，具體步驟如下按常規(guī)方法提取人扁桃體腫瘤總RNA，然后以5′-TATAAAGCTTATGGGCATGATGACACGGATGCT-3′和5′-TATACTCGAGTCAGGCGTAGTCGGGCACGTCGTAGGGGTAAAGCATGCTATAGTTGTA-3′為引物(下劃線為HA表達(dá)標(biāo)簽)，反應(yīng)條件按照一步法RT-PCR的使用說明進行(Takara)，得到的PCR產(chǎn)物(圖1)純化后直接亞克隆到T載體(購自Promega公司)，酶切鑒定后再進行測序。將測序過的RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)HindIII和XhoI雙酶切后亞克隆到pcDNA3(購自Invitrogen公司)上，構(gòu)成pcDNA3(NOK-H)表達(dá)質(zhì)粒。
以引物5′-TATAGCGGCCGCAGTGATTATCGTCCCAACTTT-3′和5′-TATACCAGTGTGCTGGTCACTTGTCA TCGTCGTCCTTGTAGTCAAGCATGCTATAGTTGTAGA-3′以pcDNA3(NOK-H)為模板，在如下的反應(yīng)體系50ng模板DNA，100pmol每種引物，1×擴增緩沖液，200μmol/L每種dNTP，1單位高保真Taq酶；和循環(huán)程序下94℃5分鐘，94℃30秒，55℃30秒，72℃1分鐘，35個循環(huán)，72℃10分鐘延伸，擴增人NOK-H跨膜區(qū)及胞內(nèi)區(qū)，將得到的片段利用NotI和BstXI亞克隆到pcDNA3(EPOR)的NotI和BstXI位點之間，篩選得到完整的融合基因表達(dá)載體pcDNA3(EPOR/NOK-H)，測序表明該融合基因具有序列表中序列1的核苷酸序列。該融合基因C末端攜帶FLAG標(biāo)簽(序列表中序列3)，可被鼠M2抗體識別。
EPOR/NOK是具有序列表中序列2的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，DAS跨膜預(yù)測軟件分析EPOR/NOK是單一跨膜分子，跨膜區(qū)位于自氨基端第249-277氨基酸殘基(圖2)。EPOR/NOK具有典型的酪氨酸激酶功能域(自氨基端第333-600氨基酸殘基)(圖3)實施例2、BaF3-EPOR/NOK穩(wěn)定細(xì)胞系的構(gòu)建離心收取1×106野生型BaF3細(xì)胞，重懸于0.5ml無血清RPMI-1640培養(yǎng)液。將3μg實施例1中得到的pcDNA3(EPOR/NOK-H)與BaF3細(xì)胞混合，冰浴10分鐘后，用ECM399(BTX公司)電轉(zhuǎn)儀進行電轉(zhuǎn)。電轉(zhuǎn)條件為200-230V，電流為25-35毫秒。電轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞在RPMI-1640全培養(yǎng)基中生長。在G418的篩選下獲得穩(wěn)定外源基因的表達(dá)。由于質(zhì)粒pcDNA3攜帶新酶素抗性基因，穩(wěn)定細(xì)胞在500μg/ml G418下進行篩選。每三天換一次液，連續(xù)培養(yǎng)三周后，在100mm培養(yǎng)皿中進行擴增，得到細(xì)胞系BaF3-EPOR/NOK CGMCC №1144。
實施例3、檢測BaF3-EPOR/NOK穩(wěn)定細(xì)胞系EPOR/NOK基因的表達(dá)由于EPOR/NOK基因的羧基端融合了一個FLAG標(biāo)簽，陽性細(xì)胞克隆可通過蛋白印記雜交(Western Blot)進行檢測。等蛋白量的BaF3-EPOR/NOK及BaF3-P3(pcDNA3.0空載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的BaF3)對照的細(xì)胞裂解液經(jīng)10％SDS/PAGE分離后轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上。以鼠源抗FLAG標(biāo)簽的單克隆抗體(Santa Cruz Biotechnology)為一抗進行雜交，以熒光素標(biāo)記的羊源抗鼠抗體(Amersham Biosciences UK Limited)為二抗，最后用ECL化學(xué)發(fā)光的底物進行雜交信號放大，結(jié)果如圖4所示，表明細(xì)胞系BaF3-EPOR/NOK有特異性EPOR/NOK蛋白表達(dá)，分子量約為68kD。
實施例4、EPOR/NOK基因使BaF3細(xì)胞由白細(xì)胞介素3(IL-3)依賴性轉(zhuǎn)化為非依賴性BaF3細(xì)胞為小鼠前B細(xì)胞，需要有白細(xì)胞介素3的刺激下才能增殖。在沒有血清及沒有WEHI-3B的RPMI-1640(摻入的3H胸腺嘧啶脫氧核苷)培養(yǎng)液中在37℃培養(yǎng)3天，[3H]摻入檢測細(xì)胞增殖結(jié)果如圖5所示，表明在沒有血清及沒有WEHI-3B的RPMI-1640培養(yǎng)液中，BaF3-EPOR/NOK可顯著增殖3天以上，而BaF3-P3(pcDNA3.0空載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的BaF3)對照由于需要IL-3的刺激，因而細(xì)胞幾乎沒有增殖。說明在BaF3細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)EPOR/NOK基因，可以使BaF3-EPOR/NOK在沒有WEHI-3B條件培養(yǎng)液(提供IL-3)的情況下也可以增殖。
實施例5、BaF3-EPOR/NOK在‘饑餓’培養(yǎng)條件下具有錨定非依賴增長的特性穩(wěn)定細(xì)胞在半固體培養(yǎng)基中的生長是檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)化特性的依據(jù)之一。將BaF3-EPOR/NOK細(xì)胞以1×105個細(xì)胞/ml培養(yǎng)基的濃度懸浮在60mm培養(yǎng)皿盛裝的0.4％瓊脂糖培養(yǎng)基中，鋪在0.8％的瓊脂糖培養(yǎng)基之上。瓊脂糖培養(yǎng)基用RPMI-1640培養(yǎng)液制備，其中含有5％FBS及400μg/ml G418。以pcDNA3.0空載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的BaF3(BaF3-p3)為陰性對照。在沒有血清及沒有WEHI-3B上清的條件下，置于含5％二氧化碳的37℃孵箱中培養(yǎng)。三周后，用倒置顯微鏡計算直徑大于0.1mm的細(xì)胞集落數(shù)，結(jié)果如圖6所示，表明BaF3-EPOR/NOK在‘饑餓’培養(yǎng)條件下有明顯的集落生成。統(tǒng)計結(jié)果如表1所示，表明在BaF3細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)EPOR/NOK，可使BaF3細(xì)胞的增殖特性發(fā)生改變，具有腫瘤細(xì)胞的特點。
表1、BaF3穩(wěn)定細(xì)胞系在半固體瓊脂糖培養(yǎng)基中的集落生成試驗BaF3細(xì)胞系細(xì)胞數(shù)集落數(shù)(標(biāo)準(zhǔn)差)BaF3-p3 1×1050(0)BaF3-EPOR/NOK 1×105102(10)注集落數(shù)為三次平行實驗的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差實施例6、BaF3-EPOR/NOK細(xì)胞具有腫瘤生成特性，皮下接種裸鼠可導(dǎo)致惡性腫瘤生成體內(nèi)成瘤實驗的具體步驟是，將1×107BaF3-EPOR/NOK穩(wěn)定細(xì)胞系皮下注射4-6周去胸腺Balb-c裸鼠，注射部位是裸鼠右前臂腋下皮膚。以穩(wěn)定表達(dá)pcDNA3.0空載體的BaF3細(xì)胞(BaF3-p3)為陰性對照。每一種細(xì)胞注射六只裸鼠。每一實驗組包括三只雌鼠(F1、F2、F3)及三只雄鼠(M1、M2、M3)。注射BaF3-EPOR/NOK細(xì)胞7-10天后可見接種部位皮下有明顯腫瘤形成(圖7)。對照組與試驗組接種三周后的成瘤情況如圖7所示。接種BaF3-EPOR/NOK細(xì)胞一個月后小鼠全身出現(xiàn)衰竭，行動遲緩，35-40天死亡。BaF3-EPOR/NOK細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)呈現(xiàn)惡性腫瘤生長趨勢，在注射部位骨骼肌成侵潤性生長，肝臟及脾臟明顯增大，并導(dǎo)致遠(yuǎn)處臟器如肝臟、脾臟、腎臟和肺臟轉(zhuǎn)移(圖8及表2)。圖8中，箭頭指示為腫瘤轉(zhuǎn)移灶。
表2、BaF3-NOK在裸鼠腫瘤生成情況

a代表裸鼠的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差序列表<160>5<210>1<211>1953<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1atggacaaac tcagggtgcc cctctggcct cgggtaggcc ccctctgtct cctacttgct 60ggggcagcct gggcaccttc acccagcctc ccggacccca agtttgagag caaagcggcc 120ctgctggcat cccggggctc cgaagaactt ctgtgcttca cccaacgctt ggaagacttg 180gtgtgtttct gggaggaagc ggcgagctcc gggatggact tcaactacag cttctcatac 240cagctcgagg gtgagtcacg aaagtcatgt agcctgcacc aggctcccac cgtccgcggc 300tccgtgcgtt tctggtgttc actgccaaca gcggacacat cgagttttgt gccgctggag 360ctgcaggtga cggaggcgtc cggttctcct cgctatcacc gcatcatcca tatcaatgaa 420gtagtgctcc tggacgcccc cgcggggctg ctggcgcgcc gggcagaaga gggcagccac 480gtggtgctgc gctggctgcc acctcctgga gcacctatga ccacccacat ccgatatgaa 540gtggacgtgt cggcaggcaa ccgggcagga gggacacaaa gggtggaggt cctggaaggc 600cgcactgagt gtgttctgag caacctgcgg ggcgggacgc gctacacctt cgctgttcga 660gcgcgcatgg ccgagccgag cttcagcgga ttctggagtg cctggtctga gcccgcgtca 720ctactgaccg ctagcgacct ggaccctctc gcggccgcag tgattatcgt cccaactttg 780ttggttacta tcttcctcat ccttcttggg gtcatcctgt ggctttttat cagagaacaa 840agaactcaac agcagcgttc tggacctcaa ggcattgccc ctgttcctcc acctagggac 900ctaagctggg aagcaggaca tggaggaaat gtggctttgc cacttaagga gacatccgtg 960gaaaactttc tgggagctac cacacctgcc ctggctaagc tgcaggtgcc gcgggagcaa 1020ctctctgaag ttctggagca gatttgcagc ggtagctgtg ggcccatctt tcgagccaat 1080atgaacactg gggacccttc taagcccaag agtgttattc tcaaggcttt aaaagaacca 1140gctgggctcc atgaggtaca agatttctta gggcgaatcc aattccatca atacctgggg 1200aaacacaaaa acctggtgca gctggaaggc tgctgcactg aaaagctgcc actctatgtg 1260gtgttggagg atgtggccca gggggacctg cttagctttc tctggacctg tcggcgggat 1320gtgatgacta tggatggtct tctctatgat ctcacagaaa aacaagtata tcacatcgga 1380aagcaggtcc ttttggcgct ggaattcctg caggagaagc atttgttcca tggggatgtg 1440gcagccagga atattctgat gcaaagtgat ctcactgcta agctctgtgg attaggcctg 1500gcttatgaag tttacacccg aggggccatc tcctctactc aaaccatacc tctcaagtgg 1560
cttgccccag aacggcttct cctgagacct gctcgcatca gagcagatgt ctggtctttt 1620gggatcctgc tctatgagat ggtgactcta ggagcaccac cgtatcctga agtccctcct 1680accagcatcc tagagcatct ccaaagaagg aaaatcatga agagacccag tagctgcaca 1740cataccatgt acagtatcat gaagtcctgc tggcgctggc gtgaggctga ccgcccctca 1800cctagagagc tgcgcttgcg cctagaagct gccattaaaa ctgcagatga cgaggctgtg 1860ttacaagtac cagagttggt ggtacctgaa ctgtatgcag ctgtggccgg catcagagtg 1920gagagcctct tctacaacta tagcatgctt tga 1953<210>2<211>650<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>2Met Asp Lys Leu Arg Val Pro Leu Trp Pro Arg Val Gly Pro Leu Cys1 5 10 15Leu Leu Leu Ala Gly Ala Ala Trp Ala Pro Ser Pro Ser Leu Pro Asp20 25 30Pro Lys Phe Glu Ser Lys Ala Ala Leu Leu Ala Ser Arg Gly Ser Glu35 40 45Glu Leu Leu Cys Phe Thr Gln Arg Leu Glu Asp Leu Val Cys Phe Trp50 55 60Glu Glu Ala Ala Ser Ser Gly Met Asp Phe Asn Tyr Ser Phe Ser Tyr65 70 75 80Gln Leu Glu Gly Glu Ser Arg Lys Ser Cys Ser Leu His Gln Ala Pro85 90 95Thr Val Arg Gly Ser Val Arg Phe Trp Cys Ser Leu Pro Thr Ala Asp100 105 110Thr Ser Ser Phe Val Pro Leu Glu Leu Gln Val Thr Glu Ala Ser Gly115 120 125Ser Pro Arg Tyr His Arg Ile Ile His Ile Asn Glu Val Val Leu Leu130 135 140Asp Ala Pro Ala Gly Leu Leu Ala Arg Arg Ala Glu Glu Gly Ser His145 150 155 160Val Val Leu Arg Trp Leu Pro Pro Pro Gly Ala Pro Met Thr Thr His165 170 175
Ile Arg Tyr Glu Val Asp Val Ser Ala Gly Asn Arg Ala Gly Gly Thr180 185 190Gln Arg Val Glu Val Leu Glu Gly Arg Thr Glu Cys Val Leu Ser Asn195 200 205Leu Arg Gly Gly Thr Arg Tyr Thr Phe Ala Val Arg Ala Arg Met Ala210 215 220Glu Pro Ser Phe Ser Gly Phe Trp Ser Ala Trp Ser Glu Pro Ala Ser225 230 235 240Leu Leu Thr Ala Ser Asp Leu Asp Pro Leu Ala Ala Ala Val Ile Ile245 250 255Val Pro Thr Leu Leu Val Thr Ile Phe Leu Ile Leu Leu Gly Val Ile260 265 270Leu Trp Leu Phe Ile Arg Glu Gln Arg Thr Gln Gln Gln Arg Ser Gly275 280 285Pro Gln Gly Ile Ala Pro Val Pro Pro Pro Arg Asp Leu Ser Trp Glu290 295 300Ala Gly His Gly Gly Asn Val Ala Leu Pro Leu Lys Glu Thr Ser Val305 310 315 320Glu Asn Phe Leu Gly Ala Thr Thr Pro Ala Leu Ala Lys Leu Gln Val325 330 335Pro Arg Glu Gln Leu Ser Glu Val Leu Glu Gln Ile Cys Ser Gly Ser340 345 350Cys Gly Pro Ile Phe Arg Ala Asn Met Asn Thr Gly Asp Pro Ser Lys355 360 365Pro Lys Ser Val Ile Leu Lys Ala Leu Lys Glu Pro Ala Gly Leu His370 375 380Glu Val Gln Asp Phe Leu Gly Arg Ile Gln Phe His Gln Tyr Leu Gly385 390 395 400Lys His Lys Asn Leu Val Gln Leu Glu Gly Cys Cys Thr Glu Lys Leu405 410 415Pro Leu Tyr Val Val Leu Glu Asp Val Ala Gln Gly Asp Leu Leu Ser420 425 430Phe Leu Trp Thr Cys Arg Arg Asp Val Met Thr Met Asp Gly Leu Leu435 440 445Tyr Asp Leu Thr Glu Lys Gln Val Tyr His Ile Gly Lys Gln Val Leu450 455 460Leu Ala Leu Glu Phe Leu Gln Glu Lys His Leu Phe His Gly Asp Val465 470 475 480Ala Ala Arg Asn Ile Leu Met Gln Ser Asp Leu Thr Ala Lys Leu Cys
485 490 495Gly Leu Gly Leu Ala Tyr Glu Val Tyr Thr Arg Gly Ala Ile Ser Ser500 505 510Thr Gln Thr Ile Pro Leu Lys Trp Leu Ala Pro Glu Arg Leu Leu Leu515 520 525Arg Pro Ala Arg Ile Arg Ala Asp Val Trp Ser Phe Gly Ile Leu Leu530 535 540Tyr Glu Met Val Thr Leu Gly Ala Pro Pro Tyr Pro Glu Val Pro Pro545 550 555 560Thr Ser Ile Leu Glu His Leu Gln Arg Arg Lys Ile Met Lys Arg Pro565 570 575Ser Ser Cys Thr His Thr Met Tyr Ser Ile Met Lys Ser Cys Trp Arg580 585 590Trp Arg Glu Ala Asp Arg Pro Ser Pro Arg Glu Leu Arg Leu Arg Leu595 600 605Glu Ala Ala Ile Lys Thr Ala Asp Asp Glu Ala Val Leu Gln Val Pro610 615 620Glu Leu Val Val Pro Glu Leu Tyr Ala Ala Val Ala Gly Ile Arg Val625 630 635 640Glu Ser Leu Phe Tyr Asn Tyr Ser Met Leu645 650<210>3<211>1977<212>DNA<213>人工序列<220>
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Ala Ala Arg Asn Ile Leu Met Gln Ser Asp Leu Thr Ala Lys Leu Cys485 490 495Gly Leu Gly Leu Ala Tyr Glu Val Tyr Thr Arg Gly Ala Ile Ser Ser500 505 510Thr Gln Thr Ile Pro Leu Lys Trp Leu Ala Pro Glu Arg Leu Leu Leu5l5 520 525Arg Pro Ala Arg Ile Arg Ala Asp Val Trp Ser Phe Gly Ile Leu Leu530 535 540Tyr Glu Met Val Thr Leu Gly Ala Pro Pro Tyr Pro Glu Val Pro Pro545 550 555 560Thr Ser Ile Leu Glu His Leu Gln Arg Arg Lys Ile Met Lys Arg Pro565 570 575Ser Ser Cys Thr His Thr Met Tyr Ser Ile Met Lys Ser Cys Trp Arg580 585 590Trp Arg Glu Ala Asp Arg Pro Ser Pro Arg Glu Leu Arg Leu Arg Leu595 600 605Glu Ala Ala Ile Lys Thr Ala Asp Asp Glu Ala Val Leu Gln Val Pro610 615 620Glu Leu Val Val Pro Glu Leu Tyr Ala Ala Val Ala Gly Ile Arg Val625 630 635 640Glu Ser Leu Phe Tyr Asn Tyr Ser Met Leu Asp Tyr Lys Asp Asp Asp645 650 655Asp Lys658<210>5<211>1269<212>DNA<213>人工序列<220>
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權(quán)利要求
1.一種鼠源EPOR胞外區(qū)與人源NOK胞內(nèi)區(qū)嵌合受體，是具有序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列或?qū)EQ ID №2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID №2相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌合受體，其特征在于所述鼠源EPOR胞外區(qū)與人源NOK胞內(nèi)區(qū)嵌合受體是具有序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的嵌合受體，其特征在于所述鼠源EPOR胞外區(qū)與人源NOK胞內(nèi)區(qū)嵌合受體的羧基端還帶有FLAG標(biāo)簽，所述帶有FLAG標(biāo)簽的嵌合受體具有序列表中序列4的氨基酸序列。
4.鼠源EPOR胞外區(qū)與人源NOK胞內(nèi)區(qū)嵌合受體編碼基因，具有下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)編碼序列表中SEQ ID №2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基因，其特征在于所述鼠源EPOR胞外區(qū)與人源NOK胞內(nèi)區(qū)嵌合受體編碼基因是具有序列表中SEQ ID №1的核苷酸序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的基因，其特征在于所述鼠源EPOR胞外區(qū)與人源NOK胞內(nèi)區(qū)嵌合受體編碼基因的3′端還帶有FLAG標(biāo)簽的編碼基因，所述帶FLAG標(biāo)簽編碼基因的嵌合受體編碼基因具有序列表中SEQ ID №3的核苷酸序列。
7.含有權(quán)利要求4所述基因的表達(dá)載體。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的載體，其特征在于所述表達(dá)載體為pcDNA3(EPOR/NOK-H)。
9.含有權(quán)利要求4所述基因的細(xì)胞系。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的細(xì)胞系，其特征在于所述細(xì)胞系為BaF3-EPOR/NOKCGMCC №1144。
全文摘要
本發(fā)明的公開了一種鼠源EPOR胞外區(qū)與人源NOK胞內(nèi)區(qū)嵌合受體及編碼基因與應(yīng)用，其目的是提供一種鼠源EPOR(紅細(xì)胞生成素受體)胞外區(qū)與人源NOK(帶激酶功能域的新型癌基因)胞內(nèi)區(qū)嵌合受體及編碼基因與可表達(dá)該受體的細(xì)胞系。本發(fā)明所提供的鼠源EPOR胞外區(qū)與人源NOK胞內(nèi)區(qū)嵌合受體，是具有序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列或?qū)EQ ID №2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID №2相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白質(zhì)。鼠源EPOR胞外區(qū)與人源NOK胞內(nèi)區(qū)嵌合受體穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系BaF3－EPOR/NOK CGMCC№1144可作為細(xì)胞水平的模型工具用于篩選抗腫瘤生成與轉(zhuǎn)移藥物。
文檔編號C12N15/12GK1570108SQ200410037889
公開日2005年1月26日 申請日期2004年5月13日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月13日
發(fā)明者劉力, 傅新元, 常智杰, 張淑平 申請人:清華大學(xué)