哺乳動(dòng)物雙基因高效篩選表達(dá)載體及其構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物制藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及到哺乳動(dòng)物雙基因高效篩選表達(dá)載體及 其構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 基因工程藥物因具有其他藥物無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn)，迅速成為制藥產(chǎn)業(yè)中引人注目 的焦點(diǎn)，近年來(lái)，各國(guó)政府將其視為新的經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)熱點(diǎn)并大力支持。CHO細(xì)胞（Chinese hamster ovary,中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞）表達(dá)系統(tǒng)是目前應(yīng)用最廣泛的真核表達(dá)系統(tǒng)之一，被 廣泛應(yīng)用于抗體類蛋白質(zhì)藥物的生產(chǎn)。影響重組蛋白在CHO細(xì)胞中表達(dá)的因素很多，涉及 CHO細(xì)胞表達(dá)體系、表達(dá)載體系統(tǒng)、外源基因、表達(dá)細(xì)胞株的加壓擴(kuò)增與篩選、細(xì)胞大規(guī)模培 養(yǎng)等。CHO細(xì)胞表達(dá)體系和外源基因影響mRNA(Messenger RNA)的翻譯；表達(dá)細(xì)胞株的加 壓擴(kuò)增，目的在于增加外源基因的拷貝數(shù)，從而提高表達(dá)量；篩選基因的應(yīng)用使獲得穩(wěn)定 的、高表達(dá)的單克隆細(xì)胞株成為可能[吳海濤，胡云龍，陳松，等，中國(guó)生物工程雜志，2004 ; 24(8) :1-5]。構(gòu)建哺乳動(dòng)物高效篩選表達(dá)載體，是哺乳動(dòng)物細(xì)胞株生產(chǎn)制藥的重要研宄內(nèi) 容。
[0003] 為了獲得高效表達(dá)的細(xì)胞株，需要用攜帶篩選基因和目的基因的載體，轉(zhuǎn)染 哺乳動(dòng)物細(xì)胞，并使載體隨機(jī)整合到細(xì)胞基因組中，通過(guò)加壓篩選，獲得穩(wěn)定表達(dá)的 細(xì)胞株。真核細(xì)胞的篩選基因主要包括兩類：一類是新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（neomycin phosphotransferase, ΝΕΟ)等非擴(kuò)增基因，它不影響目的基因的拷貝數(shù)；另一類是共擴(kuò) 增基因，如二氫葉酸還原酶（Dihydrcofolate reductase，DHFR)基因、谷氨酰胺合成酶 (Glutamine synthetase，GS)基因等。G418是一種氨基糖苷類抗生素，通過(guò)影響核糖體的 功能阻斷蛋白質(zhì)的合成，當(dāng)NEO基因整合到基因組后，NEO基因編碼的抗性產(chǎn)物新霉素磷酸 轉(zhuǎn)移酶，可以將G418轉(zhuǎn)變成無(wú)毒形式，從而使細(xì)胞在含G418的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。葉酸類似 物氨甲噪呤（Methotrexate，MTX)能抑制二氫葉酸還原酶DHFR活性，導(dǎo)致無(wú)法合成四氫葉 酸，將攜帶目的基因和DHFR基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DHFR缺乏的細(xì)胞，在MTX選擇壓力下，幸存下 來(lái)的細(xì)胞的DHFR基因得以擴(kuò)增，帶動(dòng)目的基因的擴(kuò)增[Looney JE，Hamlin JL. Mol cell Biol，1987 ;7(2) :569-577]。然而，在選擇壓力下，DHFR臨近基因的擴(kuò)增大小和范圍是處于 變化中的，擴(kuò)增不穩(wěn)定。谷氨酰胺合成酶擴(kuò)增系統(tǒng)是新近發(fā)展起來(lái)的，當(dāng)細(xì)胞在缺乏谷氨酰 胺、加入谷氨酰胺合成酶抑制物（Methionine sulphoximine，MSX)的條件下培養(yǎng)，GS基因 不僅自身進(jìn)行自我復(fù)制，還能夠帶動(dòng)外源基因隨著GS基因的復(fù)制而復(fù)制，達(dá)到目的基因的 高水平表達(dá)[Bebbington CR，Renner G，Thomson S，et al，Biotechnology，1992 ; 10(2): 169-175]，谷氨酰胺合成酶擴(kuò)增系統(tǒng)具有更高的擴(kuò)增效率，但是篩選到的細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)不 佳。
[0004] 對(duì)篩選標(biāo)記進(jìn)行弱化后，若篩選標(biāo)記整合到細(xì)胞低表達(dá)整合位點(diǎn)，則標(biāo)記基因自 我擴(kuò)增（復(fù)制）拷貝數(shù)較低，而細(xì)胞株由于低表達(dá)量不足以應(yīng)付較高的壓力，從而在篩選 過(guò)程中死亡。只有少量篩選標(biāo)記整合到轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)的細(xì)胞，因篩選標(biāo)記的高倍數(shù)擴(kuò)增而在 較高的壓力下存活下來(lái)。由于雙表達(dá)載體的目的基因緊鄰篩選標(biāo)記，篩選標(biāo)記與目的基因 會(huì)整合到染色體同一位點(diǎn)，如果他們同在轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)，從而增加了目的基因的拷貝數(shù)，提高 了表達(dá)水平。常用的弱化篩選基因的方法包括：對(duì)篩選基因進(jìn)行突變，削弱其表達(dá)功能；改 造起始密碼子臨近序列，弱化基因表達(dá)以及弱化啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。據(jù)報(bào)道，刪除SV40啟動(dòng)子 中的一個(gè)72bp重復(fù)序列，或刪除一個(gè)72bp重復(fù)序列，并在剩余的72bp重復(fù)序列的第5-7 位引入TGG-GTT突變，使得SV40啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性降低為野生型的1/1000或1/36 [Zenke M, GrundstromT1Matthes H, et al. ΕΜΒ0, 1986, 5:387-397] 〇
[0005] 構(gòu)建一個(gè)或多個(gè)基因的高表達(dá)載體，通常是將較強(qiáng)的順式作用元件集中到一個(gè)載 體中啟動(dòng)外源基因表達(dá)，以提高重組蛋白的產(chǎn)量。真核細(xì)胞的啟動(dòng)子，主要有猴空泡病毒 SV40 (Simian vacuolating virus 40，SV40)、人巨細(xì)胞病毒 CMV (cytomegalovirus，CMV)、 人延伸因子EF-Ια (elongation factors 1α，EF-Ια，Ια是延生因子的亞基編號(hào)）啟 動(dòng)子，前者主要用于選擇基因的表達(dá)，后面兩個(gè)可以高效的表達(dá)重組蛋白。EF-Ια啟動(dòng) 子是目前最強(qiáng)的啟動(dòng)子之一，在細(xì)胞的不同時(shí)期表達(dá)都很高[Sunghoi Hong, Dong-Youn Hwangl，Soonsang Yoon，et al, Molecular Therapy, 2007; 15 (9) ,1630 - 1639]。巨細(xì)胞病 毒CMV(cytomegalovirus，CMV)啟動(dòng)子（pCMV)即早期啟動(dòng)子，僅在S期（細(xì)胞周期中的DNA 合成期）激活，應(yīng)用這類啟動(dòng)子表達(dá)外源蛋白需要宿主細(xì)胞不停增殖，這不利于連續(xù)持久 大規(guī)模培養(yǎng)宿主細(xì)胞。而人延伸因子1 α亞基啟動(dòng)子（pEF-1 α )不受細(xì)胞周期限制，且啟 動(dòng)子強(qiáng)度高于PCMV，有利于大規(guī)模外源蛋白的生產(chǎn)[來(lái)大志，翁少潔，于長(zhǎng)明，等，生物化學(xué) 與生物物理進(jìn)展，2004 ;31 (2) :118-126]。因此本發(fā)明表達(dá)載體中目的基因采用了 EF-Ia 強(qiáng)啟動(dòng)子，以期得到較高外源蛋白的表達(dá)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中陽(yáng)性克隆率低、篩選周期長(zhǎng)、目的蛋白表達(dá)量 低等不足之處，提供了哺乳動(dòng)物雙基因高效篩選表達(dá)載體及其構(gòu)建方法。由于許多哺乳動(dòng) 物細(xì)胞有內(nèi)源的DHFR和GS基因，如果只用單一的DHFR或GS系統(tǒng)來(lái)篩選，篩選過(guò)程中高表 達(dá)細(xì)胞的陽(yáng)性率較低，篩選基因的聯(lián)合使用，可以使篩選時(shí)細(xì)胞的陽(yáng)性率增高。由于GS和 DHFR都是共擴(kuò)增基因，如果利用GS-DHFR共同或者分別加壓篩選，可以結(jié)合DHFR和GS系 統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)并克服二者的缺點(diǎn)，雙篩選標(biāo)記的同時(shí)應(yīng)用使目的基因擴(kuò)增的拷貝數(shù)更高，大大 提高目的基因的表達(dá)量，可以構(gòu)建更高效的表達(dá)載體。同時(shí)，由于哺乳動(dòng)物細(xì)胞不含內(nèi)源的 NEO抗性基因，如果聯(lián)合GS、NEO基因構(gòu)建雙表達(dá)系統(tǒng)的載體共同作用細(xì)胞，可以有效利用 GS的擴(kuò)增功能和NEO的篩選系統(tǒng)的特點(diǎn)，快速獲得高效表達(dá)的細(xì)胞株。本發(fā)明構(gòu)建了兩種 攜帶不同篩選基因的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體PGD和pGN。這兩種載體的所有篩選基因都采 用了弱化的SV40的啟動(dòng)子，所有外源基因都用了強(qiáng)的外源基因啟動(dòng)子pEFl a，兩種載體都 采用了兩種篩選標(biāo)記（p⑶使用了 GS和DHFR雙篩選標(biāo)記，而pGN則使用了 GS和NEO雙篩 選標(biāo)記），這兩種高表達(dá)質(zhì)?？梢葬槍?duì)不同要求而使用。上述兩種載體的使用可以使得外源 基因的表達(dá)量更高，也易于篩選到高表達(dá)的細(xì)胞克隆并縮短了篩選時(shí)間。因此使用所述載 體篩選高表達(dá)單克隆細(xì)胞，具有速度快、陽(yáng)性克隆率高、目的蛋白表達(dá)量高等特點(diǎn)。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下：
[0008] 哺乳動(dòng)物雙基因高效篩選表達(dá)載體包含載體P⑶和載體PGN ;所述載體P⑶和所 述載體PGN均包含雙篩選基因，所述載體pGD的雙篩選基因包括谷氨酰胺合成酶GS基因和 二氫葉酸還原酶DHFR基因；所述載體pGN的雙篩選基因包括谷氨酰胺合成酶GS篩選基因 和新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶NEO基因；所述雙篩選基因的啟動(dòng)子均進(jìn)行了弱化；所述雙篩選基因 的目的基因表達(dá)框均含有強(qiáng)啟動(dòng)子。
[0009] 優(yōu)選地，所述雙篩選基因啟動(dòng)子的弱化采用缺失突變SV40啟動(dòng)子的方法。
[0010] 更加優(yōu)選地，所述篩選標(biāo)記包含弱化的SV40啟動(dòng)子控制的GS基因、DHFR基因或 NEO基因。
[0011] 更加優(yōu)選地，所述強(qiáng)啟動(dòng)子用于啟動(dòng)外源基因的表達(dá)，所述強(qiáng)啟動(dòng)子采用PEF-I α 強(qiáng)啟動(dòng)子。
[0012] 更加優(yōu)選地，所述目的基因表達(dá)框依次含有EF-Ια強(qiáng)啟動(dòng)子、目的基因以及 polyA多聚腺苷酸尾巴序列。
[0013] 更加優(yōu)選地，所述哺乳動(dòng)物雙基因高效篩選表