抗體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供抗體，所述抗體結合人CC趨化因子受體4(CCR4)的胞外域的表位并能夠抑制巨噬細胞來源的趨化因子(MDC)和/或胸腺和激活調節(jié)的趨化因子(TARC)與CCR4的結合。本發(fā)明還提供特別是在醫(yī)藥和診斷領域中，包含這樣抗體的免疫交聯(lián)物和組合物以及包括這樣抗體的方法和應用。
【專利說明】抗體
[0001] 本申請是申請日為2010年6月9日、中國專利申請?zhí)?01080035456. 1、發(fā)明名稱 為"抗體"的發(fā)明專利申請的分案申請。

【技術領域】
[0002] 本發(fā)明一般涉及抗體、CCR4生物學和相關的治療領域。更具體地，本發(fā)明提供了 與CCR4結合的抗體。這樣的抗CCR4抗體具有診斷和治療與CCR4相關的疾病和狀況的應 用，如腫瘤血管成像、治療癌癥及治療病毒和其它感染、和炎癥及免疫疾病。本發(fā)明的基于 抗體的組合物和方法同樣延伸至免疫交聯(lián)物和其它治療組合物、試劑盒和方法的應用。

【背景技術】
[0003] G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR)有800多個成員，代表了涉及信號傳輸?shù)募毎砻娣肿拥?最大家族，占>2%的人類基因組編碼的全部基因。GPCR超家族的成員具有一種共同的膜拓 撲結構：細胞外的N末端、細胞內的C末端和七次跨膜（TM)螺旋，其通過三個細胞內的環(huán)和 三個細胞外的環(huán)連接?；谒鼈児餐耐負浣Y構，GPCR也被認為是七次跨膜（7TM)受體。 這些受體控制關鍵的生理機能，包括神經傳遞、從內分泌腺和外分泌腺釋放激素和酶、免疫 反應、心肌和平滑肌收縮及血壓調節(jié)。它們的功能紊亂與一些最流行的人類疾病有關。呈 現(xiàn)的實驗數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)顯示：GPCR在癌癥的進程和轉移中具有至關重要的作用。因此， 有一種可能：一些GPCR可能是抗癌藥物的合適目標。
[0004] 趨化因子在多種疾病和失調的免疫和炎癥應答中起重要作用，所述疾病和失調包 括癌癥、病毒感染、哮喘和過敏性疾病以及自身免疫病狀如風濕性關節(jié)炎和動脈硬化。這些 小的、分泌的分子是逐漸增長的8-14kDa蛋白超家族，其特征是保守的四個半胱氨酸基序。
[0005] 研究已經證明：趨化因子的作用通過G蛋白偶聯(lián)受體的亞家族介導，其中的受體 是被指定為趨化因子（C-C基序）受體4或CC趨化因子受體4(CCR4)的受體。CCR4的具 體配體包括趨化因子胸腺和激活調節(jié)的趨化因子（TARC)(也被認為是CCL17)和源于巨噬 細胞的趨化因子（MDC)(也被認為是CCL22)。CCR4也可以與RANTES、MCP-I和MIP-I α結 合，且已經報導了響應這些配體的CCR4信號轉導。
[0006] 已經認為CCR4在T細胞趨化作用和吞噬細胞遷移至炎癥位點中是重要的。優(yōu)選 地，CCR4在輔助性T細胞2型（Th2)細胞和調節(jié)性T(Treg)細胞上表達；然而在其它健康 細胞或組織上僅發(fā)生有限量的表達。
[0007] 腫瘤細胞，特別是成人T細胞白血病/淋巴瘤細胞，可能為CCR4陽性。腫瘤細胞表 達CCR4與皮膚相關聯(lián)。一些T細胞惡性腫瘤典型地定位在皮膚上。例如，在皮膚T細胞淋巴 瘤病變中發(fā)現(xiàn)高水平的〇^4。最近，已經發(fā)現(xiàn)一些實體瘤同樣表達0^4(102009/037454)。 CCR4的表達被認為是實體瘤，特別是宮頸癌、食道癌、腎癌、腦癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、 胃癌和胰腺癌癌變的早期事件。因此，血液癌細胞和非血液癌細胞都可以表達CCR4。因此， 可以使用抗CCR4抗體診斷、監(jiān)測和治療這些癌癥。
[0008] 此外，CCR4在常規(guī)免疫和腫瘤免疫中具有重要作用。重要部分的⑶4+⑶25+調節(jié) 性T細胞（Treg)為CCR4陽性（Baatar等，2007b)。這些Treg通過多種機制抑制免疫反 應，并且已經顯示它們可以抑制腫瘤特異的免疫性。在多種癌癥中，浸潤基質、腫瘤本身或 引流淋巴結的Treg的數(shù)量增加與惡化的結果相關。在小鼠模型中的研究表明：降低Treg 活性導致內源抗腫瘤免疫性增加以及通過免疫系統(tǒng)的抗腫瘤發(fā)明的功效增強。因此，抑制 Treg功能在腫瘤的免疫療法中是有前景的方案。所述抑制可以通過殺死Treg (耗盡）、干 擾它們的抑制劑作用、改變它們的通訊模式或改變它們的分化而實現(xiàn)。
[0009] 在一組患有CCR4+T細胞白血病/淋巴瘤的患者中，所述腫瘤細胞本身作為Treg 細胞，使腫瘤在面對宿主抗腫瘤免疫反應時能夠存活。在其它類型的癌癥中，MDC和TARC 由腫瘤細胞和腫瘤微環(huán)境產生，并將CCR4+Treg細胞吸引至腫瘤，在這里它們創(chuàng)造了使腫 瘤從宿主免疫反應中逃脫的有利環(huán)境。已經報導了在患有以下癌癥的病患的外周血中具 有更高頻率的Treg :乳癌、結腸直腸癌、食管癌、胃癌、肝細胞癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌和 胰腺癌。已經報導Treg細胞為腫瘤創(chuàng)造了一種有利的環(huán)境。因此，阻止CCR4和它的配體 (如MDC)之間交互作用對治療或預防癌癥、特別是上面列出的癌癥是有用的。已經報導：在 SCID小鼠模型中，抗人MDC/CCL22抗體能夠阻止人Treg細胞滲透至移植的人卵巢腫瘤中。 據(jù)認為，存在于人實體瘤中的Treg細胞防止免疫效應物反應發(fā)展，其可能對減慢腫瘤生長 和轉移有作用。因此，通過使用抗CCR4的中和MAb (單克隆抗體）殺死腫瘤塊中的Treg細 胞和/或防止Treg細胞轉移至腫瘤位點可以導致針對實體瘤的增強的免疫反應，并作為慣 例的細胞毒素療法或抗激素療法的輔助。
[0010] 癌癥引起大約13%的人類死亡。根據(jù)美國癌癥協(xié)會的資料，在2007年，全世界有 七百六十萬人死于癌癥，因此仍然強烈和迫切地需要更多的抗腫瘤療法。
[0011] CCR4已經顯示在炎癥和免疫失調中起作用。Th2細胞和嗜堿細胞是在肺和皮膚的 過敏性反應中的關鍵細胞。已經有許多報導描述了表達CCR4的T細胞的存在以及伴隨著 CCR4配體（MDC、TARC)在過敏原激發(fā)的哮喘的支氣管活組織切片中的氣道上皮細胞上的表 達（Panina-Bordignon等，2001)。同樣在患有遺傳過敏性皮炎的病患中發(fā)現(xiàn)數(shù)量增加的 CCR4+T細胞，當疾病轉好時，發(fā)現(xiàn)CCR4+T細胞顯著減少。使用人源化的哮喘SCID小鼠模型， 結果顯示：在過敏原刺激之前用抗體封閉CCR4減少了過敏性氣道炎癥以及肺中的Th2細胞 因子水平。對于哮喘病患，通過肺遞送封閉抗體耗盡CCR4+T細胞可能是合適的治療選擇。 對于遺傳過敏性皮炎，將CCR4封閉抗體靶定遞送至皮膚可能也是一種有吸引力的治療。
[0012] 在過敏性哮喘中，高水平的過敏原特異的IgE的存在反映了對普通吸入的環(huán)境過 敏原的異常的Th2細胞免疫反應。哮喘的特點是Th2淋巴細胞和嗜酸性粒細胞的浸潤以及 Th2趨化因子的產生。過敏原通過樹突細胞（DC)出現(xiàn)在T細胞上，所述樹突細胞持續(xù)地采取 進入的外來抗原。基于通過DC的合適的活化作用，存在于患病氣道中的過敏原特異的淋巴 細胞生產1112細胞因子白介素（11^)-4、11^-5和11^-13，它們進一步地控制白細胞溢出、杯狀 細胞增生和支氣管過度反應性（BHR)。由DC產生的TARC和MDC通過引發(fā)CCR4誘導了 Th2 細胞而非Thl細胞的選擇性轉移（Perros等，2009)。在哮喘的鼠科動物模型中已經顯示： 在過敏原刺激之后，使用抗TARC抗體的治療減少了支氣管肺泡灌洗（BAL)流體中CD4+T細 胞和嗜酸性粒細胞的數(shù)量、Th2細胞因子的產生和氣道過度反應（Kawasaki等，2001)。相 反，缺乏CCR4的小鼠顯示了對氣道炎癥和BHR沒有保護作用（Chvatchko等，2000)。使用 哮喘的人源化SCID小鼠模型顯示：在過敏原刺激之前用抗體封閉CCR4減少了過敏性氣道 炎癥并肺中降低了 Th2細胞因子水平（Perros等，2009)。這些數(shù)據(jù)顯示封閉CCR4對于抑 制人類中的過敏性炎癥是一種可行的策略。
[0013] Treg細胞可以抑制樹突細胞（DC)，因此推動了疾病（特別是傳染病和癌癥）的發(fā) 展和進程。能夠阻止Treg細胞對樹突細胞的抑制的抗CCR4抗體可能因此用作疫苗中的佐 齊[J，特別是作為腫瘤接種疫苗或抗傳染病的疫苗中的佐劑。因此，抗CCR4抗體可以提高疫 苗的治療效果，特別是提高疫苗誘導的免疫反應。
[0014] 結合CCR4的化合物已經被報導在鼠科過敏性炎癥中顯示出功效（Purandare等， 2007 ;Burdi等，2007)。已經有報導稱CCR4結合化合物在體內具有合理的潛能，因為TARC 誘導的CCR4依賴的白細胞補充物募集到腹膜被抑制了差不多90%。Yokoyama和其同事 提供了一種靶定CCR4的喹唑啉衍生物，其被證明在體內對減少小鼠模型的超敏反應有作 用（Yokoyama等，2008b);該化合物的一種衍生物被證明是基于經口給藥在相似的體內小 鼠模型中有作用（Yokoyama等，2009)。最近，一組科學家使用電腦模擬（in silico)建模 方法已經鑒定了一些CCR4拮抗劑（Bayry等，2008 ;Davies等，2009)。通過將化合物引入 (docking)至建模的CCR4中，作者發(fā)現(xiàn)分子能夠在跨膜區(qū)域內結合。16種化合物抑制了 CCR4介導的CCRF-CEM細胞的轉移。當在體內用結核分支桿菌和乙肝疫苗檢測CCR4拮抗劑 的佐劑功能時，觀察到細胞和體液的免疫反應都提高的免疫原性。該觀察到的效果歸因于 Treg活性的抑制（Bayry等，2008 ;Davies等，2009)。本領域熟知：Treg細胞的一種明顯部 分為CCR4陽性（Baatar等，2007b)。據(jù)認為，所述觀察到的效果不僅對抗傳染性疾?。ㄈ?， 由病毒、細菌、分支桿菌或如原生動物的寄生蟲引起）的疫苗有用，對癌癥疫苗也有作用。
[0015] 由于這些化合物作為佐劑功效的原因是基于通過阻止CCR4介導的信號轉導抑制 Treg，期望以拮抗劑方式結合CCR4的抗體可以以相同的方式起作用；比作小分子藥物的抗 體的藥理學優(yōu)勢是本領域已知的。據(jù)我們所知，唯一一個目前在開發(fā)的抗CCR4抗體是由 Kyowa-Hakko進行的KW-0761。但是該抗體僅對ADCC有效；它不阻止經由CCR4受體的配 體介導的信號轉導。因此，期望本發(fā)明描述的抗體在通過Treg調節(jié)免疫反應方面有明顯優(yōu) 勢。
[0016] 調節(jié)Treg對臨床有用的另一種應用是癌癥治療。Treg可以抑制腫瘤特異的免疫 性，并且在一些癌癥中它們的數(shù)量增加與不利的預后和疾病進程相關。在小鼠模型中的研 究證明降低Treg活性推進了內源抗腫瘤免疫性并增加了積極免疫干涉的功效。因此，抑制 Treg作用是在人類癌癥免疫療法中值得考慮的一種策略（Curiel，2008 ;Ruter等，2009)。 該抑制作用可以通過調節(jié)Treg或通過直接殺死它們而實現(xiàn)。
[0017] 該方法的例子在本領域中通過祀定Treg其它表面（如⑶25)的化合物而描述。 Daclizumab(Zenapax?; Roche))和巴利昔單抗（Simxxlect?; Novartis)是被批準用于自身 免疫疾病、移植和癌癥（包括HTLV-I誘導的成人T細胞淋巴瘤/白血?。┑目谷薈D25抗 體（Church，2003)。Denileukin diftitox(Ontak?, DAB389IL-2 ;Ligand Pharmaceuticals Inc.)是一種將白喉毒素的活性區(qū)域與人IL-2融合的重組蛋白。在1998年，F(xiàn)DA已經 批準將它用于治療皮膚T細胞白血病/淋巴瘤（Olsen等，2001)，其通常是⑶4+⑶25+。 Denileukin diftitox革巴定IL-2受體并被提議是通過內吞作用經由CD25而被內在化。同 樣有證據(jù)表明Denileukin diftitox提高了腫瘤疫苗在患有腎細胞癌的病患中的免疫原 性（Dannull等，2005)。此外，最近的報導顯示：denileukin diftitox減少了黑色素瘤中 Treg的數(shù)量和作用，具有改進的黑色素瘤特異的免疫性（Mahnke等，2007)。
[0018] Treg上的用于靶定治療癌癥或提高癌癥疫苗效果的其它分子包括GITR(糖皮 質激素誘導的腫瘤壞死因子受體相關的基因）（Levings等，2002) ;Toll樣受體（TLR)在 多種哺乳動物細胞上隨處表達，包括人Treg(Yang等，2004 ;Rutter等，2009)和細胞毒 性T淋巴細胞抗原-4(CTLA-4 ;CD152) (Sutmuller等，2001)。目前，抗CTLA-4單克隆抗 體療法的II期和III期臨床試驗在黑色素瘤中進行，I期和II期試驗在其它腫瘤類型 中進行。兩種人類抗體 -易普利姆瑪（MDX-〇10;Bristol_Myers Squibb/Medarex)和 tremelimumab(CP-675, 206 ;Pfizer)_ 正在研究中。
[0019] 在下面的紊亂中同樣已經涉及了 CCR4 :成人T細胞白血病/淋巴瘤、外周T細胞 淋巴瘤、皮膚T細胞淋巴瘤（CTCL)、非特異彌漫性大B細胞性淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、B細 胞慢性淋巴細胞白血病、愛潑斯坦-巴爾病毒（EBV)感染、蕈狀真菌?。ㄒ环N成熟的T細胞 淋巴瘤）、塞扎里綜合征（蕈狀真菌病的一種變異）、過敏性支氣管肺曲霉?。éˇⅵ宝?、哮喘、 LPS-誘導的內毒素休克、過敏性炎癥、T細胞調節(jié)的神經變性疾病如多發(fā)性硬化（MS)、自身 免疫疾病如牛皮癬、卡斯托曼病和風濕性關節(jié)炎（RA)。
[0020] 由于它們復雜的結構，GPCR被認為對于開發(fā)特異抗體是"艱難的目標"。它們既不 能容易地從溶解細胞的膜片段中純化，也不能在不同的表達系統(tǒng)中作為正確折疊的可溶性 蛋白重組產生。根據(jù)發(fā)明人的知識，迄今為止，使用噬菌體展示以產生抗GPCR抗體的其它 人所有已知的嘗試都已經被證明是不成功的。
[0021] 與產生抗GPCR抗體相關的難點已經在Hoogenboom等，1999中列出。此外，Sui等 (2003)解釋了與嘗試獲得抗GPCR趨化因子受體CXCR4人抗體相關的難點，并報導了即使使 用結合有逐步后退選擇的開創(chuàng)方法，也不能鑒定特異抗體。因此，在GPCR領域，生產特異抗 體仍然是一個主要問題。
[0022] 被稱為IGl的鼠單克隆抗體可以從BD Pharmingen中購得，所述IGl與人CCR4反 應。該抗體可以用于免疫熒光染色，但該抗體不是中和抗體。
[0023] Ishida等，2006公開了一種被指定為KM2760的抗CCR4的嵌合抗體。作者們報導 了該抗體不阻止CCR4和它的配體MDC或TARC結合。
[0024] 本發(fā)明人意識到，鑒定識別CCR4的額外的抗體有益于擴大治療選擇的數(shù)量。特別 是，阻止CCR4與一種或多種它的配體結合的抗體可以提供更多的治療方法。
[0025] 本發(fā)明人還意識到，發(fā)展從免疫學角度更能承受的用于人類治療的治療劑是有利 的。就這點而言，人抗體通常具有至少三個用于人類治療應用的潛在優(yōu)勢。第一，所述人免 疫系統(tǒng)不會識別該抗體為外來物。第二，在人循環(huán)中的半衰期將與自然存在的人類抗體相 似，使得可以給予較少和較小頻率的劑量。第三，由于效應器部分是人，它將與人免疫系統(tǒng) 的其它部分互相作用地更好。
[0026] 因此，本領域仍然缺少可以在安全和有效治療具有涉及CCR4的素亂的病患中應 用，包括長期施用的抗CCR4抗體，并且提出開發(fā)這樣抗體的挑戰(zhàn)。
[0027] 具體地，需要抗CCR4的人抗體。盡管人抗體通常被認為是展示優(yōu)勢，但是本領域 已知：開發(fā)具有高的足夠的親和力和適當功能性質以使它們成功用于人類治療的候選物絕 不是簡單的。由于GPCR的復雜性和跨膜性質，與GPCR相關的例子更是如此。
[0028] 仍然強烈地需要可以阻止CCR4和一種或多種它的配體（如MDC和/或TARC)結 合的抗CCR4抗體。


【發(fā)明內容】

[0029] 本發(fā)明克服現(xiàn)有技術的一些局限，提供用于安全或有效治療腫瘤、病毒感染和涉 及CCR4+細胞的其它疾病和狀況（如炎癥或免疫紊亂）的新的治療組合物和方法。本發(fā)明 基于結合CCR4的抗體，更具體地結合CCR4的胞外域內的表位的抗體，更具體地是人抗體。 這樣的抗體有效治療腫瘤和病毒感染和涉及CCR4+細胞的其它疾病和狀況，如炎癥或免疫 紊亂。本發(fā)明的組合物和方法同樣擴展至使用該具體種類抗體的免疫交聯(lián)物和組合物的應 用。
[0030] 本發(fā)明的一種具體的優(yōu)勢是提供的抗體能夠抑制MDC和/或TARC與CCR4結合。 這與臨床領域的主要抗體形成對比，這些主要抗體不抑制MDC和/或TARC與CCR4結合。
[0031] 本申請發(fā)明人已經制備了結合CCR4的CCR4特異抗體。例如，結合CCR4+細胞的 抗體，具體地，所述CCR4+細胞是轉染CCR4的HEK293T細胞、轉染CCR4的DT40細胞和天然 表達CCR4的CCRF-CEM細胞（見實施例2)。重要地，所述抗體不明顯地結合CCR4-細胞，即 不表達CCR4的細胞。因此，本發(fā)明公開的抗體特異地結合CCR4,使它們成為診斷和治療本 文討論的狀況的合適候選物。
[0032] 與CCR4的胞外域中的表位、包括互補決定區(qū)（CDR)的它們的VH和VL域結合的本 發(fā)明的優(yōu)選抗體分子的氨基酸和/或DNA序列在本文列出的多個SEQ ID NO.中展示。
[0033] 因此，本發(fā)明提供一種與CCR4結合并能夠抑制MDC與CCR4結合的抗體。
[0034] 優(yōu)選地，所述抗體是分離抗體。同樣優(yōu)選地，所述抗體是人抗體。優(yōu)選地，所述抗 體結合CCR4的胞外域中的表位。所述CCR4優(yōu)選是人CCR4。因此，任何涉及"結合CCR4" 包括"結合CCR4的胞外域中的表位"的優(yōu)選實施方式。
[0035] 因此，本發(fā)明優(yōu)選地提供一種分離的人抗體，所述人抗體結合人CCR4的胞外域中 的表位并能夠抑制MDC與CCR4結合。
[0036] 在一種實施方式中，本發(fā)明提供一種與CCR4結合并能夠抑制MDC與CCR4結合的 抗體，所述抗體包括重鏈CDRl域，所述重鏈CDRl域包含SEQ ID NO: 1、7、19、101、125、126、 135或136的氨基酸序列或與這些序列中任何一條基本同源的序列，其中特別優(yōu)選的是SEQ ID N0:101、125、126、135 和 136。
[0037] 可選地或另外地，在本發(fā)明的一種實施方式中，與CCR4結合并能夠抑制MDC與 CCR4結合的抗體包括重鏈CDR2域，所述重鏈CDR2域包含SEQ ID N0:2、8、20、127或128 的氨基酸序列或與這些序列中任何一條基本同源的序列，其中特別優(yōu)選的是SEQ ID N0:8、 127 和 128。
[0038] 可選地或另外地，在本發(fā)明的一種實施方式中，與CCR4結合并能夠抑制MDC與 CCR4結合的抗體包括重鏈CDR3域，所述重鏈CDR3域包含SEQ ID N0:3、9、15或21的氨基 酸序列或與這些序列中任何一條基本同源的序列，其中特別優(yōu)選的是SEQ ID N0:9。
[0039] 可選地或另外地，在本發(fā)明的一種實施方式中，與CCR4結合并能夠抑制MDC與 CCR4結合的抗體包括輕鏈CDRl域，所述輕鏈CDRl域包含SEQ ID NO: 4、10、16、22、108、129 或130的氨基酸序列或與這些序列中任何一條基本同源的序列，其中特別優(yōu)選的是SEQ ID N0:10、129 或 130。
[0040] 可選地或另外地，在本發(fā)明的一種實施方式中，與CCR4結合并能夠抑制MDC與 CCR4結合的抗體包括輕鏈CDR2域，所述輕鏈CDR2域包含SEQ ID NO: 5、11、17、23、110、131 或132的氨基酸序列或與這些序列中任何一條基本同源的序列，其中特別優(yōu)選的是SEQ ID N0:ll、131和 132。
[0041] 可選地或另外地，在本發(fā)明的一種實施方式中，與CCR4結合并能夠抑制MDC與 CCR4結合的抗體包括輕鏈CDR3域，所述輕鏈CDR3域包含SEQ ID NO:6、12、18、24、112、133、 134、137或138的氨基酸序列或與這些序列中任何一條基本同源的序列，其中特別優(yōu)選的 是 SEQ ID N0:12、133、134、137 和 138。
[0042] SEQ ID NO: 133和134在位點11包含氨基酸Y，但是優(yōu)選地，這些序列中位點11 的氨基酸是V。SEQ ID NO: 137和138對應于SEQ ID NO: 133和134,除了位點11的氨基酸 是V。因此，在本文公開的任何實施方式中，任何提及SEQ ID NO: 133應當被理解為包含提 及SEQ ID NO: 137,任何提及SEQ ID NO: 134應當被理解為包含提及SEQ ID NO: 138。
[0043] 因此，在一些實施方式中，本發(fā)明提供一種與CCR4結合并能夠抑制MDC與CCR4結 合的抗體，所述抗體包括一個或多個重鏈CDR域，其中所述重鏈CDR域選自 ：
[0044] (a)包含SEQ ID NO: 1、7、19、101、125或126的氨基酸序列或與其基本同源的序列 的重鏈⑶Rl域；
[0045] (b)包含SEQ ID N0:2、8、20、127或128的氨基酸序列或與其基本同源的序列的重 鏈CDR2域；
[0046] (c)包含SEQ ID N0:3、9、15或21的氨基酸序列或與其基本同源的序列的重鏈 CDR3 域。
[0047] 在一些實施方式中，本發(fā)明還提供一種與CCR4結合并能夠抑制MDC與CCR4結合 的抗體，所述抗體包括一個或多個輕鏈CDR域，其中所述輕鏈CDR域選自 ：
[0048] (a)包含SEQ ID NO: 4、10、16、22、108、129或130的氨基酸序列或與其基本同源的 序列的輕鏈CDRl域；
[0049] (b)包含SEQ ID NO: 5、11、17、23、110、131或132的氨基酸序列或與其基本同源的 序列的輕鏈CDR2域；
[0050] (c)包含 SEQ ID 勵:6、12、18、24、112、133、134、137或138的氨基酸序列或與其基 本同源的序列的輕鏈CDR3域。
[0051] 在一些優(yōu)選的實施方式中，與CCR4結合并能夠抑制MDC與CCR4結合的抗體包括：
[0052] (a)包含SEQ ID NO: 3的氨基酸序列或與其基本同源的序列的重鏈CDR3域；和（b) 包含SEQ ID N0:6的氨基酸序列或與其基本同源的序列的輕鏈⑶R3域。
[0053] 更優(yōu)選地，也提供：包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列或與其基本同源的序列和/或 SEQ ID NO:4的氨基酸序列或與其基本同源的序列的CDRl域，和/或包含SEQ ID NO:2的 氨基酸序列或與其基本同源的序列和/或SEQ ID NO: 5的氨基酸序列或與其基本同源的序 列的⑶R2域。
[0054] 在一些優(yōu)選的實施方式中，與CCR4結合并能夠抑制MDC與CCR4結合的抗體包括：
[0055] (a)包含SEQ ID N0:9的氨基酸序列或與其基本同源的序列的重鏈CDR3域；和（b) 包含SEQ ID NO: 12的氨基酸序列或與其基本同源的序列的輕鏈⑶R3域。
[0056] 更優(yōu)選地，也存在：包含SEQ ID NO: 7的氨基酸序列或與其基本同源的序列和/或 SEQ ID NO: 10的氨基酸序列或與其基本同源的序列，和/或SEQ ID NO: 101的氨基酸序列 或與其基本同源的序列的CDRl域，和/或包含SEQ ID N0:8的氨基酸序列或與其基本同源 的序列和/或SEQ ID NO: 11的氨基酸序列或與其基本同源的序列的CDR2域。
[0057] 在一些優(yōu)選的實施方式中，與CCR4結合并能夠抑制MDC與CCR4結合的抗體包括：
[0058] (a)包含SEQ ID NO: 15的氨基酸序列或與其基本同源的序列的重鏈⑶R3域；和 (b)包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列或與其基本同源的序列的輕鏈⑶R3域。
[0059] 更優(yōu)選地，也存在：包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列或與其基本同源的序列和/或 SEQ ID NO: 16的氨基酸序列或與其基本同源的序列的CDRl域，和/或包含SEQ ID NO: 2的 氨基酸序列或與其基本同源的序列和/或SEQ ID NO: 17的氨基酸序列或與其基本同源的 序列的⑶R2域。
[0060] 在一些優(yōu)選的實施方式中，與CCR4結合并能夠抑制MDC與CCR4結合的抗體包括：
[0061] (a)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列或與其基本同源的序列的重鏈⑶R3域；和 (b)包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列或與其基本同源的序列的輕鏈⑶R3域。
[0062] 更優(yōu)選地，也存在：包含SEQ ID NO: 19的氨基酸序列或與其基本同源的序列和/ 或SEQ ID NO: 22的氨基酸序列或與其基本同源的序列的CDRl域，和/或包含SEQ ID NO: 20 的氨基酸序列或與其基本同源的序列和/或SEQ ID NO:23的氨基酸序列或與其基本同源 的序列的⑶R2域。
[0063] 在一些優(yōu)選的實施方式中，與CCR4結合并能夠抑制MDC與CCR4結合的抗體包括：
[0064] (a)包含SEQ ID N0:9的氨基酸序列或與其基本同源的序列的重鏈CDR3域；和（b) 包含SEQ ID NO: 112的氨基酸序列或與其基本同源的序列的輕鏈⑶R3域。
[0065] 更優(yōu)選地，也存在：包含SEQ ID NO: 7的氨基酸序列或與其基本同源的序列和/或 SEQ ID NO: 108的氨基酸序列或與其基本同源的序列的CDRl域，和/或包含SEQ ID N0:8 的氨基酸序列或與其基本同源的序列和/或SEQ ID NO: 110的氨基酸序列或與其基本同源 的序列的⑶R2域。
[0066] 在一些優(yōu)選的實施方式中，與CCR4結合并能夠抑制MDC與CCR4結合的抗體包括：
[0067] (a)包含SEQ ID N0:9的氨基酸序列或與其基本同源的序列的重鏈CDR3域；和（b) 包含SEQ ID NO: 133、134、137或138的氨基酸序列或與其基本同源的序列的輕鏈CDR3域。
[0068] 更優(yōu)選地，也存在：包含SEQ ID NO: 125或126的氨基酸序列或與其基本同源的 序列和/或SEQ ID NO: 129或130的氨基酸序列或與其基本同源的序列的CDRl域，和/或 包含SEQ ID NO: 127或128的氨基酸序列或與其基本同源的序列和/或SEQ ID NO: 131或 132的氨基酸序列或與其基本同源的序列的CDR2域。
[0069] 在一種優(yōu)選的實施方式中，單獨或組合地提供：包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列或 與其基本同源的序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID N0:2的氨基酸序列或與其基本同源的序列 的重鏈⑶R2和包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或與其基本同源的序列的重鏈⑶R3。
[0070] 在另一種優(yōu)選的實施方式中，單獨或組合地提供：包含SEQ ID N0:4的氨基酸序列 或與其基本同源的序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID N0:5的氨基酸序列或與其基本同源的序 列的輕鏈⑶R2和包含SEQ ID N0:6的氨基酸序列或與其基本同源的序列的輕鏈⑶R3。
[0071] 在一種優(yōu)選的實施方式中，單獨或組合地提供：包含SEQ ID NO: 7的氨基酸序列或 與其基本同源的序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID N0:8的氨基酸序列或與其基本同源的序列 的重鏈⑶R2和包含SEQ ID N0:9的氨基酸序列或與其基本同源的序列的重鏈⑶R3。
[0072] 在一種優(yōu)選的實施方式中，單獨或組合地提供：包含SEQ ID NO: 101的氨基酸序列 或與其基本同源的序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID N0:8的氨基酸序列或與其基本同源的序 列的重鏈⑶R2和包含SEQ ID N0:9的氨基酸序列或與其基本同源的序列的重鏈⑶R3。
[0073] 在另一種優(yōu)選的實施方式中，單獨或組合地提供：包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序 列或與其基本同源的序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO: 11的氨基酸序列或與其基本同源的 序列的輕鏈⑶R2和包含SEQ ID NO: 12的氨基酸序列或與其基本同源的序列的輕鏈⑶R3。
[0074] 在另一種優(yōu)選的實施方式中，單獨或組合地提供：包含SEQ ID NO: 108的氨基酸 序列或與其基本同源的序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO: 110的氨基酸序列或與其基本同 源的序列的輕鏈CDR2和包含SEQ ID NO: 112的氨基酸序列或與其基本同源的序列的輕鏈 CDR3。
[0075] 在一種優(yōu)選的實施方式中，單獨或組合地提供：包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列或 與其基本同源的序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID N0:2的氨基酸序列或與其基本同源的序列 的重鏈⑶R2和包含SEQ ID NO: 15的氨基酸序列或與其基本同源的序列的重鏈⑶R3。
[0076] 在另一種優(yōu)選的實施方式中，單獨或組合地提供：包含SEQ ID NO: 16的氨基酸序 列或與其基本同源的序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO: 17的氨基酸序列或與其基本同源的 序列的輕鏈⑶R2和包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列或與其基本同源的序列的輕鏈⑶R3。
[0077] 在一種優(yōu)選的實施方式中，單獨或組合地提供：包含SEQ ID NO: 19的氨基酸序列 或與其基本同源的序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID N0:20的氨基酸序列或與其基本同源的序 列的重鏈⑶R2和包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列或與其基本同源的序列的重鏈⑶R3。
[0078] 在另一種優(yōu)選的實施方式中，單獨或組合地提供：包含SEQ ID NO:22的氨基酸序 列或與其基本同源的序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID N0:23的氨基酸序列或與其基本同源的 序列的輕鏈⑶R2和包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列或與其基本同源的序列的輕鏈⑶R3。
[0079] 在一種優(yōu)選的實施方式中，單獨或組合地提供：包含SEQ ID NO: 125或126的氨基 酸序列或與其基本同源的序列的重鏈⑶R1、包含SEQ ID NO: 127或128的氨基酸序列或與 其基本同源的序列的重鏈CDR2和包含SEQ ID N0:9的氨基酸序列或與其基本同源的序列 的重鏈CDR3。
[0080] 在另一種優(yōu)選的實施方式中，單獨或組合地提供：包含SEQ ID NO: 129或130的氨 基酸序列或與其基本同源的序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO: 131或132的氨基酸序列或 與其基本同源的序列的輕鏈CDR2和包含SEQ ID NO: 133、134、137或138的氨基酸序列或 與其基本同源的序列的輕鏈CDR3。
[0081] 換一種方式看，在一些實施方式中，本發(fā)明提供一種結合CCR4且能夠抑制MDC結 合CCR4的抗體，所述抗體包括：包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或與其基本同源的序列的 重鏈⑶R3域和/或包含SEQ ID N0:6的氨基酸序列或與其基本同源的序列的輕鏈⑶R3域。
[0082] 所述抗體可選地進一步包括：包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或與其基本同源的 序列的重鏈CDR2域和/或包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列或與其基本同源的序列的輕鏈 ⑶R2域和/或進一步包括：包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列或與其基本同源的序列的重鏈 ⑶Rl域和/或包含SEQ ID N0:4的氨基酸序列或與其基本同源的序列的輕鏈⑶Rl域。
[0083] 在一些實施方式中，本發(fā)明提供一種結合CCR4且能夠抑制MDC結合CCR4的抗體， 所述抗體包括：包含SEQ ID N0:9的氨基酸序列或與其基本同源的序列的重鏈CDR3域和/ 或包含SEQ ID NO: 12的氨基酸序列或與其基本同源的序列的輕鏈⑶R3域。
[0084] 所述抗體可選地進一步包括：包含SEQ ID N0:8的氨基酸序列或與其基本同源的 序列的重鏈CDR2域和/或包含SEQ ID NO: 11的氨基酸序列或與其基本同源的序列的輕鏈 ⑶R2域和/或進一步包括：包含SEQ ID NO: 7的氨基酸序列或與其基本同源的序列的重鏈 ⑶Rl域和/或包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列或與其基本同源的序列的輕鏈⑶Rl域。
[0085] 在一些實施方式中，本發(fā)明提供一種結合CCR4且能夠抑制MDC結合CCR4的抗體， 所述抗體包括：包含SEQ ID N0:9的氨基酸序列或與其基本同源的序列的重鏈CDR3域和/ 或包含SEQ ID NO: 112的氨基酸序列或與其基本同源的序列的輕鏈⑶R3域。
[0086] 所述抗體可選地進一步包括：包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列或與其基本同源的 序列的重鏈CDR2域和/或包含SEQ ID NO: 110的氨基酸序列或與其基本同源的序列的輕 鏈⑶R2域和/或進一步包括：包含SEQ ID NO: 7或101的氨基酸序列或與其基本同源的序 列的重鏈⑶Rl域和/或包含SEQ ID NO: 108的氨基酸序列或與其基本同源的序列的輕鏈 CDRl 域。
[0087] 在一些實施方式中，本發(fā)明提供一種結合CCR4且能夠抑制MDC結合CCR4的抗體， 所述抗體包括：包含SEQ ID NO: 15的氨基酸序列或與其基本同源的序列的重鏈CDR3域和 /或包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列或與其基本同源的序列的輕鏈⑶R3域。
[0088] 所述抗體可選地進一步包括：包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或與其基本同源的 序列的重鏈CDR2域和/或包含SEQ ID NO: 17的氨基酸序列或與其基本同源的序列的輕鏈 ⑶R2域和/或進一步包括：包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列或與其基本同源的序列的重鏈 ⑶Rl域和/或包含SEQ ID NO: 16的氨基酸序列或與其基本同源的序列的輕鏈⑶Rl域。
[0089] 在一些實施方式中，本發(fā)明提供一種結合CCR4且能夠抑制MDC結合CCR4的抗體， 所述抗體包括：包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列或與其基本同源的序列的重鏈CDR3域和 /或包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列或與其基本同源的序列的輕鏈⑶R3域。
[0090] 所述抗體可選地進一步包括：包含SEQ ID NO: 20的氨基酸序列或與其基本同源的 序列的重鏈CDR2域和/或包含SEQ ID NO: 23的氨基酸序列或與其基本同源的序列的輕鏈 ⑶R2域和/或進一步包括：包含SEQ ID NO: 19的氨基酸序列或與其基本同源的序列的重 鏈⑶Rl域和/或包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列或與其基本同源的序列的輕鏈⑶Rl域。
[0091] 在一些實施方式中，本發(fā)明提供一種結合CCR4且能夠抑制MDC結合CCR4的抗體， 所述抗體包括：包含SEQ ID N0:9的氨基酸序列或與其基本同源的序列的重鏈CDR3域和/ 或包含SEQ ID勵:133、134、137或138的氨基酸序列或與其基本同源的序列的輕鏈0?3 域。
[0092] 所述抗體可選地進一步包括：包含SEQ ID NO: 127或128的氨基酸序列或與其基 本同源的序列的重鏈⑶R2域和/或包含SEQ ID NO: 131或132的氨基酸序列或與其基本 同源的序列的輕鏈⑶R2域和/或進一步包括：包含SEQ ID NO: 125或126的氨基酸序列或 與其基本同源的序列的重鏈⑶Rl域和/或包含SEQ ID NO: 129或130的氨基酸序列或與 其基本同源的序列的輕鏈CDRl域。
[0093] 換一種方式看，在一些實施方式中，本發(fā)明提供一種結合CCR4且能夠抑制MDC結 合CCR4的抗體，所述抗體包括：包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或與其基本同源的序列的 重鏈⑶R2域和/或包含SEQ ID N0:5的氨基酸序列或與其基本同源的序列的輕鏈⑶R2域。
[0094] 所述抗體可選地進一步包括：包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或與其基本同源的 序列的重鏈CDR3域和/或包含SEQ ID N0:6的氨基酸序列或與其基本同源的序列的輕鏈 ⑶R3域和/或進一步包括：包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列或與其基本同源的序列的重鏈 ⑶Rl域和/或包含SEQ ID N0:4的氨基酸序列或與其基本同源的序列的輕鏈⑶Rl域。
[0095] 在一些實施方式中，本發(fā)明提供一種結合CCR4且能夠抑制MDC結合CCR4的抗體， 所述抗體包括：包含SEQ ID N0:8、127或128的氨基酸序列或與其基本同源的序列的重鏈 ⑶R2域和/或包含SEQ ID NO: 11、131或132的氨基酸序列或與其基本同源的序列的輕鏈 CDR2 域。
[0096] 所述抗體可選地進一步包括：包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列或與其基本同源的 序列的重鏈CDR3域和/或包含SEQ ID NO: 12、133、134、137或138的氨基酸序列或與其基 本同源的序列的輕鏈⑶R3域和/或進一步包括：包含SEQ ID NO: 7、101、125或126的氨基 酸序列或與其基本同源的序列的重鏈⑶Rl域和/或包含SEQ ID NO: 10、129或130的氨基 酸序列或與其基本同源的序列的輕鏈CDRl域。
[0097] 在一些實施方式中，本發(fā)明提供一種結合CCR4且能夠抑制MDC結合CCR4的抗體， 所述抗體包括：包含SEQ ID N0:8的氨基酸序列或與其基本同源的序列的重鏈CDR2域和/ 或包含SEQ ID NO: 110的氨基酸序列或與其基本同源的序列的輕鏈⑶R2域。
[0098] 所述抗體可選地進一步包括：包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列或與其基本同源的 序列的重鏈CDR3域和/或包含SEQ ID NO: 112的氨基酸序列或與其基本同源的序列的輕鏈 ⑶R3域和/或進一步包括：包含SEQ ID NO: 7的氨基酸序列或與其基本同源的序列的重鏈 ⑶Rl域和/或包含SEQ ID NO: 108的氨基酸序列或與其基本同源的序列的輕鏈⑶Rl域。
[0099] 在一些實施方式中，本發(fā)明提供一種結合CCR4且能夠抑制MDC結合CCR4的抗體， 所述抗體包括：包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列或與其基本同源的序列的重鏈CDR2域和/ 或包含SEQ ID NO: 17的氨基酸序列或與其基本同源的序列的輕鏈⑶R2域。
[0100] 所述抗體可選地進一步包括：包含SEQ ID NO: 15的氨基酸序列或與其基本同源的 序列的重鏈CDR3域和/或包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列或與其基本同源的序列的輕鏈 ⑶R3域和/或進一步包括：包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列或與其基本同源的序列的重鏈 ⑶Rl域和/或包含SEQ ID NO: 16的氨基酸序列或與其基本同源的序列的輕鏈⑶Rl域。
[0101] 換一種方式看，在一些實施方式中，本發(fā)明提供一種結合CCR4且能夠抑制MDC結 合CCR4的抗體，所述抗體包括：包含SEQ ID N0:20的氨基酸序列或與其基本同源的序列的 重鏈⑶R2域和/或包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列或與其基本同源的序列的輕鏈⑶R2 域。
[0102] 所述抗體可選地進一步包括：包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列或與其基本同源的 序列的重鏈CDR3域和/或包含SEQ ID NO: 24的氨基酸序列或與其基本同源的序列的輕鏈 ⑶R3域和/或進一步包括：包含SEQ ID NO: 19的氨基酸序列或與其基本同源的序列的重 鏈⑶Rl域和/或包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列或與其基本同源的序列的輕鏈⑶Rl域。
[0103] 換一種方式看，在一些實施方式中，本發(fā)明提供一種結合CCR4且能夠抑制MDC結 合CCR4的抗體，所述抗體包括：包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列或與其基本同源的序列的 重鏈⑶Rl域和/或包含SEQ ID N0:4的氨基酸序列或與其基本同源的序列的輕鏈⑶Rl域。
[0104] 所述抗體可選地進一步包括：包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或與其基本同源的 序列的重鏈CDR3域和/或包含SEQ ID N0:6的氨基酸序列或與其基本同源的序列的輕鏈 ⑶R3域和/或進一步包括：包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列或與其基本同源的序列的重鏈 ⑶R2域和/或包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列或與其基本同源的序列的輕鏈⑶R2域。
[0105] 在一些實施方式中，本發(fā)明提供一種結合CCR4且能夠抑制MDC結合CCR4的抗體， 所述抗體包括：包含SEQ ID NO:7、125或126的氨基酸序列或與其基本同源的序列的重鏈 ⑶Rl域和/或包含SEQ ID NO: 10、129或130的氨基酸序列或與其基本同源的序列的輕鏈 CDRl 域。
[0106] 所述抗體可選地進一步包括：包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列或與其基本同源的 序列的重鏈CDR3域和/或包含SEQ ID NO: 12、133、134、137或138的氨基酸序列或與其基 本同源的序列的輕鏈⑶R3域和/或進一步包括：包含SEQ ID N0:8、127或128的氨基酸序 列或與其基本同源的序列的重鏈⑶R2域和/或包含SEQ ID NO: 11、131或132的氨基酸序 列或與其基本同源的序列的輕鏈CDR2域。
[0107] 換一種方式看，在一些實施方式中，本發(fā)明提供一種結合CCR4且能夠抑制MDC結 合CCR4的抗體，所述抗體包括：包含SEQ ID NO: 101的氨基酸序列或與其基本同源的序列 的重鏈⑶Rl域和/或包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列或與其基本同源的序列的輕鏈⑶Rl 域。
[0108] 所述抗體可選地進一步包括：包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列或與其基本同源的 序列的重鏈CDR3域和/或包含SEQ ID NO: 12的氨基酸序列或與其基本同源的序列的輕鏈 ⑶R3域和/或進一步包括：包含SEQ ID N0:8的氨基酸序列或與其基本同源的序列的重鏈 ⑶R2域和/或包含SEQ ID NO: 11的氨基酸序列或與其基本同源的序列的輕鏈⑶R2域。
[0109] 在一些實施方式中，本發(fā)明提供一種結合CCR4且能夠抑制MDC結合CCR4的抗體， 所述抗體包括：包含SEQ ID NO: 7的氨基酸序列或與其基本同源的序列的重鏈CDRl域和/ 或包含SEQ ID NO: 108的氨基酸序列或與其基本同源的序列的輕鏈⑶Rl域。
[0110] 所述抗體可選地進一步包括：包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列或與其基本同源的 序列的重鏈CDR3域和/或包含SEQ ID NO: 112的氨基酸序列或與其基本同源的序列的輕鏈 ⑶R3域和/或進一步包括：包含SEQ ID N0:8的氨基酸序列或與其基本同源的序列的重鏈 ⑶R2域和/或包含SEQ ID NO: 110的氨基酸序列或與其基本同源的序列的輕鏈⑶R2域。
[0111] 在一些實施方式中，本發(fā)明提供一種結合CCR4且能夠抑制MDC結合CCR4的抗體， 所述抗體包括：包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列或與其基本同源的序列的重鏈CDRl域和/ 或包含SEQ ID NO: 16的氨基酸序列或與其基本同源的序列的輕鏈⑶Rl域。
[0112] 所述抗體可選地進一步包括：包含SEQ ID NO: 15的氨基酸序列或與其基本同源的 序列的重鏈CDR3域和/或包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列或與其基本同源的序列的輕鏈 ⑶R3域和/或進一步包括：包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列或與其基本同源的序列的重鏈 ⑶R2域和/或包含SEQ ID NO: 17的氨基酸序列或與其基本同源的序列的輕鏈⑶R2域。
[0113] 在一些實施方式中，本發(fā)明提供一種結合CCR4且能夠抑制MDC結合CCR4的抗體， 所述抗體包括：包含SEQ ID NO: 19的氨基酸序列或與其基本同源的序列的重鏈CDRl域和 /或包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列或與其基本同源的序列的輕鏈⑶Rl域。
[0114] 所述抗體可選地進一步包括：包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列或與其基本同源的 序列的重鏈CDR3域和/或包含SEQ ID NO: 24的氨基酸序列或與其基本同源的序列的輕鏈 ⑶R3域和/或進一步包括：包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列或與其基本同源的序列的重 鏈⑶R2域和/或包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列或與其基本同源的序列的輕鏈⑶R2域。
[0115] 本發(fā)明的一些優(yōu)選抗體包括一個或多個選自SEQ ID NO: 1、2、3、4、5和6或與上述 SEQ ID NO中任意一條基本同源的序列的⑶R。
[0116] 本發(fā)明的一些優(yōu)選抗體包括一個或多個選自SEQ ID NO:7、8、9、10、11和12或與 上述SEQ ID NO中任意一條基本同源的序列的⑶R。
[0117] 本發(fā)明的一些優(yōu)選抗體包括一個或多個選自SEQ ID N0:101、8、9、10、ll和12或 與上述SEQ ID NO中任意一條基本同源的序列的⑶R。
[0118] 本發(fā)明的一些優(yōu)選抗體包括一個或多個選自SEQ ID NO: 7、8、9、108、110和112或 與上述SEQ ID NO中任意一條基本同源的序列的⑶R。
[0119] 本發(fā)明的一些優(yōu)選抗體包括一個或多個選自SEQ ID NO: 1、2、15、16、17和18或與 上述SEQ ID NO中任意一條基本同源的序列的⑶R。
[0120] 本發(fā)明的一些優(yōu)選抗體包括一個或多個選自SEQ ID N0:19、20、21、22、23或24或 與上述SEQ ID NO中任意一條基本同源的序列的⑶R。
[0121] 本發(fā)明的一些優(yōu)選抗體包括一個或多個選自SEQ ID N0:125、127、9、129、131或 133(137)或與上述SEQ ID NO中任意一條基本同源的序列的⑶R。
[0122] 本發(fā)明的一些優(yōu)選抗體包括一個或多個選自SEQ ID N0:126、128、9、130、132或 134(138)或與上述SEQ ID NO中任意一條基本同源的序列的CDR。
[0123] 本發(fā)明的一些優(yōu)選抗體包括兩個或更多個選自SEQ ID N0:4、5和6,或10、11和 12,或 16、17 和 18,或 22、23 和 24,或 108、110 和 112,或 129、131 和 133(137)，或 130、132 和134 (138)，或與任意一條上述SEQ ID NO基本同源的序列的輕鏈⑶R。
[0124] 特別優(yōu)選的結合分子包括三個輕鏈⑶R，所述三個輕鏈⑶R為SEQ ID NO: 4、5和6， 或 10、11 和 12,或 16、17 和 18,或 22、23 和 24,或 108、110 和 112,或 129、131 和 133(137)， 或130、132和134 (138)，或與任意一條上述SEQ ID NO ( S卩，上述輕鏈CDRl和CDR2和CDR3 或與其基本同源的序列的每一種中的一個）基本同源的序列。
[0125] 其它一些優(yōu)選抗體包括兩個或更多個重鏈⑶R，所述重鏈⑶R選自SEQ ID NO: 1、2 和3,或7、8和9,或1、2和15,或19、20和21，或101、8和9,或125和127和9,或126和 128和9,或與任意一條上述SEQ ID NO基本同源的序列。
[0126] 特別優(yōu)選的抗體包括三個重鏈⑶R，所述三個重鏈⑶R是：SEQ ID NO: 1、2和3,或 7、8 和 9,或 1、2 和 15,或 19、20 和 21，或 101、8 和 9,或 125 和 127 和 9,或 126 和 128 和 9， 或與任意一條上述SEQ ID NO ( S卩，上述重鏈⑶Rl和⑶R2和⑶R3或與其基本同源的序列 的每一種中的一個）基本同源的序列。
[0127] 在一些實施方式中，特別優(yōu)選的是SEQ ID NO: 1的重鏈CDRl與SEQ ID NO: 2的重 鏈⑶R2的組合。
[0128] 在一些實施方式中，特別優(yōu)選的是SEQ ID NO: 9的重鏈CDR3與SEQ ID NO: 8的重 鏈CDR2和/或SEQ ID NO: 7或101的重鏈CDRl的組合。
[0129] 一些更特別優(yōu)選的抗體包括三個輕鏈⑶R和三個重鏈⑶R，所述三個輕鏈⑶R是： SEQ ID NO:4、5和6或與這些序列中任何一條（S卩，上述輕鏈⑶Rl和⑶R2和⑶R3或與其 基本同源的序列的每一種中的一個）基本同源的序列，所述三個重鏈⑶R是：SEQ ID NO: 1、 2和3或與這些序列中任何一條（即，上述重鏈⑶Rl和⑶R2和⑶R3或與其基本同源的序 列的每一種中的一個）基本同源的序列。
[0130] 一些更特別優(yōu)選的抗體包括三個輕鏈⑶R和三個重鏈⑶R，所述三個輕鏈⑶R是： SEQ ID NO: 10、11和12或與這些序列中任何一條（S卩，上述輕鏈⑶Rl和⑶R2和⑶R3或 與其基本同源的序列的每一種中的一個）基本同源的序列，所述三個重鏈⑶R是：SEQ ID NO: 7、8和9或與這些序列中任何一條（S卩，上述重鏈⑶Rl和⑶R2和⑶R3或與其基本同源 的序列的每一種中的一個）基本同源的序列。
[0131] 一些更特別優(yōu)選的抗體包括三個輕鏈⑶R和三個重鏈⑶R，所述三個輕鏈⑶R是： SEQ ID NO: 10、11和12或與這些序列中任何一條（S卩，上述輕鏈⑶Rl和⑶R2和⑶R3或 與其基本同源的序列的每一種中的一個）基本同源的序列，所述三個重鏈⑶R是：SEQ ID NO: 101、8和9或與這些序列中任何一條（S卩，上述重鏈⑶Rl和⑶R2和⑶R3或與其基本同 源的序列的每一種中的一個）基本同源的序列。
[0132] 一些更特別優(yōu)選的抗體包括三個輕鏈⑶R和三個重鏈⑶R，所述三個輕鏈⑶R是： SEQ ID NO: 108、110和112或與這些序列中任何一條（S卩，上述輕鏈CDRl和CDR2和CDR3 或與其基本同源的序列的每一種中的一個）基本同源的序列，所述三個重鏈⑶R是：SEQ ID NO: 7、8和9或與這些序列中任何一條（S卩，上述重鏈⑶Rl和⑶R2和⑶R3或與其基本同源 的序列的每一種中的一個）基本同源的序列。
[0133] 一些更特別優(yōu)選的抗體包括三個輕鏈⑶R和三個重鏈⑶R，所述三個輕鏈⑶R是： SEQ ID NO: 16、17和18或與這些序列中任何一條（S卩，上述輕鏈⑶Rl和⑶R2和⑶R3或 與其基本同源的序列的每一種中的一個）基本同源的序列，所述三個重鏈⑶R是：SEQ ID NO: 1、2和15或與這些序列中任何一條（S卩，上述重鏈⑶Rl和⑶R2和⑶R3或與其基本同 源的序列的每一種中的一個）基本同源的序列。
[0134] 一些更特別優(yōu)選的抗體包括三個輕鏈⑶R和三個重鏈⑶R，所述三個輕鏈⑶R是： SEQ ID NO:22、23和24或與這些序列中任何一條（S卩，上述輕鏈CDRl和CDR2和CDR3或 與其基本同源的序列的每一種中的一個）基本同源的序列，所述三個重鏈⑶R是：SEQ ID NO: 19、20和21或與這些序列中任何一條（S卩，上述重鏈⑶Rl和⑶R2和⑶R3或與其基本 同源的序列的每一種中的一個）基本同源的序列。
[0135] 一些更特別優(yōu)選的抗體包括三個輕鏈⑶R和三個重鏈⑶R，所述三個輕鏈⑶R是： SEQ ID NO: 129、131和133(137)或與這些序列中任何一條（S卩，上述輕鏈CDRl和CDR2和 CDR3或與其基本同源的序列的每一種中的一個）基本同源的序列，所述三個重鏈CDR是： SEQ ID NO: 125、127和9或與這些序列中任何一條（S卩，上述重鏈⑶Rl和⑶R2和⑶R3或 與其基本同源的序列的每一種中的一個）基本同源的序列。
[0136] 一些特別優(yōu)選的抗體包括SEQ ID NO: 1的重鏈CDRl域、SEQ ID NO: 2的重鏈CDR2 域和SEQ ID NO: 3的重鏈⑶R3域，或所述序列是與上述序列中任何一條基本同源的序列； 和/或包括SEQ ID NO:4的輕鏈CDRl域、SEQ ID NO: 5的輕鏈CDR2域和SEQ ID NO:6的 輕鏈CDR3域，或所述序列是與上述序列中任何一條基本同源的序列。
[0137] 一些特別優(yōu)選的抗體包括SEQ ID NO: 7或101的重鏈CDRl域、SEQ ID NO:8的重 鏈⑶R2域和SEQ ID N0:9的重鏈⑶R3域，或所述序列是與上述序列中任何一條基本同源 的序列；和/或包括SEQ ID NO: 10的輕鏈CDRl域、SEQ ID NO: 11的輕鏈CDR2域和SEQ ID NO: 12的輕鏈CDR3域，或所述序列是與上述序列中任何一條基本同源的序列。
[0138] 一些特別優(yōu)選的抗體包括SEQ ID NO: 7的重鏈CDRl域、SEQ ID NO: 8的重鏈CDR2 域和SEQ ID N0:9的重鏈⑶R3域，或所述序列是與上述序列中任何一條基本同源的序列； 和 /或包括 SEQ ID NO: 108 的輕鏈CDRl 域、SEQ ID NO: 110 的輕鏈CDR2 域和 SEQ ID NO: 112 的輕鏈CDR3域，或所述序列是與上述序列中任何一條基本同源的序列。
[0139] 一些特別優(yōu)選的抗體包括SEQ ID NO: 1的重鏈CDRl域、SEQ ID NO: 2的重鏈CDR2 域和SEQ ID NO: 15的重鏈⑶R3域，或所述序列是與上述序列中任何一條基本同源的序列； 和 / 或包括 SEQ ID NO: 16 的輕鏈 CDRl 域、SEQ ID NO: 17 的輕鏈 CDR2 域和 SEQ ID NO: 18 的輕鏈CDR3域，或所述序列是與上述序列中任何一條基本同源的序列。
[0140] -些特別優(yōu)選的抗體包括SEQ ID NO: 19的重鏈CDRl域、SEQ ID NO: 20的重鏈 ⑶R2域和SEQ ID NO: 21的重鏈⑶R3域，或所述序列是與上述序列中任何一條基本同源的 序列；和/或包括SEQ ID NO: 22的輕鏈CDRl域、SEQ ID NO: 23的輕鏈CDR2域和SEQ ID NO: 24的輕鏈CDR3域，或所述序列是與上述序列中任何一條基本同源的序列。
[0141] 一些特別優(yōu)選的抗體包括SEQ ID NO: 125、126、135或136的重鏈CDRl域、SEQ ID NO: 127或128的重鏈CDR2域和SEQ ID NO: 9的重鏈CDR3域，或所述序列是與上述序列中任 何一條基本同源的序列；和/或包括SEQ ID NO: 129或130的輕鏈CDRl域、SEQ ID NO: 131 或132的輕鏈CDR2域和SEQ ID NO: 133(137)或134(138)的輕鏈CDR3域，或所述序列是 與上述序列中任何一條基本同源的序列。
[0142] 在另一種實施方式中，本發(fā)明提供一種結合CCR4且能夠抑制MDC結合CCR4的抗 體，所述抗體包括至少一個包含三個CDR的重鏈可變區(qū)和至少一個包含三個CDR的輕鏈可 變區(qū)，其中所述重鏈可變區(qū)包括：
[0143] (i)具有SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的可變重鏈（VH)⑶Rl，
[0144] (ii)具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的VH CDR2,和
[0145] (iii)具有SEQ ID NO:3或15的氨基酸序列的VH CDR3。
[0146] 在該實施方式的一種優(yōu)選的方面，一個或多個所述輕鏈可變區(qū)CDR選自：
[0147] ⑴具有SEQ ID NO:4或16的氨基酸序列的VL CDRl，
[0148] (ii)具有SEQ ID NO:5或17的氨基酸序列的VL CDR2,和
[0149] (iii)具有SEQ ID NO:6或18的氨基酸序列的VL CDR3。
[0150] 優(yōu)選地，兩個或三個所述輕鏈可變區(qū)CDR選自上面的組。
[0151] 在另一種實施方式中，本發(fā)明提供一種結合CCR4且能夠抑制MDC結合CCR4的抗 體，所述抗體包括至少一個包含三個CDR的重鏈可變區(qū)和至少一個包含三個CDR的輕鏈可 變區(qū)，其中所述重鏈可變區(qū)包括：
[0152] (i)具有SEQ ID NO:7或101的氨基酸序列的可變重鏈（VH)⑶Rl，
[0153] (ii)具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的VH CDR2,和
[0154] (iii)具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的VH CDR3。
[0155] 在該實施方式的一種優(yōu)選的方面，一個或多個所述輕鏈可變區(qū)CDR選自：
[0156] ⑴具有SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的VL CDRl，
[0157] (ii)具有SEQ ID NO: 11的氨基酸序列的VL CDR2,和
[0158] (iii)具有 SEQ ID NO: 12 的氨基酸序列的 VL CDR3。
[0159] 優(yōu)選地，兩個或三個所述輕鏈可變區(qū)CDR選自上面的組。
[0160] 在另一種實施方式中，本發(fā)明提供一種結合CCR4且能夠抑制MDC結合CCR4的抗 體，所述抗體包括至少一個包含三個CDR的重鏈可變區(qū)和至少一個包含三個CDR的輕鏈可 變區(qū)，其中所述重鏈可變區(qū)包括：
[0161] (i)具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的可變重鏈（VH)⑶Rl，
[0162] (ii)具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的VH CDR2,和
[0163] (iii)具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的VH CDR3。
[0164] 在該實施方式的一種優(yōu)選的方面，一個或多個所述輕鏈可變區(qū)CDR選自：
[0165] ⑴具有SEQ ID NO: 108的氨基酸序列的VL CDRl，
[0166] (ii)具有SEQ ID NO: 110的氨基酸序列的VL CDR2,和
[0167] (iii)具有 SEQ ID NO: 112 的氨基酸序列的 VL CDR3。
[0168] 優(yōu)選地，兩個或三個所述輕鏈可變區(qū)CDR選自上面的組。
[0169] 在另一種實施方式中，本發(fā)明提供一種結合CCR4且能夠抑制MDC結合CCR4的抗 體，所述抗體包括至少一個包含三個CDR的重鏈可變區(qū)和至少一個包含三個CDR的輕鏈可 變區(qū)，其中所述重鏈可變區(qū)包括：
[0170] (i)具有SEQ ID NO: 19的氨基酸序列的可變重鏈（VH)⑶Rl，
[0171] (ii)具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的VH CDR2,和
[0172] (iii)具有 SEQ ID NO:21 的氨基酸序列的 VH CDR3。
[0173] 在該實施方式的一種優(yōu)選的方面，一個或多個所述輕鏈可變區(qū)CDR選自：
[0174] ⑴具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的VL CDRl，
[0175] (ii)具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的VL CDR2,和
[0176] (iii)具有 SEQ ID NO:24 的氨基酸序列的 VL CDR3。
[0177] 優(yōu)選地，兩個或三個所述輕鏈可變區(qū)CDR選自上面的組。
[0178] 在另一種實施方式中，本發(fā)明提供一種結合CCR4且能夠抑制MDC結合CCR4的抗 體，所述抗體包括至少一個包含三個CDR的重鏈可變區(qū)和至少一個包含三個CDR的輕鏈可 變區(qū)，其中所述重鏈可變區(qū)包括：
[0179] ⑴具有SEQ ID NO: 125、126、135或136的氨基酸序列的可變重鏈（VH)CDR1，
[0180] (ii)具有SEQ ID NO: 127或128的氨基酸序列的VH CDR2,和
[0181] (iii)具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的VH CDR3。
[0182] 在該實施方式的一種優(yōu)選的方面，一個或多個所述輕鏈可變區(qū)CDR選自：
[0183] ⑴具有SEQ ID NO: 129或130的氨基酸序列的VL CDRl，
[0184] (ii)具有SEQ ID NO: 131或132的氨基酸序列的VL CDR2,和
[0185] (iii)具有 SEQ ID NO: 133 (137)或 134(138)的氨基酸序列的 VL CDR3。
[0186] 優(yōu)選地，兩個或三個所述輕鏈可變區(qū)CDR選自上面的組。
[0187] 本發(fā)明的一些更加優(yōu)選的實施方式提供一種結合CCR4且能夠抑制MDC結合CCR4 的抗體，所述抗體包括：包含一個、兩個或三個重鏈CDR的VH域和/或包含一個、兩個或三 個輕鏈CDR的VL域，其中所述重鏈CDR的序列是SEQ ID NO: 1、2或3或與SEQ ID NO: 1、2 或3中的一個或多個基本同源的序列，所述輕鏈⑶R的序列是SEQ ID N0:4、5或6或與SEQ ID N0:4、5或6中的一個或多個基本同源的序列。
[0188] 本發(fā)明的一些更加優(yōu)選的實施方式提供一種結合CCR4且能夠抑制MDC結合CCR4 的抗體，所述抗體包括：包含一個、兩個或三個重鏈CDR的VH域和/或包含一個、兩個或 三個輕鏈⑶R的VL域，其中所述重鏈⑶R的序列是SEQ ID NO:7、8、9或101或與SEQ ID N0:7、8、9或101中的一個或多個基本同源的序列，所述輕鏈⑶R的序列是SEQ ID NO: 10、 11或12或與SEQ ID NO: 10、11或12中的一個或多個基本同源的序列。
[0189] 本發(fā)明的一些更加優(yōu)選的實施方式提供一種結合CCR4且能夠抑制MDC結合CCR4 的抗體，所述抗體包括：包含一個、兩個或三個重鏈CDR的VH域和/或包含一個、兩個或三 個輕鏈CDR的VL域，其中所述重鏈CDR的序列是SEQ ID NO: 7、8或9或與SEQ ID NO: 7、8 或9中的一個或多個基本同源的序列，所述輕鏈⑶R的序列是SEQ ID NO: 108、110或112 或與SEQ ID NO: 108、110或112中的一個或多個基本同源的序列。
[0190] 本發(fā)明的一些更加優(yōu)選的實施方式提供一種結合CCR4且能夠抑制MDC結合CCR4 的抗體，所述抗體包括：包含一個、兩個或三個重鏈CDR的VH域和/或包含一個、兩個或三 個輕鏈CDR的VL域，其中所述重鏈CDR的序列是SEQ ID NO: 1、2或15或與SEQ ID NO: 1、 2或15中的一個或多個基本同源的序列，所述輕鏈⑶R的序列是SEQ ID N0:16、17或18或 與SEQ ID NO: 16、17或18中的一個或多個基本同源的序列。
[0191] 本發(fā)明的一些更加優(yōu)選的實施方式提供一種結合CCR4且能夠抑制MDC結合CCR4 的抗體，所述抗體包括：包含一個、兩個或三個重鏈CDR的VH域和/或包含一個、兩個或三 個輕鏈CDR的VL域，其中所述重鏈CDR的序列是SEQ ID NO: 19、20或21或與SEQ ID NO: 19、 20或21中的一個或多個基本同源的序列，所述輕鏈⑶R的序列是SEQ ID N0:22、23或24 或與SEQ ID NO:22、23或24中的一個或多個基本同源的序列。
[0192] 本發(fā)明的一些更加優(yōu)選的實施方式提供一種結合CCR4且能夠抑制MDC結合CCR4 的抗體，所述抗體包括：包含一個、兩個或三個重鏈CDR的VH域和/或包含一個、兩個或 三個輕鏈⑶R的VL域，其中所述重鏈⑶R的序列是SEQ ID NO: 125、127或9或與SEQ ID N0:125、127或9中的一個或多個基本同源的序列，所述輕鏈CDR的序列是SEQ ID N0:129、 131或133 (137)或與SEQ ID NO: 129、131或（137)中的一個或多個基本同源的序列。
[0193] 本發(fā)明的更特別優(yōu)選的實施方式提供一種結合CCR4且能夠抑制MDC結合CCR4的 抗體，所述抗體包括：包含三個輕鏈⑶R的VL域和包含三個重鏈⑶R的VH域，所述重鏈⑶R 的序列是SEQ ID N0:l、2和3或15。在優(yōu)選的實施方式中，一個、兩個或三個輕鏈⑶R如在 SEQ ID N0:4、5和6,或16、17和18中所定義的。
[0194] 本發(fā)明的更特別優(yōu)選的實施方式提供一種結合CCR4且能夠抑制MDC結合CCR4的 抗體，所述抗體包括：包含三個輕鏈⑶R的VL域和包含三個重鏈⑶R的VH域，所述重鏈⑶R 的序列是SEQ ID NO:8、9和7或101。在優(yōu)選的實施方式中，一個、兩個或三個輕鏈⑶R如 在SEQ ID N0:10、ll和12,或108、110和112中所定義的。
[0195] 本發(fā)明的更特別優(yōu)選的實施方式提供一種結合CCR4且能夠抑制MDC結合CCR4的 抗體，所述抗體包括：包含三個輕鏈⑶R的VL域和包含三個重鏈⑶R的VH域，所述重鏈⑶R 的序列是SEQ ID NO: 125、127和9。在優(yōu)選的實施方式中，一個、兩個或三個輕鏈⑶R如在 SEQ ID NO: 129、131 和 133(137)中所定義的。
[0196] 在本文描述的本發(fā)明所有實施方式中，存在于氨基酸序列中的X表示可變氨基 酸。因此，當序列包含多于一個X時，每一個X都可以是不同的，但一個或多個X也可以是相 同的。優(yōu)選地，SEQ ID NO: 125的位置1的X = S或N，和/或SEQ ID NO: 125的位置4的 X = I或M，和/或SEQ ID N0:127的位置1的X = G或A，和/或SEQ ID N0:127的位置3 的X = I或S，和/或SEQ ID NO: 127的位置5的X = I或S，和/或SEQ ID NO: 127的位置 6的X = F或G，和/或SEQ ID NO: 127的位置8的X = T或S，和/或SEQ ID NO: 127的位 置9的X是A或T，和/或SEQ ID NO: 129的位置3的X = S或G，和/或SEQ ID NO: 129的 位置4的X = T或G，和/或SEQ ID NO: 129的位置9的X = S或R，和/或SEQ ID NO: 129 的位置10的X = R或H，和/或SEQ ID NO: 129的位置11的X = Y或F，和/或SEQ ID N0:129的位置13的X = Y或F，和/或SEQ ID N0:131的位置3的X = H或N，和/或SEQ ID NO: 133或137的位置2的X = A或V，和/或SEQ ID NO: 133或137的位置6的X = S 或T。
[0197] SEQ ID NO: 125 的一種優(yōu)選的實施方式是 SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 127 的一 種優(yōu)選的實施方式是SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129的一種優(yōu)選的實施方式是SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131 的一種優(yōu)選的實施方式是 SEQ ID NO: 132,以及 SEQ ID NO: 133 的 一種優(yōu)選的實施方式是SEQ ID NO: 134。
[0198] SEQ ID NO: 125 和 / 或 SEQ ID NO: 126 的一種優(yōu)選的實施方式是 SEQ ID NO: 135， 更優(yōu)選地是SEQ ID NO: 136。SEQ ID NO: 133的一種優(yōu)選的實施方式是SEQ ID NO: 137或 SEQ ID NO: 138。SEQ ID NO: 134 的一種優(yōu)選的實施方式是 SEQ ID NO: 138。
[0199] 優(yōu)選的實施方式是存在SEQ ID NO: 125的重鏈⑶Rl。同樣優(yōu)選的實施方式是存在 SEQ ID NO: 101的重鏈⑶Rl。因此，所述重鏈⑶Rl優(yōu)選地以氨基酸S(絲氨酸）起始。
[0200] 本發(fā)明的一些優(yōu)選的實施方式提供一種結合CCR4且能夠抑制MDC結合CCR4的抗 體，所述抗體包括具有SEQ ID N0:139、69、71、73、75或105的氨基酸序列或與其基本同源 的序列的VH域和/或具有SEQ ID NO: 140、70、72、74、76或115的氨基酸序列或與其基本 同源的序列的VL域。優(yōu)選地，所述VH和/或VL域具有至少1、2、3、4或5個，如6個本文 公開的⑶R序列。
[0201] 更優(yōu)選的實施方式提供一種結合CCR4且能夠抑制MDC結合CCR4的抗體，所述抗 體包括具有SEQ ID N0:139、69、71、73、75或105的氨基酸序列的VH域和包含三個輕鏈CDR 的VL域。優(yōu)選地，所述輕鏈CDR具有SEQ ID N0:4、5和6,或10、11和12,或16、17和18， 或 22、23 和 24,或 108、110 和 112,或 129、131 和 133(137)，或 130、132 和 134(138)。
[0202] 更優(yōu)選的實施方式提供一種結合CCR4且能夠抑制MDC結合CCR4的抗體，所述抗 體包括具有SEQ ID N0:69的氨基酸序列或與其基本同源的序列的VH域和/或具有SEQ ID NO:70的氨基酸序列或與其基本同源的序列的VL域。
[0203] 更優(yōu)選的實施方式提供一種結合CCR4且能夠抑制MDC結合CCR4的抗體，所述抗 體包括具有SEQ ID N0:71的氨基酸序列或與其基本同源的序列的VH域和/或具有SEQ ID NO:72的氨基酸序列或與其基本同源的序列的VL域。
[0204] 更優(yōu)選的實施方式提供一種結合CCR4且能夠抑制MDC結合CCR4的抗體，所述抗 體包括具有SEQ ID N0:71的氨基酸序列或與其基本同源的序列的VH域和/或具有SEQ ID NO: 115的氨基酸序列或與其基本同源的序列的VL域。
[0205] 更優(yōu)選的實施方式提供一種結合CCR4且能夠抑制MDC結合CCR4的抗體，所述抗 體包括具有SEQ ID NO: 105的氨基酸序列或與其基本同源的序列的VH域和/或具有SEQ ID N0:72的氨基酸序列或與其基本同源的序列的VL域。
[0206] 更優(yōu)選的實施方式提供一種結合CCR4且能夠抑制MDC結合CCR4的抗體，所述抗 體包括具有SEQ ID N0:73的氨基酸序列或與其基本同源的序列的VH域和/或具有SEQ ID NO:74的氨基酸序列或與其基本同源的序列的VL域。
[0207] 更優(yōu)選的實施方式提供一種結合CCR4且能夠抑制MDC結合CCR4的抗體，所述抗 體包括具有SEQ ID N0:75的氨基酸序列或與其基本同源的序列的VH域和/或具有SEQ ID NO:76的氨基酸序列或與其基本同源的序列的VL域。
[0208] 更優(yōu)選的實施方式提供一種結合CCR4且能夠抑制MDC結合CCR4的抗體，所述抗 體包括具有SEQ ID NO: 139的氨基酸序列或與其基本同源的序列的VH域和/或具有SEQ ID NO: 140的氨基酸序列或與其基本同源的序列的VL域。
[0209] 在另一種實施方式中，本發(fā)明提供一種結合CCR4且能夠抑制MDC結合CCR4的抗 體，所述抗體包含氨基酸序列：SEQ ID NO: 35 (所述抗體在本文中也被指定為17G scFv)、 SEQ ID NO:46(所述抗體在本文中也被指定為9E scFv)、SEQ ID NO:104(所述抗體在本文 中也被指定為9E10J scFv)、SEQ ID N0:114(所述抗體在本文中也被指定為9E1D scFv)、 SEQ ID N0:57(所述抗體在本文中也被指定為10 scFv)或SEQ ID N0:68(所述抗體在本文 中也被指定為IlF scFv)，或者包括結合CCR4且能夠抑制MDC結合CCR4的任何抗體的片 段，或與任意一條上述序列基本同源的序列。
[0210] 本發(fā)明由單克隆抗體17G、9E、10、11F、9E10J和9E1D舉例說明，它們的單鏈形式在 表1、2、3、4、11和12中顯示（分別是SEQ ID N0:35、46、57、68、103和114)。已經獲得了全 長IgG形式的抗體17G、9E、10和11F，且它們的序列分別在表5、6、7和8中顯示。17G、9E、 IlF和10抗體的CDR域、VH和VL域在表1-4和圖1-4中顯示，9E10J和9E1D抗體的CDR 域、VH和VL域在表11和12中顯示。已經獲得了全長IgG形式的抗體9E10J和9E1D，它們 的序列在表13和14中顯示。表23列出了共同序列。本發(fā)明的優(yōu)選方面是包含這些⑶R 域或VH和VL域（或與其基本一樣的序列）的抗體。
[0211] 本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式是scFv形式的17G抗體，包含SEQ ID NO: 35或由SEQ ID NO: 35組成，其優(yōu)選地由SEQ ID NO: 34編碼。更優(yōu)選地，所述抗體包含圖1所示的氨基 酸序列或由圖1所示的氨基酸序列組成，且更優(yōu)選地，該抗體由圖1所示的核酸序列編碼。
[0212] 本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方式是scFv形式的9E抗體，包含SEQ ID N0:46或由 SEQ ID N0:46組成，其優(yōu)選地由SEQ ID N0:45編碼。更優(yōu)選地，所述抗體包含圖2所示的 氨基酸序列或由圖2所示的氨基酸序列組成，且更優(yōu)選地，該抗體由圖2所示的核酸序列編 碼。
[0213] 本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方式是scFv形式的9E10J抗體，包含SEQ ID NO: 104或 由SEQ ID NO: 104組成，其優(yōu)選地由SEQ ID NO: 103編碼。更優(yōu)選地，所述抗體包含圖27 所示的氨基酸序列或由圖27所示的氨基酸序列組成，且更優(yōu)選地，該抗體由圖27所示的核 酸序列編碼。
[0214] 本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方式是scFv形式的9E1D抗體，包含SEQ ID NO: 114或 由SEQ ID NO: 114組成，其優(yōu)選地由SEQ ID NO: 113編碼。更優(yōu)選地，所述抗體包含圖28 所示的氨基酸序列或由圖28所示的氨基酸序列組成，且更優(yōu)選地，該抗體由圖28所示的核 酸序列編碼。
[0215] 本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方式是scFv形式的10抗體，包含SEQ ID NO:57或由 SEQ ID N0:57組成，其優(yōu)選地由SEQ ID N0:56編碼。更優(yōu)選地，所述抗體包含圖3所示的 氨基酸序列或由圖3所示的氨基酸序列組成，且更優(yōu)選地，該抗體由圖3所示的核酸序列編 碼。
[0216] 本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方式是scFv形式的IlF抗體，包含SEQ ID N0:68或由 SEQ ID NO:68組成，其優(yōu)選地由SEQ ID NO:67編碼。更優(yōu)選地，所述抗體包含圖4所示的 氨基酸序列或由圖4所示的氨基酸序列組成，且更優(yōu)選地，該抗體由圖4所示的核酸序列編 碼。
[0217] 其它優(yōu)選實施方式是IgG形式的17G、9E、10、11F、9E10J和9E1D抗體，優(yōu)選地是全 長IgG形式。最優(yōu)選地是任何這些抗體的IgGl形式。
[0218] 因此，本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方式是包括SEQ ID NO: 87 (氨基酸）的重鏈和/ 或SEQ ID NO: 88 (氨基酸）的輕鏈的全長IgG抗體。同樣優(yōu)選的是包括由SEQ ID NO: 85 編碼的重鏈和/或由SEQ ID NO: 86編碼的輕鏈的IgG抗體。應當理解，全長IgG抗體將包 括兩條基本相同的重鏈和兩條基本相同的輕鏈。
[0219] 本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方式是包括SEQ ID NO: 91 (氨基酸）的重鏈和/或SEQ ID N0:92(氨基酸）的輕鏈的全長IgG抗體。同樣優(yōu)選的是包括由SEQ ID N0:89編碼的重 鏈和/或由SEQ ID NO:90編碼的輕鏈的IgG抗體。
[0220] 本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方式是包括SEQ ID NO: 95 (氨基酸）的重鏈和/或SEQ ID N0:96(氨基酸）的輕鏈的全長IgG抗體。同樣優(yōu)選的是包括由SEQ ID N0:93編碼的重 鏈和/或由SEQ ID NO:94編碼的輕鏈的IgG抗體。
[0221] 本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方式是包括SEQ ID NO: 99 (氨基酸）的重鏈和/或SEQ ID NO: 100 (氨基酸）的輕鏈的全長IgG抗體。同樣優(yōu)選的是包括由SEQ ID N0:97編碼的 重鏈和/或由SEQ ID NO:98編碼的輕鏈的IgG抗體。
[0222] 本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方式是包括SEQ ID NO: 119 (氨基酸）的重鏈和/或SEQ ID NO: 120 (氨基酸）的輕鏈的全長IgG抗體。同樣優(yōu)選的是包括由SEQ ID NO: 117編碼的 重鏈和/或由SEQ ID NO: 118編碼的輕鏈的IgG抗體。
[0223] 本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方式是包括SEQ ID NO: 123 (氨基酸）的重鏈和/或SEQ ID NO: 124 (氨基酸）的輕鏈的全長IgG抗體。同樣優(yōu)選的是包括由SEQ ID NO: 121編碼的 重鏈和/或由SEQ ID NO: 122編碼的輕鏈的IgG抗體。
[0224] 人們相信，本發(fā)明的抗體可以與對于已知的抗CCR4抗體家族的不同表位結合， 所述抗體家族包括KM2160、KM3060、KM2760和KM-0761?？贵wKM2160是一種鼠抗體，由 針對CCR4的肽片段產生，且識別存在于人CCR4的N-末端2-29位的氨基酸區(qū)域的表 位（EP1270595)。KM2760是一種嵌合形式的抗體，具有相同的結合性質（EP1270595)。 除了高度巖藻糖化以外，抗體KM3060與KM2760相同（Niwa等2004, Cancer Research 64, 2127-2133)。KM-0761 是 KM2760 的人源化形式（Ishida 等，Annals of Oncology 2008, 19 卷，附錄 4, 513)。
[0225] 已經報導KM2760不阻止CCR4和TARC或MDC的交互作用（Ishida等，2006, Cancer Research 66(11),5716-5722頁），這與本發(fā)明人在實施例3中展示的使用相當?shù)目贵w KM3060var (與KM3060相應，但是潛在地具有不同的糖性質，因為它是在不同的宿主中表 達）所得到的發(fā)現(xiàn)一致。相反，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的抗體能夠阻止CCR4與MDC的交互作用和 CCR4與TARC的交互作用（見實施例3)。這強烈地暗示了本發(fā)明的抗體與現(xiàn)有技術的包括 KM2160、KM3060、KM2760和KW-0761的家族相比結合不同的表位。
[0226] 此外，發(fā)現(xiàn)抗體17G和9E對結合CCR4彼此競爭，表示它們結合相同、相似或至少 重疊的表位。對結合CCR4,這些抗體與KM3060var都不競爭，表明KM3060var結合不同表 位。
[0227] 同樣相信，本發(fā)明的抗體可以結合與商業(yè)可獲得的抗CCR4抗體IGl識別的表位不 同的表位。BD Pharmingen將該抗體在技術數(shù)據(jù)表上闡述清楚，該抗體不是中和抗體。相 反，本發(fā)明的抗體能夠阻止MDC和TARC與CCR4結合并抑制MDC或TARC誘導的胞內鈣離子 的增加。這強烈地暗示本發(fā)明的抗體與IGl抗體結合不同的表位。
[0228] 因此，同樣提供對于結合CCR4與本文描述的任何抗體競爭的抗體。
[0229] 本文使用的術語"競爭抗體"指與"提及抗體"結合大約、基本或實質相同、或完全 一樣的表位的抗體。"競爭抗體"包括具有重疊表位特異性的抗體。因此競爭抗體能夠有效 地與提及抗體競爭結合CCR4。優(yōu)選地，所述競爭抗體能夠結合與提及抗體識別的表位相同 的表位。換一種方式看，所述競爭抗體優(yōu)選地具有與提及抗體相同的表位特異性。
[0230] 本文使用的"提及抗體"是能夠結合人CCR4的胞外域中的表位的抗體，所述抗 體具有一個或多個本文定義的CDR序列，優(yōu)選地本文定義的VH和VL域，更優(yōu)選地SEQ ID NO: 130 的 VH 和 SEQ ID NO: 140 的 VL，或 SEQ ID NO: 69 的 VH 和 SEQ ID NO: 70 的 VL，或 SEQ ID NO: 71 的 VH 和 SEQ ID NO: 72 的 VL，或 SEQ ID NO: 105 的 VH 和 SEQ ID NO: 72 的 VL，或 SEQ ID NO: 71 的 VH 和 SEQ ID NO: 115 的 VL，或 SEQ ID NO: 73 的 VH 和 SEQ ID NO: 74 的 VL，或SEQIDN0:75的VH和SEQIDN0:76的VL。最優(yōu)選的提及抗體選自17G、9E、11F、10、 9E10J 和 9E1D。
[0231] 既然已經提供了提及抗體如17G、9E、11F、10、9E10J和9E1D，鑒定一種或多種競爭 抗體是一個簡單的技術問題。由于競爭抗體的鑒定是通過與提及抗體相比所確定的，應當 理解，為了鑒定競爭抗體，任何方式都不需要確定一個或兩個抗體結合所的表位。但是，如 果需要，可以使用標準技術進行表位作圖。
[0232] 例如，在本文中提及下述用于鑒定和定義表位的方法。CCR4的氨基酸序列是已知 的，所以合成肽可以用于表位作圖，如使用Pepscan實驗。定點突變也是表位作圖中的有力 工具，且可以用于評價單個氨基酸在免疫復合物形成中的作用。蛋白足跡法依賴于當結合 成為抗體-抗原復合體時，表位被保護免于切割的事實。酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA)和血 凝實驗和狹縫印跡（slot-blotting)同樣可以用于表位作圖?？乖c抗體的結晶化可以用 于作圖非線性表位。實施這些方法的方案是廣泛可用的，本領域技術人員將知道表位作圖 的可選擇的方法。
[0233] 可以使用多種免疫篩選分析的任何一種容易地確定競爭抗體的鑒定，在所述分 析中可以測定抗體競爭。所有這些分析在本領域都是常規(guī)的并在本文中詳細描述。出 于包括進一步補充本發(fā)明的關于如何鑒定競爭抗體的教導的目的，美國專利6, 342, 219、 6, 524, 583、7, 〇56, 5〇9、6, 887, 468、6, 342, 221、6, 676, Ml、6, 7〇3, 〇2〇 和 6, 416, 758 中的每 一篇都通過引用的方式特別結合至本文。本說明書的實施例4公開了一種合適的競爭分 析。
[0234] 例如，當需要檢測的測試抗體來自于不同來源的動物，或甚至來自不同的同種型， 可以進行簡單的競爭分析，其中混合（或預吸附）提及抗體和測試抗體并將它們應用于含 有CCR4的組合物，優(yōu)選地是表達CCR4的細胞、展示CCR4的噬菌體或包含固定的CCR4的生 物芯片?；贓LISA的方案特別適合應用于這樣的簡單競爭研究中。
[0235] 在一些實施方式中，在應用于抗原組合物之前，實施者可能將提及抗體（如17G、 9E、11F、10、9E10J和9E1D)和不同量的測試抗體（如，1 :10、1:100或 1:1000)預混合一段 時間。在其它實施方式中，可以在應用于抗原組合物過程中簡單地混合所述提及抗體和不 同量的測試抗體。無論如何，通過使用核素或同種型二級抗體，實施者將能夠探測僅結合的 提及抗體，它的結合將由于"競爭"結合的測試抗體的存在而減少。
[0236] 為進行提及抗體和任何測試抗體（無論種類或同種型）之間的抗體競爭研究，實 施者可以首先用可探測的標記物如生物素或酶標記物或放射性標記物標記提及抗體（如 17G、9E、11F、10、9E10J和9E1D)以能夠進行后續(xù)鑒定。在這些情況中，實施者可以以不同的 比例（如1:10、1:100或1:1000)預混合或孵育標記的待檢測的提及抗體和測試抗體，（可 選地在合適的時間之后）然后分析標記的提及抗體的反應性并將其與孵育物中無潛在的 競爭測試抗體的對照值進行比較。
[0237] 所述分析可以是基于抗體結合的免疫學分析的范圍內的任何一種，且可以通 過探測它們的標記物的方式來探測提及抗體，所述探測標記物的方式如：在生物素化的 抗體的情況下使用鏈親和素或通過使用與酶標記物連接的發(fā)色底物（如過氧化物酶的 3, 3' 5, 5' -四甲基聯(lián)苯胺（TMB)底物）或通過簡單地探測放射性標記物。如通過結合的標 記物的減少所證明的，與提及抗體競爭結合CCR4的抗體將能夠有效地或明顯地減少提及 抗體結合CCR4。
[0238] 當不存在完全不相關的抗體時，所述（標記的）提及抗體的反應性將是對照的高 值。對照的低值將通過孵育標記的提及抗體（如17G、9E、11F、10、9E10J或9E1D)和完全相 同類型的未標記的抗體而獲得，此時將發(fā)生競爭并減少標記抗體的結合。在測試分析中，在 存在測試抗體時，標記抗體的反應性的明顯較少預示著與標記抗體"競爭"結合CCR4的測 試抗體。
[0239] 有效減少是"可重復的"，即持續(xù)觀察到的結合減少。依照本申請的"有效減少"被 定義為在大約1:10和大約1:100之間的任何比例下（在ELISA中所述提及抗體與CCR4的 結合）可重復減少至少大約20%，更優(yōu)選地至少大約25%、30%、35%、40%、45%、50%、 55 %、60 %或65 %，甚至更優(yōu)選地至少大約70 %、大約75 %或大約80 %。具有甚至更嚴格競 爭活性的抗體將展示在大約1:10和大約1:100之間的任何比例下（在ELISA或其它合適 的分析中所述提及抗體與CCR4的結合）可重復減少至少大約82%、大約85%、大約88%、 大約90%、大約92%或大約95%。盡管實施本發(fā)明不需要，但并不排除如提及抗體與CCR4 的結合可重復減少大約99%、大約98%、大約97%或大約96%的完全或近完全競爭。
[0240] 上述方法僅是合適的競爭分析的一個例子。本領域技術人員將知道其它合適的方 法和變化。下面將描述一種可選擇的競爭分析。
[0241] 在使用流式細胞術進行可選擇競爭分析之前，一些量的被測抗體應當如通過生物 素化來標記。測定生物素化的產物的功能性（結合細胞的性質的持續(xù)力）和針對固定數(shù)量 的CCR4+細胞給予次高結合水平的本發(fā)明的生物素化的抗體（Abl)的最小濃度。從指數(shù) 生長培養(yǎng)物中收獲總量為IO6個細胞，并在合適的溫度下與不同濃度抗體孵育合適時間，如 4°C下孵育1小時。清洗所述細胞并在合適溫度下與合適的探測抗體孵育合適的時間，如 4°C下再孵育1小時。清洗之后，通過流式細胞術分析所述細胞。對于每一種測試抗體，通 過繪制中值熒光強度（MFI)對抗體濃度從所述數(shù)據(jù)獲得飽和曲線。
[0242] 對于可選擇的競爭分析，可以如上述制備CCR4+細胞并用固定濃度的標記（生物 素化的）抗體（bio-Abl)和逐漸增加濃度的非標記的競爭性抗體的混合物一式兩份處理 CCR4+細胞。所述固定濃度是如上測定的對固定數(shù)量的腫瘤細胞產生合理的熒光信號的抗 體最小濃度。理想地，所述以nM計的固定濃度應當?shù)陀谄胶鉅顟B(tài)時（K d)處理抗體的親和 力。在這種情況下，上述方法可以用于估計競爭性抗體的親和力（Schodin和Kranz, 1993, J Biol Chem268:25755-7)。在合適溫度下所述抗體混合物與靶細胞孵育合適的時間，如4°C 下1小時。清洗所述細胞并通過與FITC標記的鏈親和素孵育來顯示生物素化的抗體的細胞 結合。從對于每一個測試樣品（bio_Abl+Ab2)讀取的中值熒光值中減去背景熒光（PBS-5% FCS)后，根據(jù)以下公式計算每一個Ab2濃度"c"的百分比抑制：
[0243] %抑制=(1-MFI Μ。-Abl+Ab2"c7MFI bi『Abl) XlOO
[0244] 預期能夠結合CCR4且能夠抑制MDC結合CCR4且能夠與本文描述的任何抗體競爭 的抗體，但是優(yōu)選的抗體在下文中列出。因此，下文中提供一些優(yōu)選的實施方式。
[0245] -種抗體，結合人CC趨化因子受體4 (CCR4)的胞外域中的表位并能夠抑制MDC與 CCR4的結合，其中所述抗體
[0246] (a)包括至少一個包含三個⑶R的重鏈可變區(qū)和至少一個包含三個⑶R的輕鏈可 變區(qū)，其中所述輕鏈可變區(qū)包括：
[0247] ⑴具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的可變輕鏈（VL)⑶Rl ;
[0248] (ii)具有SEQ ID N0:5的氨基酸序列的VL CDR2 ;和/或
[0249] (iii)具有SEQ ID N0:6的氨基酸序列的VL CDR3 ;和/或
[0250] 其中所述重鏈可變區(qū)包括：
[0251] (iv)具有SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的可變重鏈（VH)CDRl ;
[0252] (V)具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的VH CDR2 ;和/或
[0253] (vi)具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的VH CDR3 ;或
[0254] (b)是與抗體（a)競爭結合CCR4的抗體。
[0255] -種抗體，結合人CC趨化因子受體4 (CCR4)的胞外域中的表位并能夠抑制MDC與 CCR4的結合，其中所述抗體
[0256] (a)包括至少一個包含三個⑶R的重鏈可變區(qū)和至少一個包含三個⑶R的輕鏈可 變區(qū)，其中所述輕鏈可變區(qū)包括：
[0257] (i)具有SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的可變輕鏈（VL)⑶Rl ;
[0258] (ii)具有SEQ ID NO: 11的氨基酸序列的VL CDR2 ;和/或
[0259] (iii)具有SEQ ID NO: 12的氨基酸序列的VL CDR3 ;和/或
[0260] 其中所述重鏈可變區(qū)包括：
[0261] (iv)具有SEQ ID NO:7或101的氨基酸序列的可變重鏈（VH)CDRl ;
[0262] (V)具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的VH CDR2 ;和/或
[0263] (vi)具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的VH CDR3 ;或
[0264] (b)是與抗體（a)競爭結合CCR4的抗體。
[0265] 一種抗體，結合人CC趨化因子受體4 (CCR4)的胞外域中的表位并能夠抑制MDC與 CCR4的結合，其中所述抗體
[0266] (a)包括至少一個包含三個⑶R的重鏈可變區(qū)和至少一個包含三個⑶R的輕鏈可 變區(qū)，其中所述輕鏈可變區(qū)包括：
[0267] ⑴具有SEQ ID NO: 108的氨基酸序列的可變輕鏈（VL)CDRl ;
[0268] (ii)具有SEQ ID NO: 110的氨基酸序列的VL CDR2 ;和/或
[0269] (iii)具有SEQ ID NO: 112的氨基酸序列的VL CDR3 ;和/或
[0270] 其中所述重鏈可變區(qū)包括：
[0271] (iv)具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的可變重鏈（VH)CDRl ;
[0272] (V)具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的VH CDR2 ;和/或
[0273] (vi)具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的VH CDR3 ;或
[0274] (b)是與抗體（a)競爭結合CCR4的抗體。
[0275] -種抗體，結合人CC趨化因子受體4 (CCR4)的胞外域中的表位并能夠抑制MDC與 CCR4的結合，其中所述抗體
[0276] (a)包括至少一個包含三個⑶R的重鏈可變區(qū)和至少一個包含三個⑶R的輕鏈可 變區(qū)，其中所述輕鏈可變區(qū)包括：
[0277] (i)具有SEQ ID NO: 16的氨基酸序列的可變輕鏈（VL)⑶Rl ;
[0278] (ii)具有SEQ ID NO: 17的氨基酸序列的VL CDR2 ;和/或
[0279] (iii)具有SEQ ID NO: 18的氨基酸序列的VL CDR3 ;和/或
[0280] 其中所述重鏈可變區(qū)包括：
[0281] (iv)具有SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的可變重鏈（VH)CDRl ;
[0282] (V)具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的VH CDR2 ;和/或
[0283] (vi)具有SEQ ID NO: 15的氨基酸序列的VH CDR3 ;或
[0284] (b)是與抗體（a)競爭結合CCR4的抗體。
[0285] 一種抗體，結合人CC趨化因子受體4 (CCR4)的胞外域中的表位并能夠抑制MDC與 CCR4的結合，其中所述抗體
[0286] (a)包括至少一個包含三個⑶R的重鏈可變區(qū)和至少一個包含三個⑶R的輕鏈可 變區(qū)，其中所述輕鏈可變區(qū)包括：
[0287] (i)具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的可變輕鏈（VL)⑶Rl ;
[0288] (ii)具有SEQ ID N0:23的氨基酸序列的VL CDR2 ;和/或
[0289] (iii)具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的VL CDR3 ;和/或
[0290] 其中所述重鏈可變區(qū)包括：
[0291] (iv)具有SEQ ID NO: 19的氨基酸序列的可變重鏈（VH)CDRl ;
[0292] (V)具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的VH CDR2 ;和/或
[0293] (vi)具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VH CDR3 ;或
[0294] (b)是與抗體（a)競爭結合CCR4的抗體。
[0295] -種抗體，結合人CC趨化因子受體4 (CCR4)的胞外域中的表位并能夠抑制MDC與 CCR4的結合，其中所述抗體
[0296] (a)包括至少一個包含三個⑶R的重鏈可變區(qū)和至少一個包含三個⑶R的輕鏈可 變區(qū)，其中所述輕鏈可變區(qū)包括：
[0297] ⑴具有SEQ ID NO: 129或130的氨基酸序列的可變輕鏈（VL)CDRl ;
[0298] (ii)具有SEQ ID NO: 131或132的氨基酸序列的VL CDR2 ;和/或
[0299] (iii)具有 SEQ ID NO: 133、134、137 或 138 的氨基酸序列的 VL CDR3 ;和 / 或
[0300] 其中所述重鏈可變區(qū)包括：
[0301] (iv)具有SEQ ID NO: 125、126、135或136的氨基酸序列的可變重鏈（VH)CDRl ;
[0302] (V)具有SEQ ID NO: 127或128的氨基酸序列的VH CDR2 ;和/或
[0303] (vi)具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的VH CDR3 ;或
[0304] (b)是與抗體（a)競爭結合CCR4的抗體。
[0305] 在一種實施方式中，所述抗體
[0306] (a)具有 SEQ ID NO:69 的 VH 域和 SEQ ID NO: 70 的 VL 域；或
[0307] (b)是與抗體（a)競爭結合CCR4的抗體。
[0308] 在一種實施方式中，所述抗體
[0309] (a)具有 SEQ ID NO: 71 的 VH 域和 SEQ ID NO: 72 的 VL 域；或
[0310] (b)是與抗體（a)競爭結合CCR4的抗體。
[0311] 在一種實施方式中，所述抗體
[0312] (a)具有 SEQ ID NO: 105 的 VH 域和 SEQ ID NO: 72 的 VL 域；或
[0313] (b)是與抗體（a)競爭結合CCR4的抗體。
[0314] 在一種實施方式中，所述抗體
[0315] (a)具有 SEQ ID NO: 71 的 VH 域和 SEQ ID NO: 115 的 VL 域；或
[0316] (b)是與抗體（a)競爭結合CCR4的抗體。
[0317] 在一種實施方式中，所述抗體
[0318] (a)具有 SEQ ID NO: 73 的 VH 域和 SEQ ID NO: 74 的 VL 域；或
[0319] (b)是與抗體（a)競爭結合CCR4的抗體。
[0320] 在一種實施方式中，所述抗體
[0321] (a)具有 SEQ ID NO: 75 的 VH 域和 SEQ ID NO: 76 的 VL 域；或
[0322] (b)是與抗體（a)競爭結合CCR4的抗體。
[0323] 在一種實施方式中，所述抗體
[0324] (a)具有 SEQ ID NO: 139 的 VH 域和 SEQ ID NO: 140 的 VL 域；或
[0325] (b)是與抗體（a)競爭結合CCR4的抗體。
[0326] 優(yōu)選地，抗體（b)具有一個或多個本文描述的⑶R序列、VH域和/或VL域。
[0327] 優(yōu)選地，抗體（b)與抗體（a)結合相同的表位。
[0328] 基本同源序列的一些例子是與公開的氨基酸序列具有至少70%-致性的序列。在 一些實施方式中，結合CCR4并能夠抑制MDC與CCR4結合的本發(fā)明的抗體包括包括至少一 個輕鏈可變區(qū)和/或至少一個重鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)包括與SEQ ID NO: 140、70、72、 74、76或115的氨基酸序列有至少大約75%、更優(yōu)選地至少大約80%、更優(yōu)選地至少大約 85%、更優(yōu)選地至少大約90%或95%以及最優(yōu)選地至少大約97%的氨基酸序列一致性的 氨基酸序列區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包括與SEQ ID N0:139、69、71、73、75或105的氨基酸序列 具有至少大約75%、更優(yōu)選地至少大約80%、更優(yōu)選地至少大約85%、更優(yōu)選地至少大約 90 %或95 %以及最優(yōu)選地至少大約97 %的氨基酸序列一致性的氨基酸序列區(qū)。
[0329] 基本同源序列的其它優(yōu)選的例子是公開的氨基酸序列中包含保守氨基酸取代的 序列。
[0330] 基本同源序列的其它優(yōu)選的例子是在公開的一個或多個⑶R區(qū)中包含多達1、2、3 或4個，優(yōu)選地多達1或2個變化的氨基酸的序列。這樣的變化可以是保守氨基酸取代或 非保守氨基酸取代，或它們的混合。
[0331] 在所有這樣的實施方式中，優(yōu)選的變化是保守氨基酸取代。
[0332] 在所有的實施方式中，包含基本同源序列的抗體保留結合CCR4的能力和抑制MDC 與CCR4結合的能力。
[0333] 本發(fā)明的其它實施方式提供結合蛋白，所述結合蛋白結合CCR4且具有抑制MDC與 CCR4結合的能力且包括本發(fā)明的抗體、本發(fā)明的VH或VL域、或本發(fā)明的一個或多個CDR。 在一種優(yōu)選的實施方式中，這樣的結合蛋白是抗體。
[0334] 本發(fā)明的優(yōu)選的抗體包括至少一個包括三個⑶R的重鏈可變區(qū)和至少一個包括 三個⑶R的輕鏈可變區(qū)。這些⑶R的例示的和優(yōu)選的序列在本文中描述。
[0335] 如本文中所使用的，除非有其它明確的說明或以科學術語解釋，簡寫術語"CCR4" 意味著CC趨化因子受體4 (也被認為是CD194)。
[0336] CCR4可以是自由CCR4,如重組或純化的CCR4,但優(yōu)選地，它以自然形式存在，如位 于細胞表面上。
[0337] 本發(fā)明的抗體或結合蛋白也可以結合CCR4的片段，特別是包括胞外域或由胞外 域組成的片段，或可以結合包括CCR4或CCR4片段的實體。當然，本發(fā)明的抗體的表位位于 CCR4的胞外域中。
[0338] "CCR4"也可以指任何形式的CCR4,具體是由于CCR4在哺乳動物種類中保守。因 此，本發(fā)明的抗體或抗體片段可以結合例如人、猴子（如食蟹猴）、母牛（牛）、小鼠、大鼠、 倉鼠、雪貂、豚鼠和/或兔的CCR4。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體或抗體片段將至少結合人CCR4。 因此，除非另有說明，本文中任何涉及"CCR4"可以被認為是"人CCR4"。在一些優(yōu)選的實施 方式中，本發(fā)明的抗體或抗體片段將至少結合人和猴子（如食蟹猴）CCR4。在其它優(yōu)選的 實施方式中，本發(fā)明的抗體或抗體片段將至少結合人和小鼠 CCR4。在其它優(yōu)選的實施方式 中，本發(fā)明的抗體或抗體片段將至少結合人、猴子和小鼠 CCR4。在其它優(yōu)選的實施方式中， 本發(fā)明的抗體或抗體片段將至少結合人、猴子、豚鼠和小鼠 CCR4?？贵w9E和9E10J能夠結 合人和猴子CCR4,但不結合鼠 CCR4 (實施例8)，所以在一些優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的抗 體或抗體片段將至少結合人和猴子CCR4,但不結合鼠 CCR4。在其它優(yōu)選的實施方式中，本 發(fā)明的抗體或抗體片段將結合人和猴子CCR4,但不結合鼠 CCR4,如，僅結合人和猴子CCR4。
[0339] 如本文中所使用的，在本發(fā)明的抗體或抗體片段的內容中的術語"結合CCR4"或 "抗CCR4"意味著能夠實施以下一種或多種、優(yōu)選地以下多于一種、以及最優(yōu)選地以下全部 情形的抗體或抗體片段：
[0340] (a)結合在細胞表面上表達的CCR4,如通過流式細胞術或免疫組織化學法所確定 的；
[0341] (b)結合構象依賴的（如非線性的）CCR4表位，如通過在非還原條件下在蛋白質印 跡中結合CCR4所確定的；
[0342] (c)結合固相基質上的自由CCR4,如重組表達的CCR4,如通過ELISA分析或 BIAcore分析所確定的；
[0343] (d)至少結合人CCR4,更優(yōu)選地結合人和猴子CCR4或結合人和小鼠 CCR4,最優(yōu)選 地結合人、猴子和小鼠 CCR4或結合人和猴子CCR4而不結合小鼠 CCR4 ;
[0344] (e)如在本文其它地方所討論的以IOnM或更少、優(yōu)選地5nM或更少、更優(yōu)選地3nM 或更少或2nM或更少、最優(yōu)選地InM或更少的結合親和力（Kd)結合人CCR4 ;
[0345] (f)如在本文其它地方所討論的以相似的親和力，如以IOnM或更少、優(yōu)選地5nM或 更少、更優(yōu)選地3nM或更少或2nM或更少、如InM或更少的Kd結合人和猴子CCR4或結合人 和小鼠 CCR4,優(yōu)選地結合人和猴子CCR4而不結合小鼠 CCR4。
[0346] 本發(fā)明的優(yōu)選的抗體或抗體片段也能夠實施以下一種或多種、優(yōu)選地以下多于一 種以及最優(yōu)選地以下所有的功能性質：
[0347] (g)如在本其它地方描述的誘導CCR4+細胞的ADCC ;
[0348] (h)抑制CCR4與至少MDC和/或TARC、優(yōu)選地MDC和TARC、或優(yōu)選地至少MDC和 /或TARC和選自RANTES、MCP-I和MIP-I α中的一個或多個的結合；
[0349] (i)誘導體內抗腫瘤效果；
[0350] (j)當對患有腫瘤的動物給藥時定位于腫瘤；
[0351] (k)誘導 CCR4+ 細胞的 CDC ;
[0352] (1)抑制對CCR4配體的CCR4介導的細胞應答，優(yōu)選地，抑制對CCR4配體的應答中 胞內鈣離子濃度的增加；
[0353] (m)抑制CCR4+細胞對CCR4配體如MDC的趨化作用。
[0354] 在結合CCR4+細胞的內容中，應當理解，本發(fā)明的抗體結合CCR4+細胞且不明顯地 結合CCR4-細胞（如在實施例2中所顯示的）。
[0355] 術語"不明顯地結合CCR4-細胞"應當被理解為所述抗體與CCR4-細胞的任何結合 都不阻止所述抗體出于治療或診斷目的的應用。因此，"不明顯"結合CCR4-細胞意味著所 述抗體與CCR4-細胞的結合比它與一種或多種CCR4+細胞的結合弱。因此可能與正常細胞 發(fā)生一些交叉反應，但是該結合水平可以被認為是"背景"結合。出于治療或診斷的目的， 主要的考慮是所述抗體與一種或多種類型的CCR4+細胞的結合必須比與任何CCR4-細胞的 結合更強，在治療或診斷應用中，所述抗體可能與CCR4-細胞接觸。
[0356] 本發(fā)明的抗體可以指定為"CCR4特異的"。所述術語"CCR特異的"應當被解釋為 所述抗體與表達CCR4的細胞的結合是足夠特異的以使得所述抗體用于治療或診斷目的。 本領域技術人員可以容易地通過比較與靶定CCR4+細胞的結合力和與一種或多種類型的 CCR4-細胞（如野生型、即未轉染CCR4的HEK293T細胞或DT40細胞）的結合力以確定任何 給定的抗體是否是CCR4特異的。
[0357] 本領域技術人員將知道如使用流式細胞術評估與CCR4+細胞的結合相比較于與 CCR4-細胞的結合，且實施例2中描述了一種合適的實施例。
[0358] 本領域已知的免疫組織化學技術將被用于評價抗體與細胞或樣品的結合。這樣的 分析將被用于檢測具體抗體的特異性，或檢測組織樣品中CCR4表達。簡要地，所述抗體可 以例如在人組織的高密度陣列上被檢測，所述人組織包括陽性對照（已知是CCR4陽性的細 胞）和陰性對照（已知是CCR4陰性的細胞）?？梢酝ㄟ^四步等級（0、1、2、3)的視覺檢查評 估膜染色強度。優(yōu)選的抗體對CCR4+組織顯示弱的或強的免疫組織化學得分，優(yōu)選地為強 的免疫組織化學得分。
[0359] 可以使用已知方法分析種類交叉反應性，實施例8中描述了一個合適的分析。
[0360] 已經顯示抗體17G、9E、10和IlF能夠抑制CCR4與它的配體TARC和MDC結合（實 施例3)。因此，優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體能夠抑制CCR4與一個或多個它的配體結合。優(yōu)選地， 至少抑制與MDC的結合。更優(yōu)選地，抑制與MDC和TARC的結合。在一些實施方式中，抑制 CCR4與TARC的結合。在本文公開的任何方面的實施方式中，本發(fā)明的抗體能夠抑制MDC和 /或TARC與CCR4結合。因此，盡管貫穿本文所提及的是抑制MDC與CCR4的結合，本文公開 的任何該方面和實施方式的一種實施方式是抑制與MDC和/或TARC結合。
[0361] "抑制配體與CCR4的結合"意思是與不存在所述抗體時的結合相比，存在所述抗 體時，配體與〇^4的結合減少了至少20%、30%或40%，更優(yōu)選地至少45%、50%、55%、 60 %、65 %、70 %或75 %，甚至更優(yōu)選地至少80 %。同樣期望配體與CCR4的結合減少了至 少85 %、90%或95 %的實施方式。換一種方式看，當所述配體首先與CCR4接觸，隨后添加 所述抗體，所述配體可以抑制抗體與CCR4結合。
[0362] 確定抗體是否可以抑制配體與CCR4結合的分析是熟知的，并且在實施例3中描述 了一個合適的分析。簡要地，CCR4+細胞用或不用MDC孵育，然后加入抗體，隨后用標記的 抗人抗體探測所述抗體。當存在MDC時，預孵育導致結合CCR4的抗體減少。具體地，抑制 了抗體與轉染了 CCR4和用MDC或TARC預孵育的DT40細胞（ATCC CRL-2111)的結合。
[0363] 用于確定抗體是否能夠阻止配體與CCR4結合的可選擇的分析包括使用標記的配 體，如放射性同位素標記的配體。實施例9中描述了一種合適的分析。
[0364] 抗體17G和9E已經顯示了能夠抑制對CCR4配體的CCR4介導的細胞應答，特別是 通過抑制應答CCR4配體中胞內鈣離子濃度的增加（見實施例5)。已經證明了抗體9E和 9E10J對TARC誘導的信號轉導的依賴劑量的抑制（見實施例5)。因此，本發(fā)明的抗體優(yōu)選 地能夠抑制對CCR4配體的CCR4介導的細胞應答，特別是通過抑制答應CCR4配體中胞內鈣 離子濃度的增加。具體地，所述抗體優(yōu)選地能夠抑制CCRF-CEM細胞（ATCC CCL-119)中MDC 誘導的鈣離子流和/或TARC誘導的鈣離子流。合適的分析方法是已知的，且實施例5中公 開了一個分析。
[0365] 其它優(yōu)選的性質包括當施用本發(fā)明的抗體時在體內不存在有意義的毒性且在體 內不存在有意義的其它副作用。
[0366] 在一些實施方式中，所述抗體可以抑制CCR4+細胞對CCR4配體（如MDC或TARC) 的趨化作用。已經顯示抗體9E和9E10J能夠抑制CCR4+細胞對CCR4配體的趨化作用（實 施例13)。因此，本發(fā)明的抗體優(yōu)選地能夠抑制CCR4+細胞對CCR4配體（優(yōu)選地MDC和/ 或TARC)的趨化作用。
[0367] 在一些實施方式中，所述抗體可以誘導CCR4+細胞的補體依賴細胞毒性（CDC)，但 是在其它實施方式中，所述抗體不能夠誘導CDC。在一些實施方式中，所述抗體可以誘導 CCR4+細胞的細胞凋亡，但是在其它實施方式中，所述抗體不能夠誘導細胞凋亡。抗體9E顯 示不能誘導Ramos細胞的細胞凋亡（見實施例12)，因此在一些實施方式中，本發(fā)明的抗體 不能夠誘導CCR4+細胞的有意義的細胞凋亡。在一些實施方式中，通過結合CCR4所述抗體 可以被CCR4+細胞內在化，但是在其它實施方式中，沒有發(fā)生有意義的內在化。
[0368] 可以使用已知的標準方法評估細胞凋亡的誘導，例如分析膜聯(lián)蛋白V染色的方 法。簡要地，可以用抗體孵育細胞合適的時間，如24小時，并在收獲細胞和膜聯(lián)蛋白V染色 之后，通過FACS分析（如使用EasyCyte)測量所述效果。
[0369] 可以使用已知的標準方法分析CDC的誘導，如基于吸收和代謝氧化還原染料 如Alamar藍來測量活細胞的相對數(shù)量的方法。合適的分析在H Gazzano-Santoro等，J Immunol Methods. 1997,28 ;202 (2) :163-71 中公開。
[0370] 本領域技術人員將知道分析內在化的合適方法，例如在流式細胞術或共聚焦顯微 方法中使用溫差熒光標記。合適的分析的例子包括標記有pH敏感染料（如CypHer5E)的 二級抗體，其在堿性PH值時有最低限度的熒光（如在細胞外所發(fā)現(xiàn)的）和在酸性pH值時 有最大限度的熒光（如在細胞內所發(fā)現(xiàn)的）。
[0371] 可以使用標準方法分析趨化作用的抑制，如使用transwell分析。簡要地，在一個 小室中將能夠進行趨化作用并表達CCR4的細胞與抗體接觸，CCR4配體（如MDC)放置于另 一個小室中，另一個小室與第一個小室通過具有合適孔大小的過濾器膜分開。通過比較存 在抗體時的趨化作用和不存在抗體時的趨化作用，確定所述抗體對細胞向配體遷移（趨化 作用）的作用。
[0372] 術語CCR4的"配體"包括CCR4的天然配體，如MDC、TARC、RANTES、MCP-I和/或 MIP-I α，這些配體可以是天然產生的、重組表達的或在實驗室中合成的。
[0373] "CCR4+細胞"意味著在它們表面表達CCR4的細胞，優(yōu)選地至少基本處于它的野生 構型。CCR4+細胞可以天然地表達CCR4,或者它們可以是表達重組CCR4的轉化體。
[0374] 因此，根據(jù)本發(fā)明，在多種實施方式中可以制備并應用一系列抗CCR4抗體，所述 實施方式包括治療在本文其它地方描述的任何紊亂，具體地是癌癥、免疫紊亂、炎癥紊亂和 傳染。
[0375] 如在貫穿整個申請文件中使用的，術語"一個（種）"在這種意義下使用：它們意 味著"至少一個（種）"、"至少第一個（種）"、"一個（種）或多個（種）"或"多個（種）" 提及的成分或步驟，除非在那之后具體陳述了上限。因此，如在本文中使用的，"抗體"意味 著"至少第一種抗體"。根據(jù)本發(fā)明的公開內容，本領域技術人員將知道組合物的可操作的 限定和參數(shù)，如任何單一試劑的量。
[0376] 本發(fā)明的優(yōu)選實施方式是包括至少一個本發(fā)明的抗CCR4抗體或其抗原結合片段 的組合物。
[0377] 包含編碼如本文定義的本發(fā)明的抗體或它們的部分或片段的核苷酸序列的核酸 分子、或與其基本同源的核酸分子構成了本發(fā)明的另外方面。優(yōu)選的核酸分子包含編碼SEQ ID NO: 35 (優(yōu)選地由 SEQ ID NO: 34 編碼）、SEQ ID NO: 46 (優(yōu)選地由 SEQ ID NO: 45 編碼）、 SEQ ID NO:104(優(yōu)選地由 SEQ ID NO: 103編碼）、SEQ ID NO:114(優(yōu)選地由 SEQ ID NO: 113 編碼）、SEQ ID NO: 57 (優(yōu)選地由 SEQ ID NO: 56 編碼）或 SEQ ID NO: 68 (優(yōu)選地由 SEQ ID N0:67編碼）列出的氨基酸序列的序列。其它優(yōu)選的核酸分子包含編碼重鏈可變區(qū)（VH)的 序列和/或包含編碼輕鏈可變區(qū)（VL)的序列，所述重鏈可變區(qū)具有SEQ ID N0:69、71、73、 75或105(優(yōu)選地分別由SEQ ID勵:77、79、81、83或106編碼）或139的氨基酸序列，所 述輕鏈可變區(qū)具有SEQ ID N0:70、72、74、76或115(優(yōu)選地分別由SEQIDN0:78、80、82、 84或116編碼）或140的氨基酸序列。更優(yōu)選的是編碼以下組合物的核酸：SEQ ID NO: 139 和 140,或 SEQ ID NO: 69 和 70,或 SEQ ID NO: 71 和 72,或 SEQ ID NO: 105 和 72,或 SEQ ID NO: 71和115,或SEQ ID NO: 73和74,或SEQ ID NO: 75和76。同樣優(yōu)選的是包括以下組合 的核酸分子：SEQ ID NO: 77 和 78,或 SEQ ID NO: 79 和 80,或 SEQ ID NO: 106 和 80,或 SEQ ID N0:79 和 116,或 SEQ ID N0:81 和 82,或 SEQ ID N0:83 和 84。
[0378] 其它優(yōu)選的核酸分子包含編碼本發(fā)明的IgG形式的抗體（如在實施例1中描述的 那些）或鼠嵌合形式的抗體的序列。
[0379] 如上所顯示的，本發(fā)明包括的其它核酸分子是編碼本發(fā)明的人抗體的部分或片段 的那些，如編碼抗體的重鏈可變區(qū)（VH)的那些（如編碼SEQ ID勵:69、71、73、75或105的 那些，如分別是SEQ ID N0:77、79、81、83或106)或編碼抗體的輕鏈可變區(qū)（VL)的那些（如 編碼SEQIDN0:70、72、74、76或115的那些，如分別是SEQIDN0:78、80、82、84或116)。 其它優(yōu)選的核酸分子是編碼本發(fā)明的抗體的重鏈的那些（如編碼SEQ ID N0:87、91、95、99、 119或123的那些，如分別是SEQ ID N0:85、89、93、97、117或121)或編碼抗體的輕鏈的那 些（如編碼SEQIDN0:88、92、96、100、120或124的那些，如分別是SEQIDN0:86、90、94、 98、118 或 122)。
[0380] 因此，如本文所定義的抗體的片段、或與其基本同源的序列、或包含編碼這些片段 的序列的核酸分子形成了本發(fā)明的另外方面。
[0381] 有利地，當以IgG形式時，本發(fā)明的抗體具有高的結合CCR4的親和力，即Kd值的 范圍是I X KT8M或I X KT9M或更少。重要地，具有這樣親和力的抗體處于已經顯示用于治 療的確定的范圍。優(yōu)選地，當以IgG形式時，本發(fā)明的抗體結合CCR4的親和力相應于Kd小 于 30nM、20nM、15nM 或 10nM，更優(yōu)選地小于 10、9· 5、9、8· 5、8、7· 5、7、6· 5、6、5· 5、5、4· 5、4、 3· 5、3、2· 5、2、1· 5 或 InM，最優(yōu)選地小于 0· 9、0· 8、0· 7、0· 6、0· 5、0· 4、0· 3、0· 2 或 0· InM。
[0382] 可以使用任何合適的測定Kd的方法。但是，優(yōu)選地通過以下方法測定Kd :在體 外實驗中檢測抗多種濃度抗原（CCR4)的測試抗體的不同濃度以構建飽和曲線，如使用 Lineweaver-Burk方法；或通過使用商業(yè)可購的結合模型軟件，如BlAcorelOOO評估軟件中 的1:1結合模型。實施例2中使用了一種合適的分析，其中使用"一個位點特異結合"模型 f軟件Prism(GraphPad,圣地亞哥，CA)從IgG在CCR+細胞上的滴定計算Kd值。
[0383] 關于Kd值的測定，本領域技術人員將意識到來自使用表達目標物（如CCR4)的細 胞的結合實驗的表觀Kd值不能被認為是親和力的絕對指示，因為實驗條件將影響表觀結 合親和力。例如，CCR4的表達水平可能很大程度地取決于培養(yǎng)細胞的條件以及不同細胞類 型的區(qū)別。因此最好是比較從一組實驗中獲得的表觀Kd值，并且將從一組實驗獲得的表觀 Kd值和從不同組實驗獲得的表觀Kd值進行比較并不總是合適的，特別是如果實驗條件變 化得特別明顯。
[0384] 可選地，可以通過進行細胞表面保持力分析來測定CCR4陽性細胞表面的分離率 和抗體半衰期Adams等，1998, Prolonged in vivo tumour retention of a human diabody targeting the extracellular domain of human HER2/neu. Br J Cancer 77:1405-12 ;Le Gall 等，1999,Di_，tri-and tetrameric single chain Fv antibody fragments against human CD19:effect of valency on cell binding. FEBS Lett 453:164-8。后一種方法更 適于模擬人類病患在治療狀況下的真實情形。
[0385] 在一些實施方式中，本發(fā)明的抗體可以結合人CCR4和猴子CCR4。在物種之間，特 別是人和通常被用作臨床前動物模型的物種之間的這樣交叉反應可能是有利的，因為它使 得從臨床前研究到臨床應用的轉換更有效。例如，具有與在使用的具體動物模型中存在的 天然CCR4交叉反應的抗體意味著這個模型中的結果更接近于反映人類病患的情形，因此 對例如使用的劑量產生更精確的估計并增加鑒定任何潛在相關或有問題的副作用可能性。
[0386] 例如，本發(fā)明的抗體結合人CCR4和猴子CCR4的能力意味著可以在臨床前毒性研 究中檢測這樣的抗體以得知治療的副作用并發(fā)現(xiàn)合適的耐受劑量。
[0387] 此外，結合人CCR4和小鼠 CCR4的能力意味著由在小鼠模型（如使用免疫活性小 鼠的鼠同源模型）中的本發(fā)明抗體顯示的結果更接近于代表抗體在人類受試者中的活性。 這個的原因是結合人CCR4但不結合小鼠 CCR4的抗體將結合由小鼠模型中的人腫瘤細胞表 達的CCR4而不能結合內源鼠 CCR4。這當然與人類病患的情形不同，其中存在腫瘤表達CCR4 和內源CCR4。
[0388] 這特別是抗體對鼠 CCR4和人CCR4有相似親和力的情況。
[0389] 這種情形的潛在缺點是結合人CCR4但不結合鼠 CCR4或對鼠 CCR4具有明顯較低 親和力的抗體可能在免疫系統(tǒng)受損的鼠（如裸鼠或SCID鼠）的人腫瘤移植物模型中良好 地實現(xiàn)功能，但是這可能不能由在存在更多CCR4的人系統(tǒng)中進行相似的功能實現(xiàn)而反映。 換句話說，在具有結合人CCR4但不結合小鼠 CCR4的抗體的小鼠移植物系統(tǒng)中看到的抗腫 瘤效果可能比臨床實際情況看上去更好。相反，當與結合人CCR4和小鼠 CCR4的抗體一起 處理時，這將與小鼠模型系統(tǒng)中存在的所有形式的CCR4都結合，并且當更接近于表示當抗 體被投放于人體中的情形。這特別是抗體對鼠 CCR4和人CCR4有相似親和力的情況。
[0390] 在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的抗體以相似的親和力結合人CCR4和猴子CCR4,或 結合人CCR4和小鼠 CCR4,所述親和力例如是Kd值為IOnM或更少或5nM或更少，更優(yōu)選地 為3nM或更少或2nM或更少，最優(yōu)選地是InM或更少。
[0391] "相似的親和力"意思是所述抗體與人CCR4的結合親和力和所述抗體與一種或多 種感興趣的其它物種（如猴子或小鼠）的結合親和力是可比的，如不多于20倍的差異。更 優(yōu)選地，結合親和力之間的所述差異少于15倍，更優(yōu)選地少于10倍，最優(yōu)選地少于5、4、3 或2倍。
[0392] 但是，在其它實施方式中，本發(fā)明的抗體可能不結合猴子CCR4和/或它們可能不 結合小鼠 CCR4。
[0393] 本發(fā)明的抗體結合CCR4。因此，本發(fā)明的抗體或結合蛋白可以用于在體內或體外 探測CCR4,特別是探測CCR4+細胞。例如，由于一些腫瘤細胞上表達CCR4,本發(fā)明的抗體或 結合蛋白可以用于在體內或體外探測腫瘤細胞。此外，所述抗體定位于CCR4+細胞的能力 意味著本發(fā)明的抗體可以靶定存在CCR4+細胞的身體位點，其中所述抗體可以在所述靶位 點上起作用。具體地，所述抗體定位于CCR4+腫瘤細胞的能力意味著本發(fā)明的抗體能夠靶 定存在CCR4+腫瘤細胞的身體位點，其中所述抗體可以在所述靶位點上起作用。
[0394] 例如，所述抗體可以如通過激活或誘導ADCC來誘導它本身的抗CCR4+細胞作用， 即作為裸露的抗體。作為裸露Ab的能力是有益的?？蛇x地或另外地，通過與另一種治療分 子（如本文中所描述的毒素或其它抗癌分子或抗炎試劑）連接，所述抗體可以誘導抗CCR4+ 細胞作用。
[0395] 優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體具有誘導CCR4+細胞的抗體依賴細胞毒性（ADCC)的能力。 可以在體外使用本領域已知的方法測定ADCC。實施例6中描述了 一個合適的方法?？蛇x地， 例如，可以使用鉻51釋放試驗。因此，在體外如存在人PBMC，本發(fā)明的抗體可以引起殺死 至少 10%、15%、20%、22%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%的(：0?4+細胞。 例如，已經顯示在存在人PBMC時，抗體17G可以引起殺死至少10%、15%、20%或22%的 CCR4+細胞系CCRF-CEM ;而在存在人PBMC時，抗體9E可以引起殺死至少10 %、15 %、20 %、 22%、30%、40%、45%、50%、55%的 CCR4+細胞系 CCRF-CEM(見實施例 6)。在存在人 PBMC 時，已經顯示抗體9E10J可以引起殺死至少10%、15%、20%、22%、30%、35%、40%、42% 的CCR4+細胞系CCRF-CEM (見實施例6)。對于一些應用，特別是一些治療應用，ADCC是有 利的。因此，在優(yōu)選實施方式中，所述抗體可以誘導CCR4+細胞的ADCC，優(yōu)選地是CCR4+腫 瘤細胞和/或CCR4+Th2細胞的ADCC。在一些實施方式中，所述抗體介導的ADCC存在PBMC， 但是同樣預期抗體介導的ADCC缺少PBMC的實施方式。在其它實施方式中，所述抗體幾乎 不誘導或誘導不明顯的ADCC。
[0396] 在需要的抗體濃度以達到這樣的ADCC水平方面，優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體同樣地顯 示出合適的效力。再一次，實施例6中描述了一種合適的體外試驗。因此，在體外，CCR4+細 胞（如CCRF-CEM細胞）的半數(shù)最大量細胞溶解所需要的抗體濃度（EC 5tl)優(yōu)選地小于700ng/ ml、650ng/ml、620ng/ml、600ng/ml、550ng/ml、500ng/ml、450ng/ml、400ng/ml、350ng/ml、 300ng/ml、250ng/ml、200ng/ml、150ng/ml、100ng/ml、90ng/ml、80ng/ml、70ng/ml、60ng/ml、 50ng/ml、46ng/ml、40ng/ml、35ng/ml、30ng/ml、25ng/ml、20ng/ml、15ng/ml、10ng/ml、9ng/ ml、7ng/ml、5ng/ml、2ng/ml、lng/ml、0. 5ng/ml 或 0· 25ng/ml。例如，已經顯示本發(fā)明的 17G 抗體對CCRF-CEM細胞的EC5tl是619ng/ml ;本發(fā)明的抗體9E對CCRF-CEM細胞的EC 5Q是 46ng/ml ;在一個單獨的實驗中，本發(fā)明的抗體9E10 J對CCRF-CEM細胞的EC5tl是25ng/ml (見 實施例6)。
[0397] 當與合適的對照水平比較時，優(yōu)選地，上述能力是在可測量的或有意義的水平上 觀察到的，更優(yōu)選地，在統(tǒng)計學有意義的水平上觀察到的。
[0398] 應當注意，關于非特異和特異腫瘤細胞溶解的量以及EC50值，由不同供體制備的 PBMC (效應細胞）可能展示明顯不同的ADCC。該現(xiàn)象已經由Naundorf等，2002描述，當由 本發(fā)明的抗體試驗ADCC時同樣能夠觀察到（見實施例6和11)。
[0399] 人IgGl是一種糖蛋白，具有兩條N連接的連接至Fc域的寡聚糖鏈。所述寡聚糖 是復合的雙觸角型，包括三甘露糖核心結構，存在或不存在核心巖藻糖、二等分的N-乙酰 氨基葡萄糖（GIcNAc)、半乳糖和末端唾液酸，引起了結構多種多樣。人血清IgG和治療抗體 已知都是典型地嚴重巖藻糖化。
[0400] 已經報導，在一些實例中，可以通過操縱人IgGl亞家族上的寡聚糖狀態(tài)以實現(xiàn) ADCC的增強。具體地，已經顯示去巖藻糖化能夠引起一些抗體的ADCC活性增加 （Niwa R 等，2004)。因此，在優(yōu)選實施方式中，在生產/表達蛋白過程中、和/或體外生產/表達蛋 白之后修飾根據(jù)本發(fā)明的抗體以產生特異的糖基化形式，特別是對抗體的治療應用有益的 糖基化形式。優(yōu)選地，所述特異的糖基化形式是減少或缺失基于巖藻糖的糖基化，其優(yōu)選地 增加了抗體誘導ADCC的能力。因此，在優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明的抗體具有特異的糖基化 形式，優(yōu)選地增加所述抗體誘導ADCC的特異的糖基化形式。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體是去巖 藻糖化的或非巖藻糖化的。
[0401] 本領域技術人員知道制備去巖藻糖化或非巖藻糖化的抗體的合適方法。如在實施 例10中所描述的，這可以通過在存在Kifunensine (例如100ng/ml)時生產抗體而完成，所 述Kifunensine是I型α -甘露糖苷酶的選擇性抑制劑，導致在生產過程中所述分子的巖 藻糖基化減少。缺失一種或多種對于寡聚糖基質的巖藻糖基化所需的蛋白的合適宿主細胞 可以用于制備去巖藻糖基化的抗體，如巖藻糖基轉移酶缺失的宿主細胞。合適的宿主細胞 的例子是這樣的細胞：其中與胞內糖核苷一GFP-巖藻糖的合成相關的酶活性和/或與糖鏈 修飾相關的酶活性是減少的或缺失的，所述糖鏈修飾中巖藻糖的第一位與N-乙酰氨基葡 萄糖的第六位在還原末端通過復合的N-糖苷連接的糖鏈中的α鍵連接。這樣的酶的例子 包括與⑶P-巖藻糖合成相關的酶，包括GMD (⑶P-甘露糖4, 6-脫水酶）、Fx (⑶P-酮-6-脫 氧甘露糖-3, 5-差向異構酶、4-還原酶）、GFPP (⑶P- β -L-巖藻糖焦磷酸化酶）。
[0402] "去巖藻糖化"的意思是結合至Fc區(qū)的總復合的N-糖苷連接的糖鏈中至少10%， 優(yōu)選地至少 20%、30%、4050%、60%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、 96%、97%、98%或至少99%是巖藻糖沒有結合至糖鏈的還原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的 糖鏈。
[0403] "非巖藻糖化"的意思是抗體中不存在明顯水平的巖藻糖。
[0404] -些抗體能夠被它們結合的細胞內在化。因此，在本發(fā)明的一些實施方式中，實施 抗體能夠被內在化。這個性質特別有利于用在免疫交聯(lián)物中，因為與所述抗體分子連接的 任何其它試劑應當與抗體分子一起被內在化。在其它實施方式中，沒有看見明顯的內在化。
[0405] 具體對于醫(yī)藥應用，期望的是所述抗體沒有誘導任何明顯的血小板聚集。可以如 在實施例15中所描述的測定血小板聚集。該實施例顯示了抗體9E10J對血小板聚集沒有 明顯的作用。因此，在本發(fā)明的一些實施方式中，所述抗體對血小板聚集沒有任何明顯的作 用。
[0406] 如上述討論的，一些PBL(包括Treg)表達CCR4,因此在實施例16中試驗了抗體 9E10J對PBL的能力，且該實施例顯示9E10J可以結合PBL。因此，在本發(fā)明的一些實施方 式中，所述抗體可以結合PBL，優(yōu)選地結合Treg和/或Th2細胞。這個性質是有利的，特別 是在免疫治療中，因為它可能耗盡Treg細胞。
[0407] 在下面的關于本發(fā)明的組合物、免疫交聯(lián)物、醫(yī)藥品、復合物、雞尾酒、試劑盒、第 一和第二醫(yī)藥應用和所有方法的描述中，除非另有明確的說明或以科技術語解釋，術語"抗 體"和"免疫交聯(lián)物"、或它們的抗原結合區(qū)或片段指抗CCR4抗體以及具體的17G、9E、10、 11F、9E10J 和 9E1D 抗體。
[0408] 如在本文中使用的"抗體"和"免疫球蛋白"廣泛地指包括人抗原結合域的任何免 疫學結合試劑或分子，包括多克隆抗體和單克隆抗體。根據(jù)重鏈恒定區(qū)的類型，所有抗體都 被指定為五個主要類之一 ：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM,且本發(fā)明的抗體可能是這些類中的任 何一個。這些中的幾個被進一步分為亞類或同種型，如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4等等。對應 于不同免疫球蛋白家族的重鏈恒定區(qū)被分別定義為α、δ、ε、 Y和μ。不同類的免疫球 蛋白的亞單元結構和三維構造是已知的。
[0409] 通常，當本發(fā)明中使用全抗體而不是抗原結合區(qū)時，IgG和/或IgM是優(yōu)選的，因 為它們在生理情形中是最常見的抗體且因為它們在實驗室裝置中最容易制備。特別優(yōu)選的 是IgGl抗體。
[0410] 基于它們恒定域的氨基酸序列和可變域的框架區(qū)的一些氨基酸，哺乳動物抗體的 "輕鏈"被指定為兩種特別不同類型之一：卡帕（Ο和拉姆達（λ)。本發(fā)明的抗體對使用 K或λ輕鏈恒定區(qū)基本沒有偏好。
[0411] 如本領域技術人員所理解的，由術語"抗體"所包括的免疫學結合反應物擴展至所 有抗體和它們的抗原結合片段，包括全抗體、二聚抗體、三聚抗體和多聚抗體、雙特異抗體、 嵌合抗體、重組抗體和工程抗體，和它們的片段。
[0412] 因此，術語"抗體"用于表示具有抗原結合區(qū)的任何抗體樣分子，且該術語包括包 含抗原結合域的抗體片段，如Fab'、Fab、F(ab'） 2、單域抗體（DABs)、TandAbs二聚物、Fv、 SCFV (單鏈Fv)、(^?￥、(18-80?￥、？(1、線性抗體、小體（111；[11；[130(1丨68)、雙價抗體、雙特異抗體片 段、雙祀向抗體（bibody)、三革巴向抗體（tribody)(分別指scFv-Fab融合的、雙特異的或三 特異的）、sc-雙價抗體、κ ( λ )抗體（scFv-CL融合物）、雙特異T細胞聯(lián)合體（Engager) (BiTE) (scFv-scFv串聯(lián)體以吸引T細胞）、雙可變域（0￥0)18(雙特異形式）、小免疫蛋白 (SIP)(小體類型）、SMIP( "小模塊化免疫治療物" scFv-Fc二聚物、DART(ds-穩(wěn)定的雙價 抗體"雙重親和力重復靶定"）、包括一個或多個⑶R的小抗體類似物等。
[0413] 制備和使用多種基于抗體的構建體和片段的技術是本領域已知的（見Kabat等， 1991，通過引用的方式特異結合至本文）。具體地，雙價抗體在EP 404, 097和WO 93/11161 中進一步描述，而線性抗體在Zapata等（1995)中進一步描述。
[0414] 可以使用常規(guī)技術將抗體分成片段。例如，可以通過用胃蛋白酶處理所述抗體而 產生F(ab'） 2片段?？梢蕴幚淼玫降腇(ab'）2片段以減少二硫鍵橋以產生Fab1片段。木瓜 蛋白酶的消化可以導致形成Fab片段。同樣可以通過重組技術合成或化學合成Fab、Fab'和 F(ab'）2、scFv、Fv、dsFv、Fd、dAbs、TandAbs、ds-scFv、二聚物、小體、雙價抗體、雙特異性抗 體片段和其它片段。本領域中已知并描述了生產抗體片段的技術。例如，Beckman等，2006 ; Holliger&Hudson, 2005 ;Le Gall 等，2004 ;Reff&Heard, 2001 ;Reiter 等，1996 和 Young 等，1995都進一步描述和實施了有效抗體片段的生產。
[0415] 所述抗體或抗體片段可以天然產生或完全合成或部分合成產生。因此所述抗體可 以來自任何合適來源、如重組來源和/或在轉基因動物或轉基因植物中、如在使用IgY技術 的卵中產生。因此，所述抗體分子可以在體內或體外生產。
[0416] 優(yōu)選地，所述抗體或抗體片段包括包含三個⑶R域的抗體輕鏈可變區(qū)（')和包含 三個⑶R域的重鏈可變區(qū)（V h)。所述VL和VH通常來自于抗原結合位點。
[0417] "Fv"片段是包含全部的抗原識別位點和結合位點的最小抗體片段。該區(qū)具有緊密 而非共價連接的一個重鏈可變域和一個輕鏈可變域的二聚物。在這個結構中，每個可變域 的三個超變區(qū)（CDR)互相作用以限SV h-'二聚物表面的抗原結合位點。共同地，六個超變 區(qū)（CDR)賦予了抗體抗原結合特異性。
[0418] 但是，在本領域中有明確的記載：抗體存在輕鏈可變域的三個⑶R和重鏈可變域 的三個CDR對于抗原結合并不是必須的，因此，小于上述典型抗體片段的結構已知是有效 的。
[0419] 例如，胳馬它（camelid)抗體（Hamers-Casterman 等，1993 ;Arbabi Ghahroudi 等，1997)具有廣泛的抗原結合性質但是缺少輕鏈。同樣，僅包括VH域（Ward等，1989 ; Davies 和 Riechmann, 1995)或僅包括 VL 域（van den Beucken 等，2001)的單域抗體的結 果顯示這些域可以以可接受的高親和力結合抗原。因此，三個CDR能夠有效地結合抗原。
[0420] 同樣已知單一⑶R、兩個⑶R可以有效地結合抗原。作為第一種例子，單一⑶R可 以插入至異種的蛋白并賦予所述異種蛋白以抗原結合能力，如通過插入至異種蛋白（如 GFP)的VH⑶R3區(qū)賦予所述異種蛋白以抗原結合能力所例示的（Kiss等，2006;Nicaise 等，2004)。
[0421] 進一步已知兩個⑶R可以有效結合抗原，甚至賦予比親本抗體所具有的更好的性 質。例如，已經顯示（Qiu等，2007)，來自親本抗體的兩個⑶R(VH⑶Rl區(qū)和VL⑶R3區(qū)） 保持了親本分子的抗原識別性質，但是具有更好的滲透腫瘤的能力。使用合適的連接片段 (如來自于VH FR2)以類似于天然親本抗體的方式將這些CDR域連接起來以調整CDR產生 更好的抗原識別。因此，本領域已知，以合適的框架區(qū)的方式構建包括兩個CDR域（優(yōu)選地 一個來自VH域且一個來自VL域，更優(yōu)選地，兩個⑶R域的一個是⑶R3域）的結合抗原的 抗體類似物以保持在親本抗體中發(fā)現(xiàn)的構造是可能的。
[0422] 因此，盡管本發(fā)明的優(yōu)選抗體可能包括六個⑶R區(qū)（三個來自于輕鏈，三個來自于 重鏈），本發(fā)明也包括具有少于六個CDR區(qū)的抗體和少至一個或兩個CDR區(qū)的抗體。此外， 同樣預期具有僅來自重鏈或輕鏈的CDR的抗體。
[0423] 結合CCR4的本發(fā)明的優(yōu)選抗體包括至少一個包括三個⑶R的重鏈可變區(qū)和至少 一個包括三個⑶R的輕鏈可變區(qū)，其中所述重鏈可變區(qū)包括：
[0424] (a)具有SEQ ID NO: 1的氨基酸序列或與其基本同源的序列的可變重鏈（VH) CDRl ;
[0425] (b)具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列或與其基本同源的序列的VH⑶R2 ;和
[0426] (c)具有SEQ ID NO:3或15的氨基酸序列或與其基本同源的序列的VH CDR3 ;或
[0427] (d)具有SEQ ID N0:7或101的氨基酸序列或與其基本同源的序列的可變重鏈 (VH)CDRl ;
[0428] (e)具有SEQ ID N0:8的氨基酸序列或與其基本同源的序列的VH⑶R2 ;和
[0429] (f)具有SEQ ID N0:9的氨基酸序列或與其基本同源的序列的VH CDR3 ;或
[0430] (g)具有SEQ ID NO: 19的氨基酸序列或與其基本同源的序列的可變重鏈（VH) CDRl ;
[0431] (h)具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列或與其基本同源的序列的VH CDR2 ;和
[0432] (i)具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列或與其基本同源的序列的VH⑶R3 ;或
[0433] (j)具有SEQ ID NO: 125或126的氨基酸序列或與其基本同源的序列的可變重鏈 (VH)CDRl ;
[0434] (k)具有SEQ ID NO: 127或128的氨基酸序列或與其基本同源的序列的VH CDR2 ; 和
[0435] (c)具有SEQ ID N0:9的氨基酸序列或與其基本同源的序列的VH⑶R3。
[0436] 用于與具體的重鏈⑶R區(qū)連接的優(yōu)選的輕鏈⑶R區(qū)在本文其它地方描述。但是， 同樣期待包括三個CDR的用于與本發(fā)明的重鏈可變區(qū)連接的其它輕鏈可變區(qū)。本領域技術 人員可以容易地鑒定與本發(fā)明的重鏈可變區(qū)組合并產生結合CCR4的抗體的合適的輕鏈可 變區(qū)。
[0437] 例如，本發(fā)明的重鏈可變區(qū)可以與單一的輕鏈可變區(qū)或所有的輕鏈可變區(qū)組合， 得到的抗體經檢測與CCR4結合。將期望的是合理數(shù)量的這種本發(fā)明的重鏈可變區(qū)與不同 的輕鏈可變區(qū)的組合將保持結合CCR4的能力。
[0438] 相似的方法將用于鑒定與本發(fā)明的優(yōu)選輕鏈可變區(qū)組合的可選的重鏈可變區(qū)。
[0439] 在一些實施方式中，所述抗體或抗體片段包括全部或一部分重鏈恒定區(qū)，如IgGU IgG2、IgG3、IgG4、IgAl、IgA2、IgE、IgM或IgD恒定區(qū)。優(yōu)選地，所述重鏈恒定區(qū)是IgGl重 鏈恒定區(qū)，或其一部分。此外，所述抗體或抗體片段可以包括全部或一部分κ輕鏈恒定區(qū) 或λ輕鏈恒定區(qū)，或其一部分。所有或部分這樣的恒定區(qū)可以天然產生或可以全部或部分 地合成。這樣恒定區(qū)的合適序列是已知的并在本領域中有文獻記載。當本發(fā)明的抗體包括 來自重鏈和輕鏈的全部恒定區(qū)時，這樣的抗體在本文中典型地被定義為"全長"抗體或"完 全"抗體。
[0440] 包含F(xiàn)c區(qū)的抗體優(yōu)選用于一些應用，特別是體內治療應用，其中Fc區(qū)調節(jié)了效應 作用，如ADCC。
[0441] 本文使用的與氨基酸或核酸序列相關的術語"基本同源"包括與本文公開的氨基 酸或核酸序列具有至少70 %或75 %、優(yōu)選地至少80 %、以及甚至更優(yōu)選地至少85 %、90 %、 95 %、96 %、97 %、98 %或99 %序列一致性的序列。因此，本發(fā)明的基本同源序列包括本發(fā)明 的序列的單一或多個堿基或氨基酸改變（添加、取代、插入或缺失）。在氨基酸水平，優(yōu)選的 基本同源序列在一個或多個框架區(qū)和/或構成本發(fā)明的序列的一個或多個CDR中包含多至 1、2、3、4或5個、優(yōu)選地多至1、2或3個、更優(yōu)選地多至1或2個變化的氨基酸。所述改變 可以是保守的氨基酸或非保守的氨基酸。優(yōu)選地，所述改變是保守氨基酸取代。
[0442] 基本同源的核酸序列也包括與本文公開的核酸序列（或它們的互補序列）雜交的 核苷酸序列，如在至少適度嚴格雜交條件下與編碼本發(fā)明的一個或多個輕鏈或重鏈的⑶R、 本發(fā)明的輕鏈可變區(qū)或重鏈可變區(qū)或本發(fā)明的抗體的核苷酸序列雜交（或與它們的互補 序列雜交）的核苷酸序列。
[0443] 術語"基本同源"同樣包括本發(fā)明的氨基酸序列和核苷酸序列的變異體或化學等 價物，所述變異體或化學等價物以基本相同的方式實現(xiàn)與本發(fā)明的蛋白或核酸分子基本相 同的功能。例如，任何基本同源抗體（或編碼它的基本同源的核酸）需要保持上述的結合 CCR4的能力。例如，任何基本同源的抗體應當保持如在本文其它地方所定義的抗體功能性 能力。優(yōu)選地，任何基本同源的抗體應當保持與被所討論的抗體識別的CCR4的相同表位特 異結合的能力，所述相同表位如本發(fā)明的CDR域識別的相同表位或本文公開的本發(fā)明的VH 和VL域。通過本領域已知和描述的方法，如使用結合分析（如競爭分析）可以容易地檢測 與相同表位/抗原的結合?？梢酝ㄟ^本領域已知和描述的方法容易地檢測其它功能性質的 保持力。
[0444] 因此，本領域技術人員將意識到，所述結合分析可以用于檢測"基本同源"抗體是 否具有與本發(fā)明的抗體和抗體片段相同的結合特異性，例如，如ELISA分析或BIAcore分析 的結合分析可以容易地用于確定這樣的"基本同源"抗體是否可以結合CCR4。如上所述，競 爭結合分析可以用于檢測"基本同源"抗體是否保持與本發(fā)明的抗體所識別的基本一樣的 CCR4表位特異結合的能力。下面所述的方法僅是合適的競爭分析的一個例子。本領域技術 人員將知道其它合適的方法和變化。
[0445] 本發(fā)明蛋白的基本同源序列包括，但不限于，保守氨基酸取代；或例如不影響抗體 的VH、VL或CDR域的變化，所述抗體包括例如使用不同連接片段的scFv抗體或添加有對結 合抗原沒有影響的標簽序列或其它成分的抗體；或將一種類型或形式的抗體分子或片段轉 換成另一種類型或形式的抗體分子或片段（如從Fab轉化成scFv，反之亦然）；或將一種抗 體分子轉化成一種具體家族類或亞類的抗體分子（如將一種抗體分子轉化成IgG或其亞類 如 IgGl 或 IgG3)。
[0446] 本文使用的"保守氨基酸取代"是指所述氨基酸殘基被具有相似側鏈的另一種氨 基酸取代。本領域已經定義了具有相似側鏈的氨基酸家族，包括堿性側鏈（如賴氨酸、精氨 酸、組氨酸）、酸性側鏈（如天冬氨酸、谷氨酸）、無電荷的極性側鏈（如甘氨酸、天冬酰胺、 谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸）、非極性側鏈（如甘氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、 纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸）、分支側鏈（如蘇氨酸、 纈氨酸、異亮氨酸）和芬芳側鏈（如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸）。
[0447] 可以用任何合適的方法評估一致性。但是，對于確定序列之間的一致程度，使序列 進行多重比對的計算機程序（如Clustal W，（Thompson等，1994))是有用的。如果需要，所 述Clustal W運算法則可以與BLOSUM 62得分矩陣（Henikoff和Henikoff, 1992)和10分 的缺口打開處罰和0. 1分的缺口延伸處罰一起使用，使得在兩條序列之間獲得最商的順序 匹配，其中，所述比對包括一條序列的至少50%的總長度?？梢杂糜诒葘π蛄械钠渌椒ㄊ?Needleman和Wunsch (1970)提出的比對方法，并由Smith和Waterman (1981)修訂，使得在 兩條序列之間獲得最高的順序匹配并確定兩條序列之間相同氨基酸的數(shù)量。計算兩條氨基 酸序列之間百分比一致性的其它方法是本領域公認的，包括例如Carillo和Lipton(1988) 描述的那些，和在牛津大學出版社（紐約，1988)出版的Biocomputing:Informatics and Genomics Projects中所描述的那些。
[0448] 通常，計算機程序可以用于這樣的計算。比較和比對序列對的程序，如 ALIGN (Myers 和 Miller, 1988)、FASTA (Pearson 和 Lipman, 1988 ;Pearson, 1990)和缺口的 (gapped)BLAST(Altschul 等，1997)、BLASTP、BLASTN 或 GCG(Devereux 等，1984)也可以 用于這個目的。此外，歐洲生物信息研究所的Dali服務器提供基于結構的蛋白序列比對 (Holm, 1993 ; 1995 ; 1998)。
[0449] 通過提供參考點，可以使用具有默認參數(shù)（如在GENESTREAM網絡服務器，IGH，蒙 彼利埃，法國的互聯(lián)網上可以利用的）的ALIGN程序測定根據(jù)本發(fā)明的具有70%、75%、 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同源性或序列一致性的序列。
[0450] "至少適度嚴格雜交條件"意思是促進溶液中兩個互補核酸分子之間選擇性雜 交的條件。雜交可以發(fā)生于全部或部分核酸序列分子。所述雜交部分的長度典型地是 至少15(如20、25、30、40或50)個核苷酸。本領域技術人員將意識到核酸二倍體或雜 交體的穩(wěn)定性由Tm決定，所述Tm在包含鈉的緩沖液中由鈉離子濃度和溫度決定（Tm = 81.5°C-16.6(Logl0[Na+])+0.41(% (G+O-600/1)或相似的等式）。因此，決定雜交體穩(wěn) 定性的清洗條件的參數(shù)是鈉離子濃度和溫度。為了鑒定與已知核酸分子相似但不相同的分 子，可以假定1 %的錯配，導致Tm降低大約1°C。例如，如果尋找的核酸分子具有>95%的一 致性，最終的清洗溫度將減少大約5°C?；谶@些考慮，本領域技術人員將能夠容易地選擇 合適的雜交條件。在優(yōu)選的實施方式中，選擇嚴格雜交條件。例如，可以使用以下條件以完 成嚴格雜交：基于上述等式，在Tm-5°C、5X氯化鈉/檸檬酸鈉（SSC)/5XDenhardt' s溶液 /1.0% SDS下雜交，然后在60°C、0. 2XSSC/0. 1% SDS下清洗。適度嚴格雜交條件包括在 42°C、3XSSC下的清洗步驟。進一步舉例，"雜交"的序列是在非嚴格條件（如室溫，6XSSC， 50%甲酰胺）結合（雜交）的并在低嚴格條件（如室溫、2父55(：，更優(yōu)選地421：、2\55〇 或更高嚴格條件（如65°C、2XSSC)下清洗的那些序列（其中，SSC = 0· 15M NaCl、0. 015M 朽1檬酸鈉，pH7. 2)。
[0451] 但是，應當理解，可以使用選擇性的緩沖液、鹽和溫度實現(xiàn)相當?shù)膰栏穸?。關 于雜交條件的其它指導可以在Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley&Sons，N. Y.，1989,6. 3. 1-6. 3. 6和Sambrook等，分子克隆，實驗室手冊，冷泉港出版 社，1989,卷3中找到。
[0452] 一般而言，優(yōu)選在高嚴格度條件下雜交的序列，如若不是密碼子簡并，在高嚴格度 條件下雜交的序列。
[0453] 在其它優(yōu)選的實施方式中，提供比初始抗CCR4抗體（如17G、9E、10、11F、9E10J* 9E1D)具有改進或更優(yōu)越性質的二代抗體。例如，所述二代抗體具有更強的結合CCR4的親 和力、更好的交叉反應性、更好的靶定CCR4+細胞（特別是腫瘤細胞）的能力、改進的誘導 ADCC的能力、改進的誘導CDC的能力、改進的對本文其它地方描述的紊亂的治療能力。
[0454] 使用如本文或本領域詳細描述的一種或多種分析法可以容易地進行和量化用于 鑒定有效的二代抗體的比較。與本發(fā)明的抗CCR4抗體（如17G、9E、10、11F、9E10J*9E1D 抗體）相比，具有至少2倍、5倍、10倍、20倍和優(yōu)選地至少50倍的改進的生物學性質或活 性的二代抗體包括在本發(fā)明中。
[0455] 本發(fā)明的抗體、結合蛋白和核酸分子通常是"分離的"或"純化的"分子范圍，因為 它們與在人和動物體或源自人或動物體的組織樣品中原位存在的任何這樣的成分不同。但 是。所述序列可以與在人或動物體中發(fā)現(xiàn)的序列相應或基本同源。因此，本文使用的涉及 核酸分子或序列和蛋白或多肽（如抗體）的術語"分離的"或"純化的"表示從它們的天然 環(huán)境中分離、純化或基本游離的分子，如從人或動物體分離或純化的分子（如果真正地，它 們天然發(fā)生），或表示由技術方法產生的分子，即包括重組體和合成產生的分子。
[0456] 因此，當與核酸分子聯(lián)合使用時，這樣的術語可以表示基本上沒有材料的核酸，所 述材料天然地與其它核酸/基因或多肽聯(lián)合。這些術語也可以表示當由重組DNA技術產生 時基本上沒有細胞物質或培養(yǎng)基的核酸，或當化學合成時基本上沒有化學前體或其它化學 物質的核酸。分離的或純化的核酸也可以是基本上沒有在源自的核酸中與所述核酸天然側 翼連接的序列（即位于所述核酸的5'或3'末端的序列）或由例如基因工程方法連接至核 酸側翼的序列（如標簽序列或沒有治療價值的其它序列）。
[0457] 因此，當與本發(fā)明的蛋白或多肽分子如輕鏈⑶Rl、2和3、重鏈⑶Rl、2和3、輕鏈可 變區(qū)、重鏈可變區(qū)和結合蛋白或抗體（包括全長抗體）聯(lián)合使用時，術語"分離的"或"純化 的"典型地指基本上沒有它所源自的來源的細胞物質或其它蛋白的蛋白。在一些實施方式 中，特別是當所述蛋白應用于人或動物時，當由重組技術產生時，這樣的分離的或純化的蛋 白基本上沒有培養(yǎng)基；或者當化學合成時，這樣的分離的或純化的蛋白基本上沒有化學前 體或其它化學物質。這樣的分離的或純化的蛋白也可以是無側翼序列的，如上述關于分離 的核酸分子所描述的那些。
[0458] 本文使用的術語"核酸序列"或"核酸分子"指天然存在的堿基、糖和糖之間（骨 架）連接鍵組成的核苷酸或核苷酸單體序列。該術語同樣包括含有非天然存在的單體的修 飾的或取代的序列或它們的一部分。本發(fā)明的核酸序列可以是脫氧核糖核酸序列（DNA)或 核糖核酸序列（RNA)且可以包括天然存在的堿基，包括腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶 和尿嘧啶。這些序列也可以包含修飾的堿基。這樣修飾的堿基的例子包括氮雜和脫氮雜腺 嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶，以及黃嘌呤和次黃嘌呤。所述核酸分子可以是雙 鏈或單鏈的。所述核酸分子可以是全部地或部分地合成或重組。
[0459] 在優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明的抗體是人抗體，更優(yōu)選地是全長人抗體。在這點上， 人抗體對于人類治療通常具有至少三個潛在優(yōu)勢。第一，人免疫系統(tǒng)不會將所述抗體識別 為外來物質。第二，在人體循環(huán)中的半衰期將與天然發(fā)生在人體中的半衰期相似，使得可以 給予較小的和更少頻率的劑量。第三，由于所述效應器是人，它將與人免疫系統(tǒng)的其它部分 更好地相互作用，例如通過補體依賴的細胞毒性（CDC)或抗體依賴的細胞毒性（ADCC)更有 效地破壞靶細胞。
[0460] 但是，盡管人抗體通常被認為表現(xiàn)這些優(yōu)勢，已知開發(fā)具有足夠親和力和合適功 能性質以使得它們作為成功的人類治療的候選物的人類抗體絕不是簡單的。因此本領域仍 然缺失用于人類安全或有效治療的抗CCR4抗體，并提出開發(fā)這樣的試劑的挑戰(zhàn)。
[0461] 本文中與抗體分子和結合蛋白聯(lián)合使用的術語"人"首先指具有可變區(qū)（如VH、'、 CDR或FR區(qū)）和可選的抗體恒定區(qū)、分離自或源自人類部分或源自或相應于在人中（如在 人生殖細胞或體細胞中）發(fā)現(xiàn)的序列的抗體和結合蛋白。17G、9E、10、11F、9E10J和9E1D抗 體是這樣的人抗體分子的例子，其中所述可變區(qū)已經分離自人部分。
[0462] 本發(fā)明的"人"抗體和結合蛋白進一步包括不是由人序列編碼的氨基酸殘基，如體 外隨機引入的突變或定位突變，例如通過體外克隆或PCR引入的突變。這樣突變的具體例 子是包括在所述抗體或結合蛋白的小數(shù)量殘基中的保守取代或其它突變的突變，如在所述 抗體或結合蛋白的5、4、3、2或1個殘基中或在構成所述抗體或結合蛋白的一個或多個CDR 的5、4、3、2或1個殘基中。一些這樣的"人"抗體的例子包括已經進行過標準的修飾技術 以減少潛在的免疫原性位點的數(shù)量的抗體和可變區(qū)。
[0463] 因此，本發(fā)明的"人"抗體包括源自人的序列和涉及在人中發(fā)現(xiàn)的序列，但是可能 沒有天然存在于體內人抗體種系部分。此外，本發(fā)明的人抗體和結合蛋白包括含有從人序 列中鑒定的人共同序列或與人序列基本同源的序列的蛋白。
[0464] 此外，本發(fā)明的人抗體和結合蛋白不限于VH、八、⑶R或FR區(qū)的組合，已發(fā)現(xiàn)所述 Vh、八、CDR或FR區(qū)在人抗體分子中是組合的。因此，本發(fā)明的人類抗體和結合蛋白可以包 括或對應于這些區(qū)的組合，所述組合并不需要在人類中天然存在。
[0465] 在優(yōu)選實施方式中，所述人類抗體是完全人抗體。如本文中使用的，"完全人"抗 體是包括如上所定義的"人"可變區(qū)域和/或CDR的抗體，基本上沒有非人抗體序列或沒有 任何非人抗體序列。例如，包括人可變區(qū)域和/或CDR、"基本上沒有非人抗體序列"的抗體 是其中僅多至5、4、3、2或1個氨基酸不是由人類抗體序列編碼的抗體、域和/或CDR。因 此，"完全人"抗體不同于"人源化"抗體，所述"人源化"抗體基本上基于非人類可變區(qū)域， 如小鼠可變區(qū)域，其中一些氨基酸已經變化以更好地與一般在人抗體中存在的氨基酸保持 一致。
[0466] 本發(fā)明的"完全人"抗體可以是沒有任何其它實質抗體序列的人可變區(qū)域和/或 CDR，如可以是單鏈抗體?？蛇x地，本發(fā)明的"完全人"抗體可以是與一個或多個人類抗體恒 定區(qū)整合或可操作連接的人類可變區(qū)域和/或CDR。一些優(yōu)選的完全人抗體是具有完全IgG 恒定區(qū)的IgG抗體。
[0467] 在其它實施方式中，本發(fā)明的"人類"抗體將是部分的人類嵌合抗體。如本文中所 使用的，"部分的人類嵌合"抗體是包括可操作地連接至或接枝至非人類（如大鼠或小鼠） 的恒定區(qū)的"人類"可變區(qū)域和/或CDR的抗體。這樣的部分人類嵌合抗體可以用在例如臨 床前研究中，其中所述恒定區(qū)將優(yōu)選地是與在臨床前檢測中使用的相同動物的恒定區(qū)。這 些部分人類融合抗體也可以用在例如體外診斷中，其中所述非人類物種的恒定區(qū)可以提供 抗體探測的額外選擇。
[0468] 本文使用的術語"片段"指生物學相關的片段，如對抗原結合有作用的片段，例如 形成部分的抗原結合位點，和/或對抑制或減少CCR4抗原功能有作用的片段。一些優(yōu)選的 片段包括本發(fā)明抗體的重鏈可變區(qū)（％域）和/或輕鏈可變區(qū)（VJst)。一些優(yōu)選的片段 包括本發(fā)明的抗體的一個或多個重鏈CDR(或本發(fā)明的￥ 11域）或本發(fā)明的抗體的一個或多 個輕鏈CDR(或本發(fā)明的 '域）。一些優(yōu)選的片段是至少5個氨基酸長度并包括至少一個 ⑶R區(qū)、優(yōu)選地⑶R3區(qū)、更優(yōu)選地重鏈⑶R3區(qū)。
[0469] 在一些實施方式中，其中本發(fā)明的抗體包括任何定義序列的片段（如包括SEQ ID N0:35、46、57、68、104或114的片段），如是包括本發(fā)明的V# /或^域的抗體，或是包括 本發(fā)明的一個或多個CDR的抗體或結合蛋白，這些區(qū)/域通常在所述抗體或結合蛋白中分 離，使得每一個區(qū)/域實施它的生物學功能并因此保留結合抗原的作用。因此，所述％和 '域優(yōu)選地由合適的支架（scaffold)序列/連接片段序列分開,CDR優(yōu)選地由合適的框架 區(qū)分開，所述框架區(qū)如在自然存在的抗體和/或有效構建的抗體中所發(fā)現(xiàn)的那些。因此，本 發(fā)明的V h、'和個別的CDR序列優(yōu)選地位于合適的框架或支架內或與合適的框架或支架組 合以使得抗原結合。這樣的框架序列或區(qū)可以對應于自然存在的框架區(qū)、FR1、FR2、FR3和 /或FR4,在適當?shù)那闆r下以形成合適的支架；或可以對應于如通過比較多個自然存在的框 架區(qū)所鑒定的共有框架區(qū)?？蛇x地，可以使用非抗體支架或框架，如T細胞受體框架。
[0470] 可以用于框架區(qū)的合適序列在本領域是公知的并有文獻記載的，且可以使用它們 中的任意一種。由于框架區(qū)的優(yōu)選序列是構成本發(fā)明的％和/或VJst的一個或多個（即 1、2、3或4個）框架區(qū)，即一個或多個在表1、2、3或4中公開的框架區(qū)，或與其基本同源的 框架區(qū)，特別是能夠保持抗原特異性的框架區(qū)，例如導致所述抗體基本上一樣或一樣的3D 結構的框架區(qū)。
[0471] 在一些優(yōu)選實施方式中，在本發(fā)明的抗體中存在全部四個可變輕鏈（SEQ ID NO: 30、31、32和33)和/或可變重鏈（SEQ ID NO: 25、26、27和28)，在適當?shù)那闆r下，SEQ ID NO: 35 (同樣在表1中顯示）的FR區(qū)或與其基本同源的FR區(qū)。
[0472] 在一些優(yōu)選實施方式中，在本發(fā)明的抗體中存在全部四個可變輕鏈（SEQ ID N0:41、42、43和44)和/或可變重鏈（SEQ ID N0:36、37、38和39)，在適當?shù)那闆r下，SEQ ID N0:46(同樣在表2中顯示）的FR區(qū)或與其基本同源的FR區(qū)。
[0473] 在一些優(yōu)選實施方式中，在本發(fā)明的抗體中存在全部四個可變輕鏈（SEQ ID NO:41、42、43和44)和/或可變重鏈（SEQ ID NO: 36、37、102和39)，在適當?shù)那闆r下，SEQ ID NO: 103的FR區(qū)或與其基本同源的FR區(qū)。特別優(yōu)選的實施方式是其中存在SEQ ID NO: 102 或與其基本同源的序列的重鏈FR區(qū)。
[0474] 在一些優(yōu)選實施方式中，在本發(fā)明的抗體中存在全部四個可變輕鏈（SEQ ID NO: 107、109、111和44)和/或可變重鏈（SEQ ID NO: 36、37、38和39)，在適當?shù)那闆r下，SEQ ID NO: 114的FR區(qū)或與其基本同源的FR區(qū)。
[0475] 在一些優(yōu)選實施方式中，在本發(fā)明的抗體中存在全部四個可變輕鏈（SEQ ID NO: 52、53、54和55)和/或可變重鏈（SEQ ID NO: 47、48、49和50)，在適當?shù)那闆r下，SEQ ID NO: 57 (同樣在表3中顯示）的FR區(qū)或與其基本同源的FR區(qū)。
[0476] 在一些優(yōu)選實施方式中，在本發(fā)明的抗體中存在全部四個可變輕鏈（SEQ ID N0:63、64、65和66)和/或可變重鏈（SEQIDN0:58、59、60和61)，在適當?shù)那闆r下，SEQ ID N0:68(同樣在表4中顯示）的FR區(qū)或與其基本同源的FR區(qū)。
[0477] 此外，盡管本發(fā)明的優(yōu)選抗體由本發(fā)明的Vh、'或CDR構成，應當注意，本發(fā)明的抗 體同樣包括一個或多個本發(fā)明的V h、'或⑶R和非本發(fā)明的其它V H、'或⑶R的組合，條件 是仍然存在本文所列出的本發(fā)明抗體的結合CCR4的性質或抗CCR4的性質。
[0478] 本文使用的術語"重鏈互補決定區(qū)""重鏈⑶R"）指抗體分子中重鏈可變區(qū)（Vh 域）內的超可變區(qū)。所述重鏈可變區(qū)從氨基端到羧基端有三個CDR，定義為重鏈CDR1、重鏈 ⑶R2和重鏈⑶R3。所述重鏈可變區(qū)同樣具有四個框架區(qū)（從氨基端到羧基端為FR1、FR2、 FR3和FR4)。這些框架區(qū)分開了⑶R。
[0479] 本文使用的術語"重鏈可變區(qū)"（V>t)指抗體分子的重鏈可變區(qū)。
[0480] 本文使用的術語"輕鏈互補決定區(qū)""輕鏈⑶R"）指抗體分子中輕鏈可變區(qū)（八 域）內的超可變區(qū)。所述輕鏈可變區(qū)從氨基端到羧基端有三個CDR，定義為輕鏈CDR1、輕鏈 CDR2和輕鏈CDR3。所述輕鏈可變區(qū)同樣具有四個框架區(qū)（從氨基端到羧基端為FR1、FR2、 FR3和FR4)。這些框架區(qū)分開了⑶R。
[0481] 本文使用的術語"輕鏈可變區(qū)"域）指抗體分子的輕鏈可變區(qū)。
[0482] 應當注意的是，在必要時，本文服從Kabat命名法，以定義⑶R的位置（Kabat 等，1991，通過參考的方式明確地結合至本文）。
[0483] 本領域技術人員將知道，本發(fā)明的蛋白和多肽，如輕鏈⑶R和重鏈⑶R、輕鏈可變 區(qū)和重鏈可變區(qū)、抗體、抗體片段和免疫交聯(lián)物可以以本領域已知和描述的幾種方法的任 何一種進行制備，但是最優(yōu)選地是使用重組方式制備。
[0484] 編碼本發(fā)明抗體的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的核酸片段可以源自或產生自任何 合適的方法，如通過克隆或合成?？梢允褂帽绢I域公知和描述的方法來制備這樣的序列，例 如從如人種系基因中克隆合適的序列然后對這些種系序列進行任何必要的修飾以獲得本 發(fā)明的序列。一種可選擇的即更有效的方法可以是合成合適的輕鏈可變區(qū)序列或重鏈可變 區(qū)序列作為重疊引物，然后使用引物延伸以獲得全長序列。然后可以通過PCR使用引物擴 增所述全長序列，所述引物包含用于進一步克隆和處理（如克隆至合適的表達載體中）的 合適的酶切位點。每個可變區(qū)5-7條重疊引物通常是足夠的，從而使得該技術非常有效和 精確。
[0485] 一旦已經獲得了編碼本發(fā)明抗體的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的核酸片段，這些片 段可以進一步用于標準重組DNA技術的處理，例如以將可變區(qū)片段轉換成具有合適恒定區(qū) 域的全長抗體分子，或轉換成本文其它地方描述的具體形式的抗體片段，如Fab片段、scFv 片段等。代表性地，或作為該進一步處理過程的一部分，所述編碼本發(fā)明抗體分子的核酸片 段通常合并在合適的表達載體中以促進本發(fā)明抗體的產生。
[0486] 可能的表達載體包括但不限于，粘粒、質粒或修飾的病毒（如復制缺陷性逆轉錄 病毒、腺病毒和腺相關病毒），只要所述載體能夠與使用的宿主細胞適合。所述表達載體"適 于宿主細胞的轉化"，意思是所述表達載體包含本發(fā)明的核酸分子和基于用于表達的宿主 細胞所選擇的調節(jié)序列，所述調節(jié)序列與所述核酸分子可操作地連接?？刹僮鞯剡B接意味 著表示所述核酸以允許核酸表達的方式與調節(jié)序列連接。
[0487] 本發(fā)明因此預期一種重組表達載體，所述重組表達載體包含本發(fā)明的核酸分子或 其片段，和用于轉錄和翻譯由本發(fā)明的核酸分子編碼的蛋白序列所必需的調節(jié)序列。
[0488] 合適的調節(jié)序列可以源自多種來源，包括細菌、真菌、病毒、哺乳動物或昆蟲的基 因（如，見Goeddel，1990中描述的調節(jié)序列）。合適的調節(jié)序列的選擇取決于下面描述的 選擇的宿主細胞，且本領域普通技術人員可以容易地完成。這樣的調節(jié)序列的例子包括：轉 錄啟動子和增強子或RNA聚合酶結合序列，包括翻譯起始信號的核糖體結合序列。此外，取 決于所選擇的宿主細胞和使用的載體，可以將其它序列如復制起點、額外的DNA限制酶切 位點、增強子和賦予轉錄可誘導性的序列合并在所述表達載體中。
[0489] 本發(fā)明的重組表達載體也可以包含促進選擇轉化或轉染有本發(fā)明的重組分子的 宿主細胞的選擇性標記物基因。所述選擇性標記物基因的例子是編碼以下蛋白的基因：賦 予對一些藥物具有抗性的新霉素和潮霉素 、β -半乳糖苷酶、氯霉素乙酰轉移酶、螢火蟲螢 光素酶、或免疫球蛋白或其部分，如免疫球蛋白（優(yōu)選地IgG)的Fc部分。選擇性標記物 基因的轉錄由選擇性標記物蛋白的濃度變化監(jiān)測，所述選擇性標記物蛋白是如β -半乳糖 苷酶、氯霉素乙酰轉移酶或螢火蟲熒光素酶。如果選擇性標記物基因編碼賦予抗生素抗性 (如新霉素抗性）的蛋白，可以用G418選擇轉化株細胞。已經合并了選擇性標記物基因的 細胞將存活，而其它細胞死亡。這使得可以看見并分析本發(fā)明的重組表達載體的表達，特別 是測定突變對表達和表型的作用。將意識到，可以將所述選擇性標記物引入至與目標核酸 分開的載體上。
[0490] 所述重組表達載體可以包含表達融合基團的基因，所述融合基團增加了所述重 組蛋白的表達，增加了重組蛋白的可溶性，并通過在親合純化中作為配體（例如，可以 存在使得進行純化和/或鑒定的適當?shù)?標簽"，如組氨酸標簽或myc標簽）增加了目 標重組蛋白的純化。例如，可以將蛋白水解的分解位點添加至目標重組蛋白以使得在 純化所述融合蛋白之后將所述重組蛋白從融合基團中分離。典型的融合表達載體包括 pGEX (Amrad Corp.，Melbourne,澳大利亞）、pMal (新英格蘭生物實驗室，Beverly, MA)和 pRIT5 (Pharmacia，Piscataway，NJ)，它們分別將谷胱甘肽S轉移酶（GST)、麥芽糖E結合蛋 白或蛋白A融合至重組蛋白中。
[0491] 可以將重組表達載體引入至宿主細胞中以產生轉化的宿主細胞。術語"轉化有"、 "轉染有"、"轉化"和"轉染"意味著包括通過本領域已知的多種可能的技術之一將核酸（如 載體）引物至細胞中。本文使用的術語"轉化的宿主細胞"意味著同樣包括已經轉化有本 發(fā)明的重組表達載體的能夠糖基化的細胞?？梢酝ㄟ^如電穿孔或氯化鈣介導的轉化將核酸 轉化至原核細胞。例如，可以通過常規(guī)技術，如磷酸鈣或氯化鈣共沉淀、DEAE-右旋糖苷介 導的轉染、脂質轉染法、電穿孔或顯微注射法將核酸引入至哺乳動物細胞中。用于轉化和轉 染宿主細胞的合適方法可以在Sambrook等，1989和其它實驗室教科書中找到。
[0492] 合適的宿主細胞包括廣泛多種的真核宿主細胞和原核細胞。例如，本發(fā)明的蛋白 可以在酵母細胞或哺乳動物細胞中表達。其它合適的宿主細胞可以在Goeddel，1990中找 至LU此外，本發(fā)明的蛋白可以在原核細胞如大腸桿菌中表達（Zhang等，2004)。
[0493] 適于完成本發(fā)明的酵母和真菌宿主細胞包括但不限于：啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)、畢赤酵母屬（Pichia)或克魯維酵母屬（Kluyveromyces)和曲霉屬 (Aspergillus)的多個種。在酵母菌啤酒酵母（S.cerevisiae)中表達的載體的例子包 括 pYepSecl(Baldari.等，1987)、pMFa(Kurjan 和 Herskowitz, 1982)、pJRY88(Schultz 等，1987)和 pYES2 (Invitrogen Corporation，San Diego，CA)。用于轉化酵母和真菌的方 案是本領域普通技術人員熟知的（見Hinnen等，1978 ;Ito等，1983,和Cullen等，1987)。
[0494] 適于完成本發(fā)明的哺乳動物細胞包括：COS(如ATCC No. CRL 1650或1651)、 BHK (如 ATCC No. CRL 6281)、CHO (ATCC No. CCL 61)、HeLa (如 ATCC No. CCL 2)、293 (ATCC 吣.1573)、呢-1細胞、呢0(八丁0：0^-11177)和？61'.(：61'0(〇11。611，1^1(1611，荷蘭）。引導 在哺乳動物細胞中表達的合適的表達載體通常包括啟動子（如來自于病毒物質，如多瘤病 毒、腺病毒2、細胞巨化病毒和猿病毒40)，以及其它轉錄和翻譯控制序列。哺乳動物表達載 體的例子包括 PCDM8 (Seed, B.，1987)和 pMT2PC (Kaufman 等，1987)。
[0495] 根據(jù)本文提供的教導，同樣可以容易地實現(xiàn)用于將合適類型的表達載體引入至 植物、鳥和昆蟲細胞中的啟動子、終止子和方法。例如，在一個實施方式中，本發(fā)明的蛋 白可以從植物細胞中表達（見Sinkar等，1987,其綜述了毛根農桿菌（Agrobacterium rhizogenes)載體的應用；同樣見Zambryski等，1984,其描述了用于植物細胞表達載體的 應用，所述載體包括PAPS2022、PAPS2023和PAPS2034等）。
[0496] 適于實現(xiàn)本發(fā)明的昆蟲細胞包括來自家蠶、Trichoplusia或Spodotera種的細胞 和細胞系。適于在培養(yǎng)的昆蟲細胞（SF9細胞）中表達蛋白的桿狀病毒載體包括pAc系列 (Smith 等，1983)和 pVL 系列（Luckow 和 Summers 1989)。PCT/US/02442 中描述了一些適 于表達本發(fā)明的重組蛋白的桿狀病毒-昆蟲細胞表達系統(tǒng)。
[0497] 可選地，同樣可以在非人類的轉基因動物如大鼠、兔子、綿羊和豬中表達本發(fā)明的 蛋白（Hammer等，1985 ;Palmiter等，1983 ;Brinster等，1985 ;Palmiter和Brinster 1985， 以及U. S.專利號4, 736, 866)。
[0498] 同樣可以使用蛋白質化學領域內公知的技術通過化學合成法制備本發(fā)明的蛋白， 如固相合成法（Merrifield(1964) ;Frische等；1996)或在均質溶液中合成。
[0499] 可以利用重組技術通過融合制備N-末端或C-末端融合蛋白，所述融合蛋白包 括與其它分子如蛋白結合的本發(fā)明抗體和蛋白。得到的融合蛋白包含本發(fā)明的抗體或蛋 白，所述抗體或蛋白與選擇的蛋白或標記物蛋白或本文描述的標簽蛋白融合。同樣可以通 過公知技術將本發(fā)明的抗體和蛋白與其它蛋白結合。例如，可以使用包含雙異官能硫醇 的連接體將所述蛋白化學結合，所述連接體如在WO 90/10457中所描述的、N-琥珀酰亞胺 基-3-(2-吡啶二硫代-丙酸酯）或N-琥珀酰亞胺基-5硫代乙酸酯?？梢杂糜谥苽淙诤?蛋白或結合物的蛋白質的實例包括細胞結合蛋白如免疫球蛋白、激素、生長因子、植物血凝 素、胰島素、低密度脂蛋白、胰高血糖素、內啡肽、鐵傳遞蛋白、蛙皮素、唾液酸糖蛋白、谷胱 甘肽-S-轉移酶（GST)、紅血球凝集素（HA)和截短型的myc。
[0500] 不考慮制備第一個抗CCR4抗體核酸片段的方式，可以通過標準的分子生物學技 術容易地制備更多的合適的抗體核酸片段。為了確認任何變異體、突變體或二代抗CCR4 抗體核酸片段適于在本發(fā)明中使用，將檢測核酸片段以確認根據(jù)本發(fā)明的抗CCR4抗體的 表達。優(yōu)選地將在標準的、更優(yōu)選地標準嚴格雜交條件下檢測所述變異體、突變體或二代 核酸片段以確認雜交。例示的合適的雜交條件包括在大約50°C、大約7%十二烷基硫酸鈉 (SDS)、大約0.5M NaPO4、大約ImM EDTA條件下雜交，并在42 °C下用大約1% SDS清洗。
[0501] 由于可以容易地制備多種抗體，可以通過對動物或病患提供至少第一個核酸片段 或分子以實行本發(fā)明的治療方法，所述第一個核酸片段或分子在病患體內表達生物學有效 量的至少第一個本發(fā)明的抗CCR4抗體。所述"表達抗CCR4抗體的核酸片段或分子"通常 將是以至少一種表達構建體或載體的形式，和可以是以包含在病毒或包含在重組宿主細胞 內的表達構建體或載體的形式。本發(fā)明的優(yōu)選基因治療載體通常將是病毒載體，如重組逆 轉錄病毒、單純皰疹病毒（HSV)、腺病毒、腺相關病毒（AAV)、細胞巨化病毒（CMV)等等。
[0502] 另一方面提供一種包含一種或多種本發(fā)明的核酸片段或分子的表達構建體或表 達載體。優(yōu)選地，所述表達構建體或載體是重組的。優(yōu)選地，所述構建體或載體進一步包括 用于轉錄和翻譯由本發(fā)明的核酸分子編碼的蛋白序列的必需的調節(jié)序列。
[0503] 另一方面提供一種包含一種或多種本發(fā)明的表達構建體或表達載體的宿主細胞 或病毒。還提供包含一種或多種本發(fā)明的核酸分子的宿主細胞或病毒。表達本發(fā)明抗體的 宿主細胞或病毒構成了另一方面。
[0504] 本發(fā)明的另一方面提供一種生產本發(fā)明抗體的方法，所述方法包括培養(yǎng)本發(fā)明宿 主細胞的步驟。優(yōu)選的方法包括步驟：（i)在適于表達編碼的抗體或蛋白的條件下培養(yǎng)宿 主細胞，所述宿主細胞包含一種或多種本發(fā)明的重組表達載體或一種或多種本發(fā)明的核酸 序列；以及可選地（ii)從宿主細胞或培養(yǎng)基/上清液中分離或獲得所述抗體或蛋白。這樣 的生產方法同樣可以包括純化所述抗體或蛋白產物的步驟和/或將所述抗體或產物配制 在包括至少一種其它成分（如藥物學可接受的載體或賦形劑）的組合物中。
[0505] 在本發(fā)明的抗體或蛋白由多于一種多肽鏈（例如Fab片段的一些片段）組成的實 施方式中，所有的多肽優(yōu)選地在宿主細胞中（從相同或不同的表達載體）表達，則所述完整 蛋白（如本發(fā)明的結合蛋白）可以在所述宿主細胞中聚集并從宿主細胞中分離或純化。
[0506] 本發(fā)明的抗體同樣可以用于生產結合CCR4的其它抗體。這樣的應用包括例如在 親本抗體的氨基酸序列中添加、缺失、取代或插入一個或多個氨基酸以形成新的抗體，其中 所述親本抗體是如在本文其它地方描述的本發(fā)明的一種抗體，并檢測得到的新抗體以鑒定 結合CCR4的抗體。這樣的方法可以用于形成多樣的新抗體，可以檢測所有抗體結合CCR4 的能力。
[0507] 優(yōu)選地，所述添加、缺失、取代或插入一個或多個氨基酸發(fā)生在一個或多個CDR 域。
[0508] 可以使用本領域公知和文獻記載的技術以任何合適的方式實現(xiàn)對親本抗體的這 樣的修飾或突變，例如通過隨機突變或定向突變的方法完成。如果使用定向突變，則鑒定用 于突變形成的合適殘基的一種方式利用結合蛋白-抗原復合物（如Ab-Ag復合物）的結晶 結構的分辨力（resolution)以鑒定涉及抗原結合的關鍵殘基（Davies和Cohen, 1996)。然 后，突變這些殘基以提高交互作用?？蛇x地，可以簡單地靶定用于定向突變的一個或多個氨 基酸殘基并評估結合CCR4的效果。
[0509] 可以以任何合適方式實現(xiàn)隨機突變，例如，通過易錯PCR、鏈改組或突變體大腸桿 菌菌株實現(xiàn)。
[0510] 因此，本發(fā)明的一個或多個Vh域可以與來自任何合適來源的單一的V ^域或全部的 '域結合，并檢測得到的新抗體以鑒定特異于CCR4的抗體。相反地，本發(fā)明的一個或多個 '域可以與來自任何合適來源的單一的V h域或全部的Vh域結合，并檢測得到的新抗體以鑒 定結合CCR4的抗體。
[0511] 相似地，在適當情況下，本發(fā)明V#P /或\域的一個或多個或優(yōu)選地全部三個⑶R 可以接枝于單一 ％和/或V Jst或全部的V /或V 并檢測得到的新抗體以鑒定結合 CCR4的抗體。
[0512] 已經顯示，⑶R，特別是輕鏈和/或重鏈的⑶R3的定向突變是增加抗體親和力的有 效技術，并且是優(yōu)選的。優(yōu)選地，封閉CDR3或被稱為"熱點"的特異區(qū)的3-4個氨基酸作為 突變形成的目標。
[0513] "熱點"是體內發(fā)生體細胞高度突變的序列（Neuberger和Milstein，1995)。所述 熱點序列可以被定義為一些密碼子中的共同核苷酸序列。所述共同序列是四核苷酸RGYW， 其中R可以是A或G，Y可以是C或T，W可以是A或T(Neuberger和Milstein, 1995)。此 夕卜，相比于由對應于潛在熱點序列的TCN編碼的絲氨酸，由核苷酸AGY編碼的絲氨酸殘基主 要地存在于可變區(qū)的⑶R域（Wagner等，1995)。
[0514] 因此，可以掃描本發(fā)明每一個抗體的重鏈⑶R和輕鏈⑶R的核苷酸序列是否存在 熱點序列和AGY密碼子。然后可以可選地使用國際ImMunoGen Ties數(shù)據(jù)庫（IMGT1Iittp:// imgt. cines. fr/textes/vquest/)將輕鏈Q)R域和重鏈⑶R域的鑒定的熱點與重鏈和輕鏈 的原始序列進行比較（Davies等，1990)。與種系相同的序列暗示沒有發(fā)生體細胞突變。因 此，可以模擬體內發(fā)生的體細胞突變引入隨機突變或可選地，在熱點和/或AGY密碼子處發(fā) 生定點突變。相反，一種不同序列顯示已經發(fā)生體細胞突變。仍然需要確定體內體細胞突 變是否是最佳的。
[0515] 用于突變的優(yōu)選熱點是編碼暴露的氨基酸的那些，且優(yōu)選地編碼形成部分抗原結 合位點的氨基酸的那些。用于突變的其它優(yōu)選熱點是編碼非保守氨基酸的那些。優(yōu)選地， 不突變編碼CDR內的包埋氨基酸或保守氨基酸的熱點。這些殘基對于整體結構通常是關鍵 地，且由于它們是包埋的，它們不太可能與抗原相互作用。
[0516] 實現(xiàn)上述氨基酸和蛋白質域操作的方式是本領域技術人員熟知的。例如，上述操 作可以在核酸水平通過遺傳工程便利地實現(xiàn)，其中編碼合適結合蛋白和它們的域的核酸分 子被修飾以使得得到的表達蛋白的氨基酸序列以合適的方式順次被修飾。
[0517] 檢測一種或多種抗體特異結合CCR4的能力可以通過任何合適的方式實現(xiàn)，這些 方式在本領域是公知的并有文獻記載的?？梢詮呐囵B(yǎng)收集物中獲得CCR4+細胞系，或可以 通過用使得重組CCR4表達的構建體轉化CCR4陰性細胞制備CCR4+細胞系。這些細胞或固 定的CCR4可以通過常規(guī)方法如ELISA、BiaCon等容易地用于分析結合。
[0518] 由這些方法生產的新抗體將優(yōu)選地具有提高的功能性質，如對于CCR4比親本抗 體具有更高或改進的親和力（或至少相當?shù)挠H和力），并可以以與本發(fā)明其它地方描述的 本發(fā)明抗體相同的方式治療和使用（例如，用于治療、診斷、組合物中等）?？蛇x地或其它 地，所述新抗體將具有一個或多個在本文其它地方描述的其它提高的功能性質。
[0519] 由這些方法產生、獲得或可獲得的新抗體形成本發(fā)明的另一方面。
[0520] 本發(fā)明進一步提供包含至少一種本發(fā)明的人類抗體或抗體片段的組合物，可選地 包括一種稀釋劑。這樣的組合物可以是藥物學可接受的組合物或用于實驗室研究的組合 物。在藥物組合物這方面，它們可以優(yōu)選地被配制成腸胃外、靜脈內或甚至皮下給藥。
[0521] 本發(fā)明提供本發(fā)明的人類抗體和抗體片段的一些方法和應用。關于所有方法，除 非另有明確的說明，術語"一個（種）"用于表示所述方法中"至少一個（種）"、"至少第一 個（種）"、"一個（種）或多個（種）"或"多個（種）"步驟。這與治療方法中的給藥步驟 特別相關。因此，不僅僅可以使用本發(fā)明的不同劑量，也可以使用例如注射的不同劑量數(shù)， 達到和包括多種注射。在施用抗CCR4治療抗體之前、之后或期間可以使用組合的治療。
[0522] 提供具有重要的生物學暗示的本發(fā)明抗體或免疫交聯(lián)物的多種體外有用的方法 和應用。首先提供的是結合CCR4的方法和在結合CCR4中的應用，所述方法通常包括用本 發(fā)明的至少第一種抗CCR4抗體或其抗原結合片段有效地接觸包含CCR4的組合物。本發(fā)明 的抗體或其免疫交聯(lián)物可以因此用于結合分析中。合適地有用的結合分析包括本領域中一 般使用的那些，如免疫印跡技術、蛋白質印跡、斑點印跡、RIA、ELISA、免疫組織化學法、熒光 激活細胞分離技術（FACS)、免疫沉淀反應、親和色譜法等。
[0523] 提供檢測CCR4的方法和在檢測CCR4中的應用，所述方法或應用通常包括在有效 允許CCR4/抗體復合物形成的條件下用本發(fā)明的至少第一個抗體或免疫交聯(lián)物或它們的 抗原結合片段接觸懷疑含有CCR4的組合物，并檢測形成的復合物。所述檢測方法和應用可 以與生物學樣品聯(lián)合使用，如診斷腫瘤；還提供基于此的診斷試劑盒。
[0524] 本發(fā)明的方法和應用特別計劃用于患有疾病或狀況或處于疾病或狀況發(fā)展的風 險的動物和病患，所述疾病或狀況與CCR4表達或活性相關或其中CCR4具有生物學作用。這 樣的疾病和狀況包括由CCR4陽性細胞（典型地CCR4+、Th2或Thl7細胞）介導的疾病，在 結合CCR4配體后，所述細胞可以參與將引起紊亂或疾病或對紊亂或疾病有作用的信號轉 導途徑。它們也包括由表達CCR4細胞的異常增殖引起的疾病。這樣異常增殖的細胞可以 是自然的CCR4+，或者它們可以是已經突變或轉化的以表達CCR4。如上描述的，CCR4的表 達可以幫助癌癥細胞表達該抗原以躲避免疫系統(tǒng)。因此，提供了治療由CCR4介導的和/或 由CCR4陽性細胞的異常增殖所表征的疾病或紊亂的方法。
[0525] 從另一方面看，提供了狀況的治療，其可以獲益于以下的一種或多種：
[0526] (i)選擇性消除CCR4+細胞；
[0527] (ii)抑制CCR4與一個或多個它的配體結合；
[0528] (iii)抑制CCR4介導的對CCR4配體的細胞反應，特別是抑制趨化作用或增加的細 胞內鈣離子濃度（細胞活化）。
[0529] 優(yōu)選地，所述CCR4配體是MDC和/或TARC。
[0530] 本領域普通技術人員已知，由于CCR4涉及在廣泛范圍的疾病和紊亂中，一旦顯示 提供的抗CCR4治療對任何可接受的模型系統(tǒng)有效，則該抗CCR4治療可以用于治療與CCR4 表達相關的全部范圍的疾病和紊亂。
[0531] 在一種實施方式中，所述CCR4介導的狀況是2型T輔助細胞介導的免疫疾病。"2 型T輔助細胞介導的免疫疾病"的意思是涉及由于過敏原特異的Th2細胞的顯現(xiàn)和激活的 免疫球蛋白E(IgE)和肥大細胞的疾病。
[0532] CCR4介導的疾病或紊亂可以是與炎癥、感染和/或癌癥相關的疾病或狀況。這樣 的疾病或紊亂可以用本發(fā)明的抗體和組合物治療或預防。優(yōu)選的疾病或狀況包括：（1)過 敏性疾病，如全身過敏或超敏反應、藥物過敏癥、過敏性支氣管肺曲霉?。éˇⅵ宝?、蟲刺過敏 癥和食物過敏癥；（2)炎性腸疾病，如克羅恩氏病、潰瘍性結腸炎、回腸炎和腸炎；（3)陰道 炎；(4)牛皮癬和炎癥性皮膚病，如皮炎、濕疹、遺傳過敏性皮炎、過敏性接觸皮炎、風疹和 瘙癢癥；（5)血管炎；(6)脊柱關節(jié)?。唬?)硬皮??；(8)哮喘和呼吸過敏性疾病，如過敏性哮 喘、過敏性鼻炎、慢性阻塞性肺病、超敏肺疾病等等；(9)自身免疫疾病，如關節(jié)炎（包括風 濕性的和牛皮癬的）、多發(fā)性硬化、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、I型糖尿病、腎小球性腎炎等等；（10) 移植排斥（包括同種異體移植排斥和移植物抗宿主?。┖停?1)其中不期望的炎癥反應需 要被抑制的其它疾病，如動脈硬化、肌炎、T細胞介導的神經變性疾病、多發(fā)性硬化、腦炎、腦 膜炎、肝炎、腎炎、膿毒病、結節(jié)病、過敏性結膜炎、耳炎、卡斯托曼病、竇炎、LPS誘導的內毒 素休克、白塞病和痛風；（12)癌癥，血液癌癥和非血液癌癥，優(yōu)選地乳癌、結腸直腸癌、食道 癌、胃癌、肝細胞癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、成人T細胞白血病/淋巴瘤（ATL)、外 周T細胞淋巴瘤、非特異的彌漫性大B細胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、B細胞慢性淋巴細胞白血 病、CTCL、獨特地蕈狀真菌病、塞扎里綜合征、宮頸癌、腎癌、腦癌、前列腺癌、胃癌；（13)傳 染病，如愛潑斯坦-巴爾病毒（EBV)感染、HIV感染和其它病毒感染。
[0533] 本發(fā)明的抗體與CCR4的結合同樣可以削弱CCR4陽性異常細胞（如癌細胞）的能 力以躲避宿主免疫系統(tǒng)。本發(fā)明的抗體可以用于阻止由Treg細胞引起的DC抑制，因此提 供本發(fā)明的抗CCR4抗體作為疫苗中的佐劑的應用。所述疫苗優(yōu)選地適用于癌癥或傳染性 疾病的疫苗。所述疫苗可以是預防性疫苗或治療性疫苗。"佐劑"的意思是提高宿主對抗原 的免疫反應的試劑。當用作疫苗佐劑時，本發(fā)明的抗體因此典型地與抗原聯(lián)合或共同給藥， 期望抗所述抗原能夠引起免疫反應。
[0534] 如在本文中使用的，術語"異常增殖"意思是偏離正常的、正確的或期望的過程的 細胞增殖。例如，異常細胞增殖可以包括細胞不適當?shù)脑鲋?，所述細胞的DNA或其它細胞成 分已經被破壞或有缺陷。
[0535] 異常細胞增殖可以包括細胞增殖，所述細胞增殖的特征與由不適當?shù)母咚郊毎?分裂、不適當?shù)牡退郊毎蛲龌蚨咚?、介導或導致的跡象相關。這樣的跡象的特征 是例如癌的或非癌的，良性的或惡性的細胞、細胞群或組織的單一或多樣的局部異常增殖。
[0536] 本文中任何提及"腫瘤"同樣指"癌癥"或"癌"。同樣可以治療轉移性癌，如同可 以減少原發(fā)性腫瘤的轉移。采用抗CCR4抗體的免疫療法可能治療在手術后期病患中留下 的被稱為微小殘留疾?。∕RD)。
[0537] 因此本發(fā)明進一步提供治療上述疾病的方法和在治療上述疾病的方法中的應用， 包括對患有這樣疾病的動物或病患施用治療有效量的本發(fā)明的抗CCR4抗體,或這樣的抗 CCR4抗體的抗原結合片段或免疫交聯(lián)物。
[0538] 本發(fā)明的另一方面提供了本發(fā)明的抗體或這樣的抗體的抗原結合片段或免疫交 聯(lián)物在制備用于治療、成像或診斷的組合物或藥物中的應用。
[0539] 本發(fā)明的另一方面提供了在治療、診斷或成像中應用的本發(fā)明的抗體或這樣的抗 體的抗原結合片段或免疫交聯(lián)物。
[0540] 此外，本發(fā)明提供組合物，所述組合物包含本發(fā)明的抗體或這樣的抗體的抗原結 合片段或免疫交聯(lián)物和一種或多種制藥學可接受的賦形劑、載體、稀釋劑、緩沖液或穩(wěn)定 劑。
[0541] 本文描述的體內方法通常在哺乳動物中實現(xiàn)?？梢蕴幚砣魏尾溉閯游?，例如人和 任何家畜、家養(yǎng)動物的或實驗動物。具體例子包括小鼠、大鼠、豬、貓、狗、綿羊、兔子、母牛和 猴子。但是優(yōu)選地，所述哺乳動物是人。
[0542] 因此，本文使用的術語"動物"或"病患"包括任何哺乳動物，例如人和任何家畜、 家養(yǎng)動物或實驗動物。具體例子包括小鼠、大鼠、豬、貓、狗、綿羊、兔子、母牛和猴子。但是 優(yōu)選地，所述動物或病患是人受試者。
[0543] 本發(fā)明聯(lián)系了使用非結合的或裸露抗體或其片段治療如上定義的紊亂和CCR4+ 細胞（優(yōu)選地CCR4+腫瘤細胞）的方法，所述目標方法使用免疫交聯(lián)物，其中本發(fā)明的抗體 或抗原結合片段可操作地連接至治療試劑。除非另有明確說明或者以科技術語解釋，本文 中使用的術語"抗體和其片段"因此意味著沒有連接至另一種試劑的"未結合或裸露的"抗 體或片段，所述試劑優(yōu)選地是治療或診斷試劑。這些定義并不排除所述抗體的修飾，如，僅 作為示例，所述修飾是提高所述抗體或抗體與其它效應物的組合物的生物半衰期、親和力、 親合力或其它性質。
[0544] 本發(fā)明的方法和應用同樣包括未結合的或裸露的抗體和免疫交聯(lián)物的應用。在基 于免疫交聯(lián)物的治療方法中，本發(fā)明的抗體或抗原結合片段優(yōu)選地可操作地連接至第二種 治療試劑（抗CCR4抗體本身是第一種治療試劑）。所述治療試劑可以是例如抗癌癥試劑或 抗炎癥試劑,包括皮質類固醇和非類固醇抗炎癥藥物（NSAID)。
[0545] 前述的治療方法和應用將通常包括對動物或病患系統(tǒng)地施用制藥學有效的組合 物，如通過經皮吸收、肌肉內注射、靜脈注射等等。但是，可以接受使得治療試劑定位在腫瘤 位點的任何給藥途徑。因此，遞送的其它合適途徑包括口服、經鼻或呼吸和局部的。
[0546] 本文使用的"給藥（或施用）"指以有效發(fā)揮治療效果（如抗腫瘤效果）的量和時 間提供或遞送抗CCR4抗體治療。部分地，由于簡單和可重復性，似蛋白質治療的被動給藥 通常是優(yōu)選的。
[0547] 但是，術語"給藥（或施用）"在本文中用于表示將本發(fā)明的抗CCR4抗體遞送或以 其它方式提供至靶位點的任意和全部方式。因此，"給藥（或施用）"包括以有效遞送至靶 位點的方式提供產生本發(fā)明的抗CCR4抗體的細胞。在這樣的實施方式中，可以期望在選擇 性的可滲透膜、結構或可移植的裝置中配制或包裹所述細胞，通常是可以被移除以終止治 療的一種形式。外源的本發(fā)明的抗CCR4抗體通常也將是優(yōu)選地，因為這代表了一種可以嚴 密監(jiān)視和控制劑量的非侵入性方法。
[0548] 本發(fā)明的治療方法和應用同樣延及提供編碼本發(fā)明的抗CCR4抗體的核酸，其有 效導致所述核酸在腫瘤附近表達或導致所述核酸在靶位點定位?？梢允褂萌魏位蛑委熂?術，如裸露的DNA遞送、重組基因和載體、基于細胞的遞送、包括體外處理病患細胞等等。
[0549] 本發(fā)明的抗CCR4抗體同樣可以用于將其它治療或診斷試劑遞送至靶位點。在這 樣的實施方式中，實施其它治療或診斷試劑通?？刹僮鞯剡B接至本發(fā)明的抗CCR4抗體。
[0550] 用在本發(fā)明的"治療有效量"是指本發(fā)明的抗CCR4抗體或其免疫交聯(lián)物的量，在 對患有CCR4+腫瘤的動物或病患給藥的基礎上，所述量可以有效地特異殺死至少一部分靶 CCR4+細胞，特異地誘導至少一部分靶CCR4+細胞的細胞凋亡，特異地誘導至少一部分靶 CCR4+細胞壞死，抑制CCR4配體與CCR4結合，抑制CCR4介導的對CCR4配體的細胞應答、 優(yōu)選地抑制應答CCR4配體時細胞內鈣離子濃度的增加，減少炎癥，和/或誘導腫瘤衰退或 好轉。優(yōu)選地，當在正常、健康組織中表現(xiàn)出很少結合和不結合、或很少殺死或不殺死細胞， 以及對動物或病患的正常、健康組織發(fā)揮出可以忽略的或可以處理的副作用時實現(xiàn)這些效 果。
[0551] "靶位點"是指介導紊亂或以引起或加劇紊亂的異常方式增殖的CCR4+細胞的位 置。所述靶位點因此可以例如是腫瘤或CCR4介導的炎癥的位點。"靶細胞"是介導紊亂或 以引起或加劇紊亂的異常方式增殖的CCR4+細胞。因此，靶細胞可以例如包括CCR4+腫瘤 細胞、CCR4+Treg細胞和/或CCR4+Th2細胞。
[0552] 在本文中涉及的將CCR4+細胞如CCR4+腫瘤細胞殺死或誘導細胞凋亡或誘導細胞 壞死或減少炎癥或誘導腫瘤衰退或好轉的內容中使用的術語"優(yōu)選地"和"特異地"意思是 實現(xiàn)CCR4+靶細胞破壞（如腫瘤細胞破壞和/或腫瘤壞死）的本發(fā)明抗CCR4抗體或其免 疫交聯(lián)物實際上被限制被靶位點上，且基本上不擴展引起動物或受試者的正常的、健康的 組織破壞和/或組織壞死。
[0553] 本發(fā)明的抗CCR4抗體或治療結合物優(yōu)選地連接至一種或多種放射療法試劑、化 學療法試劑、抗血管新生試劑、誘導細胞凋亡試劑、抗微管蛋白藥物、抗細胞或細胞毒性試 齊U、細胞因子或趨化因子拮抗劑、細胞因子或趨化因子表達抑制劑、ATP酶抑制劑、抗炎癥試 齊U、其它抗體（如雙特異性抗體）或凝結劑（凝結因子）或抗炎癥試劑如皮質類固醇、優(yōu)選 地糖皮質激素或非類固醇抗炎癥藥物（NSAID)。
[0554] 因此本發(fā)明提供一系列連接的抗體和其片段，其中所述抗CCR4抗體可操作地連 接至至少一種其它的治療或診斷試劑。術語"免疫交聯(lián)物"廣泛地用于定義所述抗體與另一 種有效試劑的可操作的聯(lián)系，且不意味著單獨表示任何類型的可操作的聯(lián)系，特別是不限 于化學"結合"。特別期待的是重組融合蛋白。只要遞送或靶定試劑能夠與所述目標結合， 且在遞送的基礎上，所述治療或診斷試劑充分起作用，則連接的模式將是合適的。
[0555] 同樣期待通過抗體上的糖基團連接試劑。0-連接和N-連接的糖基化都是在抗體 中天然存在的。如果需要，可以對重組抗體進行修飾以重新產生或產生額外的糖基化位點， 這可以通過將合適的氨基酸序列（如天冬酰胺-X-絲氨酸、天冬酰胺-X-蘇氨酸、絲氨酸或 蘇氨酸，其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸）加工至所述抗體的原始序列中而簡單實現(xiàn)。
[0556] 目前用于本發(fā)明的抗CCR4抗體或治療結合物和相關方法和應用的優(yōu)選試劑是補 充或提高所述抗體的效果的那些試劑和/或選擇用于具體類型紊亂（如腫瘤類型）或病患 的那些試劑。
[0557] "補充或提高所述抗體的效果的治療試劑"包括放射療法試劑、化學療法試劑、抗 血管新生試劑、誘導細胞凋亡試劑、抗微管蛋白藥物、抗細胞或細胞毒性試劑、凝結劑、細胞 因子或趨化因子拮抗劑、細胞因子或趨化因子表達抑制劑、ATP酶抑制劑、抗炎癥試劑如皮 質類固醇、優(yōu)選地糖皮質激素或非類固醇抗炎癥藥物（NSAID)、其它抗體（如雙特異性抗 體），優(yōu)選地它們中的一種或多種可以在此使用。
[0558] 目前優(yōu)選的抗癌癥、特別是抗白血病試劑包括蒽環(huán)霉素藥物，如道諾霉素、阿霉 素、阿糖胞苷、6-硫鳥嘌呤、米托蒽醌、白消安（Mylcran? )、達沙替尼（Sprycel?)、強的松、 硫酸長春新堿（Oncovin? )、苯丁酸氮芥、氟達拉濱、噴司他丁和克拉屈濱。
[0559] 目前治療ATL的優(yōu)選試劑包括齊多夫定（疊氮胸苷）和CHOP方式。CHOP代表環(huán) 磷酰胺、羥基道諾霉素（阿霉素）、長春新堿（Oncovin)(長春新堿）、強的松/氫化波尼松。
[0560] 目前優(yōu)選的抗血管新生試劑包括血管抑素、內皮抑素、促血管生成素、血管抑制 素、人血管生成抑制素和maspin中的任何一種。
[0561] 本文使用的"抗微管蛋白藥物"意思是抑制細胞有絲分裂的任何試劑、藥物、前藥 或其組合物，優(yōu)選地通過直接或間接抑制細胞有絲分裂所必需的微管蛋白活性（優(yōu)選地， 微管蛋白的聚合或解聚）。目前優(yōu)選的抗微管蛋白藥物包括秋水仙堿、紫杉醇、長春堿、長春 新堿、去乙酰長春酰胺和一種或多種的考步他?。╟ombretastatin)。
[0562] 目前優(yōu)選的NSAID包括C0X-2抑制劑、磺酰苯胺、利克飛龍（Iicofelone)和ω-3 脂肪酸。
[0563] 所述優(yōu)選試劑與本發(fā)明的抗CCR4抗體的連接或聯(lián)系給出了"免疫交聯(lián)物"，其中 這樣的免疫交聯(lián)物通常具有提高的和甚至協(xié)同的治療性質，如抗腫瘤或抗炎癥性質。
[0564] 抗細胞和細胞毒性試劑的應用導致了本發(fā)明的抗CCR4抗體"免疫毒素"，然而凝 結因子的應用導致本發(fā)明的抗CCR4抗體"凝結配體（coaguligand) "。
[0565] 同樣期待至少兩種治療試劑的應用，如一種或多種放射療法試劑、化學療法試劑、 抗血管新生試劑、誘導細胞凋亡試劑、抗微管蛋白藥物、抗細胞和細胞毒性試劑、細胞因子 或趨化因子拮抗劑、細胞因子或趨化因子表達抑制劑、ATP酶抑制劑、抗炎癥試劑如皮質類 固醇、優(yōu)選地糖皮質激素、或非類固醇抗炎癥藥物（NSAID)、其它抗體（如雙特異性抗體）和 凝結劑因子的組合。
[0566] 在一些實施方式中，本發(fā)明的抗CCR4抗體治療劑將可操作地連接至能夠殺死細 胞或抑制細胞生長或細胞分裂的細胞毒性試劑、抑制細胞生長試劑或其它的抗細胞試劑。 合適的抗細胞試劑包括化學療法試劑，以及細胞毒素和細胞生長抑制劑。細胞生長抑制劑 通常打亂了靶細胞的自然細胞循環(huán)，優(yōu)選地使得所述細胞從細胞循環(huán)中去除。
[0567] 示例性的化學治療試劑包括：激素，如類固醇；抗代謝物，如阿糖胞苷、氟尿嘧啶、 氨甲蝶呤、或氨蝶呤；蒽環(huán)霉素；絲裂霉素 C ;長春花生物堿；抗生素；秋水酰胺；依托泊苷； 光神霉素；和抗腫瘤烷化劑，如苯丁酸氮芥或美法侖。一些優(yōu)選的抗細胞試劑是DNA合成抑 制劑，如道諾霉素、阿霉素/亞德里亞霉素等等。大體上，目前優(yōu)選的抗癌試劑是紫杉酚/ 紫杉醇、多烯紫杉醇、順鉬、吉西他濱、考步他汀和阿霉素/亞德里亞霉素。
[0568] V型ATP酶抑制劑目前同樣是優(yōu)選的，例如水揚酰胺（salicylihalamide)、 刀球航霉素或巴弗洛霉素，同樣優(yōu)選的是蛋白合成抑制劑，如psymberin、青腰蟲素、 irciniastatin A0
[0569] 由于與其它潛在的治療試劑相比，大多數(shù)毒素具有更強的遞送細胞殺傷效應的能 力，故在一些治療應用中，毒素部分將是優(yōu)選的。因此，用于本發(fā)明的抗CCR4抗體構建體的 一些優(yōu)選抗細胞試劑是來源于植物、真菌或細菌的毒素。示例性的毒素包括表鬼白毒素； 細菌內毒素或細菌內毒素的脂質A部分；核糖體失活蛋白，如阜草素或白樹毒素；a-八疊球 菌；曲霉素；局限曲霉素；核糖核酸酶，如胚胎核糖核酸酶；白喉毒素和假單胞菌外毒素。目 前優(yōu)選的例子是蓖麻毒素、白樹毒素、紅豆因、白喉、假單胞菌和百日咳毒素。
[0570] -些優(yōu)選的毒素是A鏈毒素，如蓖麻毒素 A鏈。最優(yōu)選的毒素基團是已經過修飾 或去除糖基殘基的蓖麻毒素 A鏈，被稱為"去糖基化A鏈"（dgA)。去糖基化蓖麻毒素 A鏈 是優(yōu)選的，因為它具有極強的潛力、更長的半衰期，且因為制造臨床等級和規(guī)模是經濟上可 行的。同樣可以使用重組和/或截短的蓖麻毒素 A鏈。
[0571] 本發(fā)明的抗CCR4抗體治療劑同樣可以包括能夠促進凝結的成分，即凝結劑。這 里，所述靶定抗體可以直接地或間接地（如通過另一種抗體）連接至一種直接或間接刺激 凝結的因子。
[0572] 用于這種應用的優(yōu)選凝結因子是組織因子（TF)和TF衍生物，如截短的TF(tTF)、 二聚體、三聚體、聚合體/多聚體TF和缺乏激活因子VII能力的突變體TF。其它合適的凝 結因子包括依賴維生素 K的凝結劑，如因子ΙΙ/IIa、因子VII/VIIa、因子IX/IXa和因子X/ Xa ;缺乏Gla修飾的依賴維生素 K的凝結因子；拉塞爾毒蛇蛇毒因子X活化劑；激活血小板 化合物，如凝血噁烷A2和凝血噁烷A 2合酶；和纖維蛋白溶解抑制劑，如α 2-抗纖維蛋白溶 酶?？傮w而言，目前優(yōu)選的是截短的組織因子（tTF)。
[0573] 免疫交聯(lián)物和免疫毒素的制備是本領域公知的（見，如美國專利號4, 340, 535)。 出于更進一步補充涉及免疫毒素的生產、純化和應用的教導，通過參考的方式將下述每一 項專利進一步結合至本文：美國專利號：6,004,554、5,855,866、5,965, 132、5,776,427、 5, 863, 538、5, 660, 827 和 6, 051，230。
[0574] 多種化學療法試劑和其它藥理學試劑同樣可以成功地連接至本發(fā)明的抗CCR4抗 體治療劑。已經連接至抗體的示例性抗腫瘤試劑包括阿霉素、道諾霉素、氨甲蝶呤和長春 堿。此外，已經描述了其它試劑如新制癌菌素、大分子霉素、三亞胺醌和α-蠅蕈素的連接 (見美國專利號5, 660, 827、5, 855, 866和5, 965, 132,每一篇都結合至本文）。
[0575] 同樣可以容易地實現(xiàn)"凝結配體"的制備。一種或多種凝結因子與本發(fā)明的抗CCR4 抗體的可操作的聯(lián)系可以是直接聯(lián)接，如上面對于免疫毒素所描述的那些?？蛇x地，所述可 操作地聯(lián)系也可以是非直接的連接，如所述抗體可操作地連接至結合凝結因子的第二個結 合區(qū)，所述第二個結合區(qū)優(yōu)選地是抗體或抗體的抗原結合片段。所述凝結因子應當在與它 的功能性凝結位點不同的位置與本發(fā)明的抗CCR4抗體連接，特別是使用共價鍵結合所述 分子。
[0576] 同樣可以在本發(fā)明的方法中使用雙特異性或三特異性抗體。在這樣的抗體中，一 條臂結合CCR4且是本發(fā)明的抗體。制備雙特異性抗體的方法是本領域公知的并有文獻記 載的。
[0577] 在制備免疫交聯(lián)物、免疫毒素和凝聚配體中，可以使用重組表達。編碼選擇的本發(fā) 明的抗CCR4抗體、治療試劑、毒素或凝結劑的核酸分子序列在表達載體中框內連接。因此， 重組表達導致核酸翻譯以產生期望的免疫交聯(lián)物?；瘜W交聯(lián)劑和抗生物素蛋白：生物素橋 同樣可以將治療試劑和本發(fā)明的抗CCR4抗體連接。
[0578] 本發(fā)明的組合物和方法可以與其它治療劑和診斷劑聯(lián)合使用。在生物試劑方面， 優(yōu)選地診斷試劑或治療試劑，與本發(fā)明的抗CCR4抗體結合使用，術語"結合"簡潔地用于包 括一系列實施方式。除非另有明確的說明或以科學術語解釋，"結合"術語應用于多種形式 的組合的組合物、醫(yī)藥品、雞尾酒、試劑盒、方法和第一及第二醫(yī)藥用途。
[0579] 本發(fā)明的"結合的"實施方式因此包括，例如其中本發(fā)明的抗CCR4抗體是裸露的 抗體且與一種不與其可操作地連接的試劑或治療試劑聯(lián)合使用。在這樣的例子中，所述試 劑或治療試劑可以以非靶定的或靶定的形式使用。在"非靶定的形式"中，所述試劑，特別 是治療試劑，將通常根據(jù)本領域的常規(guī)應用而使用。在"靶定的形式"中，所述試劑將通常 可操作地連接至不同的抗體或靶定區(qū)，所述抗體或靶定區(qū)將試劑或治療試劑遞送至目標疾 病位點。這樣靶定形式的生物試劑（診斷劑和治療劑）的應用在本領域中同樣是非常標準 的。
[0580] 在本發(fā)明其它的"結合的"實施方式中，本發(fā)明的抗CCR4抗體是免疫交聯(lián)物，其中 所述抗體是與所述試劑或治療試劑可操作地連接或結合的它本身。所述可操作的連接包括 如本文中所述的和本領域已知的所有形式的直接和間接的連接。
[0581] 所述"結合的"應用，特別是涉及本發(fā)明的抗CCR4抗體與治療試劑結合同樣包括 組合的組合物、醫(yī)藥品、雞尾酒、試劑盒、方法和第一及第二醫(yī)藥用途，其中所述治療試劑是 前藥形式。在這樣的實施方式中，所述能夠將前藥轉換成功能性形式的藥物的激活成分可 以再一次可操作地與本發(fā)明的抗CCR4抗體連接。
[0582] 在一些優(yōu)選的實施方式中，所述治療組合物、混合物、醫(yī)藥品、雞尾酒、試劑盒、方 法和第一及第二醫(yī)藥用途將是"前藥組合物"。如本領域普通技術人員所理解的，除非有明 確說明，術語"前藥組合物"意思是本發(fā)明的抗體與能夠將所述前藥轉換成活性藥物的成分 可操作地連接，而不是將抗體與前藥本身連接。但是，沒有要求本發(fā)明的前藥實施方式必須 用作前藥組合物。因此，前藥可以以本領域使用的任何方式所使用，包括ADEPT和其它形 式。
[0583] 因此，當描述組合的組合物、醫(yī)藥品、雞尾酒、試劑盒、方法和第一及第二醫(yī)藥用途 時，優(yōu)選地以診斷試劑形式，更優(yōu)選地以治療試劑形式，所述組合物包括是裸露抗體的抗 CCR4抗體和免疫交聯(lián)物，且其中本發(fā)明的體內實施方式的實踐包括在前、同時或在后施用 裸露的抗體或免疫交聯(lián)物和生物試劑、診斷試劑或治療試劑；只要在一些結合的或未結合 的形式中，實現(xiàn)提供全面提供一些形式的抗體和一些形式的生物試劑、診斷試劑或治療試 劑。
[0584] 簡單地解釋了本發(fā)明關于腫瘤的上述和其它效果以解釋操作的組合模式、連接試 劑的類型等等。該描述的方法不應當被解釋為本發(fā)明的抗CCR4抗體的有益性質的保守的 陳述或過度簡化。因此，應當理解為這樣的抗體本身具有抗CCR4性質且這樣抗體的免疫交 聯(lián)物將保留這些性質并將這些性質與連接試劑的性質結合；此外，所述抗體和任何連接試 劑的結合效果將典型地被提高和/或放大。
[0585] 因此，本發(fā)明提供組合物、藥物組合物、治療試劑盒和醫(yī)學雞尾酒，可選地在至少 第一種組合物或容器中包括生物學有效量的至少第一種本發(fā)明的抗CCR4抗體或這樣的抗 CCR4抗體的抗原結合片段或免疫交聯(lián)物；和生物學有效量的至少第二種生物學試劑、成分 或系統(tǒng)。
[0586] 所述"至少第二種生物學試劑、成分或系統(tǒng)"通常將是治療或診斷試劑、成分或系 統(tǒng)，但不需要一定是。例如，所述至少第二種生物學試劑、成分或系統(tǒng)可以包括用于修飾所 述抗體和/或用于將其它試劑連接至所述抗體的成分。一些優(yōu)選的第二種生物學試劑、成 分或系統(tǒng)是用于制備和使用前藥的前藥或成分，包括用于制備前藥本身的成分和配合本發(fā) 明的抗體在這樣的前藥或ADEPT實施方式中起作用的成分。
[0587] 當包括治療試劑或診斷試劑作為至少第二種生物學試劑、成分或系統(tǒng)時，這樣的 治療劑和/或診斷劑將典型地是在治療或診斷一種或多種上述紊亂中使用的那些。
[0588] 因此，在一些實施方式中，"至少第二種治療試劑"將包括在治療試劑盒或雞尾酒 中。術語"至少第二種治療劑"是針對本發(fā)明的抗CCR4抗體是第一種治療試劑而言的。因 此，本發(fā)明的抗體可以和化學療法試劑、放射療法試劑、細胞因子或趨化因子拮抗劑、細胞 因子或趨化因子表達抑制劑、抗血管新生試劑、誘導細胞凋亡試劑或抗癌免疫毒素或凝聚 配體、或包括皮質類固醇和NSAID的抗炎癥試劑結合，這些試劑的一部分在本文的其它地 方描述。
[0589] 其它示例性的抗癌試劑包括如新霉素、鬼臼毒素、TNF-α、α νβ 3拮抗劑、鈣離子載 體、鈣流誘導試劑、以及它們的任意衍生物或前藥。目前優(yōu)選的抗微管蛋白藥物包括秋水仙 堿、紫杉酚、長春堿、長春新堿、去乙酰長春酰胺、考布他汀或它們的衍生物或前藥。
[0590] 在本發(fā)明的組合物、試劑盒和/或藥物方面，所述治療試劑的組合的有效量可以 是包括在單一容器或容器裝置中，或包括在不同容器或容器裝置中。所述雞尾酒通常將被 混合在一起以組合使用。通常優(yōu)選的是配制成靜脈內給藥的試劑。同樣可以包括成像成 分。所述試劑盒同樣可以包括使用所述至少第一種抗體和所包括的一種或多種其它生物學 試劑的說明書。
[0591] 通常而言，所述至少第二種治療試劑可以與本發(fā)明的抗CCR4抗體同時施用于動 物或病患；所述第二種治療試劑和本發(fā)明的抗CCR4抗體來自單一的藥物組合物或來自緊 密共同施用的兩種藥物組合物。
[0592] 可選地，可以在施用本發(fā)明的抗CCR4抗體相續(xù)的時間內對動物或病患施用所述 至少第二種治療試劑。本文使用的"相續(xù)的時間"意思是"交錯的"，使得在不同于施用本 發(fā)明的抗CCR4抗體的時間對所述動物或病患施用至少第二種抗癌試劑。通常，在有效分隔 開的時間內施用兩種試劑以使得兩種試劑發(fā)揮各自的治療效果，即，在"生物學有效時間間 隔"施用它們?？梢栽诒景l(fā)明的抗CCR4抗體之前的生物學有效時間或在所述治療之后的生 物學有效時間對所述動物或病患施用所述至少第二種治療試劑。
[0593] 因此，本發(fā)明提供治療患有腫瘤的動物或病患的方法，包括：
[0594] (a)對所述動物或病患進行充分減少所述腫瘤負擔的第一種治療；和
[0595] (b)隨后施用至少第一種本發(fā)明的抗CCR4抗體或其抗原結合片段；可選地其中所 述抗體或片段可操作地與第二種治療試劑連接。
[0596] 優(yōu)選的第一種治療包括外科切除和化學療法干涉。
[0597] 在其它實施方式中，本發(fā)明提供治療患有CCR4介導的紊亂的動物或病患，包括：
[0598] (a)對所述動物或病患進行充分減少所述CCR4介導的負擔如炎癥的第一種治療； 和
[0599] (b)隨后施用至少第一種本發(fā)明的抗CCR4抗體或其抗原結合片段；可選地其中所 述抗體或片段可操作地與第二種治療試劑連接。
[0600] 在一些其它實施方式中，本發(fā)明的抗體和免疫交聯(lián)物可以與一種或多種診斷試劑 結合，典型的診斷試劑是在診斷如上所述的紊亂中所使用的。因此本發(fā)明包括一系列的診 斷組合物、試劑盒和方法。
[0601] 更多方面是診斷或成像受試者的方法，包括對受試者施用合適量的如本文所定義 的本發(fā)明的抗體或其它蛋白并檢測受試者中所述的本發(fā)明抗體或其它蛋白的存在和/或 量和/或位置。
[0602] 在一種實施方式中，本發(fā)明提供一種減少動物中與CCR4表達相關的免疫抑制的 方法，包括對所述動物施用有效量的本發(fā)明的抗體或它的免疫交聯(lián)物，以在所述動物中形 成所述抗體和CCR4的復合物，因此減少動物中與CCR4表達相關的免疫抑制。
[0603] 根據(jù)上述應用和方法成像或診斷的合適疾病包括任何疾病，優(yōu)選地是在本文其它 地方描述的任何癌癥。
[0604] 在一種實施方式中，本發(fā)明提供一種在動物中診斷疾病或監(jiān)測疾病進程的方法， 包括步驟：
[0605] (a)用本發(fā)明的抗體或其免疫交聯(lián)物接觸取自所述動物的檢測樣品。
[0606] 在另一種實施方式中，本發(fā)明提供一種在動物中診斷疾病或監(jiān)測疾病進程的方 法，包括步驟：
[0607] (a)用本發(fā)明的抗體或其免疫交聯(lián)物接觸取自所述動物的檢測樣品；
[0608] (b)測量或檢測所述檢測樣品中抗體-抗原復合物的存在和/或量和/或位置； 以及可選地
[0609] (C)將檢測樣品中抗體-抗原復合物的存在和/或量與對照樣品進行比較。
[0610] 在上面的方法中，在允許形成抗體-抗原復合物的條件下完成所述接觸步驟。本 領域技術人員可以容易地決定合適的條件。
[0611] 在上述方法中，可以使用任何合適的檢測樣品，如懷疑感染疾病的活檢細胞、組織 或器官或組織切片。
[0612] 在上述方法中，在檢測樣品中存在任何量的抗體-抗原復合物將預示著存在疾 病。優(yōu)選地，對于陽性診斷，所述檢測樣品中抗體-抗原復合物的量大于、優(yōu)選地明顯大于 在合適的對照樣品中發(fā)現(xiàn)的量。更優(yōu)選地，所述明顯更大的水平是統(tǒng)計學明顯，優(yōu)選地概率 值〈0.05。測量統(tǒng)計顯著性的合適方法是本領域公知的并有文獻記載的，且可以使用這些中 任一種。
[0613] 監(jiān)測疾病的進程同樣可以包括在所述時間內監(jiān)測檢測樣品中抗體-抗原復合物 的存在和/或量。因此，監(jiān)測可以包括（d)將取自所述動物的第一種檢測樣品中抗體-抗 原復合物的存在和/或量與取自所述動物的第二種檢測樣品中抗體-抗原復合物的存在和 /或量進行比較。"第一種檢測樣品"的意思在取出"第二種檢測樣品"之前取出的樣品，例 如在取出第二種檢測樣品之前的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12天、周、月或年取出的樣 品。與第一種檢測樣品相比，抗體-抗原復合物的量在第二種檢測樣品中減少表示疾病好 轉，而增加表示疾病惡化。
[0614] 本領域技術人員可以容易地選擇合適的對照樣品，例如，在診斷具體疾病情況下， 合適的對照可以是取自不患有疾病的受試者的樣品。同樣可以容易地測定合適的對照"值" 而不需要在每一次檢測中運行對照"樣品"，例如，通過參考本領域已知的正常受試者的范 圍。
[0615] 對于在診斷或成像應用中使用，本發(fā)明的抗體可以用可檢測的標記物標記，所述 標記物如不透射線物或放射性同位素，如 311、14(：、，、355、1231、1251、 1311;放射性發(fā)射體（如 α、β或Y發(fā)射體）；熒光（熒光團）或化學發(fā)光（發(fā)色團）化合物，如異硫氰酸熒光素、 若丹明或螢光素；酶，如堿性磷酸酶、β_半乳糖苷酶或辣根過氧化物酶；成像劑；或金屬離 子；或化學基團如生物素，其可以通過結合特異的同類可檢測基團（如標記的抗生物素蛋 白/鏈霉親和素）而被檢測。將標記物連接至結合蛋白（如抗體或抗體片段）的方法是本 領域已知的。這樣的可檢測標記物可以檢測所述檢測樣品中結合蛋白-抗原復合物的存 在、量或位置。
[0616] 在體內使用的優(yōu)選的可檢測的標記物包括X-射線可檢測的化合物，如鉍（III)、 金（III)、鑭（III)或鉛（II);放射性離子，如銅 67、鎵67、鎵68、銦m、銦113、碘 123、碘125、碘131、 汞197、汞 2°3、錸186、錸188、銣97、銣 1(13、锝99m或釔9°;核磁自旋共振同位素，如鈷（II)、銅（II)、 鉻（III)、鏑（III)、鉺（III)、釓（III)、欽（III)、鐵（II)、鐵（III)、錳（II)、釹（III)、鎳 (II)、釤（III)、鋱（III)、釩（II)或鐿（III);或若丹明或熒光素。
[0617] 本發(fā)明同樣包括包含本發(fā)明抗體的診斷或成像試劑，所述本發(fā)明抗體連接至直接 或間接產生可檢測的信號的標記物。合適的標記物在本文其它地方描述。
[0618] 本發(fā)明進一步提供試劑盒，所述試劑盒包括一種或多種本發(fā)明的抗體、免疫交聯(lián) 物或組合物或一種或多種編碼本發(fā)明抗體的核酸分子、或一種或多種包括本發(fā)明的核酸序 列的重組表達載體、或一種或多種包括本發(fā)明的重組表達載體或核酸序列的宿主細胞或病 毒。優(yōu)選地，所述試劑盒用于本文描述的方法和應用中，如本文描述的治療、診斷或成像方 法，或用在本文描述的體外分析或方法中。在這樣試劑盒中的抗體優(yōu)選地是本文其它地方 描述的抗體結合物，如可以連接至可檢測基團或可以是免疫交聯(lián)物。優(yōu)選地，所述試劑盒包 括說明所述試劑盒成分如在診斷中使用的說明書。優(yōu)選地，所述試劑盒用于診斷或治療本 文其它地方描述的疾病，且可選地包括說明所述試劑盒成分在診斷或治療這樣疾病中應用 的說明書。
[0619] 本文定義的本發(fā)明的抗體同樣可以用作體外或體內應用和分析的分子工具。由于 所述抗體具有抗原結合位點，這些可以作為特異結合對的成員而起作用且這些分子可以用 在需要特異結合對成員的任何分析中。
[0620] 因此，本發(fā)明的其它方面提供包含本文定義的本發(fā)明抗體的試劑，且這樣抗體用 作如體外或體內分析中的分子工具。
[0621] 可以通過以下方式完成癌癥治療：
[0622] (a)通過對患有腫瘤的動物或病患施用診斷量的至少第一種可檢測的-標記的本 發(fā)明的抗CCR4抗體、包括可操作地連接至本發(fā)明的抗CCR4抗體的診斷試劑形成腫瘤圖像， 從而形成腫瘤的可檢測圖像；以及
[0623] (b)隨后對同樣的動物或病患施用治療最優(yōu)化量的本發(fā)明的至少第一種裸露的抗 CCR4抗體或使用同樣抗體的治療劑-抗體構建體，從而引起抗腫瘤效果。
[0624] 現(xiàn)在，將參考所述表和圖更詳細地描述以下非限定性實施例，其中，
[0625] 表1列出了本文公開的涉及抗體17G的一些序列；
[0626] 表2列出了本文公開的涉及抗體9E的一些序列；
[0627] 表3列出了本文公開的涉及抗體10的一些序列；
[0628] 表4列出了本文公開的涉及抗體IlF的一些序列；
[0629] 表5列出了本文公開的涉及IgG形式的抗體17G的一些序列。所述可變區(qū)用下劃 線表示。
[0630] 表6列出了本文公開的涉及IgG形式的抗體9E的一些序列。所述可變區(qū)用下劃 線表示。
[0631] 表7列出了本文公開的涉及IgG形式的抗體10的一些序列。所述可變區(qū)用下劃 線表示。
[0632] 表8列出了本文公開的涉及IgG形式的抗體IlF的一些序列。所述可變區(qū)用下劃 線表示。
[0633] 表9顯示了使用軟件Prism(GraphPad,圣地亞哥，CA)的"一個位點特異結合"模 式從IgG對CCR4+細胞的滴度計算的親和力（K d值）。使用應用不同CCR4+細胞類型的IgG 形式的抗體17G、9E和KM3060var (見實施例2)。
[0634] 表10顯示了抗體KM3060var的序列。
[0635] 表11列出了本文公開的涉及抗體9E10J的一些序列；
[0636] 表12列出了本文公開的涉及抗體9E1D的一些序列；
[0637] 表13列出了本文公開的涉及IgG形式的抗體9E10J的一些序列。所述可變區(qū)用 下劃線表示。
[0638] 表14列出了本文公開的涉及IgG形式的抗體9E1D的一些序列。所述可變區(qū)用下 劃線表示。
[0639] 表15顯示了從實施例4獲得結果測定的表觀親和力（IC5tl和K D)。
[0640] 表16顯示了在Ca++流分析中測量的IC 5(|值（實施例5)。
[0641] 表17顯示了抗CCR4抗體的ADCC活性的比較（實施例6)。
[0642] 表18顯示了包括去巖藻糖化的9E10J的抗CCR4抗體的ADCC活性的比較（實施 例 11)。
[0643] 表19顯示了實施例14的一些結果。表觀親和力（Kd)通過在流式細胞技術中飽 和抗體對細胞的滴定而測量。
[0644] 表20顯示了實施例9的一些結果。生物素化的MDC的細胞結合抑制的ICJt和 計算的親和力（K d)從對DT-40-CCR4+和CCRF-CEM細胞的競爭結合實驗中測量。
[0645] 表21顯示了實施例9的一些結果。生物素化的TARC細胞結合抑制的ICJt從對 DT-40-CCR4+和CCRF-CEM細胞的競爭結合實驗中測量。
[0646] 表22顯示了從實施例9的競爭實驗中測量的IC5tl值的概括。
[0647] 表23顯示了基于本文公開的抗體的CDR共同序列。
[0648] 表24顯示了實施例15關于測量9E10J對血小板凝聚效果的一些結果。從新鮮的 供體血液中分離血小板并在存在9E10J-IgG (10 μ g/ml)或天然配體MDC和TARC (0. 25 μ g/ ml)時孵育血小板。ADP(3yM)用作對照以證明血小板的表現(xiàn)如所期待的。所述測量中還 包括抗GFP(10y g/ml)以證明所述分析的特異性。通過測量樣品室中的吸光率測量凝聚并 以％表示，并將其與平行進行的血小板耗盡的血漿（ = 0%凝聚）進行比較。預孵育=首先 用所述血小板孵育IgG樣品10分鐘，然后加入配體；混合=將IgG樣品與配體混合，然后用 血小板孵育。
[0649] 圖1顯示了克隆17G的重鏈和輕鏈的核苷酸和氨基酸序列。通過Ncol/Notl位點 將scFv克隆至pH0G21中。用于初始克隆的限制性位點（NcoI、HindIII、MluI和NotI)用 斜體和下劃線表示。VH和VL之間的連接片段是斜體的。C-myc表位和6個組氨酸分別用 下劃線和雙下劃線表示。
[0650] 圖2顯示了克隆9E的重鏈和輕鏈的核苷酸和氨基酸序列。通過Ncol/Notl位點 將scFv克隆至pH0G21中。用于初始克隆的限制性位點（NcoI、HindIII、MluI和NotI)用 斜體和下劃線表示。VH和VL之間的連接片段是斜體的。C-myc表位和6個組氨酸分別用 下劃線和雙下劃線表示。
[0651] 圖3顯示了克隆10的重鏈和輕鏈的核苷酸和氨基酸序列。通過Ncol/Notl位點 將scFv克隆至pH0G21中。用于初始克隆的限制性位點（NcoI、HindIII、MluI和NotI)用 斜體和下劃線表示。VH和VL之間的連接片段是斜體的。C-myc表位和6個組氨酸分別用 下劃線和雙下劃線表示。
[0652] 圖4顯示了克隆IlF的重鏈和輕鏈的核苷酸和氨基酸序列。通過Ncol/Notl位點 將scFv克隆至pH0G21中。用于初始克隆的限制性位點（NcoI、HindIII、MluI和NotI)用 斜體和下劃線表示。VH和VL之間的連接片段是斜體的。C-myc表位和6個組氨酸分別用 下劃線和雙下劃線表示。
[0653] 圖5圖示說明了實施例2的流式細胞計數(shù)的結果。通過對轉染和未轉染CCR4的 DT40細胞染色確定IgG形式的抗體17G和9E的CCR4特異性。在這個實驗中，所述IgG形 式的抗CCR4抗體KM3060var作為陽性對照，抗GFP的IgG作為陰性對照。
[0654] 圖6圖示說明了實施例2的流式細胞計數(shù)的一些結果。使用流式細胞計數(shù)分析抗 CCR4抗體KM3060var、17G和9E與表達CCR4細胞系CCRF-CEM的結合。對細胞一式三份染 色，且誤差棒顯示標準偏差太小而看不見。所述陰性對照抗GFP抗體沒有給出任何染色信 號。
[0655] 圖7圖示說明了實施例2的流式細胞計數(shù)的一些結果。通過對轉染或未轉染CCR4 的DT40細胞染色確定10抗體的CCR4特異性。在本實驗中，所述抗GFP scFv作為陰性對 照。
[0656] 圖8圖示說明了實施例2的流式細胞計數(shù)的一些結果。通過對轉染或未轉染CCR4 的DT40細胞染色確定IlF抗體的CCR4特異性。在本實驗中，所述抗VZV scFv作為陰性對 照。
[0657] 圖9是顯示實施例3的一些結果的圖。如在用各不同濃度的MDC與孵育之后，通 過用scFV染色細胞流式細胞計數(shù)所測定的，所述抗CCR4抗體干擾11F、9E、17G和10干擾 配體MDC與轉染CCR4的DT40細胞的結合。根據(jù)之前的報導，抗體KM3060var不干擾MDC 與CCR4受體的結合。
[0658] 圖10。圖10A、B和C是顯示了實施例4的競爭分析的結果的圖。抗體與CCR4的 結合被顯示為圖示的逐漸增加濃度的檢測抗體（即假定的競爭者）的最大結合（即，不存 在任何競爭者時的結合）百分比。
[0659] 圖IOA顯示存在非生物素化的IgG形式的17G、9E和KM3060var時，0. 28nM的生物 素化的IgG形式的17G與轉染CCR4的DT40細胞結合。KM3060var對17G與CCR4的結合 不具有任何可察覺的效果，而抗體9E的存在引起與CCR4結合的17G的量減少，表明17G和 9E彼此競爭結合CCR4。
[0660] 圖IOB顯示了存在非生物素化的17G、9E和KM3060var時，7nM的生物素化IgG形 式的9E與轉染CCR4的DT40細胞結合。KM3060var對9E與CCR4的結合不具有任何可察覺 的效果，而抗體17G的存在引起與CCR4結合的9E的量減少，證實了圖IOA中17G和9E彼 此競爭結合CCR4的結果。
[0661] 圖IOC顯示了存在非生物素化的17G、9E和KM3060var時，6. 8nM生物素化IgG形 式的KM3060var與轉染CCR4的DT40細胞結合?？梢娍匆?，17G和9E都不與KM3060var競 爭結合CCR4。
[0662] 圖11顯示了實施例5的結果，其中分析了通過IgG形式的9E、17G和KM3060var 的鈣流抑制。用Fluo-4標記的天然CCR4+CCRF-CEM細胞系用抗體預孵育，隨后用TARC(A) 或MDC(B)配體刺激。在加入配體后的大約15秒開始記錄細胞。TARC和MDC均引起鈣流， 在圖中表現(xiàn)為峰值。TARC誘導的鈣流幾乎完全由17G和9E分別抑制，但KM3060var不抑 制。MDC誘導的鈣流也同樣強烈地由17G和9E分別抑制，但KM3060var不抑制。
[0663] 圖12A和B顯示實施例6的抗體依賴的細胞毒性（ADCC)結果。該圖片顯示了，當 存在人PBMC時，17G (圖12B)和9E (圖12A)能夠誘導CCRE-CEM細胞的ADCC。
[0664] 圖13是顯示實施例2的一些結果的圖。通過對轉染和未轉染CCR4的DT40細胞 染色確定抗體9E10J和9E1D的CCR4特異性。在這個實驗中，9E作為陽性對照。使用淺灰 棒顯示結合CCR4+細胞，使用深灰棒顯示結合至CCR4-細胞，缺少深灰棒意味著沒有檢測到 明顯結合。
[0665] 圖14是顯示實施例3的一些結果的圖。當存在或不存在CCR4配體TARC時，分析 抗CCR4抗體17G、9E、10、llF和KM3060varscFv與轉染CCR4的DT40細胞的結合，如通過 流式細胞計數(shù)所測定的。
[0666] 圖15顯示了實施例4的一些結果。當存在逐漸增加濃度的未標記的IgG形式的 9E、9E10J或KM3060var時，固定量的生物素化的IgGl形式的9E在0· 7nM(a，c)或3. 3nM(b) 時對DT-40-CCR4+(a-b)或CCRF-CEM細胞（c)的競爭滴定。通過Str印-PE檢測結合的生 物素化的IgG。MFI =熒光強度中值。
[0667] 圖16顯示了實施例5的一些結果。使用重疊濃度間隔對用Fluo-4標記的 CCRF-CEM細胞進行Ca++流分析。在加入CCR4特異配體TARC之前用IgG形式的9E、9E10J 或KM3060var預孵育所述細胞15分鐘。所述IgG濃度是0. 001 μ g/ml (a)、0. 01 μ g/ml (b)、 0· 1 μ g/ml (c)、0· 1 μ g/ml (e)、I. 0 μ g/ml (f)和 10 μ g/ml (g)。使用軟件 Prism(GraphPad) 對曲線下的面積（AUC)求積分并繪制成AUC百分比用于TARC單獨的最大刺激，如在圖（d) 和（h)中關于左柱和右柱所分別顯不的。
[0668] 圖17顯示了實施例5的一些結果。使用重疊濃度間隔對用Fluo-4標記的 CCRF-CEM細胞進行Ca++流分析。在加入CCR4特異配體TARC之前用IgG形式的9E10J或 KM3060var預孵育所述細胞15分鐘。使用廣泛范圍的IgG濃度。記錄信號并使用軟件 Prism(GraphPad)對曲線下的面積（AUC)求積分并繪制成AUC百分比用于TARC單獨的最大 刺激。
[0669] 圖18顯示了實施例6的一些結果，關于由抗CCR4抗體介導的CCRF-CEM細胞 的ADCC。圖18(a)比較了 IgG形式的9E和IgG形式的9E10J，圖18(b)比較了 9E10J和 KM3060var。
[0670] 圖19顯示了實施例10的一些結果。去巖藻糖化的9E10J(9E10Jdef)、未修飾的 9E10J和KM3060var與DT40細胞的結合，所述DT40細胞穩(wěn)定轉染CCR4 (+)或未轉染CCR4、 即CCR4陰性（_)。顯示的是20yg/ml濃度時的結合信號。用抗人FITC(異硫氰酸熒光素） (山羊）結合的IgG檢測結合。
[0671] 圖20顯示了實施例11的一些結果。由抗CCR4抗體介導的CCRF-CEM細胞的ADCC， 將去巖藻糖化的9E10J(9E10Jdef)與未修飾的9E10J和KM3060var比較。
[0672] 圖 21 顯示了實施例 14 的一些結果。IgG 9E、9E1D 和 KM3060var 對 DT-40CCR4+細 胞（a)和對人T-細胞白血病細胞CCRF-CEM(b)的結合滴定。用抗人FITC進行檢測。MFI， 熒光強度中值。
[0673] 圖22顯示了實施例14的一些結果。scFv 9E、9E1D和9E10J對DT-40CCR4+細胞 的結合滴定。所述scFv通過myc-標簽交叉連接以刺激模擬類似二聚IgG的情形。用抗人 PE進行檢測。MFI，熒光強度中值。
[0674] 圖23顯示了實施例14的一些結果。IgG形式的9E、9E10J和KM3060var對人T細 胞白血病細胞CCRF-CEM的結合滴定。用抗人PE進行檢測。MFI，熒光強度中值。
[0675] 圖24顯示了實施例9的一些結果。當存在逐漸增加濃度的未標記的抗體（scFv 或IgG形式的9E10J)或CCR4配體（MDC)時，固定量的生物素化的MDC(a、b中大約10nM， c、d中大約20nM)對DT-40-CCR4+(a)或CCRF-CEM細胞（b-d)的競爭滴定。通過Str印-PE 檢測結合的生物素化的MDC。MFI，熒光強度中值。
[0676] 圖25顯示了實施例9的一些結果。當存在逐漸增加濃度的未標記的抗體（IgG 形式的9E10J)或CCR4配體（MDC或TARC)時，固定量的生物素化的TARC(大約20nM)對 DT-40-CCR4+(a、b)或CCRF-CEM細胞（c、d)的競爭滴定。使用Str印-PE檢測結合的生物素 化的MDC。在（b)和（d)中，在存在1% BSA情況下用細胞孵育蛋白。MFI，熒光強度中值。
[0677] 圖26顯示了實施例9的一些結果。當存在逐漸增加量的未標記的抗體9E、9E10J 或未標記的配體時，固定量的生物素化的MDC(a)和TARC(b)的競爭滴定。
[0678] 圖27顯示了克隆9E10J的重鏈和輕鏈的核苷酸和氨基酸序列。通過Ncol/Notl位 點將scFv克隆至pH0G21中。用于初始克隆的限制性位點（Ncol、Hindlll、MluI和NotI) 用斜體和下劃線表示。VH和VL之間的連接片段是斜體的。C-myc表位和6個組氨酸分別 用下劃線和雙下劃線表示。
[0679] 圖28顯示了克隆9E1D的重鏈和輕鏈的核苷酸和氨基酸序列。通過Ncol/Notl位 點將scFv克隆至pH0G21中。用于初始克隆的限制性位點（Ncol、Hindlll、MluI和NotI) 用斜體和下劃線表示。VH和VL之間的連接片段是斜體的。C-myc表位和6個組氨酸分別 用下劃線和雙下劃線表示。
[0680] 圖29顯示了實施例13的一些結果?？笴CR4抗體和對照抑制配體（TARC ;3. 5nM) 誘導的細胞遷移。人T細胞白血病CCRF-CEM細胞被誘導以遷移至Multiscreen-MIC室中， 其中配體TARC被放置在較低的室中，而在較上方的室中所述細胞與抗體或培養(yǎng)基共孵育 僅作為對照。檢測和計算遷移至較低室中的細胞。繪制了一式三份的平均值和SD值。（a) 比較9E10J與9E和抗GFP對TARC誘導的遷移的抑制。（b)比較9E10J與IGl和KM3060var 對TARC誘導的遷移的抑制。
[0681] 圖30顯示了實施例16的一些結果。外周血淋巴細胞（PBL)的染色。從總細胞群 中提出淋巴細胞。通過用抗⑶3-APC-lgG (人）和抗⑶8-PE-Cy5-IgG (人）孵育而挑出T細 胞。從20 μ g/ml低至0. 3ng/ml滴定生物素化的9E10J和生物素化的比較物KM3060var，并 用PE連接的鏈霉親和素檢測。使用PBL的圖例是a)提取淋巴細胞群；b)提取CD3陽性細 胞并又分成⑶8陽性（⑶4陰性）細胞和⑶8陰性（⑶4陽性）細胞；c) 9E10J和KM3060var 對提取的CD8陰性細胞（CD4陽性細胞）的滴定曲線，表示為％陽性事件。
[0682] 以下非限定性例子示例性地說明了本發(fā)明。 實施例
[0683] 實施例1 :新抗體
[0684] 已經鑒定了四個能夠特異結合CCR4的人類抗體。將單鏈形式的抗體克隆至 PH0G21質粒中，所述質粒包含c-myc和6個組氨酸標簽表位。轉染TGl細菌，用IPTG誘導 scFv表達。通過EasyCyte確認純化的scFv的結合。
[0685] 對產生克隆的抗體的重鏈和輕鏈的核苷酸序列測序。所述抗體被指定為17G、9E、 11F、10、9E10J和9E1D。17G的輕鏈和重鏈的核苷酸序列和氨基酸序列在圖1中示出。17G 的輕鏈和重鏈的CDR域在表1中示出。9E的輕鏈和重鏈的核苷酸和氨基酸序列在圖2中示 出。9E的輕鏈和重鏈的CDR域在表2中示出。10的輕鏈和重鏈的核苷酸序列和氨基酸序 列在圖3中示出。10的輕鏈和重鏈的⑶R域在表3中示出。IlF的輕鏈和重鏈的核苷酸序 列和氨基酸序列在圖4中示出。IlF的輕鏈和重鏈的CDR域在表4中示出。
[0686] 已經鑒定了另外兩種能夠特異結合CCR4的抗體。如上所述制備單鏈形式的抗體。 9E10J的輕鏈和重鏈的核苷酸序列和氨基酸序列在圖27中示出。9E10J的輕鏈和重鏈的CDR 域在表11中示出。9E1D的輕鏈和重鏈的核苷酸序列和氨基酸序列在圖28中示出。9E1D 的輕鏈和重鏈的⑶R域在表12中示出。
[0687] 同樣制備了 IgG形式的抗體17G、9E、10、11F、9E10J和9E1D。使用標準方案制備 IgG。簡要地，將編碼相對應的可變域的基因克隆至哺乳動物表達載體pLNO中，所述表達載 體包含人恒定區(qū)基因（Norderhaug等，1997)。所述抗體在細胞工廠中表達，收獲的第一撥 產品通過蛋白A柱純化并通過尺寸排阻色譜法分餾成單體。所述IgG保留了它們特異結合 CCR4的能力。
[0688] 所述IgG形式是IgGl同種型，并包括兩條重鏈和兩條輕鏈。每一條重鏈包括一個 SEQ ID NO: 69 (對于 17G)、SEQ ID NO: 71 (對于 9E 或 9E1D)、SEQ ID NO: 73 (對于 10)、SEQ ID NO: 75 (對于11F)、或SEQ ID NO:105(對于9E10J)的VH域和一個人IgGl恒定區(qū)。每 一條輕鏈包括一個 SEQ ID NO: 70 (對于 17G)、SEQ ID NO: 72 (對于 9E 或 9E10J)、SEQ ID N0:74(對于 10)、SEQ ID N0:76(對于 11F)或 SEQ ID N0:115(對于 9E1D)的 VL 域和一 個人λ輕鏈恒定區(qū)，但IgG形式的IlF除外，它包括人κ輕鏈。17G、9E、10、11F、9E10J和 9E1D的全長IgG序列分別在表5、6、7、8、13和14中示出。
[0689] 已經鑒定了另一種抗體9ElDv。所述抗體在FR3的第88位具有一個點突變（根據(jù) Kabat 等，Sequences of proteins of immunological interest ;第五版，1991 編號），其 中9ElDv具有丙氨酸（A)，代替了在9E1D中發(fā)現(xiàn)的纈氨酸（V)。在目前檢測的范圍內，9ElDv 的性質與抗體9E1D的性質似乎一致。
[0690] 實施例2 :抗CCR4抗體與表汰目標的細朐的結合
[0691] 為證明實施例1中公開的抗體的CCR4特異性以及評估它們的結合親和力，用IgG 形式的17G和9E以及scFv 10和IlF在流式細胞計數(shù)中對內部轉染有CCR4和未轉染CCR4 的HEK293T細胞、DT40細胞和天然的CCR4+CCRF-CEM細胞系染色。作為陽性對照，使用內部 克隆的并表達的IgG形式的KM3060var，所述IgG形式的KM3060var特異于存在于人CCR4 的N末端2-29位的表位（EP1270595)?？笹FP抗體（由抗綠色熒光蛋白所產生）或抗VZN 抗體（由抗水痘帶狀皰疹病毒產生）用作陰性對照（抗GFP抗體是scFv和IgG形式，而抗 VAN僅作為scFv形式）。
[0692] CCRF-CEM(急性淋巴細胞性白血病，ATCC 號 CCL-119)、HEK293T/17(人腎，ATCC 號 CRL-11268)，和DT40(雞淋巴瘤，ATCC號CRL-2111)細胞系從美國模式培養(yǎng)物保藏所獲得 (ATCC,洛克維爾，MD)。CCRF-CEM細胞和DT40細胞在RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，HEK293T 細胞在Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)中培養(yǎng)。所有的細胞用胎牛血清培養(yǎng)， 對于DT細胞和HEK293T細胞，其濃度是10 %;對于CCRF-CEM細胞，其濃度是20 %。所有的 培養(yǎng)基都補充有青霉素和鏈霉素。
[0693] 對于流式細胞計數(shù)實驗，從培養(yǎng)瓶中收獲細胞，用PBS清洗兩次，用含有0. 2% BSA 和 0· 09% NaNjtJ PBS 重懸，最后等分成至 V 型 96 孔板（Greiner Bio-One, Frickenhausen, 德國）中，每孔I X IO5個細胞。將細胞在400g下離心5分鐘并在4°C下用不同抗體稀釋度 孵育45分鐘。
[0694] 對于用scFv的染色，在添加至細胞之前，用嵌合的（鼠可變域/人恒定域）抗 c-myc抗體預孵育scFv制品。
[0695] 在用含有0.2% BSA和0.09% NaNj^PBS清洗之后，4°C下，所述細胞用IOyg/ ml的RPE連接的山羊抗人IgG (AbDSerotec, Diisseldorf,德國）染色30分鐘。清洗 所述染色的細胞，用200 μ 1的含有0.2% BSA和0.09% NaNj^PBS重懸并轉移至U 型96孔板（Corning, Schiphol-Ri jk,荷蘭）中用于在EasyCyte流式細胞儀（Guava Technologies, Hayward, CA,美國）中獲得結果。
[0696] 獲得的結果清楚地表明抗體17G、9E、10和IlF特異于CCR4。圖5中示例性地說 明了抗體17G和9E與CCR4陽性DT40細胞的結合同與CCR4陰性DT細胞的結合的比較。 17G和9E與表達CCR4的CCRF-CEM細胞的結合在圖6中示出。同樣發(fā)現(xiàn)了 17G和9E與 CCR+HEK293T細胞同CCR-HEK293T細胞比較的選擇性結合。
[0697] 在低的納摩爾濃度的范圍內評估從這些IgG滴定實驗中推斷的親和力值（KD)(見 表9)。
[0698] 抗體10 scFv對CCR4的特異性在圖7中例示，抗體IlF scFv對CCR4的特異性在 圖8中例示。
[0699] 在基本符合上述描述的情況下，檢測9E10J和9E1D對未轉染和轉染CCR4的DT40 細胞的結合特異性。對于這個實驗，9E10J和9E1D作為scFv表達，其在3'末端具有c-myc 標簽，用于產生二聚物以模擬IgG模式。在加入至細胞之前，用抗c-myc抗體預孵育上述抗 體?；旧先缟纤鐾瓿扇旧?。所述結果顯示9E10J和9E1D選擇性地結合CCR4陽性細胞 (圖 13)。
[0700] 實施例3 :抗CCR4抗體干擾配體結合
[0701] 為確定所述抗CCR4抗體是否干擾CCR4配體和受體結合，在用scFv染色之前，用 轉染CCR4的DT40細胞預孵育MDC(從P印roTech EC Ltd.獲得，倫敦，英國）。作為陰性對 照，使用KM3060var scFv (序列見表10)，其特異于人CCR4的N末端部分。在之前顯示，所 述抗體 KM3060 不干擾配體與受體結合（T Ishida 等（2006) Specific Recruitment of CC Chemokine Receptor 4-Positive Regulatory T Cells in Hodgkin Lymphoma Fosters Immune Privilege，Cancer Res 66: (11) :5716-5722.)。碰306(^&1·對應于 KM3060,但是它 在不同的宿主細胞中表達，其可能導致連接至該抗體的糖鏈不同。
[0702] 從培養(yǎng)瓶中收獲CCR4+DT40細胞，用RPMI-1640培養(yǎng)基清洗2次，并等分至V型96 孔板中，每孔1><1〇 5個細胞（6代；[116113；[0-0116，？1'；^1^11113118611，德國）。在 500\8下對細 胞離心5分鐘，然后在37°C下，用含有0、1或10ng/ml MDC(P印roTech EC，倫敦，英國）的 1^^1-1640培養(yǎng)基孵育30分鐘。在500\8離心5分鐘后，吸出上清液，在41：下用0.5 48/ ml的scFv和2. 5 μ g/ml的含人Fc的內部產生的抗-cMyc孵育細胞1小時。用含有0. 2% BSA和0.09 % NaNj^PBS清洗三次之后，在4 °C下用2.5 μ g/ml的RPE連接的山羊抗人 IgG(AbDSerotec，DUsseldorf，德國）對細胞染色1小時。將細胞清洗、在200μ 1含有0· 2% BSA和0· 09%似隊的PBS中重懸并轉移至U型96孔板（Corning, Schiphol-Ri jk,荷蘭） 用于使用EasyCyte裝置的流式細胞計數(shù)（Guava Technologies, Hayward, CA,美國）。所述 結果顯示，除用KM3060var抗體染色之外，在用10ng/ml的MDC預孵育轉染CCR4的DT40細 胞之后，所述結果顯示了染色信號的明顯降低（圖9)。這表明抗體17G、9E、10和IlF干擾 配體結合并因此具有阻止CCR4的活性。
[0703] 相似的實驗顯示全部4個抗體17G、9E、10和IlF同樣干擾TARC和CCR4結合。該 結果在圖14中示出。
[0704] 實施例4 :抗CCR4抗體之間的競爭
[0705] 為分析結合抗CCR4抗體17G、9E和KM3060var的表位，使用流式細胞計數(shù)進 行競爭實驗。當存在不同濃度的未生物素化的抗CCR4抗體時，生物素化的抗體與轉 染CCR4的DT40細胞的結合受到挑戰(zhàn)。從培養(yǎng)瓶中收獲CCR4+DT40細胞，用PBS清洗兩 次，用含有〇. 2 % BSA和0. 09 %似隊的PBS重懸，最后等分成至V型96孔板（Greiner Bio-One, Frickenhausen,德國）中，每孔IX IO5個細胞。將細胞在400Xg下離心5分鐘 并在4°C下用不同抗體稀釋度孵育45分鐘。將細胞在400Xg下離心5分鐘并在4°C下用 固定量的生物素化的IgG和不同濃度的未生物素化的抗體孵育3-4小時。在用含有0. 2% BSA和0. 09%似隊的PBS清洗之后，4°C下，所述細胞用2. 5 μ g/ml的鏈霉親和素 -RPE (BD Pharmingen,圣地亞哥，CA，美國）染色30分鐘。將染色的細胞清洗、在250 μ 1含有0.2% BSA和0.09 % NaN^PBS中重懸并轉移至U型96孔板（Corning, Schiphol-Rijk,荷蘭）用 于在EasyCyte流式細胞計數(shù)儀（Guava Technologies, Hayward, CA,美國）上獲得結果。顯 示在圖10A、B和C中的結果說明17G和9E抗體具有相同的或至少重疊的表位。KM3060var 抗體和其它兩種抗體與細胞的結合沒有競爭，說明17G和9E與KM3060var不結合相同的表 位。
[0706] 進行了更多的競爭實驗以評估所述檢測抗體是否識別相同的或重疊的表位，以 測量它們對于CCR4的相對親和力。使用標記的9E作為競爭劑檢測抗體9E10J、9E和 KM3060var。
[0707] 如實施例2中所描述的培養(yǎng)DT40和CCRF-CEM細胞。從培養(yǎng)瓶中收獲細胞，用PBS 清洗兩次（400 X g、5分鐘、4°C )，并用含有0. 2% BSA和0. 09%似隊的PBS重懸。將細胞等 分成至￥型96孔板（6代：[116113;[0-0116，？1'；^1^11113118611，德國）中，每孔1\105個細胞。離 心細胞（400 X g、5分鐘、4°C )并在50 μ 1的混合有生物素化的競爭抗體9E(0. 1或0. 5 μ g/ ml)的IgG形式的9E10J或KM3060var(從5yg/ml開始系列稀釋）中重懸。4?下，將所述 細胞孵育2小時，每45分鐘用吸液管混合。將所述細胞用150 μ 1含有0.2% BSA和0.09% 似隊的PBS清洗三次并在4°C下用3 μ g/ml的鏈霉親和素 PE (BD Biosciences)染色45分 鐘。將細胞清洗、在200 μ 1含有0. 2% BSA和0. 09%似隊的PBS中重懸并轉移至U型96 孔Costar板（Corning, Schiphol-Rijk,荷蘭）用于使用FACS Canto II流式細胞計數(shù)儀 (BD Biosciences,海德爾堡，德國）的流式細胞計數(shù)。
[0708] 在圖15中顯示的結果證明了 9E和9E10J以劑量依賴方式有效地抑制細胞結合生 物素化的IgG形式的9E。相反，當用生物素化的9E滴定KM3060var時，結合信號幾乎沒有 減少；因此確定了由這些抗體識別的表位不重疊。
[0709] 為檢測IC50值（導致50%生物素化的IgG的結合被抑制的抗體濃度），使用軟 件Prism(GraphPad)的"log(抑制劑）vs.應答"模式通過非線性回歸曲線擬合對實驗數(shù) 據(jù)進行擬合。根據(jù)來自之前描述的方法的以下等式計算表觀結合親和力（K d) (Kipriyanov 等，1997b ;Schodin& Kranz, 1993):
[0710] Kd ⑴=IC5t/(l+[bi0-lgG(9E)]/KD(9E))，
[0711] 其中，I是未標記的抑制劑（IgG)，[bio_lgG(9E)]是固定濃度的生物素化的IgG形 式的9E，K D(9E)是源自飽和滴定實驗（4. 95nM)的IgG形式的9E的結合親和力。結果在表15 中示出。
[0712] 實施例5 :桔抗活件
[0713] 評估了 9E和17G在天然的CCR4+CCRF-CEM細胞系中減少配體誘導的鈣流的能力。 抗體KM3060var用作陰性對照。已經報道序列相同的去巖藻糖化的克隆KM2760不抑制CCR4 信號轉導。在調節(jié)條件下培養(yǎng)的CCRF-CEM靶細胞通過離心沉淀并在RPMI-1640培養(yǎng)基中 重懸兩次。一毫升的2· 5X IO6細胞與Flu〇-4_AM(Invitrogen, Carlsbad,加利福尼亞）、 Pluronic F-127(Invitrogen, Carlsbad,加利福尼亞）和丙磺舒混合達到終濃度分別是 1 μ M、0. 02%和1禮。所述細胞在37°C下在垂直旋轉輪（7rpm)上孵育30分鐘。所有的后 續(xù)步驟在存在ImM丙磺舒的情況下完成。所述細胞在含有10% FCS的RPMI-1640中清洗兩 次，在分析緩沖液（145mM NaCl、4mM KCl、lmM NaH2P04、0.8mM MgCl2、25mM H印es、22mM 葡萄 糖）中清洗一次，然后重懸至I. 2X106細胞/ml的終密度?；旌系润w積的細胞、含有或不含 有抗體的分析緩沖液和配體（MDC或TARC)。在加入配體之前，將前兩種成分（細胞和抗體） 預孵育15分鐘。IgG、TARC和MDC的終濃度分別是10 μ g/ml、10ng/ml和2. 5ng/ml。立即 使用FACSCanto II流式細胞計數(shù)儀（BD Biosciences,海德爾堡，德國）上的515_545nm 光譜過濾器分析所述樣品。
[0714] 顯示在圖11中的結果清楚地證明了 9E和17G均作為TARC和MDC的抑制劑。假 設單獨對TARC的信號是100%，以10 μ g/mL濃度的IgG形式的9E、17G和KM3060var預孵 育的細胞顯示對TARC刺激的信號反應是3%、-1%和104% (圖11A)。因此，用IgG形式 的9E、17G和KM3060var預孵育的細胞顯示對MDC刺激的信號反應分別是不存在IgG時對 MDC的信號的64%、42%和92% (圖11B)。當用IgG形式的9E或17G代替TARC和MDC配 體加入細胞時，沒有檢測到信號（數(shù)據(jù)未顯示）。IgG形式的9E或17G同樣沒有顯示CXCR4 特異的SDF-I配體的任何抑制（數(shù)據(jù)未顯示）。
[0715] 同樣在相似的條件下用人IgGl形式的抗體9E10J進行所述實驗，但是所述細胞在 37°C下不使用旋轉輪用Flu 〇4-AM孵育抗體孵育40分鐘?？贵wKM3060var作為陰性對照， 同樣也包括抗體9E (都是以人IgG形式）。在圖16中顯示的結果證明9E和9E10J抗體對 TARC誘導的信號轉導有劑量依賴的抑制。
[0716] 使用廣泛范圍的IgG濃度的9E10J詳細分析Ca++流抑制（圖17)。如在實施例14 中所解釋的計算IC 5(l(ng/ml)值。在濃度100-300ng/ml (0. 7-2. OnM)時達到完全信號抑制， 計算的ICJt是43. 3pM (表16)。
[0717] 實施例6 :抗體依賴的細朐介導的細朐毒件（ADCC)
[0718] 在天然CCR4+CCRF-CEM細胞系中評估9E和17G誘導ADCC的能力。在常規(guī)情況下培 養(yǎng)的CCRF-CEM靶細胞通過離心沉淀并在RPMI-1640培養(yǎng)基中重懸。該步驟重復一次。一毫 升的2· 5X IO6細胞與I丐黃綠素_AM(Invitrogen, Carlsbad,加利福尼亞）混合以達到10 μ M 的終濃度，然后在37°C下在垂直旋轉輪（7rpm)上孵育30分鐘。所述細胞在含有10% FCS 的RPMI-1640中清洗三次并將細胞密度調整至3 X IO5Ail。分別地，按照常規(guī)步驟制備外周 血單核細胞（PBMC)(通過Ficoll-Hypaque梯度離心富集），在含有10% FCS的RPMI-1640 中清洗，然后懸浮至每毫升6 X 106。將50 μ 1的每一種靶細胞和效應細胞添加至96孔微量 滴定板的相同孔中，使得效應物和靶細胞的比例（Ε:Τ)是20:1。將20 μ 1所述抗體（都是 以IgG形式）添加至相同孔中以達到終濃度范圍是10-10000ng/mL，且每個濃度四份樣品。 然后在37°C下將所述微量滴定板孵育4小時，然后在3小時和45分鐘之后向一些孔中加入 20 μ 1的0. 9% Triton-XlOO以使靶細胞完全溶解。然后將每個樣品100 μ 1的上清液轉移 至黑色微量滴定板，并在TECAN Μ200板讀數(shù)儀中分析熒光（激發(fā)：488nm ;發(fā)射：518nm)。從 所有其它樣品的強度中減去沒有抗體的樣品中的熒光強度。在用TritonX-100處理后，基 于100%細胞溶解的樣品的熒光強度，評估含有抗體的樣品的溶解百分比。通過非線性回歸 分析和使用軟件Prism(GraphPad,圣地亞哥，CA,美國）的三參數(shù)擬合模型計算劑量-反 應曲線。
[0719] 在圖12A和12B中顯示的結果清楚地證明當存在人PBMC時，9E和17G能夠誘導 八0(1：4(： 5(|值分別是6191^/1111和461^/1111，且最大殺死量是55%和22%。
[0720] 除了不使用旋轉輪外，在與上面描述的那些條件相似的條件下，同樣檢測抗體 9E10J誘導CCRF-CEM細胞的ADCC的能力，并與抗體9E和抗體KM3060var進行比較，。顯 示在圖18和表17中的結果顯示9E和9E10J能夠誘導ADCC，且由9E10J對ADCC的誘導比 KM3060var對ADCC的誘導更強。
[0721] 實施例7-抗cMvc雜奪體/人IgGl抗體的制各
[0722] 抗 cMyc 雜交體 / 人 IgGl 抗體：9E10H 鏈（AJ000488)和輕鏈 9E10L 鏈（AJ000489) 可變DNA序列從GeneArt定制，并轉換成雜交體人IgGl/ κ蛋白。根據(jù)Norderhaug 等，JM204:77-87的方法分別用特別引物以scFv為模板通過PCR克隆可變VH和VL區(qū)、消 化并連接至重鏈載體和輕鏈載體。瞬時轉染HEK293/T細胞；5-6天后，通過蛋白A及隨后 的尺寸排阻純化IgG以分離單體IgG部分。
[0723] 實施例8 :種類奪叉反應
[0724] 檢測抗體9E和9E10J與來自非人類物種的CCR4的交叉反應的能力。
[0725] 在含有10% FBS(來自PAA，目錄號A15-252)和IX青霉素/鏈霉素（來自PAA， 目錄號P11-010)的DMEM(來自PAA，目錄號E15-810)中培養(yǎng)Hek293T/17。它們每周被分 離2-3倍。Hek293T/17以32000細胞/cm 2播種48小時，在周末時播種27000細胞/cm 2。
[0726] 對于瞬時轉染，在T75(NUNC)培養(yǎng)瓶中，將Hek293T/17細胞以2X106細胞起始量 培養(yǎng)。48小時后，用Fugene (ROCHE)轉染所述細胞。每個T75使用40 μ 1的Fugene和16 μ g 的DNA。轉染后48小時分析所述細胞。
[0727] 用編碼人CCR4的pcDNA3. 1質?；蚓幋a小鼠 CCR4(GeneBank CAA62372)或猴子 (獼猴）CCR4 (PubMed 登錄號 XP_001098807)的 pLNO 質粒（Norderhaug 等，1997)瞬時轉 染冊1(-2931'/17細胞，使用？即61^0?〇(* 6)作為轉染試劑。非轉染（〇^4陰性）的細胞用 作陰性對照。在上述的常規(guī)條件下，繼續(xù)培養(yǎng)所述細胞48小時。在室溫下用PBS清洗所述 細胞兩次，通過用Accutase (PAA實驗室，林茨，奧地利）孵育3分鐘將所述細胞從培養(yǎng)瓶 中分離。所述細胞用PBS清洗兩次（400 X g、5分鐘、4°C )，并用含有0. 2% BSA和0. 09% NaNjtJ PBS 重懸。將細胞等分成至 V 型 96 孔板（Greiner Bio-One, Frickenhausen,德國） 中，每孔IXlO5個細胞。離心細胞（400Xg、5分鐘、4°C )并在50μ 1的含有0. 2% BSA和 0. 09% NaNjP 10 μ g/ml的9Ε或9E10J的PBS中重懸。4°C下，將所述細胞繼續(xù)孵育60分 鐘。通過離心和在1〇〇μ1的FACS緩沖液中再重懸將所述樣品清洗兩次。所述細胞球最終 在50 μ 1含有3 μ g/ml的抗人IgG-PE (BD Biosciences)中重懸并在4°C下孵育45分鐘。如 上所述將所述樣品清洗兩次并在250 μ 1的FACS緩沖液中重懸，隨后轉移至至U型96孔板 (Corning, Schiphol-Rijk,荷蘭）用于基于FACS Canto II (BD Biosciences，San Jose, CA) 的流式細胞計數(shù)。
[0728] 9E和9E10J均與人和猴子CCR4強烈結合，沒有檢測到與鼠 CCR4結合。
[0729] 實施例9 :抑制配體結合
[0730] 使用生物素化的配體在競爭實驗中檢測抗體9E和9E10J抑制MDC和TARC與CCR4+ 細胞結合的能力。設計所述實驗以給出抗體與CCR4的親和力同配體與CCR4的親和力的比 較的表征。
[0731] 用生物素化的MDC或生物素化的TARC對DT-40-CCR4+細胞和CCRF-CEM細胞進行 競爭結合分析。如在實施例2中所描述的培養(yǎng)DT40和CCRF-CEM細胞。使用標準程序將 TARC和MDC生物素化。所述生物化過程引起一些損失，使得本文敘述的生物素化的MDC和 TARC的濃度是近似值。
[0732] 從培養(yǎng)瓶中收獲細胞，用PBS清洗兩次（400Xg、5分鐘、4 °C )，并用含 有0. 2 % BSA和0. 09 %似隊的PBS重懸。將細胞等分成至V型96孔板（Greiner Bi〇-〇ne，F(xiàn)rickenhausen,德國）中，每孔 IXlO5 個細胞。離心細胞（400Xg、5 分鐘、4°C) 并在50 μ 1的混合有固定濃度的生物素化配體（10或20nM，見圖24的圖例）的IgG、單鏈或 未標記的配體中重懸（起始于100/500/26,4μ g/ml的1:10稀釋系列）。4°C下，將所述細 胞孵育2小時，每45分鐘用吸液管混合。將所述細胞用150 μ 1含有0. 2% BSA和0. 09% NaN^PBS清洗三次，并在4°C下用3 μ g/ml的鏈霉親和素 PE (BD Biosciences)染色45分 鐘。將細胞清洗、在200 μ 1含有0. 2% BSA和0. 09%似隊的PBS中重懸并轉移至U型96 孔Costar板（Corning, Schiphol-Rijk,荷蘭）用于使用FACS Canto II流式細胞計數(shù)儀 (BD Biosciences，海德爾堡，德國）的流式細胞計數(shù)。為檢測IC50值（導致信號減少50% 的抑制劑的濃度），使用軟件Prism(GraphPad)的"log(抑制劑）vs.應答"模式通過非線 性回歸曲線擬合對實驗數(shù)據(jù)進行擬合。根據(jù)來自之前描述的方法的以下等式計算表觀結合 親和力（Kd) (Kipriyanov 等，l"7b ;Schodin & Kranz，I"3):
[0733] Kd(I) = IC50/(l+[bi0-MDC]/Kd (MDC)),
[0734] 其中，I是未標記的抑制劑（抗體或配體），[bio-MDC]是固定濃度的生物素化的 MDC，Kd (MDC)是 MDC，0· ISnM 的結合親和力（Imai 等，I"8)。
[0735] 在圖24和表20中顯示的競爭結合實驗結果證明高親和力配體MDC的CCR4結合 可以由IgG形式的9E10J以劑量依賴形式有效抑制。轉染CCR4的DT40細胞比CCRF-CEM 細胞表達更高密度的CCR4, CCRF-CEM細胞表面上具有15倍少的CCR4受體。
[0736] 應當注意到，未標記的MDC能夠完全抑制生物素化的MDC與CCRF-CEM細胞的結 合，而抗體9E10J不能（圖24)。這個觀察表明MDC可能與CCRF-CEM細胞上的另一種受 體結合。更可能地，這是一種非典型的清除（誘捕）GPCR受體D6,其能夠以高親和力結合 MDC (Graham, 2009 ;Locati等，2005)。這也可以解釋更高的表觀IC50。
[0737] 使用生物素化的TARC進行相似的結合抑制實驗。如所期望的，TARC、抗體9E10J 和MDC均與標記的TARC有效競爭（圖25)。為避免標記配體的非特異細胞結合，一半的實 驗在存在1 %的BSA時進行，所述BSA作為封閉劑。BSA的存在或不存在似乎沒有明顯的影 響（圖25b和d中存在BSA，圖25a和c中不存在BSA)。
[0738] 實施例10 :去巖藻糖化的9E10 T的產牛
[0739] 已經報導，可以通過操作寡聚糖對人IgGl亞類的狀態(tài)提高ADCC(Niwa R 等，CanRes，64卷，2004)。已經證明修改巖藻糖的量對提高ADCC具有有益效果。因此，在 存在Kifunensine時生產抗體9E10J，所述Kifunensine是一種I型α -甘露糖苷酶的選擇 性抑制劑，引起在細胞培養(yǎng)生產中IgG巖藻糖化的停止。對于質量控制，首先檢測去巖藻糖 化的IgG形式的9E10J對DT40細胞的結合特異性，并與未修飾的9E10J和KM3060var進行 比較，所述DT40細胞穩(wěn)定轉染有CCR4。
[0740] 在存在Kifunensine (100ng/ml ;Sigma)時生產IgG。在收獲細胞培養(yǎng)基之后，首 先基于親和力純化使用蛋白A柱（HiTrap，5ml，蛋白A ;GE)分離IgG。使用檸檬酸鹽緩沖 液（PH3)洗提IgG并轉移至IM Tris緩沖液（pH 9)中。在第二次純化之前，濃縮IgG樣品 并裝填用于尺寸排阻色譜法（HiLoad S印hadex 200, GE ;運行緩沖液PBS pH 7. 4)。收集單 體部分并第二次濃縮IgG。對于結合實驗，兩倍梯度稀釋IgG,起始于20 μ g/ml的濃度直到 0. 15625 μ g/ml。在穩(wěn)定轉染有人CCR4的DT40細胞（I. 5*106/ml)上孵育IgG。未轉染的 DT40細胞用作陰性對照。通過抗人FITC(山羊）結合的抗體檢測結合的IgG。
[0741] 圖19中呈現(xiàn)的結果證明去巖藻糖化模式的修飾對9E10J的CCR4結合能力沒有任 何影響。
[0742] 實施例11 :去巖藻糖化的IgGl奪異體的抗體依賴的細朐毒件（ADCC)的誘導
[0743] 將根據(jù)實施例10中描述的內容制備的去巖藻糖化的9E10J與未修飾的9E10J和 未修飾的KM3060var進行比較。使用組成型表達CCR4的CCRF-CEM細胞檢測IgG。如在實 施例6中的描述分析ADCC誘導。
[0744] 在圖20和表18中顯示的結果證明，與未修飾的9E10J相比，候選的9E10J的去巖 藻糖化變異體具有提高的通過PBMC殺死CCR4陽性CCRF-CEM細胞的性質并具有更高的細 胞溶解活性（低4-5倍的EC50)。
[0745] 實施例12 :牛長抑制和細朐凋亡的誘導
[0746] 使用膜聯(lián)蛋白V染色和FACS分析分析抗體誘導Ramos細胞（源自Burkitt淋巴 瘤的B類淋巴母細胞系）的能力。沒有觀察到細胞凋亡的明顯誘導。使用9E、9E10J和 KM3060var (均以IgG形式）對CCRF-CEM細胞和Ramos細胞（源自Burkitt淋巴瘤的B類 淋巴母細胞系）進行生長抑制檢測。沒有觀察到生長抑制。
[0747] 實施例13 :趨化作用的抑制
[0748] i)通過一個室中用抗體9E或9E10J接觸能夠趨化作用的CCR4+細胞，將CCR4配 體（MDC或TARC)放置在另一個室中分析抗體9E和9E10J對趨化作用的抑制，所述另一個室 與第一個室通過具有合適孔尺寸的膜或過濾器分離。通過比較存在抗體時的趨化作用和不 存在抗體時的趨化作用測量抗體對細胞向配體遷移的作用（趨化作用）。發(fā)現(xiàn)9E和9E10J 均能夠抑制CCR4陽性細胞向MDC和TARC的趨化作用。
[0749] ii)評估了 9E10J減少配體誘導的天然CCR4+CCRF-CEM細胞的遷移的能力，并與 9E、KM3060var和IGl抗體進行比較。所述的抗體以IgGl的形式檢測。
[0750] 如在實施例2中描述的培養(yǎng)的CCRF-CEM靶細胞通過離心沉淀并在沒有FCS的 RPMI-1640培養(yǎng)基中重懸兩次。在第三次離心步驟中，細胞在補充有1% FCS的RPMI-1640 培養(yǎng)基中重懸并調整到I. 6X IO7細胞/ml的終密度。平行地，向Multiscreen-MIC 96孔 板（8μπι 孔，Millipore, Billerica，MA,美國，MAMIC5S10)的每一個較低室中加入 150μ1 的補充有1%FCS、含有3. 5ηΜ的TARC的RPMI。向Multiscreen-MIC 96孔板的上面室中 加入50μ1的含有IgG的細胞（從167ηΜ系列稀釋至0. 3ηΜ)并在37°C下孵育3小時。 移走過濾器并在重懸浮之后將100 μ 1的細胞（從較低的室）轉移至96孔C0ASTAR板中 (Greiner Bi〇-〇ne，F(xiàn)rikenhausen,德國）；向樣品中另加入 ΙΟΟμΙ 的 PBS(補充有 0.2% BSA和0. 09% NaN3)。通過計算獲得的細胞計算遷移。
[0751] 在圖29中呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)證明了 9E和9E10J對TARC誘導的CCRF-CEM細胞的趨化作 用的抑制。對于抗體KM3060var和IGl或對照IgG (抗GFP)沒有觀察到對趨化作用的明顯 抑制。
[0752] 實施例14 :對于CCR4的結合特異件和親和力
[0753] 在滴定實驗中，檢測scFv或IgG形式的9E1D和9E10J對DT40+細胞的特異結合 性。
[0754] 如實施例2中所描述的內容培養(yǎng)DT40和CCRF-CEM細胞。從培養(yǎng)瓶中收 獲DT40CCR4+細胞和DT40(CCR4_)細胞，用PBS清洗兩次（400Xg、5分鐘、4°C )，并用 含有0. 2 % BSA和0. 09 %似隊的PBS重懸。將細胞等分成至V型96孔板（Greiner Bi〇-〇ne，F(xiàn)rickenhausen,德國）中，每孔 IXlO5 個細胞。離心細胞（400Xg、5 分鐘、4°C) 并在50 μ 1的含有ScFv (5 μ g/ml)、0.2 % BSA和0.09 % NaN3、內部產生的具有人Fe的抗 cMyc抗體（25 μ g/ml)的PBS中重懸。孵育一個小時后（4°C )，將所述細胞用150 μ 1含有 0. 2% BSA和0. 09% NaN3的PBS清洗三次并在4°C下用2. 5 μ g/ml的RPE連接的山羊抗人 IgG(AbDSerotec，DUsseldorf，德國）染色45分鐘。將細胞清洗、在 200μl含有0·2%BSA 和0· 09%似隊的PBS中重懸并轉移至U型96孔Costar板（Corning, Schiphol-Rijk,荷 蘭）用于使用Easy Cyte裝置（Guava Technologies, Hayward, CA,美國）的流式細胞計數(shù)。
[0755] 可選地，將9E1D和9E10J轉化成全長人IgGl形式并檢測其細胞結合。從培養(yǎng) 瓶中收獲DT40CCR4+細胞和DT40(CCR4_)細胞，用PBS清洗兩次（400Xg、5分鐘、4°C)， 并用含有0.2 % BSA和0.09 % NaNj^PBS重懸。將細胞等分成至V型96孔板（Greiner Bi〇-〇ne，F(xiàn)rickenhausen,德國）中，每孔 IXlO5 個細胞。離心細胞（400Xg、5 分鐘、4°C) 并以起始于10 μ g/ml (50 μ 1/孔）的1:5的IgG稀釋系列重懸。4°C下，孵育一個小時后，將 所述細胞用150μ 1含有0. 2%BSA和0. 09%NaN^PBS清洗三次，并在4°C下用2. 5μ g/ml 的 RPE 連接的山羊抗人 IgG(AbDSerotec，Diisseldorf,德國）或 2.5yg/ml 抗人 IgG Fe(山 羊多克隆aff.pur)FITC(Sigma Aldrich)染色45分鐘。將細胞清洗、在200μ 1含有0. 2% BSA 和 0· 09% NaN3的 PBS 中重懸并轉移至 U 型 96 孔 Costar 板（Corning, Schiphol-Ri jk, 荷蘭）用于使用 Easy Cyte 裝置（Guava Technologies, Hayward, CA,美國）或FACS Canto Π 流式細胞儀（BD Biosciences，海德爾堡，德國）的流式細胞計數(shù)。
[0756] 使用軟件Prism(GraphPad,圣地亞哥，CA)的"一個位點-特異結合"模式從非線 性擬合的實驗數(shù)據(jù)曲線中推算表觀親和力值（K D)。由于已知KM3060var與CCR4結合，它被 用作陽性對照。結果顯示在圖21、22和23以及表19中。
[0757] 實施例15 :血小板的凝聚測量
[0758] 已知CCR4在血小板上表達，且它的配體MDC和TARC誘導血小板凝聚。這可能 有潛在的問題，因為IgG分子具有兩個配體結合位點，因此有這樣的可能：如果IgG的 兩條臂能夠結合不同血小板上的CCR4,能夠識別CCR4的IgG可能能夠交叉連接血小 板。這可能導致體內點凝結。因此，檢測9E10J-IgG對血小板凝聚的作用。9E10J-IgG 與分離的血小板單獨孵育或與配體MDC或TARC結合孵育。ADP是一種充分描述的凝聚 誘導物（Varon 和 Spectre〃Antiplatelet agents^Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 267-72, 2009)，在每一次測量中作為陰性對照。
[0759] 將一共30ml的新鮮的捐獻血液收集到含有檸檬酸鈉的管中。在室溫（RT)下185g 離心15分鐘獲得富含血小板的血漿。含有血小板的血漿轉移至新的管子中。為定義基準， 通過在RT下將Iml富含血小板的血漿在1200g下5分鐘離心制備無血小板的血漿，將上清 液轉移至新的管子中并以下述與富含血小板的樣品相同的方式處理。在37°C下通過攪拌使 用Packs-4血小板凝集儀（Helena Biosciences,美國）測量凝聚。在FACS緩沖液（PBS, pH 7.4,0.2% BSA，0.09 % NaN3)中用濃度為 10 μ g/ml 的血小板孵育 IgG (9E10J 和抗 GFP 作為陰性對照）。ADP作為凝聚的陽性對照，其使用的終濃度是3μΜ。配體（MDC和TARC) 被檢測是〇. 25 μ g/ml。
[0760] 將用ADP獲得的信號設為100%，基線0由無血小板的血漿定義，在所有的實驗設 定中都平行地測量無血小板的血漿。
[0761] 為檢查檢測的IgG與分離的血小板結合，平行地進行血小板的FACS染色。將血小 板轉移至V型96孔板（Greiner Bio-One, Frikenhausen,德國）中并通過加入100 μ 1的 FACS 緩沖液（IXPBS，pH 7. 4,補充有 0.02 % BSA 和 0.09 % NaN3)清洗一次。然后在 4°C 下在存在gElOJ-IgGaOyg/ml)時將血小板孵育1小時，然后在100μ 1的FACS緩沖液 (lXPBS，pH 7. 4,補充有(λ 02% BSA和(λ 09% NaN3)中清洗兩次。4°C下，在IgG染色的細 胞上孵育1小時后，使用抗人PE (1:400稀釋）檢測結合的IgG。在FACS測量中分析染色的 血小板。
[0762] 觀察到9E10J_IgG對血小板的結合（數(shù)據(jù)沒有顯示）。凝聚測量的結果在表24中 概括。推斷：盡管9E10J-IgG與血小板結合，它對血小板凝聚沒有作用；它本身不誘導凝聚， 它也不抑制配體誘導的血小板凝聚。
[0763] 實施例16 :IgG形式的9E10T與外周血淋巴細朐（PBL)的結合
[0764] 由于已知CCR4在淋巴細胞（如Th2細胞和Treg細胞）上表達，繪制9E10J和 KM3060var對從血沉棕黃色塊中分離的PBL的滴定曲線。
[0765] 按照EZ-連接馬來酰亞胺-PEO固相生物素化試劑盒（Pierce, Thermo Fisher, P. 0. Box 117Rockford，IL. 61105美國）的手冊對抗體9E10J和KM3060var進行生物素化。如 根據(jù)實施例2給出的方案通過評估生物素化的抗體和非生物素化的抗體與CCRF-CEM細胞 的結合所判定的，所述生物素化不明顯影響抗體識別它們目標的能力（數(shù)據(jù)沒有顯示）。
[0766] 通過Ficoll-(Hypaque)梯度離心從新鮮的捐獻血液中制備人PBL，在 RPMI-1640/10% FCS 中清洗。向 Leucosep 管（50ml ;Greiner Bio-One, Frikenhausen,德 國）加入15ml的淋巴細胞分離劑（Fresenius Kabi Norge,奧斯陸，挪威）并在室溫下 IOOOg離心30秒。
[0767] 將所述血沉棕黃色塊用280ml的lXDulbeccos PBS(pH 7. 4)稀釋并將35ml 稀釋的血液轉移至每一個 Leucosep 管（50ml ;Greiner ;Bi〇-〇ne, Frikenhausen)。基于 在室溫下IOOOg離心10分鐘（無中斷，無加速），將所述靶細胞轉移至50ml管中（50ml Falcon, Greiner Bio-One, Frikenhausen,德國），處于 50ml 的 RPMI 培養(yǎng)基中。在室溫下， 以200g、15分鐘將PBL制成球形，在50ml的RPMI培養(yǎng)基中重懸并在計數(shù)細胞前通過70 μ m 細胞過濾網過濾。在補充有0.2 % BSA和0.09 % NaNj^lX PBS (pH7. 4)中將PBL稀釋至 終細胞數(shù)量為I. 5 X IO6個細胞/ml。
[0768] 在補充有0. 2% BSA和0. 09%似隊的IXPBS Dulbeccos (pH7. 4)中將生物素化的 IgG形式的9E10J和KM3060var從20μg/ml稀釋至0.3ng/ml，并將一共1.5X105個PBL孵 育2小時。在用150 μ 1含有0.2% BSA和0.09% NaNj^PBS (pH7. 4)中清洗細胞兩次后， 移除未結合的IgG。在孵育之后用PE標記的鏈霉親和素（BD-Biosciences Norge;在補充 有0· 2% BSA和0· 09% NaN3的PBS(pH 7. 4)中以1:100稀釋）檢測結合的IgG。
[0769] 用抗⑶3-APC連接的抗體和抗⑶8_PE_Cy5連接的抗體（BD-Biosciences Norge ; 均在補充有〇· 2% BSA和0· 09% NaN3的PBS(pH 7· 4)中以1:100稀釋）對細胞進行雙重 染色。為補償熒光染料的信號重疊，將抗⑶4-PE連接的IgG(BD-Biosciences挪威）添加 至分離的孔中。在FACS-cantoII (BD-Biosciences挪威）上分析樣品。
[0770] 為評估PBL與IgG形式的9E10J和KM3060var的結合，首先從全部情況中挑選出 淋巴細胞。然后，從淋巴細胞群中分離出⑶3陽性細胞。然后將⑶3陽性細胞分成⑶8陽 性（=⑶4陰性）細胞和⑶8陰性（=⑶4陽性）細胞，其包括Treg片段。PE頻道中的信 號強度表示IgG形式的9E10J和KM3060var對⑶8陰性（=⑶4陽性）細胞的結合。在與 陰性對照（=PE連接的鏈霉親和素）比較后，結合以％ (陽性事件）表示。
[0771] 如在圖30中所表示的，9E10J結合挑選的⑶4陽性細胞（通過⑶8陰性染色測 定）。在濃度低至32ng/ml (相當于?210pM的IgG)時仍然可檢測到結合。在這個濃度，沒 有檢測到競爭劑KM3060var的結合信號。從這個角度講，9E10J可能對無 Treg細胞的免疫 療法有作用。
[0772]表 I

【權利要求】
1. 一種抗體在制備用于治療由CCR4介導的疾病或特征是CCR4+細胞的異常增殖的疾 病的藥物中的應用，其中，所述疾病選自癌癥、炎癥疾病、免疫疾病或傳染??；其中，所述抗 體是一種分離的人抗體，所述抗體結合人CC趨化因子受體4 (CCR4)的胞外域中的表位并能 夠抑制巨噬細胞來源的趨化因子（MDC)和/或胸腺和激活調節(jié)的趨化因子（TARC)與CCR4 的結合，其中，所述抗體 (a) 包括至少一個包含三個⑶R的重鏈可變區(qū)和至少一個包含三個⑶R的輕鏈可變區(qū)， 其中所述重鏈可變區(qū)包括： (i) 氨基酸序列為SEQ ID N0:7的可變重鏈（VH)⑶R1 ; (ii) 氨基酸序列為SEQ ID N0:8的VH CDR2 ;和 (iii) 氨基酸序列為SEQ ID N0:9的VH CDR3 ;和 其中所述輕鏈可變區(qū)包括： (iv) 氨基酸序列為SEQ ID N0:10的可變輕鏈（VL)CDRl ; (v) 氨基酸序列為SEQ ID N0:11的VL CDR2 ;和 (vi) 氨基酸序列為SEQ ID NO: 12的VL CDR3 ; 或 (b) 是可以與抗體（a)競爭結合人CCR4的抗體，并且包括至少一個包含三個CDR的重 鏈可變區(qū)和至少一個包含三個CDR的輕鏈可變區(qū)，其中所述重鏈可變區(qū)包括： (i) 氨基酸序列為SEQ ID N0:101的可變重鏈（VH)⑶R1 ; (ii) 氨基酸序列為SEQ ID N0:8的VH CDR2 ;和 (iii) 氨基酸序列為SEQ ID N0:9的VH CDR3 ; 以及其中所述輕鏈可變區(qū)包括： (iv) 氨基酸序列為SEQ ID N0:10的可變輕鏈（VL)CDRl ; (v) 氨基酸序列為SEQ ID N0:11的VL CDR2 ;和 (vi) 氨基酸序列為SEQ ID NO: 12的VL CDR3 ; 或 (c) 是可以與抗體（a)競爭結合人CCR4的抗體，并且包括至少一個包含三個CDR的重 鏈可變區(qū)和至少一個包含三個CDR的輕鏈可變區(qū)，其中所述重鏈可變區(qū)包括： (i) 氨基酸序列為SEQ ID N0:1的可變重鏈（VH)⑶R1 ; (ii) 氨基酸序列為SEQ ID N0:2的VH CDR2 ;和 (iii) 氨基酸序列為SEQ ID N0:3的VH CDR3 ;以及 其中所述輕鏈可變區(qū)包括： (iv) 氨基酸序列為SEQ ID N0:4的可變輕鏈（VL)CDRl ; (v) 氨基酸序列為SEQ ID N0:5的VL CDR2 ;和 (vi) 氨基酸序列為SEQ ID N0:6的VL CDR3。
2. 根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于，所述疾病選自過敏性疾病、炎性腸疾病、 陰道炎、牛皮癬、炎癥性皮膚病、血管炎、脊柱關節(jié)病、硬皮病、哮喘、呼吸過敏性疾病、自身 免疫疾病、移植排斥、病毒傳染病。
3. 根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于，所述疾病選自動脈硬化、肌炎、T細胞介導 的神經變性疾病、多發(fā)性硬化、腦炎、腦膜炎、肝炎、腎炎、膿毒病、結節(jié)病、過敏性結膜炎、耳 炎、卡斯托曼病、竇炎、LPS誘導的內毒素休克、白塞病和痛風。
4. 根據(jù)權利要求2所述的應用，其特征在于，所述過敏性疾病選自全身過敏、超敏反 應、藥物過敏癥、過敏性支氣管肺曲霉?。ˋBPA)、蟲刺過敏癥和食物過敏癥。
5. 根據(jù)權利要求2所述的應用，其特征在于，所述炎性腸疾病選自克羅恩氏病、潰瘍性 結腸炎、回腸炎和腸炎。
6. 根據(jù)權利要求2所述的應用，其特征在于，所述炎癥性皮膚病選自皮炎、濕疹、遺傳 過敏性皮炎、過敏性接觸皮炎、風疹和瘙癢癥。
7. 根據(jù)權利要求2所述的應用，其特征在于，所述哮喘或呼吸過敏性疾病選自過敏性 哮喘、過敏性鼻炎、慢性阻塞性肺病和超敏肺疾病。
8. 根據(jù)權利要求2所述的應用，其特征在于，所述自身免疫疾病選自關節(jié)炎、多發(fā)性硬 化、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、I型糖尿病、腎小球性腎炎。
9. 根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于，所述癌癥選自乳癌、結腸直腸癌、食道癌、 胃癌、肝細胞癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、成人T細胞白血病/淋巴瘤（ATL)、外周T 細胞淋巴瘤、非特異的彌漫性大B細胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、B細胞慢性淋巴細胞白血病、 蕈狀真菌病和塞扎里綜合征。
10. 根據(jù)權利要求2所述的應用，其特征在于，所述病毒傳染病選自愛潑斯坦-巴爾病 毒（EBV)感染和HIV感染。
11. 根據(jù)權利要求1-10任意一項所述的應用，其特征在于，所述抗體具有VH域和/或 乂1域，其中所述711域的序列是5￡〇10勵:69，所述￥1域的序列是5￡〇10勵:70 ;或者，其 中所述VH域的序列是SEQ ID NO: 71或105,所述VL域的序列是SEQ ID NO: 72。
【文檔編號】A61P35/00GK104436191SQ201410645401
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2010年6月9日 優(yōu)先權日:2009年6月9日
【發(fā)明者】拉維尼婭·黛安娜·奇科爾塔什·貢納松, 迪德里克·派于斯 申請人:奧菲技術科學研究院