專利名稱：表達(dá)抗炎細(xì)胞因子il-10的骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種骨髓來源的、可表達(dá)抗炎細(xì)胞因子IL-10的新型神經(jīng)干細(xì)胞系的 建立方法，及此種將細(xì)胞替代與基因治療結(jié)合為一體的新型神經(jīng)干細(xì)胞對多發(fā)性硬化的治 療作用。
背景技術(shù)：
神經(jīng)干細(xì)胞(Neural stem cell, NSCs)是指具有自我更新能力、并能分化為神經(jīng) 元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(少突膠質(zhì)、星形膠質(zhì)細(xì)胞)的一組細(xì)胞群。近年來許多學(xué)者用神經(jīng)干 細(xì)胞移植治療多發(fā)性硬化(multiple sclerosi^MS)、帕金森氏病、阿爾茨海默病等神經(jīng)系 統(tǒng)疾病及神經(jīng)損傷，取得了顯著治療效果。但該神經(jīng)干細(xì)胞來源于胚胎或成體動(dòng)物的側(cè)腦 室周圍和海馬等區(qū)域，取材困難、損傷較大，胚胎來源的神經(jīng)干細(xì)胞無法回避免疫排斥和道 德倫理等問題，降低了臨床治療的可行性[1_3]。因此，尋找取材方便、來源豐富、無免疫排斥 的神經(jīng)干細(xì)胞的新來源具有重要的意義。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有較強(qiáng)的自我更新和多分化 潛能，在一定條件下可分化為神經(jīng)干細(xì)胞[4_5]，且取材容易，可直接抽取病人骨髓、經(jīng)體外分 選而獲得，無免疫原性，來源豐富穩(wěn)定，因而日漸受到人們的重視，可成為神經(jīng)干細(xì)胞臨床 應(yīng)用的一個(gè)理想的新來源。多發(fā)性硬化(multiple sclerosisJS)是一種常見的由自身免疫反應(yīng)介導(dǎo)的中樞 神經(jīng)系統(tǒng)炎性脫髓鞘疾病。病灶多發(fā)于腦和脊髓的白質(zhì)，呈多灶性炎性細(xì)胞侵潤、脫髓鞘及 神經(jīng)元損傷，可導(dǎo)致感覺、運(yùn)動(dòng)、意識和神經(jīng)認(rèn)知等多方面的功能障礙。該病多發(fā)于20-40 歲的青壯年人，復(fù)發(fā)率和致殘率高，是青壯年人非外傷性神經(jīng)殘疾最常見的原因，迄今為止
還無法治愈[6_7]。神經(jīng)干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)及成功分離，為MS患者的治療帶來了新的希望。本發(fā)明以自體 骨髓為來源的神經(jīng)干細(xì)胞移植入體內(nèi)后，能與腦源神經(jīng)干細(xì)胞一樣遷移、整合入CNS病變 部位，分化為神經(jīng)元及少突膠質(zhì)細(xì)胞，成為髓鞘修復(fù)和神經(jīng)元再生的潛在來源。但由于其抗 炎作用較弱，不能解除中樞持續(xù)性炎癥對髓鞘和神經(jīng)元的損傷，因此治療效果不十分理想。 為增強(qiáng)其療效，我們選擇了白細(xì)胞介素10 (IL-10)，將其基因轉(zhuǎn)入骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞(Bone Marrow-NSCs，BM-NSCs)。IL-10是一種抗炎細(xì)胞因子，主要由Th2類細(xì)胞產(chǎn)生，可抑制T細(xì) 胞增殖分化，抑制單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞的生物學(xué)活性，抑制Thl細(xì)胞產(chǎn)生致炎細(xì) 胞因子IL-2、IFN-γ等[3’8]。表達(dá)IL-10的新型BM-NSCs靜脈移植后不僅可在外周及中樞 發(fā)揮抗炎作用，保護(hù)中樞病變區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞免受或減輕炎癥反應(yīng)的損害，維持神經(jīng)元的存 活與髓鞘的完整性，而且還能促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞分化為髓鞘修復(fù)與再生所必需的少突膠質(zhì)細(xì) 胞，抑制形成MS病灶斑塊的星形膠質(zhì)細(xì)胞增生，發(fā)揮神經(jīng)修復(fù)/保護(hù)和免疫調(diào)節(jié)的雙重作 用，使療效顯著增強(qiáng)。綜上所述，本發(fā)明以自體骨髓為來源的神經(jīng)干細(xì)胞不僅是一種理想的、無限制的 神經(jīng)干細(xì)胞的新來源，還是基因治療的良好載體，可將細(xì)胞替代和基因治療有機(jī)地結(jié)合為 一體，為多發(fā)性硬化及其它神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療提供了一種全新的途徑，具有十分廣闊的開發(fā)和應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種來源于骨髓、可表達(dá)抗炎細(xì)胞因子IL-10的新型神經(jīng) 干細(xì)胞的制備方法，用于治療MS及其它多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用 如下技術(shù)方案—種表達(dá)抗炎細(xì)胞因子IL-10的骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞的制備方法，包括下述步驟一、小鼠骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞的生成與鑒定1、提取成年小鼠全骨髓細(xì)胞，用微珠標(biāo)記抗體及磁性細(xì)胞分選儀 (MiltenyiBiotec)篩選出間充質(zhì)干細(xì)胞[lineage_/CD117 (c_kit)+]，體外用 bFGF 和 EGF誘導(dǎo)分化為神經(jīng)干細(xì)胞，經(jīng)免疫組化染色、熒光顯微鏡檢測，證實(shí)與腦源神經(jīng)干細(xì)胞 (SVZ-NSCs)具有相同的細(xì)胞表型，都表達(dá)Nestin與S0X2，可鑒定為未分化神經(jīng)干細(xì)胞。見 附圖1。2、體外自我更新與分化能力的檢測繪制生長曲線，檢測其自我更新能力；以維 甲酸(RA)和BDNF為誘導(dǎo)劑，體外誘導(dǎo)分化2周，免疫組化檢測NF_M、NG2、GFAP的表達(dá)。結(jié) 果證實(shí)BM-NSCs與SVZ-NSCs具有相同的自我更新與分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的能力。 見附圖2。二、構(gòu)建IL-10和EGFP共表達(dá)的質(zhì)粒、轉(zhuǎn)染骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞及檢測IL-10的表 達(dá)神經(jīng)元(NF-M+)、少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞(NG2+)、星形膠質(zhì)細(xì)胞(GFAP+)，少數(shù)細(xì)胞 仍維持于未分化狀態(tài)(Nestin+)。紅色神經(jīng)細(xì)胞特異性標(biāo)志蛋白陽性染色。放大倍數(shù) 100X?？寺⌒∈驣L-10基因、構(gòu)建共表達(dá)IL-10和EGFP的逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒，由CMV啟動(dòng) 子驅(qū)動(dòng)；以293T細(xì)胞包裝病毒；用病毒上清轉(zhuǎn)染BM-NSCs ；以免疫組化法和ELISA法檢測， 證實(shí)被轉(zhuǎn)染的BM-NSCs可有效表達(dá)IL-10。見圖3。三、IL-10基因修飾骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞移植治療多發(fā)性硬化動(dòng)物模型UMS模型制作與骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞移植治療雌性C57BL/6小鼠(8_12周)皮下 注射髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白乳化液(M0G35-55)，200ug/只，誘導(dǎo)MS動(dòng)物模型。22天后尾 靜脈注射IL-10基因修飾BM-NSCs (IL 10-BM-NSCs)和對照組BM-NSCs各1. 5 X IO6個(gè)細(xì)胞/ 只。結(jié)果顯示ILlO-BM-NSCs治療組臨床癥狀明顯較對照組減輕，證實(shí)IL-10表達(dá)明顯增強(qiáng) 了 BM-NSCs對MS的治療作用。見圖4。2、抗炎作用檢測骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞靜脈移植2周后取模型小鼠脾細(xì)胞，用ELISA 法檢測各種細(xì)胞因子的分泌。結(jié)果表明ILlO-BM-NSCs明顯降低了小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌炎 性細(xì)胞因子IFN-r和IL-17，而增加了抗炎細(xì)胞因子IL_4、IL_5、IL-13的分泌，從而使抗炎 作用顯著增強(qiáng)。見圖5。3、體內(nèi)分化、神經(jīng)修復(fù)與髓鞘再生作用檢測靜脈移植6周后，取腦與脊髓制成冰 凍切片，免疫組化檢測NeuN、GalC、GFAP的表達(dá)，以GFP陽性作為外源性移植細(xì)胞的追蹤標(biāo) 志；電鏡觀察髓鞘修復(fù)與再生。結(jié)果證實(shí)IL-10的表達(dá)促使BM-NSCs更多地分化為能修復(fù) 髓鞘的GalC+少突膠質(zhì)細(xì)胞，抑制其分化為形成MS病灶斑塊的GFAP+星型膠質(zhì)細(xì)胞；電鏡檢查結(jié)果證實(shí)IL-10的表達(dá)促進(jìn)了髓鞘的修復(fù)與再生，使有髓鞘軸突所占百分率明顯增加。 見圖6。本發(fā)明提供一種制備神經(jīng)干細(xì)胞的簡捷而有效的方法，制備的神經(jīng)干細(xì)胞能為MS 患者帶來希望，并能治療其它多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病。


圖1為骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞(BM-NSCs)和腦源神經(jīng)干細(xì)胞(SVZ_NSCs)的生成與鑒 定示圖。
圖2和圖3為BM-NSCs與SVZ-NSCs自我更新與分化能力的比較示圖。 圖4至圖7為構(gòu)建IL-10與EGFP共表達(dá)質(zhì)粒、轉(zhuǎn)染BM-NSCs及IL-10表達(dá)的檢測示圖。
圖8為IL-10的表達(dá)增強(qiáng)了骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞對MS的治療作用示圖。 圖9為IL-10的表達(dá)增強(qiáng)了骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞的抗炎作用示圖。 圖10至圖12為ILlO-BM-NSCs的體內(nèi)分化及促進(jìn)髓鞘修復(fù)與再生作用示圖。 圖1為骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞(BM-NSCs)和腦源神經(jīng)干細(xì)胞(SVZ-NSCs)的生成與鑒定 示圖。從成年小鼠的腓骨中提取全骨髓細(xì)胞，用微珠標(biāo)記抗體及磁性細(xì)胞分選儀篩選出 lineage7CD117(c-kit)+ 細(xì)胞，以 1. OX 105/ml 密度置于 DMEM/F12+bFGF 20ug/ml+EGF 20ug/ml+2%B27中培養(yǎng)，每隔3天換液一次。3_5周后誘導(dǎo)形成神經(jīng)干細(xì)胞球(A)；分離 上述小鼠腦組織SVZ區(qū)細(xì)胞，以上述培養(yǎng)基培養(yǎng)，1-2周后形成神經(jīng)干細(xì)胞球(B)。免疫組 化染色、熒光顯微鏡檢測結(jié)果顯示BM-NSCs與SVZ-NSCs細(xì)胞球及單個(gè)細(xì)胞都為Nestin (綠 色)和S0X2(紅色)陽性，可鑒定為未分化NSCs，兩者的細(xì)胞表型相同。藍(lán)色細(xì)胞核DAPI 染色。放大倍數(shù)神經(jīng)球10X，單細(xì)胞85X。圖2為BM-NSCs與SVZ-NSCs自我更新與分化能力的比較示圖。㈧生長曲線測 定取第三代BM-與SVZ-NSCs神經(jīng)球，打散成單細(xì)胞，以相同細(xì)胞密度(1.0X105/ml)置于 DMEM/F12+bFGF 20ug/ml+EGF 20ug/ml+2% B27 中培養(yǎng)。第 5，9，13，16 天分別取出，分散為 單細(xì)胞，計(jì)數(shù)，繪制生長曲線，結(jié)果顯示BM-與SVZ-NSCs增值速度無顯著差別；(B)體外分 化實(shí)驗(yàn)將上述兩種神經(jīng)球打散成單細(xì)胞，加入DMEM/F12+RA 15ug/ml+BDNF 20ug/ml中體 外分化，兩周后免疫組化檢測，顯示BM-NSCs與SVZ-NSCs都分化為神經(jīng)元(NF-M+)、少突膠 質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞(NG2+)、星形膠質(zhì)細(xì)胞(GFAP+)，少數(shù)細(xì)胞仍維持于未分化狀態(tài)(Nestin+)。 紅色神經(jīng)細(xì)胞特異性標(biāo)志蛋白陽性染色。放大倍數(shù)100X。圖3為構(gòu)建IL-10與EGFP共表達(dá)質(zhì)粒、轉(zhuǎn)染BM-NSCs及IL-10表達(dá)的檢測示圖。 (A)共表達(dá)IL-10與EGFP (Lv. IL-10)及只表達(dá)GFP (Lv. EGFP)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體結(jié)構(gòu)圖， 由CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)；⑶免疫組化法檢測IL-10的轉(zhuǎn)染與表達(dá)用293T細(xì)胞包裝病毒、收集 72小時(shí)內(nèi)病毒上清液；用濃縮的病毒上清轉(zhuǎn)染BM-NSCs，3天后以免疫組化染色、熒光顯微 鏡檢測，顯示兩組BM-NSCs都顯著表達(dá)GFP (綠色)，說明兩組BM-NSCs都被病毒質(zhì)粒有效 轉(zhuǎn)染，但I(xiàn)L-10 (紅色)只在ILlO-BM-NSCs中顯著表達(dá)，在對照組BM-NSCs幾乎不表達(dá)；(C) ELISA法檢測IL-10的表達(dá)轉(zhuǎn)染3天后取兩組BM-NSCs培養(yǎng)液上清，用ELISA法檢測兩組 上清液中IL-10含量。結(jié)果顯示在IL10-BM-NSCs上清中IL-10濃度高達(dá)710ng/ml，而在對 照組未能檢測到。以上結(jié)果說明IL-10基因修飾BM-NSCs能有效表達(dá)IL-10。
圖4為IL-10的表達(dá)增強(qiáng)了骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞對MS的治療作用示圖。雌性 C57BL/6小鼠(8-12周)皮下注射髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白乳化液(M0G35-55) 200ug/ 只誘導(dǎo)MS動(dòng)物模型，22天后尾靜脈注射(i. v.) IL10-BM-NSCs和對照組GFP_BM_NSCs各 1.5X106/只。結(jié)果顯示，PBS組呈現(xiàn)典型的疾病進(jìn)程，兩種干細(xì)胞治療組的病情明顯輕于 PBS組，而IL10-BM-NSCs對疾病的抑制作用較BM-NSCs更快更強(qiáng)。圖5為IL-10的表達(dá)增強(qiáng)了骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞的抗炎作用示圖。BM-NSCs移植2 周后取小鼠脾細(xì)胞，以1. 5X 106/ml細(xì)胞濃度置于RPMI 1640+10% FBS+10 μ g/ml M0G35-55 中培養(yǎng)。3天后取培養(yǎng)液上清，以ELISA法檢測各種細(xì)胞因子的含量。結(jié)果顯示，IL-10的表 達(dá)明顯降低了小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌炎性細(xì)胞因子IFN-r和IL-17，而使抗炎細(xì)胞因子IL-4、 IL-5、IL-13的分泌明顯增加。< 0. 05，**p < 0. 01，PBS組與其它組的比較；#p < 0. 05， ##p < 0. 01，IL10-BM-NSCs 組與對照組 BM-NSCs 組的比較，η = 8。圖6為ILlO-BM-NSCs的體內(nèi)分化及促進(jìn)髓鞘修復(fù)與再生作用示圖。干細(xì)胞移植6 周后，取各組小鼠腦制成冰凍切片，免疫組化檢測BM-NSCs的體內(nèi)分化，以GFP陽性作為外 源性移植干細(xì)胞的追蹤標(biāo)志，結(jié)果顯示，IL-10的表達(dá)促使BM-NSCs更多地分化為GalC+少 突膠質(zhì)細(xì)胞，較少地分化為GFAP+星型膠質(zhì)細(xì)胞(A、B)。電鏡檢查結(jié)果顯示，IL-10的表達(dá) 促進(jìn)了髓鞘的修復(fù)與再生，使有髓鞘軸突所占百分率明顯增加(C、D)。
具體實(shí)施例方式表達(dá)抗炎細(xì)胞因子IL-10的骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞的制備方法，包括如下步驟一、小鼠骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞的生成與鑒定1)、骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞(BM-NSCs)的生成與培養(yǎng)取8_12周C57BL/6小鼠的腓 骨，提取全骨髓細(xì)胞，用德國美天旎公司(Miltenyi Biotec)的微珠標(biāo)記抗體及磁性細(xì)胞 分選儀(QuadroMACS S印arator)分兩步篩選出間充質(zhì)干細(xì)胞。首先用系別細(xì)胞去除試 劑盒(Lineage Cell Depletion Kit)去除成熟造血細(xì)胞，如T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核/巨噬 細(xì)胞、粒細(xì)胞和紅細(xì)胞以及定向祖細(xì)胞(⑶5+，⑶45+，CDllb+, Gr-I+, TERl 19+，7/4+)，保留系 別陰性細(xì)胞(lineage-)；再用抗 CDl 17 微(CDl 17 (c_kit)Microbeads)篩選出 lineage7 CD117(c-kit)+間充質(zhì)干細(xì)胞，以 1 XlO5Ail 密度置于 DMEM/F12+bFGF 20ug/ml+EGF 20ug/ ml+2% B27中培養(yǎng)，每隔3天換液一次，3_5周后誘導(dǎo)形成神經(jīng)干細(xì)胞球。結(jié)果見圖1A。2)、腦源神經(jīng)干細(xì)胞(SVZ-NSCs)的體外培養(yǎng)分離上述小鼠腦組織SVZ區(qū)，切成 Icm3小塊，胰蛋白酶消化20π η、70μ m細(xì)胞濾網(wǎng)過濾，將提取出的細(xì)胞以IX 105/ml密度加 入DMEM/F 12+bFGF 20ug/ml+EGF 20ug/ml+2% B27中體外培養(yǎng)，1-2周后形成神經(jīng)干細(xì)胞 球。結(jié)果見圖1B。3)、取第三代神經(jīng)干細(xì)胞球及打散的單個(gè)神經(jīng)干細(xì)胞，以抗小鼠Nestin和S0X2抗 體進(jìn)行免疫組化染色、熒光顯微鏡檢測。結(jié)果顯示BM-NSCs與SVZ-NSCs都為Nestin和S0X2 陽性，可鑒定為未分化NSCs。結(jié)果見圖1A，B。2、骨髓源與腦源神經(jīng)干細(xì)胞的自我更新與分化能力的比較，證實(shí)兩者具有相同的 自我更新與分化能力，都能分化為神經(jīng)元與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(圖2)。方法如下1)、生長曲線測定取第三代BM-與SVZ-NSCs神經(jīng)球，打散成單細(xì)胞，以相同細(xì)胞 密度(1.0X105/ml)置于 DMEM/F 12+bFGF 20ug/ml+20ug/ml+2% B27 中培養(yǎng)。第 5，9，13，16天分別取出，分散為單細(xì)胞，計(jì)數(shù)，繪制生長曲線。結(jié)果顯示BM-與SVZ-NSCs增值速度 無顯著差別。結(jié)果見圖2A。2)、體外分化實(shí)驗(yàn)將上述兩種神經(jīng)球打散成單細(xì)胞，加入DMEM/F12+維甲酸 (RA) 15ug/ml+腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF) 20ug/ml中體外誘導(dǎo)分化。兩周后免疫組化鑒 定，證實(shí)BM-NSCs與SVZ-NSCs都分化為神經(jīng)元(NF-M+)、少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞(NG2+)、星 形膠質(zhì)細(xì)胞(GFAP+)，少數(shù)細(xì)胞仍維持于未分化狀態(tài)(Nestin+)。結(jié)果見圖2B。二、IL-10與EGFP共表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建、轉(zhuǎn)染BM-NSCs及IL-10表達(dá)的檢測(圖3)。1、克隆小鼠IL-10基因，構(gòu)建可共表達(dá)IL-10與EGFP的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)質(zhì)粒，由 CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)；只表達(dá)EGFP的質(zhì)粒作為對照。見圖3A。2、以293T細(xì)胞包裝病毒；收集72小時(shí)內(nèi)病毒上清液；用濃縮的病毒上清轉(zhuǎn)染 BM-NSCs。3天后以免疫組化染色、熒光顯微鏡檢測，結(jié)果顯示兩組BM-NSCs都顯著表達(dá)GFP， 但I(xiàn)L-10只在IL10-BM-NSCs中顯著表達(dá)，在對照組BM-NSCs幾乎不表達(dá)(圖3B)；轉(zhuǎn)染3 天后取細(xì)胞培養(yǎng)上清，用ELISA法(IL-lOELISAKit，BD Bioscience)檢測兩組BM-NSCs的 IL-10表達(dá)量。結(jié)果顯示在IL10-BM-NSCs上清中IL-10濃度高達(dá)710ng/ml，而在對照組未 能檢測到IL-10 (圖3C)。三、IL-10基因修飾骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞移植治療MS動(dòng)物模型(圖4，5，6)UMS動(dòng)物模型的建立與骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞移植治療取雌性C57BL/6小鼠(8_12 周)，每組5只，皮下注射髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白乳化液(M0G35-55) 200ug/只，誘導(dǎo)MS動(dòng) 物模型。22天后尾靜脈注射(i. v.) IL10-BM-NSCs與對照組BM-NSCs各1. 5X IO6/只，觀察、 記錄臨床評分的改變。結(jié)果顯示，PBS組呈現(xiàn)典型的疾病進(jìn)程，兩個(gè)干細(xì)胞移植組的發(fā)病明 顯輕于PBS組，而IL10-BM-NSCs對疾病的抑制作用較BM-NSCs更快更強(qiáng)(圖4)。2、IL10-BM-NSCs的抗炎作用干細(xì)胞移植2周后取各組模型小鼠脾臟，用70 μ m 細(xì)胞濾網(wǎng)(BD Falcon)擠壓、過濾脾臟組織制成單細(xì)胞懸液，以1. 5X 106/ml細(xì)胞濃度置于 RPMI 1640+10% FBS+10 μ g/ml M0G35-55中培養(yǎng)。3天后取培養(yǎng)液上清，以ELISA法檢測各 種細(xì)胞因子的改變(IFN-r、IL-17、IL-4、IL-5、IL-13ELISA Kit, BD Bioscience)。結(jié)果顯 示，ILlO-BM-NSCs明顯降低了小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌炎性細(xì)胞因子IFN_r和IL-17，增加了抗 炎細(xì)胞因子IL-4、IL-5、IL-13的分泌，從而使抗炎作用顯著增強(qiáng)(圖5)。3、IL10-BM-NSCs的體內(nèi)分化、促進(jìn)髓鞘修復(fù)與再生作用干細(xì)胞移植6周后，取 各組小鼠腦與脊髓，制成冰凍切片，免疫組化檢測NeuN、GalC, GFAP表達(dá)，以GFP陽性作為 外源性移植干細(xì)胞的追蹤標(biāo)志。電鏡觀察髓鞘修復(fù)與再生。結(jié)果顯示，IL-10的表達(dá)促使 BM-NSCs更多地分化為能修復(fù)髓鞘的GalC+少突膠質(zhì)細(xì)胞，抑制其分化為形成MS病灶斑塊 的GFAP+星型膠質(zhì)細(xì)胞；電鏡檢查結(jié)果顯示，IL-10的表達(dá)促進(jìn)了髓鞘的修復(fù)與再生，使有 髓鞘軸突所占百分率明顯增加(圖6)。
權(quán)利要求
表達(dá)抗炎細(xì)胞因子IL 10的骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞的制備方法，包括如下步驟1)、骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞的生成與培養(yǎng)取8 12周C57BL/6小鼠的腓骨，提取全骨髓細(xì)胞，用德國美天旎公司的微珠標(biāo)記抗體及磁性細(xì)胞分選儀分兩步篩選出間充質(zhì)干細(xì)胞；首先用系別細(xì)胞去除試劑盒去除成熟造血細(xì)胞，包括T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞和紅細(xì)胞以及定向祖細(xì)胞CD5+，CD45+，CD11b+，Gr 1+，TER119+，7/4+，保留系別陰性細(xì)胞；再用抗CD117微篩選出lineage /CD117(c kit)+間充質(zhì)干細(xì)胞，以1×105/ml密度置于DMEM/F12+bFGF 20ug/ml+EGF 20ug/ml+2％B27中培養(yǎng)，每隔3天換液一次，3 5周后誘導(dǎo)形成神經(jīng)干細(xì)胞球；2)、腦源神經(jīng)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)分離上述小鼠腦組織SVZ區(qū)，切成1cm3小塊，胰蛋白酶消化20min、70μm細(xì)胞濾網(wǎng)過濾，將提取出的細(xì)胞以1×105/ml密度加入DMEM/F12+bFGF 20ug/ml+EGF 20ug/ml+2％B27中體外培養(yǎng)，1 2周后形成神經(jīng)干細(xì)胞球；3)、取第三代神經(jīng)干細(xì)胞球及打散的單個(gè)神經(jīng)干細(xì)胞，以抗小鼠Nestin和SOX2抗體進(jìn)行免疫組化染色、熒光顯微鏡檢測；結(jié)果顯示BM NSCs與SVZ NSCs都為Nestin和SOX2陽性，可鑒定為未分化NSCs；4)、骨髓源與腦源神經(jīng)干細(xì)胞的自我更新與分化能力的比較，證實(shí)兩者具有相同的自我更新與分化能力，都能分化為神經(jīng)元與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞；方法如下①、生長曲線測定取第三代BM 與SVZ NSCs神經(jīng)球，打散成單細(xì)胞，以相同細(xì)胞密度置于DMEM/F12+bFGF 20ug/ml+EGF 20ug/ml+2％B27中培養(yǎng)；第5，9，13，16天分別取出，分散為單細(xì)胞，計(jì)數(shù)，繪制生長曲線；結(jié)果顯示BM 與SVZ NSCs增值速度無顯著差別；②、體外分化實(shí)驗(yàn)將上述兩種神經(jīng)球打散成單細(xì)胞，加入DMEM/F12+維甲酸15ug/ml+腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子20ug/ml中體外誘導(dǎo)分化；兩周后免疫組化鑒定，證實(shí)BM NSCs與SVZ NSCs都分化為神經(jīng)元NF M+、少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞NG2+、星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP+，少數(shù)細(xì)胞仍維持于未分化狀態(tài)Nestin+。
全文摘要
本發(fā)明提供一種來源于骨髓、可表達(dá)抗炎細(xì)胞因子IL-10的新型神經(jīng)干細(xì)胞的制備方法，包括①骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞的生成與培養(yǎng)、腦源神經(jīng)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)。②骨髓源與腦源神經(jīng)干細(xì)胞的自我更新與分化能力的比較，并證實(shí)兩者具有相同的自我更新與分化能力，都能分化為神經(jīng)元與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)能。本發(fā)明方法制備的神經(jīng)干細(xì)胞能用于治療MS疾病及其它多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，為多發(fā)性硬化及其它神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療提供了一種全新的途徑，具有十分廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號C12N5/10GK101914492SQ20101019379
公開日2010年12月15日 申請日期2010年6月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月8日
發(fā)明者孟憲生, 康廷國, 徐志立, 楊靜嫻, 王東 申請人:遼寧中醫(yī)藥大學(xué)