Bv8和/或EG-VEGF促進造血的用途的制作方法

文檔序號：864085閱讀：424來源：國知局

專利名稱：Bv8和/或EG-VEGF促進造血的用途的制作方法
Bv8和/或EG-VEGF促進造血的用途本申請是申請?zhí)枮?00480013161. 9，申請日為2004年3月12日，發(fā)明名稱為“Bv8 和/或EG-VEGF促進造血的用途”的專利申請的分案申請。GENENTECH, INC等，美國國民或居民，提交該PCT申請，要求2003年3月12日提交的美國臨時申請60/妨4，462和2003年10月14日提交的美國臨時申請60/511，390的優(yōu)先權(quán)。
背景技術(shù)：
Bv8是一種小分子蛋白，它最初是從青蛙Bombina variegata的皮膚分泌物中分離得到的(Mol lay 等 Eur. J.Pharmacol. 374 :189-196 (1999))。(Mo 11 ay et al. ,Eur. J. P/ MMco.，374 :189-196(1999))。Bv8屬于包括內(nèi)分泌腺來源的血管內(nèi)皮生長因子(EG-VEGF) 在內(nèi)的結(jié)構(gòu)關(guān)聯(lián)肽種類(LeCouter et al.，nature，412 :877-884(2001))。這些分子的明顯不同的結(jié)構(gòu)基序是輔脂肪酶-折疊，其中10個半胱氨酸殘基在保守區(qū)(conserved span) 內(nèi)形成5個二硫橋。Bv8和EG-VEGF是血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)同系物，VEGF是已知在腫瘤生長和存活中有重要作用的血管生成因子。BvS和EG-VEGF都被鑒定為對特定組織的內(nèi)皮細胞具有選擇性活性的血管生成因子。EG-VEGF促進培養(yǎng)的腎上腺毛細血管內(nèi)皮細胞的增殖，遷移，存活以及排列(fenestration)并誘導卵巢和睪丸中的血管生成。LeCouter et al.，2001， Nature, 412 :877-884 ；LeCouter et al. , 2003, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100 :2685_2690。和EG-VEGF—樣，BvS促進腎上腺皮質(zhì)毛細血管內(nèi)皮細胞的增殖，存活和遷移，并誘導睪丸中的血管生成。LeCouter et al. , 2003, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100 2685-2690.睪丸顯示相對較高的內(nèi)皮細胞更新率。因此，Bv8和EG-VEGF以及其它因子諸如VEGF被認為在睪丸血管的完整性保持及其增殖調(diào)節(jié)中有重要作用。VEGF是已知在腫瘤生長和存活中具有重要作用的血管生成因子。由于BvS和 EG-VEGF是對特定組織具有選擇性活性的血管生成因子，還需要對所述分子進行進一步的表征。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明基于對Bv8和EG-VEGF在造血干細胞(HSC)，系定向型血液祖細胞 (lineage-committed blood progenitor cell)以及淋巴細胞中的新的表達和活性的鑒定。具體如本文所述，Bv8, EG-VEGF，及其受體表達于骨髓HSC，外周血白細胞(PBL)，以及許多血液惡性細胞系中。體外和體內(nèi)試驗顯示BvS和EG-VEGF能夠促進骨髓單個核細胞以及脾來源的祖細胞的集落形成，增加血白細胞的群體，并促進B淋巴細胞和T淋巴細胞的活化。因此，BvS核酸和多肽，EG-VEGF核酸和多肽，或其組合可用于多種分析以及造血相關(guān)疾病、嗜中性粒細胞減少癥(neutropenia)、免疫缺陷疾病以及自身免疫病的診斷和治療中。Bv8和EG-VEGF的受體見于骨髓造血干細胞(⑶34+)和系定向型祖細胞(⑶34+)。 BV8和/或EG-VEGF誘導⑶34+髓樣(myeloid)及淋巴樣(lymphoid)祖細胞的增殖。該增殖導致白細胞數(shù)目增加，所述白細胞包括B細胞，T細胞，具體是嗜中性粒細胞。BV8，EG-VEGF，及其激動劑可用于治療，例如用于免疫缺陷疾病的治療中，所述免疫缺陷疾病諸如淋巴細胞減少癥，嗜中性粒細胞減少癥等。這些分子也可用于促進骨髓抑制，例如化療誘導的骨髓抑制之后的造血恢復?，F(xiàn)在發(fā)現(xiàn)各種白血病細胞，諸如ALL，AML, MPD, CML以及MDS細胞表達BV8和 EG-VEGF的受體。生長因子BV8和/或EG-VEGF的拮抗劑對抑制這些白血病細胞的增殖有用。令人吃驚的發(fā)現(xiàn)是，BV8和/或EG-VEGF也誘導B和T細胞活化。這些分子的激動劑和拮抗劑可治療性地用于調(diào)節(jié)免疫反應。Bv8，EG-VEGF，及其激動劑可用于并誘導免疫受損的個體例如HIV患者中的T細胞增殖及活化。這些分子的拮抗劑可治療性地用于抑制免疫反應，例如與自身免疫病相關(guān)的免疫反應。骨髓細胞的增殖一方面，本發(fā)明提供誘導骨髓細胞增殖的方法。一個實施方案中，所述方法包括使 BM細胞與細胞增殖誘導有效量的Bv8，EG-VEGF，或其組合接觸。另一實施方案中，所述方法包括將編碼Bv8，EG-VEGF,或其組合的多核苷酸序列導入BM細胞，所述多核苷酸序列的量可有效誘導BM細胞增殖。在一個實施方案中，Bv8和/或EG-VEGF是天然序列Bv8和/或EG-VEGF多肽。優(yōu)選天然序列BvS多肽是天然人BvS多肽。天然人BvS多肽可包含氨基酸序列SEQ ID NO 2 或氨基酸序列SEQ ID NO :4。在另一實施方案中，天然序列BvS包含氨基酸序列SEQ ID NO 6。在另一實施方案中，BvS能與肝素結(jié)合。優(yōu)選，天然序列EG-VEGF多肽是天然人EG-VEGF 多肽。天然人EG-VEGF多肽可包含氨基酸序列SEQ ID NO :8。在另一實施方案中，天然序列EG-VEGF包含氨基酸序列SEQ ID NO :10。在另一實施方案中，Bv8和/或EG-VEGF是免疫粘附素。在另一實施方案中，BvS和/或EG-VEGF是嵌合的。在一個實施方案中，Bv8/EG_VEGF促進BM造血干細胞和/或系定向型祖細胞的增殖。所述系定向型祖細胞通常是髓系和/或淋巴系。在另一方面，本發(fā)明提供了在需要具體血細胞群的患者中維持所述細胞群的方法。在一個實施方案中，所述方法包括使所述細胞與能夠有效促進所述細胞增殖的量的 Bv8，EG-VEGF，或其組合接觸，從而維持其群體。在另一個實施方案中，所述方法包括將編碼 Bv8, EG-VEGF，或其組合的多核苷酸序列引入所述細胞，所述多核苷酸的量能有效促進細胞存活。所述方法還包括將編碼VEGF的核酸引入所述細胞中。一方面，所需具體細胞類型是白細胞，優(yōu)選嗜中性粒細胞，B淋巴細胞，⑶4+T淋巴細胞，和/或⑶8+T淋巴細胞。另一方面，所述患者患有嗜中性粒細胞減少癥，淋巴細胞減少癥(lymphopenia)，或免疫缺陷疾病，并因此需要嗜中性粒細胞，B淋巴細胞，⑶4+T淋巴細胞，和/或⑶8+T淋巴細胞。異常造血的治療另一方面，本發(fā)明提供治療哺乳動物中與異常造血相關(guān)的疾病的方法。一個實施方案中，所述方法優(yōu)選包括將包含Bv8，EG-VEGF,或其組合，或其激動劑或拮抗劑的組合物給藥哺乳動物，所述組合物的量足以治療所述疾病。所述哺乳動物優(yōu)選人。一方面，本發(fā)明任意方法中所用包含Bv8，EG_VEGF，或其組合的組合物包含天然序列BvS多肽和/或天然序列EG-VEGF多肽。優(yōu)選，所述天然序列BvS多肽是天然人BvS多肽。天然人BvS多肽可包含氨基酸序列SEQ ID NO 2或氨基酸序列SEQ ID NO :4。另一個實施方案中，天然序列BvS包含氨基酸序列SEQ ID NO :6。另一個實施方案中，BvS多肽與肝素結(jié)合。優(yōu)選，天然序列EG-VEGF多肽是天然人EG-VEGF多肽。天然人EG-VEGF多肽可包含氨基酸序列SEQ ID NO :8。另一個實施方案中，天然序列EG-VEGF包含氨基酸序列SEQ ID NO :10。血液疾病的治療另一方面，本發(fā)明提供治療哺乳動物優(yōu)選人中的血液疾病的方法。一個實施方案中，所述方法包括將細胞增殖抑制有效量的BvS拮抗劑，EG-VEGF拮抗劑，或其組合給藥哺乳動物。一個實施方案中，可用本發(fā)明方法治療的血液疾病包括各種白血病，骨髓增生性疾病，骨髓發(fā)育不良性疾病，淋巴組織增生性疾病，和淋巴組織發(fā)育不良性疾病。優(yōu)選，所述血液疾病選自急性髓性白血病(acute myeloid leukemia) (AML)，慢性髓性白血病(chronic myelogenous leukemia) (CML),急性淋巴母細胞白血病(acute lymphoblastic leukemia) (ALL)，多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma)，T-細胞淋巴瘤(T-cell lymphoma)，真性紅血球
(polycythaemia vera) (PV)，帛胃個生1&/]、|&±曾(essential thrombocythaemia) (ET)，和骨髓外化生(myeloid metaplasia)(骨髓纖維化(myelofibrosis))等。免疫疾病的治療本發(fā)明另一方面提供通過給藥Bv8，EG-VEGF，或其組合治療哺乳動物優(yōu)選人中的免疫缺陷疾病的方法?；加忻庖呷毕菁膊〉幕颊呷狈和T淋巴細胞，并需要增加的 B淋巴細胞和/或T淋巴細胞群體?？商峁〣v8，EG-VEGF,或其組合以增加B和T細胞群體。所述免疫缺陷疾病可以是原發(fā)或繼發(fā)的。一個實施方案中，繼發(fā)性免疫缺陷疾病是與感染性疾病(包括人免疫缺陷病毒(HIV)或肝炎)相關(guān)的疾病。另一個實施方案中，所述免疫缺陷疾病是與給藥免疫抑制劑相關(guān)的疾病，諸如具有繼發(fā)性免疫抑制效應的治療劑，所述治療劑包括但不限于，5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)，長春新堿(vincristine)，順鉬(cisplatin)，oxoplatin,甲氨喋呤(methotrexate)，3 ‘-疊氮基(azido)_3'-脫氧胸苷(deoxythymidine)，紫杉醇(paclitaxel)，紫杉萜(doxetaxel)，蒽環(huán)類抗生素 (anthracycline antibiotic), 5 M^iItlo本發(fā)明另一方面提供治療哺乳動物優(yōu)選人中的免疫缺陷疾病的方法。BvS拮抗劑， EG-VEGF拮抗劑，或其組合，可用于治療自身免疫病，其中活化的B細胞，CD4+T細胞，和/或 CD8+T細胞的數(shù)目減少是所需的。具體實施方案包括利用本發(fā)明提供的藥劑和組合物治療自身免疫病相關(guān)的ΙΙ，ΠΙ，和IV型超敏反應。一個實施方案中，所述方法包含將自身免疫疾病抑制有效量的BvS拮抗劑，EG-VEGF拮抗劑，或其組合給藥哺乳動物。另一個實施方案中，所述方法包括將BvS拮抗劑，EG-VEGF拮抗劑，或其組合給藥患者，所述藥劑的量可有效抑制⑶4+淋巴細胞和/或⑶8+Τ淋巴細胞的增殖。免疫反應的調(diào)節(jié)本發(fā)明另一方面提供調(diào)節(jié)免疫反應的方法?？山o藥Bv8，EG-VEGF，或其組合，或其激動劑來活化B淋巴細胞，CD4+T淋巴細胞，和/或CD8+T淋巴細胞。一個實施方案中，可給藥Bv8，EG-VEGF,或其組合，或其激動劑來選擇性促進或抑制⑶4+T淋巴細胞和/或⑶8+T 淋巴細胞的增殖。Bv8和EG-VEGF誘導⑶4+T淋巴細胞和⑶8+T淋巴細胞中的細胞因子產(chǎn)生。一個實施方案中，誘導⑶4+T淋巴細胞中的IL-2合成的Bv8，EG-VEGF，其激動劑，或其組合可用于誘導CD4+淋巴細胞的增殖。另一個實施方案中，可給藥誘導CD4+T淋巴細胞中的IFN-Y 的Bv8，EG-VEGF,其激動劑，或其組合來抑制⑶4+T淋巴細胞的增殖。拮抗劑本發(fā)明所用BvS拮抗劑和EG-VEGF拮抗劑可以是任何可以阻斷，干擾，或最小化 Bv8和/或EG-VEGF活性的組合物。這些拮抗劑包括抗_Bv8和/或抗-EG-VEGF抗體或其片段，能夠與BvS和/或EG-VEGF受體結(jié)合而不激發(fā)信號轉(zhuǎn)導活性的經(jīng)截短的肽，能夠螯合 Bv8和/或EG-VEGF肽的可溶性Bv8和/或EG-VEGF受體，能夠干擾Bv8或EG-VEGF受體活性的抗_Bv8和/或抗-EG-VEGF受體抗體或小分子。一個實施方案中，Bv8或EG-VEGF受體是Bv8/EG-VEGF受體-1和/或Bv8/EG-VEGF受體-2。Bv8和EG-VEGF結(jié)合受體1和受體2，這將在發(fā)明詳述部分更詳細描述。制品另一方面，本發(fā)明提供一種制品，其包括容器，BvS和/或EG-VEGF，以及使用BvS 和/或EG-VEGF的說明。一個實施方案中，所述說明是使用BvS和/或EG-VEGF治療與異常造血相關(guān)的疾病的說明。另一個實施方案中，所述說明是使用BvS和/或EG-VEGF治療免疫缺陷疾病相關(guān)疾病的說明。另一方面，本發(fā)明提供一種制品，其包括容器，BvS拮抗劑和/ 或EG-VEGF拮抗劑，以及使用BvS拮抗劑和/或EG-VEGF拮抗劑的說明。一個實施方案中，所述說明是使用BvS拮抗劑和/或EG-VEGF拮抗劑治療血液疾病的說明。另一個實施方案中，所述說明是使用BvS拮抗劑和/或EG-VEGF拮抗劑治療免疫缺陷疾病的說明。另一個實施方案中，所述說明是使用BvS拮抗劑和/或EG-VEGF拮抗劑治療自身免疫病的說明。鑒定拮抗劑的方法本發(fā)明另一方面提供了鑒定BvS拮抗劑的方法，所述方法是使候選化合物與BvS 接觸，測定該化合物對BvS生物學活性的影響，并鑒定抑制BvS生物學活性的拮抗劑。在一個實施方案中，BvS拮抗劑通過其抑制BvS刺激內(nèi)皮細胞增殖的能力來鑒定。在另一實施方案中，Bv8或EG-VEGF拮抗劑通過其抑制Bv8或EG-VEGF促進內(nèi)皮細胞存活的能力來鑒定。

圖1顯示編碼人Bv8同系物的cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO :1)。分別用粗體和下劃線表示起始密碼子(從核酸位置11開始的“atg”)和終止密碼子(從核酸位置398 開始的“taa”)的位置。圖2顯示人Bv8同系物多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO :2)，其由編碼序列SEQ ID N0:1衍生。公認的信號序列包含氨基酸1-21。圖3顯示編碼人Bv8同系物旁路剪接形式的cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO 3)。分別用粗體和下劃線表示起始密碼子(從核酸位置11開始的“atg”)和終止密碼子(從核酸位置398開始的“taa”)的位置。圖4顯示人Bv8同系物多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO :4)，其由編碼序列SEQ ID NO :3衍生。圖5顯示編碼小鼠Bv8同系物的cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO :5)。分別用粗體和下劃線表示起始密碼子(從核酸位置11開始的“atg”)和終止密碼子(從核酸位置398開始的“taa”)的位置。圖6顯示小鼠Bv8同系物多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO 6)，由編碼序列SEQ ID NO :5衍生。圖7顯示小鼠BvS同系物與人BvS同系物的序列比對。潛在的肝素_結(jié)合區(qū)用盒子表示。該區(qū)不出現(xiàn)在旁路剪接轉(zhuǎn)錄物中。小鼠BvS同系物與人BvS同系物有近96%相同。圖8顯示編碼人天然序列EG-VEGF的cDNA的多核苷酸序列(SEQ ID NO :7)。圖9顯示人天然序列EG-VEGF多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO :8)，其來自SEQ ID NO 7的編碼序列。圖10顯示編碼天然小鼠EG-VEGF多肽(SEQ ID NO 10)的cDNA的多核苷酸序列 (SEQ ID NO 9)。圖11顯示人天然EG-VEGF多肽(SEQ ID NO 8)與天然小鼠EG-VEGF多肽(SEQ ID NO:8)的比對。圖12顯示人Bv8同系物(SEQ ID NO 4的氨基酸觀_108)的氨基酸序列與人 EG-VEGF(SEQ ID NO :10的氨基酸20-105)的氨基酸序列的比對。沒有顯示任一分子的信號序列。人Bv8與人EG-VEGF大約60 %相同。圖13顯示RNA斑點雜交試驗的結(jié)果，所述結(jié)果揭示骨髓，PBL以及睪丸中的hBv8信號。圖14A-D是照片，顯示原位雜交研究的結(jié)果，其揭示了嗜中性粒細胞和相關(guān)浸潤細胞中Bv8的受限制的表達。圖14A和B顯示扁桃體炎中的Bv8表達，圖14A顯示組織的蘇木精-伊紅染色，圖14B顯示利用33P-標記的探針顯示的、BvS在相同組織中的表達。圖 14C和D顯示闌尾炎中的Bv8表達，圖14C顯示組織的蘇木精-伊紅染色，圖14D顯示利用 33P-標記的探針顯示的、BvS在相同組織中的表達。圖15A-D圖示了各種組織和細胞中BvS及其受體的實時定量PCR表達分析的結(jié)果。圖15A顯示BvS在骨髓以及睪丸中強烈表達；圖15B顯示BvS在多種類型造血細胞中的差異表達；圖15C和D顯示造血細胞的Bv8/EG-VEGF受體-1表達(圖15C)以及Bv8/ EG-VEGF受體-2表達(圖15D)。圖16是柱圖，顯示Bv8與Bv8/EG_VEGF受體_1和Bv8/EG_VEGF受體_2在以下各種白血病細胞系中的實時定量PCR表達分析的結(jié)果(A)HL60CML ;(B)K562CML ;(C)Hel-92 紅白血??；(D)TF-I全血細胞減少癥；(E)KG-IAML。圖17A-B圖示了在各種生長因子存在的條件下，體外骨髓單個核培養(yǎng)物中的集落形成。圖17A顯示Bv8(5nM和50mM)增加小鼠骨髓單個核細胞中的集落形成。圖17B顯示，BvS與EG-VEGF相似，可增加人骨髓單個核細胞培養(yǎng)物中具體類型的髓樣祖細胞的集落形成。Ct指實施例2中所述的完全培養(yǎng)基。基礎(chǔ)指實施例2中所述的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。圖18圖示了 BvS與EG-VEGF相似，增加體內(nèi)白細胞計數(shù)。細胞計數(shù)在將表達BvS 的腺病毒載體導入體內(nèi)后3天(淺灰)，6天(深灰)，或12天(空心柱)測定。圖19A-D圖示了，人和小鼠來源的B淋巴細胞，⑶4+T淋巴細胞，⑶8+T淋巴細胞，和自然殺傷細胞中，Bv8/EG-VEGF受體-1和Bv8/EG-VEGF受體-2的實時定量PCR表達分析。圖19A和B顯示人(圖19A)和小鼠(圖19B)來源的B淋巴細胞，⑶4+T淋巴細胞，⑶8+T淋巴細胞，和自然殺傷細胞中，Bv8/EG-VEGF受體-1的相對轉(zhuǎn)錄水平。圖19C和D顯示人 (圖19C)和小鼠(圖19D)來源的B淋巴細胞，CD4+T淋巴細胞，CD8+T淋巴細胞，和自然殺傷細胞中，Bv8/EG-VEGF受體-2的相對轉(zhuǎn)錄水平。圖20圖示了 Bv8和EG-VEGF增加離體小鼠B淋巴細胞的3H-胸苷摻入。圖21圖示了 Bv8和EG-VEGF增加離體小鼠⑶4+T淋巴細胞中的3H-胸苷摻入。插圖顯示在濃度漸增的EG-VEGF或Bv8存在的條件下，⑶4+T細胞中的3H-胸苷摻入。圖22A-D圖示了 EG-VEGF誘導CD4+T細胞中的細胞因子生成。EG-VEGF誘導CD4+T 細胞中的IL-2和IFN-Y生成。圖23A-E圖示了 Bv8促進5-FU骨髓抑制后體內(nèi)造血的恢復。體內(nèi)引入表達Bv8 的腺病毒載體后第5、11和14天測定細胞計數(shù)。Fltsel指VEGF突變體，其選擇性結(jié)合FLTl 受體。KDRsel指VEGF突變體，其選擇性結(jié)合KDR受體。BvS增加5-FU骨髓抑制后的白細胞計數(shù)，粒細胞計數(shù)，單核細胞計數(shù)以及血小板計數(shù)。圖M圖示了 5-FU骨髓抑制后，存在多種生長因子的條件下，脾來源的定向單個核細胞在體外的集落形成。與用非病毒或LacZ治療的對照小鼠相比，分離自經(jīng)BvS治療的動物的脾細胞含有明顯更多的髓樣祖細胞(CFU-GM)。優(yōu)選實施方案詳述I.定義除非特別聲明，本文中采用的技術(shù)和科學術(shù)語與本發(fā)明所述技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所通常理解的術(shù)語具有相同的含義。參見，例如Singleton等，Dictionafy of Microbiology 和 Molecular Biology 第 2 版，J. Wiley & Sons(New York, NY 1994)； Sambrook 等，Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Press (Cold Springs Harbor, NY 1989)。為了本發(fā)明的目的，對以下術(shù)語作出如下限定。本文中術(shù)語“Bv8”和“Bv8多肽”可互換使用，它們指天然序列Bv8，BvS變體，和嵌合Bv8，它們每一個都在本文中限定。可選地，BvS不與天然糖基化相關(guān)。“天然糖基化” 是指，當BvS在哺乳動物細胞(具體是在天然產(chǎn)生BvS的細胞)中產(chǎn)生時，與其共價結(jié)合的糖組分。因此，非人細胞中產(chǎn)生的人BvS是一例“不與天然糖基化相關(guān)”的Bv8。BvS可根本不發(fā)生糖基化，正如它在原核細胞，例如大腸桿菌中產(chǎn)生時那樣。Bv8核酸是編碼上文定義的Bv8多肽的RNA或DNA，或者是與所述DNA或RNA雜交并在嚴格雜交條件下與其穩(wěn)定結(jié)合的、長度超過約10個核苷酸的RNA或DNA。嚴格雜交條件是指，(1)利用低離子強度和高溫洗滌，例如，0. 15M NaCl/0.015M檸檬酸鈉/0. NaDodSO4, 50°C，或⑵在雜交期間使用變性劑，如甲酰胺，例如50% (vol/vol)甲酰胺以及 0. 牛血清白蛋白/0. 1% Ficoll/0. 聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸鈉緩沖液，pH 6.5， 750mM NaCl，75mM 檸檬酸鈉，42°C。當多核苷酸處于與另一個核酸序列有功能關(guān)系的位置上時，該多核苷酸是可操作相連的。BvS核酸可以與另一核酸序列在載體中可操作相連，使其能在具體宿主生物中表達。這可以通過本領(lǐng)域已知方法進行。例如，前序列或分泌前導序列被表達為參與多肽分泌的前蛋白時，編碼前序列或分泌前導序列的DNA與編碼該多肽的DNA是可操作相連的；啟動子或增強子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄時，其與該編碼序列是可操作相連的；或核糖體結(jié)合位點處在促進翻譯的位置上時，它與編碼序列是可操作相連的。通常，“可操作相連”是指相連的DNA是鄰接的，而且，在分泌前導序列的情況中，是鄰接并處在閱讀相。但增強子不是必需鄰接的。連接可通過在便利的限制性位點連接來完成的。如果不存在這類位點，可根據(jù)常規(guī)實踐使用合成的寡核苷酸接頭或連接區(qū)?！疤烊恍蛄蠦v8”包括具有與自然界衍生的BvS相同的氨基酸序列的多肽，無論其通過什么方法制備。因此，天然序列BvS可以具有天然人Bv8、鼠Bv8、或任何其它哺乳動物物種來源的BvS的氨基酸序列。例如，全長天然序列人BvS的氨基酸序列見圖2(SEQ ID NO :2)。另一種全長天然序列人Bv8見圖4 (SEQ ID NO :4)。這兩個序列是對編碼標準 (canonical)肝素結(jié)合區(qū)的外顯子進行兩種不同剪接的結(jié)果。因此，氨基酸序列如圖2 (SEQ ID NO :2)所示的那種天然序列人BvS包含肝素結(jié)合區(qū)，而圖4(SEQ ID NO :4)所示天然序列Bv8不含該區(qū)。天然序列小鼠Bv8氨基酸序列見圖6 (SEQ ID NO :6)。人和鼠Bv8的序列也已經(jīng)公開，參見 Wechselberger 等(FEBS Lett. 462 177-181 (1999))和 Li 等(Mol. Pharm. 59 =692-698 (2001)) 0這樣的天然序列Bv8可以從自然界分離，也可以通過重組和/ 或合成手段制備。術(shù)語“天然序列BvS”具體包含BvS的天然前原(pr印ro)形式，原(pro) 形式，成熟形式和截短形式，天然變體形式(例如旁路剪接形式，諸如圖4(SEQ ID N0:4)所示的形式)，以及天然等位變體。優(yōu)選的天然序列BvS是圖2 (SEQ ID NO 2)所示的全長天然序列人Bv8。"Bv8變體”是指，具有不同于天然序列BvS多肽的氨基酸序列的生物活性BvS多肽，如圖2，4和6 (SEQ ID NO :2，4和6)所示的人和鼠Bv8，可通過在天然序列中插入、缺失、修飾和/或取代一或多個氨基酸殘基而獲得。BvS變體通常與天然序列BvS有不到100% 序列同一性，如圖2(SEQ ID N0J)所示的人Bv8。但一般情況下，生物活性BvS變體具有與天然BV8(如圖2(SEQ ID NO 2)所示的人Bv8)至少約70%氨基酸序列同一性的氨基酸序列，優(yōu)選至少約75%，更優(yōu)選至少約80%，還更優(yōu)選至少約85%，還更優(yōu)選至少約90%，優(yōu)選以的增量從至少約95%遞增到至少約99%的氨基酸序列同一性。BvS變體包括具有至少5個氨基酸且保留了相應天然序列BvS多肽的生物活性的肽片段。BvS變體還包括在天然BvS序列的N-或C-末端，或者內(nèi)部添加了一或多個氨基酸殘基的BvS多肽。BvS變體還包括缺失了多個氨基酸殘基并且任選地被一或多個氨基酸殘基取代的BvS多肽。BvS 變體還可以進行共價修飾，例如用不同于天然氨基酸的組分進行取代，或者修飾氨基酸殘基從而產(chǎn)生非天然氨基酸。BvS變體可以包含肝素結(jié)合區(qū)。本文中術(shù)語“EG-VEGF”和“EG-VEGF多肽”可互換使用，它們指天然序列EG-VEGF， EG-VEGF變體，和嵌合EG-VEGF，它們每一個都在本文中限定?？蛇x地，EG-VEGF不與天然糖基化相關(guān)。“天然糖基化”是指，當EG-VEGF在哺乳動物細胞(尤其天然產(chǎn)生EG-VEGF的細胞)中產(chǎn)生時，與其共價結(jié)合的糖組分。因此，非人細胞中產(chǎn)生的人EG-VEGF是一例“不與天然糖基化相關(guān)”的EG-VEGF。有時，EG-VEGF根本不發(fā)生糖基化，正如它在原核細胞，例如大腸桿菌中產(chǎn)生時那樣。EG-VEGF核酸是編碼上文定義的EG-VEGF多肽的RNA或DNA，或者是與所述DNA 或RNA雜交并在嚴格雜交條件下與其穩(wěn)定結(jié)合的、長度超過約10個核苷酸的RNA或DNA。嚴格雜交條件是指，(1)利用低離子強度和高溫洗滌，例如，0.15M NaCl/0.015M檸檬酸鈉 /0. NaDodSO4, 50°C，或(2)在雜交期間使用變性劑，如甲酰胺，例如50% (vol/vol)甲酰胺以及0. 牛血清白蛋白/0. 1% Ficoll/0. 聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸鈉緩沖液，pH 6.5，750111]^^(1，751111檸檬酸鈉，421。當多核苷酸處于與另一個核酸序列有功能關(guān)系的位置上時，該多核苷酸是可操作相連的。EG-VEGF核酸可以與另一核酸序列在載體中可操作相連，使其能在具體宿主生物中表達。這可以通過本領(lǐng)域已知方法進行。例如，前序列或分泌前導序列被表達為參與多肽分泌的前蛋白時，編碼前序列或分泌前導序列的DNA與編碼該多肽的DNA是可操作相連的；啟動子或增強子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄時，其與該編碼序列是可操作相連的；或核糖體結(jié)合位點處在促進翻譯的位置上時，它與編碼序列是可操作相連的。通常，“可操作相連”是指相連的DNA是鄰接的，而且，在分泌前導序列的情況中，是鄰接并處在閱讀相。但增強子不是必需鄰接的。連接可通過在便利的限制性位點連接來完成的。如果不存在這類位點，可根據(jù)常規(guī)實踐使用合成的寡核苷酸接頭或連接區(qū)?！疤烊恍蛄蠩G-VEGF”包括具有與自然界衍生的EG-VEGF相同的氨基酸序列的多肽，無論其通過什么方法制備。因此，天然序列EG-VEGF可以具有天然人EG-VEGF、鼠 EG-VEGF、或任何其它哺乳動物物種來源的EG-VEGF的氨基酸序列。一個實施方案中，全長天然序列人EG-VEGF包含氨基酸序列SEQ ID NO :8。一個實施方案中，全長天然序列小鼠 EG-VEGF包含氨基酸序列SEQ ID NO :10。人和鼠EG-VEGF的序列也已經(jīng)公開，參見LeCouter 等，2001，Nature, 412 :877_844。這樣的天然序列EG-VEGF可以從自然界分離，也可以通過重組和/或合成手段制備。術(shù)語“天然序列EG-VEGF”具體包含EG-VEGF的天然前原(pr印ro)形式，原(pro)形式，成熟形式和截短形式，天然變體形式(例如旁路剪接形式)，以及天然等位變體。優(yōu)選的天然序列EG-VEGF是包含氨基酸序列SEQ ID NO 8的全長天然序列人EG-VEGF。“EG-VEGF變體”是指，具有不同于天然序列EG-VEGF多肽的氨基酸序列的生物活性EG-VEGF多肽，如人和鼠EG-VEGF，可通過在天然序列中插入、缺失、修飾和/或取代一或多個氨基酸殘基而獲得。EG-VEGF變體通常與天然序列EG-VEGF有不到100%序列同一性。但一般情況下，生物活性EG-VEGF變體具有與天然EG-VEGF至少約70%氨基酸序列同一性的氨基酸序列，優(yōu)選至少約75 %，更優(yōu)選至少約80 %，還更優(yōu)選至少約85 %，還更優(yōu)選至少約90 %，優(yōu)選以1 %的增量從至少約95 %遞增到至少約99 %的氨基酸序列同一性。EG-VEGF 變體包括具有至少5個氨基酸且保留了編碼天然序列EG-VEGF多肽的生物活性的肽片段。 EG-VEGF變體還包括在天然EG-VEGF序列的N-或C-末端，或者內(nèi)部添加了一或多個氨基酸殘基的EG-VEGF多肽。EG-VEGF變體還包括缺失了多個氨基酸殘基并且任選地被一或多個氨基酸殘基取代的EG-VEGF多肽。EG-VEGF變體還可以進行共價修飾，例如用不同于天然氨基酸的組分進行取代，或者修飾氨基酸殘基從而產(chǎn)生非天然氨基酸。EG-VEGF變體可以包含肝素結(jié)合區(qū)。BvS或EG-VEGF的“氨基酸序列同一性百分比”在本文中定義為，經(jīng)過序列對比，并在必要時導入空隙以獲取最大序列同一性百分比，而不將任何保守取代視為序列同一性的一部分時，候選序列中與BvS序列中的殘基相同的氨基酸殘基的百分比。在候選的BvS或 EG-VEGF序列中，在N-末端、C-末端或內(nèi)部的延伸，缺失或插入，都不視為影響序列同一性或同源性。序列比對的方法和計算機程序是已知的。一個這樣的計算機程序是Genentech， Inc.公司擁有的“ALIGN-2”，該程序及其用戶文件(user documentation)已提交美國版權(quán)局(United States Copyright Office), Washington, D. C. 20559，其美國版權(quán)注冊號為TXU510087。“嵌合EG-VEGF”分子是包含與異源多肽融合或鍵合的全長EG-VEGF或其一或多個結(jié)構(gòu)域的多肽。嵌合EG-VEGF分子通常與天然EG-VEGF共享至少一種生物學特性。嵌合 EG-VEGF分子的一個實例是帶有可用于純化的表位標簽的分子。另一種嵌合EG-VEGF分子是EG-VEGF免疫粘附素。本文中“帶有表位標簽”是指，包含與“標簽多肽”融合的BvS或EG-VEGF的嵌合多肽。標簽多肽具有足以提供制備抗體所需的表位的殘基，但同時它又很短，不會干擾BvS 的生物活性。標簽多肽優(yōu)選非常獨特，使其抗體基本上不與其它表位發(fā)生交叉反應。合適的標簽多肽通常具有至少6個氨基酸殘基，通常約8-50個氨基酸殘基(優(yōu)選約9-30個殘基)。優(yōu)選聚-組氨酸序列，它可以與鎳結(jié)合，從而能通過M-NTA層析分離帶有該標簽的蛋白(參見，例如 Lindsay 等 1996Neuronl7 :571-574)?！胺蛛x的”是指，從BvS或EG-VEGF來源純化得到的，或者是通過重組或合成方法制備并純化的BvS或EG-VEGF。純化的BvS基本上不含其它多肽或肽?！盎旧喜缓笔侵福?其它來源的蛋白的污染少于約5%，優(yōu)選少于約2%，更優(yōu)選少于約1%，還更優(yōu)選少于約 0.5%，最優(yōu)選少于約0. 1%?！盎炯儭钡牡鞍资侵敢环N組合物，其總重量中所述蛋白的重量占至少約90%，優(yōu)選占至少約95%，更優(yōu)選占至少約90%，還更優(yōu)選占至少約95%?！盎揪弧钡牡鞍资侵敢环N組合物，其總重量中有至少約99%重量是所述蛋白?！凹觿笔蔷哂刑烊恍蛄蠦vS或EG-VEGF的一或多種生物學特性的分子或化合物。包括但不限于，有機小分子，肽，和激動劑抗-BvS或抗EG-VEGF抗體。術(shù)語“拮抗劑”使用其最廣泛含義，包括任何能部分地或完全地阻斷、抑制、或中和天然BvS或EG-VEGF多肽的生物活性的分子。合適的拮抗劑分子具體包括拮抗劑抗體或抗體片段，天然BvS或EG-VEGF多肽的片段或氨基酸序列變體，可溶性BvS或EG-VEGF受體或其片段，肽，有機小分子等。鑒定BvS和/或EG-VEGF多肽的激動劑或拮抗劑的方法包括使 BvS或EG-VEGF多肽與候選的激動劑或拮抗劑分子接觸，并測定通常與BvS或EG-VEGF多肽有關(guān)的一或多種生物活性的改變。本文中“有活性”或“活性”是指保留了天然或天然存在的BvS或EG-VEGF的生物活性或免疫活性的BvS或EG-VEGF形式，其中“生物”活性是指由天然或天然存在的BvS或 EG-VEGF導致的生物功能(抑制性或刺激性)，而不是指天然或天然存在的BvS或EG-VEGF 所具有的誘導產(chǎn)生抗抗原性表位抗體的能力，“免疫”活性是指天然或天然存在的BvS或 EG-VEGF所具有的誘導產(chǎn)生抗抗原性表位抗體的能力。因此，當“生物活性”與“Bv8”、“分離的Bv8”、Bv8激動劑、“EG-VEGF”、“分離的 EG-VEGF”或EG-VEGF激動劑聯(lián)合使用時，是指顯示或共有天然序列Bv8或EG-VEGF的效應功能的Bv8或EG-VEGF多肽。Bv8或EG-VEGF的一種基本效應功能是其刺激內(nèi)皮細胞增殖的能力。更優(yōu)選，所述生物活性是調(diào)節(jié)造血的能力。“生物學特性”當與“EG-VEGF”、“分離的EG-VEGF”或EG-VEGF激動劑聯(lián)合使用時，是指具有由天然序列EG-VEGF(不管是其天然構(gòu)型還是變性的構(gòu)型)直接或間接導致或?qū)嵤┑男δ芑蛐钚曰蛘呖乖δ芑蚩乖钚?。效應功能包括增強?nèi)皮細胞的增殖，誘導血管生成和/或調(diào)節(jié)造血。
“生物學特性”當與“Bv8”、“分離的Bv8”、Bv8激動劑聯(lián)合使用時，是指具有由天然序列Bv8 (不管是其天然構(gòu)型還是變性的構(gòu)型)直接或間接導致或?qū)嵤┑男δ芑蛐钚曰蛘呖乖δ芑蚩乖钚?。效應功能包括增強?nèi)皮細胞的增殖，誘導血管生成和/或調(diào)節(jié)造血。"Bv8受體”是與BvS結(jié)合并介導BvS的生物學特性的分子。BvS受體也可結(jié)合并介導EG-VEGF的生物學性質(zhì)。因此，術(shù)語‘‘Bv8受體‘‘的含義包括Bv8/EG_VEGF受體-1和Bv8/ EG-VEGF 受體-2 (LeCouter et al.，2003，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100 :2685-2690 ；Lin et al. ,2002,J. Biol. Chem. , 277 19276-19280 ；Masuda et al.,2002,Biochena. Biophys. Res.Commun. ，293 :396-402)?！癊G-VEGF受體”是與EG-VEGF結(jié)合并介導EG-VEGF的生物學性質(zhì)的分子。EG-VEGF 受體也結(jié)合并介導BvS的生物學性質(zhì)。因此，術(shù)語"EG-VEGF受體"的含義包括BvS/ EG-VEGF 受體-1 和 Bv8/EG-VEGF 受體-2 (LeCouter et al.，2003 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100 :2685-2690 ；Lin et al.，2002，J. Biol. Chem.，277 :19276-19280 ；Masuda et al.， 2002, Biochem. Biophys. Res. Commun. ,293 :396-402)。術(shù)語“抗體”是指最廣義上的抗體，具體包括人、非-人(例如鼠)和人源化的單克隆抗體(包括全長單克隆抗體)、多克隆抗體、多特異性抗體(如雙特異性抗體)和抗體片段，只要它們顯示所需的生物學活性。“抗體” (Ab)和“免疫球蛋白”(Ig)是具有相同結(jié)構(gòu)特征的糖蛋白。抗體表現(xiàn)出對特異抗原的結(jié)合特異性，而免疫球蛋白包括抗體和其它缺少抗原特異性的抗體-樣分子。后一類多肽例如是，在淋巴系統(tǒng)中低水平產(chǎn)生而在骨髓瘤中高水平產(chǎn)生的那些?！疤烊豢贵w”和“天然免疫球蛋白”通常是約150，000道爾頓的異四聚糖蛋白，其由兩條相同的輕鏈(L)和兩條相同的重鏈(H)組成。每條輕鏈通過一個共價二硫鍵與重鏈相連，而不同免疫球蛋白同種型的重鏈具有不同的二硫鍵數(shù)目。每條重鏈和輕鏈還有規(guī)則間隔的鏈內(nèi)二硫鍵。每條重鏈的一端有可變區(qū)(Vh)，其后是多個恒定區(qū)。每條輕鏈的一端有可變區(qū)(\)，另一端有恒定區(qū)；輕鏈的恒定區(qū)與重鏈的第一個恒定區(qū)對齊，輕鏈的可變區(qū)與重鏈的可變區(qū)對齊。人們相信有一些氨基酸殘基在輕鏈和重鏈的可變區(qū)之間形成界面。術(shù)語“可變”是指可變區(qū)的某些部分的序列在不同抗體之間有很大差異，它們可在各個具體抗體針對其具體抗原的結(jié)合和特異性方面發(fā)揮作用。然而，該變異性并非均勻分布于抗體的整個可變區(qū)。它集中于輕鏈和重鏈可變區(qū)中三個稱為超變區(qū)的節(jié)段中?？勺儏^(qū)中高度保守的區(qū)域稱為框架區(qū)(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變區(qū)各包括4個FR(分別為FR1， FR2，F(xiàn)R3和FR4)，主要采取β折疊構(gòu)型，由三個超變區(qū)相連，形成環(huán)狀連接，在某些情況下可形成所述β折疊結(jié)構(gòu)的部分。每條鏈的超變區(qū)通過FR緊密相連，彼此十分靠近，并且與其它鏈的超變區(qū)一起形成抗體的抗原結(jié)合位點(見Kabat等，Sequences of Proteins of Iroanzmaological Interest,第 5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)，第647-669頁)。恒定區(qū)不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但是表現(xiàn)出各種效應功能，例如參與抗體的抗體依賴性細胞毒性作用。本文中術(shù)語“超變區(qū)”是指抗體上負責與抗原結(jié)合的氨基酸殘基。超變區(qū)包含來自“互補決定區(qū)”或“⑶R”的氨基酸殘基(即，輕鏈可變區(qū)中的殘基M-34 (Li)，50-56 (L2) 和 89-97 (L3)，重鏈可變區(qū)中的 31-35 (Hl)，50-65 (H2)和 95-102 (H3) ；Kabat 等，Sequenceof protems of Immunological Interest,第 5 版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))，和 / 或來自“超變環(huán)”的那些殘基(即，輕鏈可變區(qū)中的殘基26-32 (Li)，50-52 (L2)和91-96 (L3)，重鏈可變區(qū)中的26-32 (Hl)， 53-55 (H2)和 96-101(H3) ；Chothia 和 Lesk J. Mol. Biol. 196 :901-917 (1987))?！翱蚣軈^(qū)，，或“FR”殘基是那些可變區(qū)的殘基而不是本文定義的超變區(qū)殘基。用木瓜蛋白酶消化抗體可產(chǎn)生兩個相同的各帶有單個抗原結(jié)合位點的抗原結(jié)合片段(稱為“Fab”片段)和殘余的“Fe”片段，F(xiàn)c片段的名稱反應了其易于結(jié)晶的能力。經(jīng)胃蛋白酶處理可產(chǎn)生具有兩個抗原結(jié)合位點并仍然能與抗原交聯(lián)的F(ab' )2片段。"Fv"是含有完整的抗原-識別和-結(jié)合位點的最小抗體片段。此區(qū)由一個重鏈可變區(qū)與一個輕鏈可變區(qū)緊密地非共價連接形成的二聚體組成。在這個構(gòu)型中，每個可變區(qū)的三個CDR相互作用，在Vh-Vl 二聚體表面限定抗原結(jié)合位點。這六個CDR共同賦予抗體以抗原結(jié)合特異性。然而，即使是單個可變區(qū)(或Fv上僅含有三個抗原特異性超變區(qū)的一半)也具有識別和結(jié)合抗原的能力，盡管與完整的結(jié)合位點相比其親和力較低。Fab段還包括輕鏈恒定區(qū)和重鏈的第一個恒定區(qū)(CHl)。Fab，片段區(qū)別于Fab片段之處在于，F(xiàn)ab'在重鏈CHl區(qū)的羧基末端多出幾個殘基，包括抗體鉸鏈區(qū)的一個或多個半胱氨酸。Fab，-SH在本文中是指恒定區(qū)半胱氨酸殘基帶有游離巰基的那些Fab，。F(ab' )2 抗體片段最初產(chǎn)生為Fab’片段對的形式，在它們之間具有鉸鏈區(qū)半胱氨酸。抗體片段的其它化學偶聯(lián)是眾所周知的。脊椎動物任何物種的抗體(免疫球蛋白)的“輕鏈”，可依據(jù)其恒定區(qū)氨基酸序列而歸為兩種完全不同類型(稱為κ和λ)中的一類。免疫球蛋白根據(jù)其重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列可分為不同的類。主要有5類免疫球蛋白IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些還可進一步分成“亞類”(同種型)，例如IgGU IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。對應于不同類抗體的重鏈恒定區(qū)分別稱為α、δ、ε、γ 和μ。不同類免疫球蛋白的亞單位結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型是眾所周知的?！翱贵w片段”包括完整抗體的一部分，通常是其抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)?？贵w片段的實例包括Fab、Fab\ F(ab' )2和Fv片段；二價抗體；線性抗體；單鏈抗體分子；和由多個抗體片段形成的多特異性抗體。本文中術(shù)語“單克隆抗體”是指來自基本均一的抗體群的抗體，即，除了可能少量存在的天然突變以外，該抗體群中的各個抗體均相同。單克隆抗體具有高度特異性，針對單個抗原位點。而且，與通常包括針對不同決定簇(表位)的不同抗體的常規(guī)(多克隆)抗體制劑相反，每種單克隆抗體是針對抗原上的單個決定簇。修飾詞“單克隆”表明該抗體的特點，即，它來自基本均一的抗體群，不解釋為需通過任何特殊方法產(chǎn)生該抗體。例如，根據(jù)本發(fā)明應用的單克隆抗體可通過由Kohler等，Nature, 256 :495(1975)首先描述的雜交瘤法進行制備，或者可通過重組DNA法進行制備(例如見美國專利4，816，567)?！皢慰寺】贵w” 還可利用例如 Clackson 等，Nature, 352 :624-628(1991)和 Marks 等，J. Mol. Biol.，222 581-597(1991))所述技術(shù)從噬菌體抗體庫中分離。本文中單克隆抗體具體包括“嵌合”抗體(免疫球蛋白)，其重鏈和/或輕鏈的一部分與源自具體物種或?qū)儆诰唧w抗體種類或亞類的抗體的相應序列相同或同源，但所述鏈的剩余部分的序列與源自另一個物種或?qū)儆诹硪粋€抗體種類或亞類的抗體(以及此抗體的片段，只要它們顯示所需的生物學活性)的相應序列相同或同源(美國專利4，816，567 ； Morrison 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 :6851-6855 (1984))?！叭嗽椿狈侨?例如鼠)抗體是包含非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗體。大多數(shù)場合，人源化抗體是人免疫球蛋白(受體抗體)，但其中受體的超變區(qū)殘基被具有所需特異性、親和力和能力的小鼠、大鼠、家兔或非人靈長類等非人源物種抗體(供體抗體)的超變區(qū)殘基所取代。在一些實例中，人免疫球蛋白的框架區(qū)(FR)殘基由相應的非人類殘基所取代。而且，人源化抗體可包括在受體抗體或供體抗體中未發(fā)現(xiàn)的殘基。這些修飾旨在進一步改善(refine)抗體的性能。通常，人源化抗體基本上包括至少一個(通常包括兩個)可變區(qū)的全部，其中超變區(qū)的全部或基本上全部對應于非人免疫球蛋白的相應部分，而FR的全部或基本上全部是人免疫球蛋白的序列。FR可選為共有序列或經(jīng)修飾的共有序列的那些，例如Carter等，美國專利6，054，297中所述。人源化抗體還任選包括免疫球蛋白恒定區(qū)(Fe)，通常為人的免疫球蛋白恒定區(qū)。詳見Jones等，Nature 321 522-525(1986) ；Riechmann 等，Nature332 :323-329(1988)；禾口 Presta，Curr. Op. Struct. Biol. 2 :593-596(1992)?！皢捂淔v”或“scFv”抗體片段包含抗體的Vh和\，結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域存在于單個多肽鏈上。Fv多肽在Vh和\結(jié)構(gòu)域之間通常還包含一個多肽接頭，它使scFv能形成抗原結(jié)合所需的結(jié)構(gòu)。關(guān)于scFv的綜述見Pluclcthun，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,卷 113, Rosenburg 禾口 Moore 編 Springer-Verlag, New York, pp.269-315(1994)。術(shù)語“二價抗體”是指具有兩個抗原結(jié)合位點的小分子抗體片段，這些片段在一條多肽鏈(Vh-Vl)上含有相連的一個重鏈可變區(qū)(Vh)和一個輕鏈可變區(qū)(VL)。利用一種太短以至于同一條鏈上的兩個結(jié)構(gòu)域無法配對的接頭，可以允許這些結(jié)構(gòu)域與另一條鏈上的互補結(jié)構(gòu)域配對，并形成兩個抗原結(jié)合位點。二價抗體的詳細說明參見，如EP 404,097 ；WO 93/11161 ；以及 Hollinger 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :6444-6448 (1993)。本申請全文中用到的“線性抗體”，是指在Zapata等，Protein Eng. 8 (10) 1057-1062(1995)中描述的抗體。簡言之，這些抗體包含一對串聯(lián)的Fd片段 (Vh-ChI-Vh-ChI)，其形成一對抗原結(jié)合區(qū)。線性抗體可以具有雙特異性或單特異性。術(shù)語“表位”是指蛋白抗原上與(單克隆或多克隆)抗體結(jié)合的位點?！凹觿┛贵w”是指可以作為BvS或EG-VEGF激動劑并因此具有天然序列BvS或 EG-VEGF的一或多種生物學特性的抗體。術(shù)語“Bv8免疫粘附素”和“EG-VEGF免疫粘附素”可分別與術(shù)語“Bv8_免疫嵌合體”和“EG-VEGF-免疫嵌合體”互換使用，它們都是指將BvS或EG-VEGF分子(天然或變體)的至少一部分與免疫球蛋白序列組合形成的嵌合分子。免疫球蛋白序列優(yōu)選，但并非必需是，免疫球蛋白恒定區(qū)。免疫粘附素可以具有人抗體的多種有價值的化學或生物學特性。由于可以將具有所需特異性的人蛋白序列與適當?shù)娜嗣庖咔虻鞍足q鏈區(qū)和恒定區(qū)(Fe) 序列相連來構(gòu)建免疫粘附素，因此可以用完整的人組分獲得所需的結(jié)合特異性。這樣的免疫粘附素對患者的免疫原性最小，長期或反復使用的安全性較好。已報道可用于治療的同型多體免疫粘附素包括⑶4-IgG免疫粘附素，它可以使 HIV與細胞表面的CD4結(jié)合。在I期臨床試驗中，將CD4-IgG施用于即將臨產(chǎn)的孕婦，所得的數(shù)據(jù)提示，這種免疫粘附素可以有效防止HIV的母嬰傳播(Ashkenazi等，Intern. Rev. Immunol. 10 :219-227(1993))。還有人開發(fā)了與腫瘤壞死因子(TNF)結(jié)合的免疫粘附素。 TNF是一種促炎(proinflammatory)細胞因子，有證據(jù)表明它是敗血性休克的主要介質(zhì)。基于小鼠敗血性休克模型的試驗表明，TNF受體免疫粘附素有望作為臨床治療敗血性休克的藥物(Ashkenazi，Α.等(1991)PNAS USASE 10535-10539)。ENBREL (etanercept) 也是一種免疫粘附素，它包含與IgG Fc區(qū)融合的TNF受體，美國食品和藥品管理局(FDA) 于1998年11月2日批準將它用于治療類風濕性關(guān)節(jié)炎。2000年6月6日，經(jīng)FDA批準，ENBREL 在治療類風濕性關(guān)節(jié)炎方面的應用進一步擴展。有關(guān)TNF阻斷藥(包括 ENBREL )的最新信息，可參見 Lovell 等，N. Engl. J. Med. 342 :763-169 (2000)，以及第 810-811 頁的相關(guān)評論；Weinblatt 等，N. Engl. J. Med. 340 :253-259(1999)；綜述見 Maini 禾口 Taylor，Annu. Rev. Med. 51 :207-229(2000.當免疫粘附素結(jié)構(gòu)的雙臂具有不同特異性時，通過與雙特異性抗體類比，將這種免疫粘附素稱為“雙特異性免疫粘附素”。Dietsch等，J. Immunol.. Methods 162 123(1993)描述了一種這樣的雙特異性免疫粘附素，它組合了粘附分子E-選擇素和P-選擇素的胞外區(qū)，這兩種選擇素在自然狀態(tài)下是在不同類型的細胞中表達。結(jié)合研究表明，如此形成的雙特異性免疫球蛋白融合蛋白與衍生出它的單特異性免疫粘附素相比，與骨髓細胞系的結(jié)合能力增強了。術(shù)語“異型粘附素”與“嵌合異型多體粘附素”可以互換使用，是指嵌合分子(氨基酸序列)的復合物，其中每一嵌合分子將每一異型多體受體單體的生物活性部分(如胞外區(qū))與一種多聚體化結(jié)構(gòu)域組合在一起。“多聚體化結(jié)構(gòu)域(multimerization domain)” 促進了該異型多體復合物內(nèi)部的嵌合分子之間穩(wěn)定的相互作用。多聚體化結(jié)構(gòu)域可以借助以下結(jié)構(gòu)發(fā)生相互作用免疫球蛋白序列，亮氨酸拉鏈，疏水區(qū)，親水區(qū)，或者形成嵌合異型多體的嵌合分子之間的分子間二硫鍵的游離巰基。多聚體化結(jié)構(gòu)域可包含免疫球蛋白恒定區(qū)。經(jīng)過改造，多聚體化結(jié)構(gòu)域還可以使其空間相互作用不僅有利于穩(wěn)定的相互作用，而且有利于在由單體混合物形成的同型二聚體上形成異型二聚體?！巴黄?!Protuberances) ”是將第一種多肽的界面上的氨基酸小側(cè)鏈替換為較大側(cè)鏈(如酪氨酸或色氨酸)而形成的。備選地，可以在第二種多肽上，通過用較小的氨基酸側(cè)鏈(如丙氨酸或蘇氨酸)取代較大側(cè)鏈，而形成與所述突起具有相同或相似大小的互補型“空穴”。所述免疫球蛋白序列優(yōu)選，但并非必需是，免疫球蛋白恒定區(qū)。本發(fā)明嵌合體中的免疫球蛋白組分優(yōu)選來自IgG，，IgG2， IgG3 或 IgG4 亞類，IgA, IgE, IgD 或 IgM，但優(yōu)選 IgG，或 IgG3。本文中“治療”是指獲得有益的或所需的臨床后果的方法。為了本發(fā)明的目的，有益的或所需的臨床后果包括，但不限于，癥狀緩解，疾病的程度減輕，疾病狀態(tài)穩(wěn)定(即，不惡化)，疾病進展延遲或減慢，疾病狀態(tài)改善或減輕，以及消退(部分或全部)，無論是可以檢測到的還是不能檢測到的?！爸委煛边€可以指與不接受治療所預期的存活相比，存活延長。 “治療”是為了阻止疾病進展或改變疾病的病理學而實施的介入。因此，“治療”既指治療性措施也指預防性措施。需要治療的個體包括那些已經(jīng)患有疾病或者希望預防患病的個體。具體地，治療可直接阻止，減緩或降低細胞變性或損傷的病理學，如癌癥治療中腫瘤細胞的病理學，或者可以使細胞對其它治療劑的治療更敏感?！伴L期(Chronic) ”給藥是指將試劑以連續(xù)方式而非短期(acute)方式給藥，使得能將最初的治療效應(活性)維持更長的時間?！伴g斷antermittent)”給藥是指一種治療，它不是沒有中斷地連續(xù)進行，本質(zhì)上是一種循環(huán)。需要治療的“哺乳動物”是指哺乳類任何動物，包括人、其它高等靈長類，家養(yǎng)動物、農(nóng)用動物，和動物園、運動項目用的動物或?qū)櫸?，如犬、貓、牛、馬、綿羊、豬、山羊、兔等。優(yōu)選哺乳動物是人。本文中“腫瘤”是指所有瘤細胞(neoplastic cell)生長和增殖(無論惡性或良性)，和所有前癌性(pre-cancerous)和癌性(cancerous)細胞和組織。術(shù)語“癌”和“癌性的”是指或描述哺乳動物中通常以細胞生長失控為特點的病理狀態(tài)。癌的實例包括但不限于癌，淋巴瘤，母細胞瘤，肉瘤和白血病。所述癌癥的更具體實例包括鱗狀細胞癌，小細胞肺癌，非小細胞肺癌，肺腺癌，肺鱗狀細胞癌，腹膜的癌，肝細胞癌，胃腸癌，胰腺癌，神經(jīng)母細胞瘤，宮頸癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，肝細胞瘤，乳腺癌，大腸癌，結(jié)腸直腸癌，子宮內(nèi)膜癌或子宮癌，唾液腺癌，腎癌，肝癌，前列腺癌，外陰癌，甲狀腺癌和各種類型的頭和頸癌?！把杭膊　敝柑卣髟谟谘毎惓Ｔ錾?或分化的疾病，其可導致血細胞發(fā)育不良性改變以及血液學惡性疾病。許多血液疾病可分類為白血病，骨髓增生性疾病(MPD)，骨髓發(fā)育不良性疾病，淋巴組織增生性疾病，和淋巴組織發(fā)育不良性疾病。這些疾病中許多可出現(xiàn)在成人以及兒童中。血液疾病的實例包括但不限于，急性髓性白血病(AML)，慢性髓性白血病(CML)，急性淋巴母細胞白血病(ALL)，多發(fā)性骨髓瘤，T-細胞淋巴瘤，淋巴組織發(fā)育不良性白血病，真性紅血球增多癥(PV)，原發(fā)性血小板增多癥(ET)，和骨髓外化生(骨髓纖維化)。術(shù)語"嗜中性粒細胞減少癥"指特征在于循環(huán)嗜中性粒細胞數(shù)目異常低下或減少的疾病或病癥。嗜中性粒細胞減少癥可以是疾病，遺傳疾病，藥物，毒素，放射和許多治病性治療諸如高劑量化療和常規(guī)腫瘤治療的結(jié)果。與嗜中性粒細胞減少癥相關(guān)的疾病或病癥包括但不限于，血液疾病，感染性疾病包括結(jié)核，傷寒，肝炎，敗血癥，急性細菌性疾病，重癥分支桿菌或真菌疾病，以及單核細胞增多癥，給藥骨髓毒性和免疫抑制劑包括放射，免疫抑制性藥物和皮質(zhì)類固醇，細胞毒化療或放療，浸潤性血液疾病(infiltrative and hematological disorder)包括白血病，骨髓瘤，何杰金氏病及淋巴瘤，粒細胞缺乏癥與再生障礙性貧血，組織細胞增多癥和結(jié)節(jié)病，手術(shù)和外傷包括燒傷，脾切除和麻醉，酒精性肝硬化，衰老，抗驚厥藥物，尿血，糖尿病，維生素和礦物質(zhì)缺乏，以及營養(yǎng)不良?；加惺戎行粤＜毎麥p少癥的患者很可能患感染和疾病，這是由于血液中的循環(huán)嗜中性粒細胞數(shù)目減少損害了患者抗擊入侵微生物的能力。術(shù)語"免疫缺陷疾病"指特征在于免疫反應降低或缺失的疾病或病癥。B細胞， T細胞，吞噬細胞，或補體可以有缺陷。所述免疫缺陷疾病可為原發(fā)或繼發(fā)的。白細胞減少癥，包括淋巴細胞減少癥，嗜中性粒細胞減少癥，單核細胞減少癥，以及粒細胞減少癥，可以與原發(fā)或繼發(fā)性免疫缺陷疾病相關(guān)。原發(fā)性免疫缺陷疾病的實例包括但不限于，B-細胞缺陷，包括無Y球蛋白血癥和伴隨高-IgM的免疫球蛋白缺陷(Ig)，T細胞缺陷包括 DiGeorge異常，慢性粘膜皮膚念珠菌病，缺陷伴有Ig，核苷磷酸化酶(phophorlyase)，和特發(fā)性CD4淋巴細胞減少癥的聯(lián)合免疫，和聯(lián)合的T和B細胞缺陷，包括重癥聯(lián)合免疫缺陷， Wiskott-Aldrich綜合癥，和X-連鎖的淋巴細胞增生性綜合癥。繼發(fā)性免疫缺陷疾病的實例包括，但不限于與感染性疾病相關(guān)的疾病，包括人獲得性免疫缺陷病毒(HIV)，肝炎，流感，結(jié)核，傷寒，敗血癥，巨細胞病毒，急性細菌性疾病，重癥分支桿菌或真菌疾病，先天性風疹，感染性單核細胞增多癥和病毒性皮疹(viral exanthm)，給藥骨髓毒性和免疫抑制劑包括放射，免疫抑制性藥物和皮質(zhì)類固醇，細胞毒化療或放療，浸潤性血液疾病包括白血病，骨髓瘤，何杰金氏病及淋巴瘤，粒細胞缺乏癥與再生障礙性貧血，組織細胞增多癥和結(jié)節(jié)病，手術(shù)和外傷包括燒傷，脾切除和麻醉，酒精性肝硬化，衰老，抗驚厥藥物，移植物抗宿主疾病，尿血，糖尿病，維生素和礦物質(zhì)缺乏，以及營養(yǎng)不良。術(shù)語“自身免疫性疾病“指由對特異性自身抗原的持續(xù)獲得性免疫反應介導的疾病。自身免疫病可根據(jù)與所述疾病相關(guān)的超敏反應的類型而分類。類型I反應由IgE介導，其誘導肥大細胞的活化。類型II和III由IgG介導，其可活化補體介導的或吞噬效應物機制。類型II反應針對細胞表面或基質(zhì)相關(guān)抗原，其導致組織破壞。類型III反應針對可溶性抗原，并且組織破壞是由免疫復合物激發(fā)的下游反應造成的。類型IV反應是T淋巴細胞介導的，并可分為兩種亞類型。第一個亞類中，組織破壞由炎性T細胞(THl細胞)導致，主要由巨噬細胞介導。第二個亞類中，組織損傷直接由細胞毒T細胞導致。自身免疫病的實例包括，但不限于，移植物抗宿主疾病，炎性腸病包括克隆氏病和結(jié)腸炎，格林巴利綜合征(Guillain-Barre' syndrome)，狼瘡，多發(fā)性硬化，重癥肌無力，視神經(jīng)炎，銀屑病，類風濕性關(guān)節(jié)炎，Graves病，自身免疫性肝炎，I型糖尿病，再生障礙性貧血，間質(zhì)性膀胱炎，硬皮病，vulvodynia，神經(jīng)性肌緊張(neuromyotonia)和白癲風(vitiligo)。疾病的“病理學”包括損害患者健康狀況(well-being)的所有現(xiàn)象。對于癌癥而言，包括但不限于，異?；蚴Э氐募毎L，轉(zhuǎn)移，干擾鄰近細胞的正常功能，釋放異常水平的細胞因子或其它分泌產(chǎn)物，抑制或加重炎癥或免疫應答，等等。與一或多種其它治療劑“聯(lián)合”給藥包括同時給藥和以任何順序連貫給藥。本文所用“載體”包括在所用劑量和濃度下對所暴露的細胞或哺乳動物沒有毒性的可藥用載體、賦形劑、或穩(wěn)定劑。生理可接受載體常常是含水的PH緩沖的溶液。生理可接受載體的實例包括緩沖劑如磷酸鹽、檸檬酸鹽、和其它有機酸；抗氧化劑包括抗壞血酸；低分子量(小于10個殘基)多肽；蛋白，如血清白蛋白、明膠、或免疫球蛋白；親水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或賴氨酸；單糖，二糖，和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合劑如EDTA ；糖醇如甘露醇或山梨醇；成鹽反離子如鈉；和/或非離子表面活性劑如TWEEN 、聚乙二醇(PEG)和PLUR0NICS ?！爸|(zhì)體”是由能向哺乳動物有效運送藥物(如BvS多肽或其抗體)的各類脂質(zhì)、磷脂和/或表面活性劑組成的小分子囊泡。脂質(zhì)體的組分通常排列為雙層形式，與生物膜的脂質(zhì)排列相似。本文中“小分子”是指分子量小于約500道爾頓。本文中術(shù)語“血管內(nèi)皮生長因子”，“ VEGF，，，“ VEGF多肽，，和“ VEGF蛋白，，包括天然序列VEGF和VEGF變體(見下文詳述)。VEGF多肽可以從各種來源分離，如從人組織類型或從其它來源分離，或通過重組和/或合成方法制備。“天然序列VEGF”包括具有與自然界衍生的VEGF相同的氨基酸序列的多肽。所述天然序列VEGF可以從自然界分離或者通過重組和/或合成手段制備。術(shù)語“天然序列 VEGF”具體包括VEGF的天然截短形式或分泌形式(如，胞外區(qū)序列)，天然變體形式(如，旁路剪接形式)以及天然衍生的等位變體。在本發(fā)明一個實施方案中，天然序列VEGF是分別由121，145，165，189和206個氨基酸殘基組成的五種已知同種型之一，對這五種同種型的描述見美國專利 5，332，671 和 5，240，848 ；W098/10071 ；Leung 等，1989，Science 246 1306-1309；Keck 等，1989，Science 246 :1309_1312。"VEGF變體多肽”是指如下定義的活性VEGF多肽，其與天然序列VEGF的氨基酸序列有至少約80%，優(yōu)選至少約85%，更優(yōu)選至少約90%，還更優(yōu)選至少約95%，最優(yōu)選至少約98%的氨基酸序列同一性。這樣的VEGF變體多肽包括，例如，在天然序列的N-和/ 或C-末端、以及一或多個內(nèi)部結(jié)構(gòu)域中添加或刪除一或多個氨基酸殘基所形成的VEGF多肽。本發(fā)明的一個實施方案中，VEGF是天然VEGF的受體特異性變體，如例如PCT公開WO 97/08313和WO 00/63380以及美國專利6，020，473中所述。VEGF的序列同一性(無論氨基酸或核酸)采用與Bv8或EG-VEGF相同的方法來確定。類似地，對BvS或EG-VEGF的激動劑和拮抗劑(包括但不限于抗體)的定義也適用于 VEGF激動劑和拮抗劑。實施本發(fā)明的方法本發(fā)明基于造血干細胞，系定向的血液祖細胞，和淋巴細胞中Bv8和EG-VEGF的新表達與活性。具體地，如本文所詳述的，Bv8, EG-VEGF及其受體在骨髓HSC，外周血白細胞 (PBL)以及許多血液惡性細胞系中表達。體外和體內(nèi)實驗都顯示，BvS和EG-VEGF能夠促進骨髓單個核細胞以及脾來源的定向型單個核祖細胞的集落形成，增加白細胞群體，以及促進B淋巴細胞和T淋巴細胞的活化。因此，BvS核酸和多肽，EG-VEGF核酸和多肽，或其組合可用于多種實驗以及造血相關(guān)疾病，嗜中性粒細胞減少癥，免疫缺陷疾病和自身免疫病的診斷和治療。A.造血造血指增殖和分化過程，其中不同類型的血細胞自具有增殖和分化能力的多能干細胞發(fā)育而來。血液中大多數(shù)血細胞壽命較短，由此在一生中可被經(jīng)常替換。循環(huán)成熟血細胞的水平可應答于不同環(huán)境應激而迅速改變，所述環(huán)境應激的范圍包括失血，感染等。胎兒約20周后，體內(nèi)的主要造血位點是骨髓(BM)，其為由異源細胞群體組成的組織，包括造血干細胞(HSC)，內(nèi)皮細胞(EC)，和其它基質(zhì)細胞以及參與骨的動態(tài)平衡的細胞包括破軟骨細胞和破骨細胞。Gerber 和 Ferrara，2003，J. Mol. Med. ,81 :20-31。正常造血基于多能干細胞的雙重功能。大量自我更新保持了未分化干細胞的群體，而分化導致各種類型成熟血細胞的形成，其可分類為三種主要的血細胞系之一淋巴細胞，骨髓細胞和紅細胞系。淋巴細胞系包括B細胞和T細胞，其在抗體生成和抗原檢測中作為整體起作用，由此作為細胞和體液免疫系統(tǒng)而發(fā)揮功能。骨髓細胞系包括單核細胞(巨噬細胞)，粒細胞(包括嗜中性粒細胞)和巨核細胞，并監(jiān)測血流中的抗原，從血流中清除抗原，抗擊感染劑，以及產(chǎn)生參與血液凝結(jié)的血小板。紅細胞系包含血紅細胞，其在整個機體內(nèi)攜氧。造血干細胞以及注定要成為嗜中性粒細胞，紅細胞，血小板等的定向型祖細胞，可通過具體祖細胞“標記”抗原的存在而與大多數(shù)其它細胞區(qū)分，所述祖細胞“標記”抗原存在于這些干/祖細胞的表面。能夠識別這種具體標記抗原的一組抗體被稱為“分化簇34” 或“⑶34”。術(shù)語“⑶34+”用于描述具有可被⑶34抗體組識別的具體細胞表面抗原的細胞。干細胞是CD34+。然而大部分CD34+骨髓細胞是B淋巴祖細胞和髓樣祖細胞。1.造血因子早期和分化的造血細胞的發(fā)育由BM微環(huán)境中的周圍細胞以及各種非造血器官 (例如肝，腎)和正常T淋巴細胞分泌的多種造血生長因子，細胞因子，以及化學因子調(diào)節(jié)。所有這些因子共同調(diào)節(jié)BM中存在的造血細胞的生物功能以及命運。Janowska-Wieczorek 等，2001，Stem Cells, 19 :99_07。已知至少四種集落刺激因子(CSF)在嗜中性粒細胞的生成的調(diào)控中協(xié)同地起作用。這四種因子，稱為GM-CSF(粒細胞和巨噬細胞)，IL-3(白介素-3)，G-CSF(粒細胞)，以及M-CSF (巨噬細胞)，已知為CSF-1，由巨噬細胞，T細胞，內(nèi)皮細胞以及其它類型的細胞合成。祖細胞應答CSF的能力部分通過細胞表面上具體CSF受體的存在而確定，部分通過所述具體CSF的濃度確定。還存在間接刺激的一些指示，其可經(jīng)由輔助細胞或通過與其它專性生長因子諸如c-kit配體，IL-6(白介素-6)7IL-11(白介素-11)，IL_4(白介素-4) dIL-l(白介素-1)的協(xié)同作用。2.嗜中性粒細胞人免疫系統(tǒng)的主要感染和疾病抗擊細胞是血白細胞(白細胞)，其來自骨髓細胞系，并在血液系統(tǒng)中循環(huán)。在許多類型的白細胞中，中性粒細胞(含有形狀奇特的細胞核以及高度顆?；募毎麧{的粒細胞亞型)，是最常見的細胞類型并占整個人體內(nèi)血白細胞的約三分之二。嗜中性粒細胞是可運動的，負責感染產(chǎn)生的趨化刺激，并能夠移動到被感染的組織中殺死入侵的微生物。所述殺死行為有賴于嗜中性粒細胞吞噬微生物以及釋放氧自由基和殺微生物酶的能力。Baggiolini, 1984, Experientia,40 :906_909。嗜中性粒細胞從干細胞分化，其中經(jīng)過一系列中間前體細胞，其可通過它們的顯微形態(tài)外觀來區(qū)分，包括諸如細胞核大小，細胞核形狀，細胞大小，細胞核/胞漿比，顆粒的存在/缺失，以及染色性質(zhì)等。最初，不能在體外直接測定的多能干細胞產(chǎn)生骨髓“祖細胞”，所述祖細胞產(chǎn)生所有骨髓細胞系的前體。第一個髓樣祖細胞稱為CFU-GEMM，即“集落形成單位-粒細胞，紅細胞，巨噬細胞和巨核細胞”。CFU-GEMM祖細胞反過來會產(chǎn)生CFU-GM 祖細胞，其也已知為“集落形成單位-粒細胞和巨噬細胞”。在所有這些描述性術(shù)語中，“集落”指能夠在克隆生長體外實驗中，在14天中產(chǎn)生50個細胞以上的細胞，所述實驗的條件是本發(fā)明實施例5所述的條件。這些細胞將分裂至少6次。CFU-GM是定向型祖細胞；其僅僅定向分化為粒細胞以及巨噬細胞。它不能分化為其它類型的細胞也不能分化為早期祖細胞。CFU-GM祖細胞可分化成原粒細胞。從CFU-GEMM 分化成原粒細胞所需的時間據(jù)信為約1-4天。原粒細胞是可被稱為嗜中性粒細胞“前體“的一系列細胞中的第一種，這是由于所述細胞一旦被允許充分發(fā)育(分化)可僅僅形成嗜中性粒細胞。嗜中性粒細胞僅僅能夠經(jīng)歷少于6次細胞分裂，并因此不如前所述在體外集落實驗中形成集落。一旦分化進展到原粒細胞階段，原粒細胞最終分化成早幼粒細胞，其經(jīng)歷約4-6 天的時程分化成中幼粒細胞。在另外的5天左右之內(nèi)，中幼粒細胞分化成晚幼粒細胞，后者分化為條帶型嗜中性粒細胞。這些條帶型嗜中性粒細胞最終分化成成熟節(jié)段型嗜中性粒細胞，其半壽期大約0.3-2天。術(shù)語“祖細胞”指干細胞，以及可形成集落的細胞?！扒绑w”指原粒細胞，早幼粒細胞和中幼粒細胞，以及在一些情況下，指晚幼粒細胞和條帶型嗜中性粒
21細胞。在該漸進性形態(tài)分化過程中，前體細胞表面抗原中的改變可被觀察到。例如，干細胞，CFU-GEMM和CFU-GM為CD;34+。在CFU-GM階段以外分化的造血細胞不再是CD;34+。對于細胞表面抗原CD33和CD45RA也觀察到類似的表達進展。所有在早幼粒細胞前體細胞之后的嗜中性前體細胞的特征在于⑶洶-，CD33+，CD38+，CD13+，CD45RA-，和CD15+。更多成熟細胞的特征在于 CDll+和 CD16+(Terstappen et. al.，1990，Leukemia，4 :657)。但是應理解，細胞表面抗原表達中的所述轉(zhuǎn)變是逐漸的，而不是突然的，其中具體前體細胞類型的一些細胞可以是陽性的，相同類型的其它細胞的具體細胞表面抗原可為陰性的。此外，具體細胞類型的具體細胞表面抗原是陽性或陰性的測定部分有賴于用于進行該測定的具體方法。通過細胞表面抗原表達來表征細胞分化可通過表征細胞表達的其它方法諸如細胞形態(tài)學來證實。“嗜中性粒細胞減少癥”是特征在于異常低數(shù)目的循環(huán)嗜中性粒細胞的疾病。患有嗜中性粒細胞減少癥的患者很可能患感染和疾病，這是由于在血液中循環(huán)的嗜中性粒細胞的數(shù)目減少從實質(zhì)上損害了所述患者抗擊任何入侵生物體的能力。嗜中性粒細胞減少癥本身是疾病、遺傳疾病、藥物、毒素和放射以及許多致病性治療的結(jié)果，所述致病性治療諸如高劑量化療(HDC)和常規(guī)腫瘤治療。例如，盡管許多癌癥被發(fā)現(xiàn)對于非常高劑量的放療或抗腫瘤(抗癌)藥物敏感，如此大量的HDC沒有被廣泛使用，因為它不僅殺死癌性細胞還經(jīng)常破壞造血系統(tǒng)細胞，其負責產(chǎn)生保持有效免疫系統(tǒng)所需的多種(army of)中性粒細胞。完全破壞嗜中性粒細胞祖細胞與前體細胞消除了所述患者產(chǎn)生成熟中性粒細胞的短期能力，由此嚴重破壞了所述患者對抗感染的能力。所述患者變成“免疫受損的”，并易患機會性感染。所述疾病最終導致發(fā)病和死亡。其它情況也會在存在對造血系統(tǒng)的嚴重侵害時出現(xiàn)，導致中性粒細胞及其前體實質(zhì)上減少。3.血液疾病血液疾病的特征在于血細胞的異常增殖和分化，其可導致血細胞的發(fā)育不良性改變以及血液惡性疾病。許多血液疾病的進展都是克隆過程，其中一種細胞類型占主要。一些情況下，其它細胞類型也可異常發(fā)育。此外，具體疾病的異常細胞代表未分化的血液祖細胞，無論多能干細胞還是系定向型前體細胞的克隆衍生物。Gerbei^P i^errara，2003，J； Mol. IVed. ,81 :20-31 ；Raskind et al.，199S，LeAce7nia，12 :108_116。許多血液疾病可分類為白血病，骨髓增生性疾病(myeloproliferative disorder) (MPD)和骨髓發(fā)育不良性疾病(myelodysplastic disorder)。這些疾病中許多可出現(xiàn)在成人以及兒童中。急性髓性白血病(AML)是最為常見的成人急性白血病類型。多種獲得性遺傳疾病以及免疫缺陷狀態(tài)與AML的危險性增加相關(guān)。這些包括可導致隨機染色體斷裂的DNA穩(wěn)定性有缺陷的疾病,諸如Bloom' s綜合征，范可尼貧血(Fanconi’ s anemia), Li-Fraumeni 家族(kindred)，共濟失調(diào)_毛細血管擴張(ataxia-telangiectasia)，和X-連鎖的無Y 免疫球蛋白血癥。阿糖胞苷(Ara-C)已經(jīng)被單獨使用或與蒽環(huán)類抗生素或柔紅霉素聯(lián)用以治療AML。急性淋巴母細胞白血病(ALL)是具有不同亞類顯示的獨特臨床特征的異源疾病。復發(fā)性細胞基因異常已經(jīng)在ALL中證實。最常見的細胞基因異常涉及染色9和22的轉(zhuǎn)位。產(chǎn)生的!Philadelphia染色體表示患者預后較差。長春新堿，蒽環(huán)類抗生素，和潑尼松可用于治療ALL。骨髓增生性疾病(MPD)的特征在于造血細胞的異常增生。在每種具體的MPD中，一種具體細胞類型為主要的，但有證據(jù)表明一些和所有其它BM細胞類型也在較小程度上異常增生。例如，慢性髓性白血病(CML)是多能干細胞的克隆性MPD。CML的特征在于存在大量在血液中循環(huán)的異常成熟粒細胞，這是由于涉及染色體9和22轉(zhuǎn)位的特異性染色體異常產(chǎn)生了 !Philadelphia染色體而造成的。電離輻射與CML的進展相關(guān)。羥基脲，干擾素 (INF)和Ara-C已經(jīng)用于治療CML患者。其它常見MPD包括，但不限于，真性紅細胞增多癥 (PV ；紅細胞過度增生)，原發(fā)性血小板減少癥(ET ；血小板過度增生)和骨髓外化生(也稱為骨髓纖維化)。骨髓發(fā)育不良綜合征(MDQ是一組異源克隆性造血干細胞疾病，由于在一或多種造血細胞系中存在發(fā)育不良性改變，包括骨髓細胞，紅細胞和巨核細胞系中的發(fā)育不良改變。這些改變導致三種細胞系中一或多個細胞系的細胞減少?；加蠱DS的患者通常出現(xiàn)與貧血，嗜中性粒細胞減少癥(感染)，或血小板減少癥(出血)相關(guān)的并發(fā)癥。通常約 10% -約70%的MDS患者出現(xiàn)急性白血病。B. Bv8 和 EG-VEGFBv8是小分子蛋白，最初分離自青蛙Bombina variegata的皮膚分泌物(Mollay et al.，1999，Eur. J. Pharmacol.，374 :189-196)。Bv8 屬于以下肽的結(jié)構(gòu)關(guān)聯(lián)種類消化性酶輔脂肪酶，Xenopus 組織者(head-organizer)，Dickkopf (Glinka et al.，1998， Nature，391 :357-362)，蛇毒蛋白 A (VPRA) (Joubert and Strydom, 1980, Hopper-Seyler' s Ζ·Physiol. Chez.，361 :1787-1794)或 HIT-1(Schweitz et al. 1999，F(xiàn)ERS ' L. ,461 183-188)，Dendroaspis polylepis polyl印is蛇毒的非毒性組分，和新近鑒定的內(nèi)分泌腺來源的血管內(nèi)皮生長因子(EG-VEGF) (LeCouter et al.，Nature,412 :877-884(2001)) 獨特的結(jié)構(gòu)基序是輔脂肪酶-折疊，其中10個半胱氨酸殘基形成保守區(qū)域內(nèi)的5個二硫橋。EG-VEGF (與VPRA有80 %相同)及VPRA與BvS肽的關(guān)系最緊密，分別具有 83%和79%同一性。最近鑒定了 BvS的小鼠和人直向同源物(也已知為激動素原蛋白 (prokineticin) -2 (PK2)) (Li et al.，2001，Mol. Pharm. ,59 :692-698)，并報道了這些蛋白的多種活性，包括對神經(jīng)元存活，胃腸平滑肌收縮以及生理周期運動節(jié)律的影響。Li et al.,2001 ；Melchiorri et al. ,2001, Eur.J. Neurosci. 13 :1694-1702 ；Cheng et al., 2002，Nature 417 :405_410。EG-VEGF和BvS都被鑒定為對特定組織的內(nèi)皮細胞具有選擇活性的血管生成因子。內(nèi)皮細胞的各種結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)，以及來自多種體內(nèi)和離體系統(tǒng)的證據(jù)，提示局部的組織特異性調(diào)節(jié)物的存在，其調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞基因型以及生長。人(h)EG-VEGF mRNA的表達主要限制于類固醇生成腺體卵巢，睪丸，腎上腺，和胎盤。EG-VEGF促進培養(yǎng)的腎上腺毛細血管內(nèi)皮細胞的增殖，遷移，存活和排列。其在遞送到卵巢的情況下誘導大量血管生成，而對其它組織沒有所述影響。LeCouter et al.，2001，Nature，412 :877_884。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Bv8主要在睪丸中表達，并主要限于初級精母細胞(LeCouter et al., 2003，PNAS 5 =2685-2690.)。和EG-VEGF —樣，Bv8能夠誘導腎上腺毛細血管內(nèi)皮細胞的增殖，存活，和遷移。BvS基因表達由低氧應激誘導。將BvS或EG-VEGF經(jīng)由腺病毒載體遞送到小鼠睪丸導致有效的血管生成反應。此外，Bv8/EG-VEGF的兩種G蛋白偶聯(lián)的受體
23Bv8/EG-VEGF受體-1和Bv8/EG_VEGF受體-2的表達局限于血管內(nèi)皮細胞(LeCouter et al.，2003, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100 :2685-2690 ；Lin etal.，2002，J. Biol. Chem. 277 19276-19280 ；Masuda et al.，2002，Biochem. Biophys. Res. Commun. 293 :396-402)。睪丸顯示相對高的內(nèi)皮細胞更新率。因此，Bv8和EG-VEGF以及其它因子諸如VEGF被認為在保持睪丸血管完整性和調(diào)節(jié)睪丸血管增生中是重要的。
C. Bv8和EG-VEGF變體的鑒定除了本文所述全長天然序列BvS和EG-VEGF多肽，還涉及可在本發(fā)明中鑒定，制備和應用的Bv8和EG-VEGF變體。Bv8和EG-VEGF變體可通過將適合的核苷酸變化引入Bv8 或EG-VEGF DNA，和/或通過合成所需BvS或EG-VEGF多肽來制備。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，氨基酸的變化可以改變BvS或EG-VEGF的翻譯后加工，例如改變糖基化位點的數(shù)目或位置。制備BvS和EG-VEGF變體的方法優(yōu)選與下文將詳細描述的制備天然序列BvS和EG-VEGF 的方法相同，但是用編碼所述變體的核酸取代編碼天然序列的核酸。編碼BvS或EG-VEGF的核酸分子用于本發(fā)明的方法中。編碼人BvS的兩種全長變體的cDNA示于圖1和2 (SEQ ID NO 1和2)，相應的推導氨基酸序列示于圖2和4 (SEQ ID N0:2和4)。編碼小鼠Bv8的cDNA示于圖5(SEQ ID NO :5)，其相應的推導氨基酸序列示于圖6 (SEQ ID NO :6)。編碼兩種全長天然EG-VEGF (SEQ ID NO :7和9)的cDNA以及相應的推導氨基酸序列(SEQ ID NO 6)可用于本發(fā)明的方法。本發(fā)明中使用的多核苷酸可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標準技術(shù)，如雜交篩選和PCR方法來獲得。編碼BvS或EG-VEGF的氨基酸序列的任何核苷酸序列都可以用于制備能分別指導 BvS或EG-VEGF表達的重組分子。本發(fā)明的方法還可以利用由BvS編碼序列與編碼異源蛋白的第二種序列形成的融合多核苷酸。為了從編碼完整Bv8或EG-VEGF cDNA的任何物種(species)克隆出全長同源 cDNA序列，或者克隆出家族成員或變體形式(如等位變體)，可以將從對應于本文所述cDNA 序列任何部分的片段制備的標記的DNA探針，用于篩選從據(jù)信能表達BvS或EG-VEGF的細胞或組織類型衍生的cDNA文庫。更具體地，可以用對應于編碼序列的5’或3’末端的寡核苷酸獲得更長的核苷酸序列。有可能必需篩選來自不同組織的多重cDNA文庫，以便獲得全長cDNA。進行cDNA 克隆時，常常難于鑒定編碼完整5’端編碼區(qū)的cDNA克隆，在這樣的事件中，可以使用 RACE (cDNA末端快速擴增)技術(shù)。RACE是業(yè)已證實的一種以PCR為基礎(chǔ)、擴增不完整cDNA 的5’端的策略。從人的胎盤合成的、含有唯一錨著序列的5’ -RACE-Ready RNA已有商品 (Clontech)。為了獲得cDNA的5，端，用所提供的錨著引物和3，引物對5，-RACE-ReadycDNA 進行PCR。然后用被錨著的引物和一種巢式3’引物按照廠家建議進行第二輪PCR。一旦獲得了全長cDNA序列，就可以將其翻譯成氨基酸序列，并檢查特定的標記(landmark)，如，以翻譯起始和終止位點為兩側(cè)的連續(xù)的開放閱讀框，潛在的信號序列，以及與本文所述BvS 和/或EG-VEGF序列的整體結(jié)構(gòu)同一性。備選地，可以使用下文所述的相應嚴格條件，用標記的探針篩選從目的生物衍生的基因組文庫?？梢愿鶕?jù)本文所述的BvS或EG-VEGF編碼序列，設(shè)計兩個簡并寡核苷酸引物庫，通過聚合酶鏈反應(PCR)分離出BvS或EG-VEGF編碼序列或同源序列。該反應的模板可以從，例如，人或非人細胞系，或者已知或懷疑表達BvS等位基因或EG-VEGF等位基因的組織制備的mRNA進行反轉(zhuǎn)錄(RT)而獲得?？梢詫CR產(chǎn)物亞克隆并測序，以確保所擴增的序列代表BvS或EG-VEGF的編碼序列。然后，用PCR片段經(jīng)各種方法分離全長cDNA克隆。例如，可以將所擴增的片段進行標記，并用于篩選噬菌體cDNA文庫。另一種方法是，用帶有標記的片段通過篩選基因組文庫來分離基因組克隆。PCR技術(shù)也可以用于分離全長cDNA序列。例如，可以按照標準方法從適當?shù)募毎麃碓椿蚪M織來源分離RNA?？梢杂锰禺愑跀U增片段5’最末端的寡核苷酸引物對所述RNA進行RT反應，從而引發(fā)第一鏈合成。然后，使所得RNA/DNA雜合體的尾部通過標準的末端轉(zhuǎn)移酶反應而帶上(tailed with)烏嘌呤，用RNAase H消化該雜合體，然后用poly-C引物引發(fā)第二鏈合成。如此一來，可以輕易分離出擴增片段上游的cDNA序列。也可以利用，例如PCR，分離出Bv8或EG-VEGF基因的突變體或等位基因變體的 cDNA克隆。在這種情況中，通過使oligo-dT寡核苷酸與從推定攜帶突變BvS等位基因，突變EG-VEGF等位基因或其組合的個體中已知或懷疑表達Bv8，EG-VEGF或其組合的組織分離得到的mRNA雜交來合成第一條cDNA鏈，并用逆轉(zhuǎn)錄酶延伸這條新鏈。然后用與正常基因的5’末端特異性雜交的寡核苷酸合成第二條cDNA鏈。再用這兩種引物將產(chǎn)物通過PCR 進行擴增，克隆到合適的載體中，用本領(lǐng)域已知的方法進行DNA序列分析。將突變BvS或 EG-VEGF等位基因的DNA序列與正常的BvS等位基因的DNA序列進行比較，確定使突變的 BvS或EG-VEGF基因產(chǎn)物的功能發(fā)生損失或改變的突變。另一種方法是，從懷疑或已知攜帶突變的BvS等位基因或突變的EG-VEGF等位基因的個體獲得DNA，用該DNA構(gòu)建基因組文庫；或者，從已知或懷疑表達突變的BvS等位基因或突變的EG-VEGF等位基因的組織獲得RNA，用該RNA構(gòu)建cDNA文庫。再將未受損的 (unimpaired)BvS基因或其任何合適的片段帶上標記，并用作探針，來鑒定所述文庫中相應的突變的BvS等位基因。然后將包含所述不同的BvS基因序列的克隆純化，按照本領(lǐng)域已知方法進行序列分析。另外，可以從懷疑或已知攜帶突變的BvS等位基因或突變的EG-VEGF等位基因的個體中已知或懷疑表達該突變的等位基因的組織分離出RNA，從該RNA合成cDNA，再用該 cDNA構(gòu)建表達文庫。在這種方法中，由推定的突變組織制備的基因產(chǎn)物得以表達，并可以按照標準的抗體篩選技術(shù)，用抗正常BvS或EG-VEGF基因產(chǎn)物的抗體進行篩選，如下所述。本文中，術(shù)語核酸，多核苷酸和核苷酸可以互換使用，它們指任何核酸，無論是脫氧核糖還是核糖核酸，也無論是由磷酸二酯鍵構(gòu)成還是由下述經(jīng)過修飾的鍵構(gòu)成，所述經(jīng)過修飾的鍵如磷酸三酯，氨基磷酸酯，硅氧烷，碳酸酯，羧甲基酯，氨基乙酸酯 (acetamidate)，氨基甲酸酯，硫醚，橋聯(lián)(bridged)氨基磷酸酯，橋聯(lián)亞甲基膦酸酯，橋聯(lián)氨基磷酸酯，橋聯(lián)氨基磷酸酯，橋聯(lián)亞甲基膦酸酯，硫代磷酸酯，甲基膦酸酯，二硫代磷酸酯，橋聯(lián)硫代磷酸酯或磺內(nèi)酯(sultone)鍵，或這些鍵的組合。術(shù)語核酸，多核苷酸和核苷酸具體包括由除了 5種生物學天然堿基(腺嘌呤，烏嘌呤，胸苷，胞嘧啶，和尿嘧啶)以外的其它堿基組成的核酸。例如，本發(fā)明的多核苷酸可以包含至少一個選自下組的經(jīng)修飾的堿基5-氟尿嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-氯尿嘧啶，5-碘尿嘧啶，次黃嘌呤，xantine,4-乙?；奏?，5-(羧基羥基甲基)尿嘧啶，5-羧基甲基氨基甲基-2-硫代尿苷，5-羧基甲基氨基甲基-尿嘧啶，二氫尿嘧啶，beta-D-半乳糖基queosine，次黃嘌呤核苷N6-異戊烯基腺嘌呤，1-甲基烏嘌呤，1-甲基次黃嘌呤核苷2，2- 二甲基烏嘌呤，2-甲基腺嘌呤，2-甲基烏嘌呤，3-甲基胞嘧啶，5-甲基胞嘧啶，N6-腺嘌呤，7-甲基烏嘌呤，5-甲基氨基甲基尿嘧啶，5-甲氧基氨基甲基-2-硫代尿嘧啶，beta-D-甘露糖基 queosine, 5N-甲氧基羧基甲基尿嘧啶，5-甲氧基尿嘧啶，2-甲基硫代_N6_異戊烯基腺嘌呤，尿嘧啶-5-氧乙酸(v)，wybutoxosine，假尿嘧啶，queosine，2_硫代胞嘧啶，5_甲基-2-硫代尿嘧啶，2-硫代尿嘧啶，4-硫代尿嘧啶，5-甲基尿嘧啶，尿嘧啶-5-氧乙酸甲基酯，尿嘧啶-5-氧乙酸(v)，5-甲基-2-硫代尿嘧啶，3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶，(acp3)w，和2，6_ 二氨基嘌呤。本發(fā)明所用的多核苷酸還可以包含至少一個修飾的糖組分，該糖組分選自阿拉伯糖，2-氟阿拉伯糖，木酮糖，和己糖。本發(fā)明的方法并不受多核苷酸來源的限定。所述多核苷酸可以來自人或非人哺乳動物，衍生自任何重組來源，通過體外合成或化學合成。所述核苷酸可以是DNA或RNA，可以是雙鏈，單鏈或部分雙鏈形式。本發(fā)明有用的核酸包括，例如但不限于，寡核苷酸如反義DNA和/或RNA ；核酶；用于基因治療的DNA ；DNA和/或RNA嵌合體；DNA的各種結(jié)構(gòu)形式，包括單鏈DNA，雙鏈DNA，超螺旋DNA和/或三螺旋DNA ；Z-DNA ；等等。核酸可以通過常用于大量制備核酸的任何常規(guī)手段來制備。例如，DNA和RNA可以用市售試劑和合成儀按照本領(lǐng)域已知的方法進行化學合成(參見，例如，Gait, 1985, Oligonucleotide Synthesis :A Practical Approach, IRL Press，牛津，英國)。RNA 可以例如諸如 SP65(Promega Corporation, Madison, WI)等質(zhì)粒通過體外轉(zhuǎn)錄而大量制備。由BvS或EG-VEGF核酸序列編碼的任何mRNA轉(zhuǎn)錄物都可以用于本發(fā)明的方法中，包括對mRNA前體進行旁路剪接或加工所得的mRNA轉(zhuǎn)錄物。在有些情況下，諸如當希望增加核酸酶的穩(wěn)定性時，優(yōu)選具有修飾的核苷酸之間連接鍵的核酸。具有修飾的核苷酸間鍵合的核酸也可以用本領(lǐng)域已知的試劑和方法合成。例如，合成含有以下核苷酸之間連接鍵的核酸的方法是本領(lǐng)域已知的，所述連接鍵是指膦酸硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，氨基磷酸甲氧基乙基氨基磷酸酯，甲乙縮醛(formacetal)，硫代甲乙縮醛(thioformacetal)，二異丙基甲硅烷基(diisopropylsilyl)，氨基乙酸酯，氨基甲酸酯，二亞甲基-硫醚(sulfide) (-CH2-S-CH2)，二亞甲基-亞砜(-CH2-S0_CH2)，二亞甲基-砜(-CH2-S02-CH2)，2，-0-烷基，和2’ -脫氧-2’ -氟硫代磷酸酯(參見，Uhlmarm 等，1990，Chem. Rev. 90 :543-584 ；Schneider 等，1990, Tetrahedron Lett. 31 :335 以及其中引用的參考文獻)。在本發(fā)明一些實施方案中，所用的核苷酸是α-端基異構(gòu)(anomeric)核苷酸。 α -端基異構(gòu)核苷酸與互補RNA形成特異性雙鏈雜合體，其中的鏈彼此平行，而不是形成通常的 β-單位(Gautier 等，1987，Nucl. Acids Res. 15 :6131-6641)。所述核苷酸是 2，_0_ 甲基核糖核苷酸 Gnoue 等，1987，Nucl. Acids Res. 15 :6131-6148)，或嵌合 RNA-DNA 類似物 (Inoue 等，1987，F(xiàn)EBS Lett. 215 :327-330)。所述核酸可以用本領(lǐng)域已知的任何適當方法進行純化。例如，可以通過反相或離子交換HPLC，大小排阻層析或凝膠電泳來純化核酸。當然，本領(lǐng)域技術(shù)人員應能認識到，純化方法部分地取決于需要純化的DNA的大小。BvS編碼序列，EG-VEGF編碼序列以及其組合的經(jīng)過分離或純化并具有至少10個核苷酸(即可雜交部分)的多核苷酸或其互補物，也可以用于本發(fā)明的方法中。在其它實施方案中，所述多核苷酸包含BvS編碼序列，EG-VEGF編碼序列以及其組合的至少25個(連續(xù))核苷酸，50個核苷酸，100個核苷酸，150個核苷酸，或200個核苷酸，或包含BvS編碼序列，EG-VEGF編碼序列以及其組合的全長。核酸可以是單鏈或雙鏈。此外，本發(fā)明涉及與上述編碼序列選擇性雜交的多核苷酸。在優(yōu)選的實施方案中，所述多核苷酸包含BvS編碼序列，EG-VEGF編碼序列以及其組合的至少10，25，50，100，150或200個核苷酸或其全長。編碼Bv8或EG-VEGF突變體，Bv8或EG-VEGF肽片段，Bv8或EG-VEGF截短形式，和 BvS或EG-VEGF融合蛋白的核苷酸序列也可以用于本發(fā)明的方法中。編碼融合蛋白的核苷酸包括，但不限于，全長BvS或EG-VEGF序列，BvS或EG-VEGF的截短形式，或者與不相關(guān)蛋白或肽融合的編碼BvS或EG-VEGF肽片段的核苷酸，例如，與Ig Fc區(qū)融合而增強所得融合蛋白(如BvS-Ig或EG-VEGF-Ig)在血流中的穩(wěn)定性和半壽期；或者酶，例如可以用作標志物的熒光蛋白或發(fā)光蛋白。此外，本發(fā)明方法中可以使用至少部分地通過一些形式的變革，如美國專利 5，605, 793和5，837，458中所述的基因改組和/或回歸(recursive)序列重組而產(chǎn)生的Bv8 或EG-VEGF多核苷酸變體。例如，可以利用這樣的技術(shù)，以一或多個Bv8和/或EG-VEGF編碼序列作為起始點，來產(chǎn)生編碼具有改變的功能和/或結(jié)構(gòu)特性的功能性和/或結(jié)構(gòu)性類似蛋白的新序列。與上述編碼BvS和/或EG-VEGF的多核苷酸序列高度相關(guān)的基因同系物也可以用于本發(fā)明。高度相關(guān)的基因同系物是編碼蛋白的多核苷酸，它們與天然BvS或EG-VEGF的氨基酸序列，例如圖2或圖4(SEQ ID NO 2和4)所示的人成熟BvS的氨基酸序列，以及成熟人EG-VEGF(SEQ ID NO :28)具有至少約60%的氨基酸序列同一性，優(yōu)選至少約65%，70%， 75%，80%，優(yōu)選以的增量從至少約85%遞增到至少約99%的氨基酸序列同一性。高度相關(guān)的同系物可以編碼與BvS和/或EG-VEGF具有相同功能活性的蛋白。本發(fā)明方法的有利之處還在于可以利用以下物質(zhì)(a)DNA載體，包含上述任一種 BvS或EG-VEGF編碼序列和/或其互補體(即反義序列)；(b) DNA表達載體，包含上述任一種BvS或EG-VEGF編碼序列、且該序列與指導其表達的調(diào)節(jié)元件可操作相連；(c)遺傳工程化宿主細胞，包含上述任一種BvS和/或EG-VEGF編碼序列或其組合，所述序列與指導其在宿主細胞中表達的調(diào)節(jié)元件可操作相連；和(d)遺傳工程化宿主細胞，其在外源引入的調(diào)節(jié)元件控制之下表達內(nèi)源BvS或EG-VEGF基因(即基因活化)。天然序列Bv8或EG-VEGF中或者本文所述Bv8或EG-VEGF的結(jié)構(gòu)域中的變異，可以通過，例如，進行保守和非保守突變的任何技術(shù)和指南來產(chǎn)生，例如，參見美國專利 5，364，934。變異可以是取代、缺失或插入一或多個編碼Bv8或EG-VEGF的密碼子，使該Bv8 或EG-VEGF的氨基酸序列與天然序列BvS或EG-VEGF相比發(fā)生改變?？蛇x地，所述變異是將BvS或EG-VEGF的一或多個結(jié)構(gòu)域中的至少一個氨基酸用另一氨基酸取代。確定哪一個氨基酸殘基可以進行插入、取代或缺失而不影響所需活性的方法可以是，將BvS或EG-VEGF 的序列與已知的同源蛋白分子的序列進行比較，并使高度同源區(qū)域中氨基酸序列變化的數(shù)量最小。氨基酸取代可以是將一個氨基酸替換為具有相似結(jié)構(gòu)和/或化學特性的另一氨基
27酸，如將亮氨酸替換為絲氨酸，即保守氨基酸替換。插入或缺失可以任選在約1-5個氨基酸的范圍內(nèi)。所能允許的變異可以如下確定在所述序列中進行總體(systematically)的氨基酸插入、缺失或取代，并檢驗所得變體是否具有全長或成熟天然序列的活性。BvS多肽片段或EG-VEGF多肽片段也可以用于本發(fā)明方法中。這樣的片段可以是，與全長天然蛋白相比，在N-末端或C-末端截短，或缺少內(nèi)部殘基。一些片段缺少BvS多肽或EG-VEGF多肽的目標生物活性所不必需的氨基酸殘基。BvS片段或EG-VEGF片段可以用多種常規(guī)技術(shù)中的任一種來制備。所需肽片段可以化學合成。另外的方法涉及對BvS或EG-VEGF片段進行酶消化，例如用已知在特定氨基酸所占據(jù)的位點進行切割的酶處理所述蛋白，或用合適的限制酶消化DNA并分離所需片段。另一種合適的技術(shù)涉及分離并通過聚合酶鏈反應(PCR)擴增編碼所需多肽片段的DNA片段。在PCR中，可以利用該DNA片段所需末端的寡核苷酸作為5’和3’。優(yōu)選BvS或EG-VEGF 多肽片段與天然BvS多肽和/或天然EG-VEGF多肽具有至少一種相同的生物學和/或免疫學活性。在具體實施方案中，感興趣的保守取代見表1的“優(yōu)選取代”欄。如果這些取代引起生物學活性的改變，則可引入表1中“取代舉例”欄的更實質(zhì)性改變，或進一步在下文的氨基酸分類中所述的更實質(zhì)性改變，并篩選產(chǎn)物。表1
原始殘基取代舉例優(yōu)選取代Ala (A)val;leu; ilevalArg (R)lys;gin; asnlysAsn (N)gin；his; asp, lys; argginAsp (D)glu;asngluCys (C)ser;alaserGln (Q)asn;,gluasnGlu (E)asp;,ginaspGly (G)alaalaHis (H)asn;,gin; lys; argargHe (I)leu;val; met; ala; phe;正亮氣酸leuLeu (L)正亮氣酸；ile; val; met; ala; pheileLys (K)arg; gin; asnargMet (M)leu; phe; ileleuPhe (F)leu; val; ile; ala; tyrtyrPro (P)alaalaSer (S)thr; cyscysThr (T)serserTrp(W)tyr; phetyrTyr (Y)trp; phe; thr; serpheVal (V)ile; leu; met; phe; ala;正亮氣酸leuBvS或EG-VEGF多肽的功能或免疫學特性的實質(zhì)改變可通過選擇性取代來完成，所選的取代應在維持(a)取代區(qū)多肽骨架的結(jié)構(gòu)，例如片層結(jié)構(gòu)或螺旋構(gòu)象，(b)該分子的靶位點的電荷或疏水性，(c)側(cè)鏈的大小，這幾方面有顯著不同的效應。天然殘基根據(jù)共有的側(cè)鏈特性可分為(1)疏水性正亮氨酸，甲硫氨酸，丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸異亮氨酸(2)中性親水半胱氨酸，絲氨酸，蘇氨酸(3)酸性天冬氨酸，谷氨酸(4)堿性天冬酰胺，谷氨酰胺，組氨酸，賴氨酸，精氨酸(5)影響側(cè)鏈定向的殘基甘氨酸，脯氨酸(6)芳香族色氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸。非保守取代將限定上述某一類的成員被另一類取代。也可以將這類取代殘基弓I入保守取代位點，更優(yōu)選引入剩余(非保守)位點?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知方法如寡核苷酸-介導的(定點)誘變、丙氨酸掃描，和PCR 誘變技術(shù)來產(chǎn)生變異?？梢詫寺〉腄NA實施定點誘變(Carter等，Nucl. Acids Res., 13 :4331(1986) ；Zoller 等，Nucl. Acids Res.，10 :6487 (1987))、盒式誘變(Wells 等， Gene，34 :315(1985))、限制選擇誘變(Wells 等，Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317 415 (1986))或其它已知技術(shù)以產(chǎn)生Bv8變體DNA和/或EG-VEGF變體DNA。掃描氨基酸分析也可用于沿鄰接序列鑒定一個或多個氨基酸。優(yōu)選的掃描氨基酸是相對較小的中性氨基酸。此類氨基酸包括丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸和半胱氨酸。丙氨酸通常是此組中優(yōu)選的掃描氨基酸，因為它不存在β -碳上的側(cè)鏈并且極少改變變體的主鏈構(gòu)象(Cunningham 和 Wells，Science, 244 1081-1085 (1989))。優(yōu)選丙氨酸的另一原因是因為它是最常用氨基酸。而且，它常常既出現(xiàn)在埋藏位置也出現(xiàn)在暴露位置(CreightonJhe Proteins, (W. H. Freeman & Co. , N. Y.) ；Chothia，J. Mol. Biol.，150 1 (1976))。如果丙氨酸取代不能產(chǎn)生足夠量的變體，則可使用同構(gòu)(isoteric)氨基酸。D.制備 Bv8，EG_VEGF，及其變體適合于制備Bv8，EG-VEGF，及其變體的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。鑒于優(yōu)選的技術(shù)對于Bv8，EG-VEGF，及其變體而言是一樣的，因而下述技術(shù)既可以分別應用于Bv8和EG-VEGF 變體也可以分別應用于天然序列Bv8和EG-VEGF。
優(yōu)選的制備方法包括從BvS或EG-VEGF的內(nèi)源性來源分離該多肽，肽合成(用肽合成儀)和重組技術(shù)(或這些技術(shù)的任意組合)。以下論述主要涉及，通過培養(yǎng)已被含有BvS核酸，EG-VEGF核酸，或其組合的載體所轉(zhuǎn)化的細胞并從培養(yǎng)物中回收該多肽來重組制備BvS或EG-VEGF。但本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到，還有其它很多種制備BvS和或EG-VEGF的方法。簡言之，該方法涉及用構(gòu)建體(即載體)轉(zhuǎn)化含有BvS或EG-VEGF編碼基因的原代人細胞，所述構(gòu)建體包含可以擴增的基因(如二氫葉酸還原酶(DHFR)或下述其它基因) 和至少一個側(cè)翼區(qū)，該側(cè)翼區(qū)有至少約150bp且與BvS或EG-VEGF基因編碼區(qū)基因座上的 DNA序列同源，因而擴增BvS或EG-VEGF基因。所述可以擴增的基因必須位于不影響B(tài)vS或 EG-VEGF基因表達的位置。轉(zhuǎn)化應使得所述構(gòu)建體同源整合到該原代細胞的基因組中，以便限定可以擴增的區(qū)域。含有該構(gòu)建體的原代細胞然后可以借助所述可以擴增的基因或該構(gòu)建體中存在的其它標記物來進行選擇。標記基因的存在可以確認該構(gòu)建體在宿主基因組中的存在和整合。不需要再對原代細胞進行其它選擇，因為可以在第二宿主中進行選擇。需要時，同源重組事件的發(fā)生可以在進行PCR之后如下確定對所擴增的DNA序列測序，或者當存在來自正確的同源整合體的DNA時確定PCR片段的合適長度并且僅僅擴增含有這類片段的細胞。另外，如果需要，可以在這時，通過將適當?shù)臄U增試劑(當可以擴增的基因是DHFR時，擴增試劑是氨甲蝶呤)作用于(stress)所選出的細胞，使這些細胞擴增，從而獲得靶基因的多個拷貝。但優(yōu)選直到下述第二輪轉(zhuǎn)化之后再進行擴增步驟。上述擴增步驟之后，從所選的原代細胞中分離出具有足以包括完整可擴增區(qū)的大小的基因組DNA部分。然后用這些基因組DNA部分轉(zhuǎn)化第二種哺乳動物表達宿主細胞，對細胞進行克隆，選出包含可擴增區(qū)的克隆。然后，在可擴增區(qū)尚未在原代細胞中擴增的情況下，用擴增試劑使可擴增區(qū)擴增。最后，對那些已包含多拷貝可擴增區(qū)(含有BvS或 EG-VEGF)的第二種表達宿主細胞進行培養(yǎng)，從而表達所述基因并產(chǎn)生所述蛋白。編碼Bv8或EG-VEGF的DNA可以從cDNA文庫獲得，所述cDNA文庫是從據(jù)信具有 Bv8mRNA或EG-VEGF mRNA并且以可測得的水平表達Bv8或EG-VEGF的組織制備的。因此，可以從人多重組織制備的cDNA文庫中很方便地得到Bv8或EG-VEGF DNA0也可以從基因組文庫或通過寡核苷酸合成來獲得編碼BvS或EG-VEGF的基因。文庫可以使用為鑒別目的基因或其編碼的蛋白而設(shè)計的探針(如抗BvS或抗 EG-VEGF抗體或至少約20-80個堿基的寡核苷酸)來篩選。用所選探針篩選cDNA或基因組文庫可以按照標準操作進行，如Sambrook等在Molecular Cloning :A Laboratory Manual (New York : Co Id Spring Harbor Laboratory, 1989)中第 10-12 章所述方法。另一種分離編碼BvS或EG-VEGF的基因的方法，是使用Sambrook等(出處同上)第14章所述的PCR方法。分離BvScDNA和/或EG-VEGF cDNA的優(yōu)選方法是，使用精心選出的寡核苷酸序列篩選來自各種人組織的cDNA文庫。選作探針的寡核苷酸序列應當具有足夠的長度并且足夠明確(unambiguous)，以便使假陽性出現(xiàn)機率最小。優(yōu)選的序列是從本文所述天然BvS或 EG-VEGF獲得的。寡核苷酸必須帶有標記，使其能通過與正在篩選的文庫中的DNA雜交而被檢測。優(yōu)選的標記方法是如本領(lǐng)域所公知的那樣，用標記的ATP和多核苷酸激酶使寡核苷酸帶上放射性標記。也可以使用其它方法標記寡核苷酸，包括但不限于，生物素標記或酶標記?？梢詫⒕幋aBv8或EG-VEGF的核酸(如cDNA或基因組DNA)插入復制載體以便進一步克隆(擴增該DNA)或進行表達?？梢允褂玫妮d體有很多。載體組分通常包括，但不限于，以下一或多項信號序列，復制起點，一或多個標記基因，增強子元件，啟動子，以及轉(zhuǎn)錄終止序列。本發(fā)明的BvS或EG-VEGF不僅可以直接重組制備，還可以制備成與異源多肽融合的多肽，所述異源多肽優(yōu)選信號序列或在成熟蛋白或多肽的N-末端具有特異性切割位點的其它多肽。通常，信號序列可以是載體的組分，或者是插入該載體的BvS或EG-VEGF DNA 的一部分。所選的異源信號序列優(yōu)選是能被宿主細胞識別并加工(即被信號肽酶切割)的信號序列。對于不能識別并加工天然BvS或EG-VEGF信號序列的原核宿主細胞來說，可以將信號序列替換為選自下組的原核信號序列堿性磷酸酶，青霉素酶，lpp，或熱穩(wěn)定腸毒素 II前導序列。為了進行酵母分泌，可以將天然信號序列替換為，例如，酵母轉(zhuǎn)化酶前導序列，α因子前導序列(包括糖酵母α因子前導序列和1991年4月23日授權(quán)的美國專利 5,010, 182所述的克魯維酵母α因子前導序列)，或酸性磷酸酶前導序列，白色念珠菌葡萄糖淀粉酶前導序列(EP 362，179，公開于1990年4月4日)，或于1990年11月15日公開的 W090/13646描述的信號。在哺乳動物細胞表達中，天然信號序列(如通常在體內(nèi)指導BvS 或EG-VEGF從人的細胞中分泌的BvS或EG-VEGF前序列)可以滿足要求，但其它哺乳動物信號序列也是適合的，如來自其它動物BvS多肽的信號序列，來自相同或相關(guān)物種的分泌多肽的信號序列，以及病毒的分泌前導序列，如單純皰疹病毒gD信號。可以將所述前體區(qū)域的DNA與編碼成熟Bv8或EG-VEGF或其可溶性變體的DNA連接在同一個閱讀框內(nèi)。表達載體和克隆載體都包含能使該載體在一或多種選定的宿主細胞中復制的核酸序列。一般情況下，在克隆載體中，這種序列是能使該載體獨立于宿主染色體DNA而復制的序列，包括復制起點或自我復制序列。這樣的序列在各種細菌、酵母和病毒中都是眾所周知的。質(zhì)粒pBR322的復制起點適合大多數(shù)革蘭氏陰性細菌，2μ質(zhì)粒起點適合酵母菌，多種病毒起點(SV40，多瘤病毒(Polyoma)，腺病毒，VSV或BPV)可用于哺乳動物細胞中的克隆載體。復制起點組分一般不是哺乳動物表達載體所必需的(SV40起點的使用通常僅僅是由于其包含早期啟動子)。大多數(shù)表達載體都是“穿梭”載體，即它們能在至少一類生物中復制但可以轉(zhuǎn)移到另一生物中進行表達。例如，可以在大腸桿菌中克隆出載體，然后將該載體轉(zhuǎn)移到酵母或哺乳動物細胞中進行表達，即使它不能獨立于宿主細胞染色體而復制也無所謂。DNA也可以通過插入宿主基因組而擴增。這可以利用芽孢桿菌作為宿主，通過，例如在該載體中包含與芽孢桿菌基因組DNA中找到的序列互補的DNA序列而很容易地實現(xiàn)。用該載體轉(zhuǎn)化芽孢桿菌導致基因組與BvSDNA和/或EG-VEGF DNA插入片段之間發(fā)生同源重組。但編碼BvS或EG-VEGF的基因組DNA的回收比外源復制載體的回收更復雜，因為必需用限制酶消化Bv8和/或EG-VEGF DNA。表達載體和克隆載體應該包含選擇基因，也稱選擇標記。該基因編碼使經(jīng)過轉(zhuǎn)化的宿主細胞在選擇性培養(yǎng)基中存活或生長所必需的蛋白。沒有被包含該選擇基因的載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞在所述選擇性培養(yǎng)基中不能存活。典型的選擇基因編碼具有以下性質(zhì)的蛋白(a)賦予對抗生素或其它毒素(如氨芐青霉素，新霉素，氨甲蝶呤或四環(huán)素)的抗性， (b)彌補營養(yǎng)缺陷，或(C)提供復合培養(yǎng)基不能供給的關(guān)鍵營養(yǎng)物，例如編碼芽孢桿菌D-丙氨酸消旋酶的基因。選擇方案的一個實例是利用藥物限制(arrest)宿主細胞的生長。那些被異源基因成功轉(zhuǎn)化的細胞產(chǎn)生一種賦予藥物抗性的蛋白，從而在該選擇環(huán)境中存活。這種顯性選擇可以采用的藥物有新霉素，霉酚酸和潮霉素。適合于哺乳動物細胞的另一例選擇標記是允許鑒定能攝取BvS核酸的細胞的那些，如DHFR或胸苷激酶?？梢詫⒉溉閯游锛毎D(zhuǎn)化體置于僅有轉(zhuǎn)化體能通過攝取該標記物而存活的選擇壓力下。選擇壓力通過將轉(zhuǎn)化體培養(yǎng)在具有連續(xù)變化的選擇試劑濃度的培養(yǎng)基中來實施，所述連續(xù)變化的濃度導致選擇基因和編碼BvS和/或EG-VEGF的DNA都被擴增。擴增是指，對生長十分關(guān)鍵的那些蛋白的生產(chǎn)所重點需要的基因在連續(xù)數(shù)代重組細胞的染色體中被不斷復制(reiterated in tandem)的過程。擴增的DNA不斷地合成Bv8和/ 或EG-VEGF。擴增基因的其它實例包括金屬硫蛋白-I和-II，優(yōu)選靈長類金屬硫蛋白基因，腺苷脫氨酶，烏氨酸脫羧酶等。一種優(yōu)選的載體系統(tǒng)可參見美國專利5，561，053。例如，用DHFR選擇基因轉(zhuǎn)化的細胞首先通過將所有轉(zhuǎn)化體培養(yǎng)在包含氨甲蝶呤 (Mtx，為DHFR的一種競爭型拮抗劑)的培養(yǎng)基中來進行鑒定。當采用野生型DHFR時，合適的宿主細胞包括DHFR活性有缺陷的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系，其制備和增殖參見tolaub 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77 :4216 (1980)。然后將經(jīng)過轉(zhuǎn)化的細胞暴露于濃度漸增的氨甲蝶呤。這導致合成多拷貝的DHFR基因，同時還合成多拷貝的包含在所述表達載體中的其它DNA，如編碼Bv8和/或EG-VEGF的DNA。當采用Mtx高抗性DHFR突變基因時，這種擴增技術(shù)可以使用其它合適的宿主細胞，如ATCC CCL61CH0-K1，盡管它存在內(nèi)源DHFR(EP 117，060)?；蛘?，宿主細胞(尤其包含內(nèi)源DHFR的野生型宿主)被編碼Bv8和/或EG-VEGF 野生型DHFR蛋白以及另一種選擇標記如氨基糖苷3’ -磷酸轉(zhuǎn)移酶(APH)的DNA序列轉(zhuǎn)化或共轉(zhuǎn)化以后，可以通過在含有針對該選擇標記的選擇試劑如氨基糖苷類抗生素(如卡那霉素，新霉素或G418)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞來進行選擇。參見美國專利4，965，199。適用于酵母的合適選擇基因是存在于酵母質(zhì)粒YRp7中的trpl基因(Minchcomb 等，Nature, 282 :39(1979))。Trpl基因為不能在色氨酸中生長的酵母突變株(例如ATCC 44076 或 PEP4-1)提供了選擇標記(Jones, Genetics，85 :12 (1977))。此后，酵母宿主細胞基因組中trpl損傷的存在提供了通過在缺乏色氨酸的條件中生長而檢測轉(zhuǎn)化的有效環(huán)境。類似地，Leu2-缺陷型酵母菌株(ATCC 20，622或38，626)可以由攜帶Leu2基因的已知質(zhì)粒來互補。此外，源自1.6μπι環(huán)狀質(zhì)粒pKDl的載體可以用于轉(zhuǎn)化克魯維酵母 (Kluyveromyces) ο Bianchi 等，Curr. Genet. ,12 :185(1987)。最近，Van den Berg, Bio/ Technology,8 :135(1990)報道了一種用于在乳克魯維酵母(K. Iactis)中大規(guī)模制備重組小牛凝乳酶的表達系統(tǒng)。還有人公開了用于通過克魯維酵母工業(yè)菌株分泌成熟重組人血清白蛋白的穩(wěn)定、多拷貝表達載體。Fleer等，1991Bio/Technology，9 :968_975。
表達載體和克隆載體通常包含能被宿主生物識別的啟動子，它與BvS核酸可操作相連。啟動子是位于結(jié)構(gòu)基因的起始密碼子上游(5’，一般相距不超過大約IOO-IOOObp)的非翻譯序列，它控制著與之可操作相連的具體核酸序列，如BvS和/或EG-VEGF核酸序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯。這種啟動子通常分為誘導型和組成型這兩類。誘導型啟動子，當培養(yǎng)條件發(fā)生一些改變，例如存在或缺乏某種營養(yǎng)，或者溫度改變時，應答這樣的改變而使受其控制的 DNA的轉(zhuǎn)錄水平升高的那些啟動子。迄今為止，由不同的宿主細胞識別的非常多種啟動子已為本領(lǐng)域熟知。通過限制酶消化而從來源DNA取出啟動子，并將分離的啟動子序列插入載體，從而將這些啟動子與編碼Bv8和/或EG-VEGF的DNA可操作相連。天然Bv8或EG-VEGF 啟動子序列和多種異源啟動子都可以用于指導BvS或EG-VEGF DNA的擴增和/或表達。但優(yōu)選異源啟動子，因為它們與天然啟動子相比，通過能引起B(yǎng)vS和/或EG-VEGF的更強轉(zhuǎn)錄并獲得更高的產(chǎn)量。適用于原核宿主的啟動子，包括β-內(nèi)酰胺酶和乳糖啟動子系統(tǒng)(Chang等， Nature, 275 :615(1978) ；Goeddel 等，Nature, 281 :544 (1979))，堿性磷酸酶，色氨酸(trp) 啟動子系統(tǒng)(Goeddel，核酸Res.，8 :4057(1980) ；EP 36776)，和雜化啟動子如tac啟動子。deBoer 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80 :21-25 (1983) 也可以使用其它已知的細菌啟動子。它們的核苷酸序列已經(jīng)公開，因此本領(lǐng)域技術(shù)人員可以利用接頭或銜接子來提供任何所需的限制性位點，將已知啟動子與編碼BvS和/或EG-VEGF的DNA可操作相連 (Siebenlist等，Cell，20 :269 (1980))。適用于細菌系統(tǒng)的啟動子還可以包含與編碼Bv8 和/或EG-VEGF的DNA可操作相連的Shine-Dalgarno (S. D.)序列。真核生物的啟動子序列也是已知的。幾乎所有的真核基因在轉(zhuǎn)錄起始點上游約 25-30個堿基處具有AT-富集區(qū)。很多基因在其轉(zhuǎn)錄起始點上游70-80個堿基處有另一種序列CXCAAT，其中X可以是任何核苷酸。大多數(shù)真核基因的3’端是AATAAA序列，它可以作為一種信號用于將poly-Α尾添加到編碼序列3’端。所有這些序列都適合于插入真核表達載體中。適用于酵母宿主的啟動序列的實例包括3-磷酸甘油酸激酶(Hitzeman等， J. Biol. Chem.，255 :2073 (1980))或其它糖酵解酶(Hess 等，J. Adv. Enzyme Reg.，7 149(1968) ；Holland, Biochemistry, 17 :4900(1978))的啟動子，所述其它糖酵解酶如烯醇化酶，甘油醛-3-磷酸脫氫酶，己糖激酶，丙酮酸脫羧酶，磷酸果糖激酶，葡萄糖-6磷酸異構(gòu)酶，3-磷酸甘油變位酶，丙酮酸激酶，磷酸丙糖異構(gòu)酶，磷酸葡萄糖異構(gòu)酶和葡萄糖激酶。其它的酵母啟動子，即那些還具有由生長條件控制轉(zhuǎn)錄的優(yōu)點的誘導型啟動子，是下述基因的啟動子區(qū)醇脫氫酶2、異細胞色素C、酸性磷酸酶、與氮代謝相關(guān)的降解酶、金屬硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶和負責麥芽糖和半乳糖利用的酶。在EP 73，657中進一步描述了適用于酵母表達系統(tǒng)的載體和啟動子。酵母增強子與酵母啟動子聯(lián)合使用也是有利的。在哺乳動物宿主細胞中，從載體轉(zhuǎn)錄Bv8和/或EG-VEGF可以受啟動子調(diào)控，所述啟動子例如來自病毒基因組，如多形瘤病毒、雞痘病毒(1989年7月5日公布的UK 2211504)、腺病毒(如腺病毒幻、牛乳頭瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨細胞病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、乙型肝炎病毒和猴病毒40(SV40)的啟動子，或者來自異源哺乳動物的啟動子，如肌動蛋白啟動子或免疫球蛋白啟動子等，來自熱休克啟動子，以及來自通常與BvS或EG-VEGF序列相連的啟動子，前提是這些啟動子與宿主細胞系統(tǒng)相容。SV40病毒的早期和晚期啟動子可以作為還包含SV40病毒復制起點的SV40限制性片段而方便地獲得。Fiers 等，Nature，273 :113(1978) ；Mulligan 等，Science, 209 1422-1427 (1980) ；Pavlalcis 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78 :7398-7402 (1981)。人巨細胞病毒的即早期啟動子可以作為Hind III E限制性片段方便地獲得。Greenaway等， Gene, 18 :355-360 (1982)。美國專利4，419，446中公開了在哺乳動物宿主中用牛乳頭瘤病毒作為載體來表達DNA的系統(tǒng)。美國專利4，601，978中敘述了對這個系統(tǒng)改進。另見Gray 等，Nature，295 =503-508(1982)中關(guān)于在猴細胞中表達編碼免疫干擾素的cDNA ;Reyes等， Nature, 297 :598-601(1982)中關(guān)于在單純皰疹病毒胸苷激酶啟動子控制下在小鼠細胞中表達人 β 干擾素 cDNA ；Canaani 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79 :5166-5170 (1982)中關(guān)于在培養(yǎng)的小鼠和兔細胞中表達人干擾素β 1基因；以及Gorman等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79 :6777-6781(1982)關(guān)于在CV-I猴腎細胞、雞胚成纖維細胞、中國倉鼠卵巢細胞、 HeLa細胞和小鼠OTH-3T3細胞中，用勞氏肉瘤病毒長末端重復序列作為啟動子來表達細菌 CAT序列。編碼BvS和/或EG-VEGF的DNA在高等真核生物中的轉(zhuǎn)錄常常通過將增強子序列插入載體中來增加。增強子是作用于啟動子以增加其轉(zhuǎn)錄的DNA順式作用元件，一般約 10 300bp。增強子相對不太依賴于方向和位置，見于轉(zhuǎn)錄單元的5’端(Laimins等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78 :993(1981))和 3，端(Luslcy 等，Mol. Cell Bio.，3 1108 (1983)), 內(nèi)含子內(nèi)部(Banerji等，Cell，33 :7 (1983))，以及編碼序列的內(nèi)部。Osborne等，Mol. Cell Bio. ,4:1293(1984)。目前已知很多哺乳動物基因(球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰島素)的增強子序列。但通常使用真核細胞病毒的增強子。實例包括在其復制起始點晚期側(cè)的SV40增強子(bp 100-270)，巨細胞病毒早期啟動子增強子，在其復制起始點晚期側(cè)的多形瘤增強子，和腺病毒增強子。也可參見Yaniv，Nature，297 :17-18(1982)所述用于活化真核啟動子的增強元件。所述增強子可以剪接插入載體中BvS或EG-VEGF編碼序列的5’或3’側(cè)，但優(yōu)選位于啟動子的5’側(cè)。用于真核宿主細胞(酵母、真菌、昆蟲、植物、動物、人或來自其它多細胞生物的有核細胞)的表達載體，還包括對轉(zhuǎn)錄終止和穩(wěn)定mRNA所必需的序列。這些序列通常來自真核或病毒DNA或cDNA的5’ (偶爾為3’)非翻譯區(qū)。這些區(qū)域包含轉(zhuǎn)錄為編碼BvS和/或 EG-VEGF的mRNA的非翻譯區(qū)中聚腺苷酸化片段的核苷酸片段。包含上述一或多個組分的合適載體的構(gòu)建可以利用標準連接技術(shù)。分離的質(zhì)粒或 DNA片段經(jīng)過切割，修剪(tailored)，并重新連接為所需形式，以便產(chǎn)生所需質(zhì)粒。為了通過分析來證實所構(gòu)建的質(zhì)粒中的正確序列，可用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌 K12菌株294(ATCC 31，446)，并用相應的氨芐青霉素或四環(huán)素抗性選擇成功的轉(zhuǎn)化子。從轉(zhuǎn)化子制備質(zhì)粒，通過限制性內(nèi)切核酸酶消化來分析，和/或用Messing等，NucleicAcids Res.，9 :309(1981)所述方法或 Maxam 等，Methods in Enzymology, 65 :499(1980)所述方法測序。在Bv8，EG-VEGF及其變體的制備中特別有用的是，能在哺乳動物細胞中瞬時表達編碼BvS和/或EG-VEGF的DNA的表達載體。通常，瞬時表達涉及應用能在宿主細胞中有效復制的表達載體，從而該宿主細胞積累所述表達載體的多個拷貝，并合成高水平的由該表達載體所編碼的所需多肽。Sambrook等，出處同上pp. 16. 17-16. 22。包含適宜表達載體及宿主細胞的瞬時表達系統(tǒng)，允許對克隆化DNA所編碼的多肽進行方便地陽性鑒定，還允許快速篩選這些多肽的所需生物特性或生理特性。因此，瞬時表達系統(tǒng)特別可用于本發(fā)明鑒定具有BvS和/或EG-VEGF生物活性的BvS類似物和變體的目的。適應于在重組脊椎動物細胞培養(yǎng)物中合成BvS的其它方法，載體，和宿主細胞在 Gething 等，Nature，293 :620-625(1981) ；Mantei 等，Nature，281 :40-46(1979) ；EP 117，060 JPEP 117，058中描述。特別可用于BvS的哺乳動物細胞培養(yǎng)表達的質(zhì)粒是 pRK5 (EP 307,247)或 pSVI6B。WO 91/0擬91，1991 年 6 月 13 日公開?？寺』虮磉_本文所述載體中DNA的適宜宿主細胞，包括原核生物、酵母或高等真核細胞。適于此目的的原核生物包括真細菌，如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性細菌，例如腸桿菌科(Enterobacteriaceae)，如埃希氏菌屬(Escherichia)，例如，大腸桿菌(E. coli), 腸桿菌屬(EntercAacter)，歐文菌屬(Erwinia)，克雷白菌屬(Klebsiella)，變形菌桿屬 (Proteus)，沙門菌屬(Salmonella)(如鼠傷寒沙門菌(Salmonella typhimurium))，沙雷菌屬(Serratia)(如粘質(zhì)沙雷菌(Serratia marcescans))和志賀菌屬(Shigella)等，以及芽孢桿菌屬(Bacilli)如枯草芽孢桿菌(B. subtilis)和地衣芽孢桿菌(B. Iicheniformis) (例如1989年4月12日出版的DD 266, 710中所述地衣芽孢桿菌41P)等，假單胞菌屬 (Pseudomonas)如銅綠菌假單胞菌(P. aeruginosa)，及鏈霉菌(Str印tomyces)。優(yōu)選的大腸桿菌克隆宿主是大腸桿菌294 (ATCC 31，446)，但其它菌株，如大腸桿菌B，大腸桿菌 X1776(ATCC 31,537)和大腸桿菌W3110 (ATCC 27, 325)也是合適的。這些實例是用于說明，并非限制。W3110株是一個特別優(yōu)選的宿主或親本宿主，因為它是重組DNA產(chǎn)物發(fā)酵常用的宿主菌株。優(yōu)選地，宿主細胞分泌少量蛋白水解酶。例如，可以修飾W3110株以使編碼蛋白的基因中發(fā)生遺傳突變，此類宿主的實例包括大腸桿菌W3110株27C7。27C7的完整基因型是 tonA Δ ptr3phoA Δ Ε15 Δ (argF-lac) 169ompT Δ degP41kanr。菌株 27C7 已于 1991 年 10 月31日保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection)，保藏號為 ATCC 55，2440或者，可以采用1990年8月7日授權(quán)的美國專利4，946，783中公開的具有突變型周質(zhì)蛋白酶的大腸桿菌株。除了原核生物，真核微生物如絲狀真菌或酵母也是適合于BvS編碼載體的克隆或表達宿主。釀酒酵母或常見的面包酵母是最常用的低等真核宿主微生物。還有多個其它屬、種和株已有商品供應，并且可以用于本發(fā)明，例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe) (Beach 等，Nature，四0 :140(1981) ； 1985 年 5 月 2 日公布的 EP 139,383)；克魯維酵母屬(Kluyveromyces)宿主(美國專利4，943，529 ；Fleer等，出處同上)，例如乳克魯維酵母(K. lactis) (MW98-8C, CBS683, CBS4574 ；Louvencourt 等，J. Bacteriol.，737 (1983))、脆壁克魯維酵母(K. fragilis) (ATCC 12，424)、保加利亞克魯維酵母(K. bulgaricus) (ATCC 16，045)、威克曼氏克魯維酵母(K. wickeramii) (ATCC24, 178)、K. waltii (ATCC 56，500)、果蠅克魯維酵母(K. drosophilarum) (ATCC36, 906 ；Van den Berg等，出處同上)、耐熱克魯維酵母(K. thermotolerans)和馬克斯克魯維氏酵母(K. marxianus)等；yarrowia(EP 402，226)；巴斯德畢赤酵母(pichia pastoris) (EP 183，070 ；Sreekrishna 等，J. Basic Microbiol.，28 :265-278(1988))；念珠菌屬；Trichoderma reesia(EP 244,234)；粗糙鏈孢霉(Case 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76 :5259-5263 (1979))；許旺氏酵母屬(schwanniomyces)如西方許旺氏酵母(schwanniomyces occidentalis) (1990 年 10 月 31日公布的EP 394, 538)等；和絲狀真菌，例如鏈孢霉屬、青霉屬、T0lyp0Cladium(1991 年1月10日公布的WO 91/00357)以及曲霉屬宿主如構(gòu)巢曲霉(Ballance等，Biochem. Biophys. Res. Commun.，112 :284-289(1983) ；Tilburn 等，Gene，26 :205-221 (1983) ；Yelton 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA,81 :1470-1474(1984))和黑曲霉等(Kelly 等，EMBO J. ,4 475-479(1985))。適合于表達糖基化BvS和/或EG-VEGF的宿主細胞來自多細胞生物。這樣的宿主細胞能將加工活性和糖基化活性組合在一起。原則上，任何高等真核細胞培養(yǎng)物都是可以的，無論它來自脊椎動物培養(yǎng)物還是無脊椎動物培養(yǎng)物。無脊椎動物細胞的實例包括植物和昆蟲細胞。目前已經(jīng)從下述宿主中鑒定了大量的桿狀病毒株和變體以及相應的容許型昆蟲宿主細胞草地夜蛾(Spodoptera Frugiperda，毛蟲)、埃及伊蚊(Aedes aegypti，岐子)、白紋伊岐(Aedes albopictus,岐子)、Drosophila melanogaster (果蠅)禾口家蠶蛾(Bombyx mori)等。參見，例如 Luckow 等，Bio/technology，6 :47-55(1988) ；Miller 等，在 Genetic Engineering 中，Setlow 等編，Vol. 8 (Plenum Publishing, 1986) ,pp. 277—279 ； Maeda等，Nature，315 :592-594(1985)。用于轉(zhuǎn)染的各種病毒株可以公開地獲得，例如加利福尼亞Y級夜蛾(Autographa California)NPV的L-I變體和家蠶蛾NPV的Bm_5株，并且這些病毒可以在此用作本發(fā)明的病毒，尤其是用于轉(zhuǎn)染草地夜蛾細胞。棉花、玉米、土豆、大豆、矮牽牛、西紅柿和煙草的植物細胞培養(yǎng)物也可以用作宿主。通常，植物細胞通過與事先經(jīng)過操作而含有編碼BvS或EG-VEGF的DNA或其組合的根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株一起保溫來進行轉(zhuǎn)染。在植物細胞培養(yǎng)物與根癌土壤桿菌一起保溫期間，編碼BvS和/或EG-VEGF的DNA被轉(zhuǎn)移到該植物細胞宿主中，使它被轉(zhuǎn)染，然后在適當?shù)臈l件下表達編碼BvS和/或EG-VEGF的DNA。此外，與植物細胞相容的調(diào)節(jié)序列和信號序列也是可以獲得的，如胭脂氨酸合成酶啟動子和聚腺苷酸化信號序列。D印iclcer 等，J. Mol.Appl.Gen.，1 :561(1982)。此外，從 T-DNA 780 基因上游區(qū)分離的DNA節(jié)段能活化或增加含有重組DNA的植物組織中植物可表達型基因的轉(zhuǎn)錄水平。 EP 321，196，1989 年 6 月 21 日公開。然而，關(guān)注最多的是脊椎動物細胞，而且在培養(yǎng)(組織培養(yǎng))中繁殖脊椎動物細胞己經(jīng)成為常規(guī)方法。參見，例如 Tissue Culture, Academic Press，Kruse 禾口 Patterson，編 (1973)。有效哺乳動物宿主細胞系的實例是用SV40轉(zhuǎn)化的猴腎CVl細胞系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚腎細胞系093細胞或經(jīng)過再克隆以便能在懸浮培養(yǎng)物中生長的293細胞， Graham 等，J. Gen Virol. 36 :59(1977))；幼倉鼠腎細胞(BHK, ATCC CCL 10)；中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR(CHO，Urlaub 等，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 77 :4216 (1980))；小鼠足細胞(TM4，Mather，Biol. R印rod. 23 :243-251(1980))；猴腎細胞(CVl ATCC CCL 70)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76, ATCC CRL-1587)；人宮頸癌細胞 OffiLA，ATCC CCL 2)；犬腎細胞(MDCK ATCC CCL 34)；布法羅(buffalo)大鼠肝細胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺細胞(W138, ATCC CCL 75)；人肝細胞(Hep G2, HB 8065)；小鼠乳腺腫瘤(MMT 060562，ATCC CCL 51)； TRI 細胞(Mather 等，Annals N. Y. Acad. Sci. 383 :44-68 (1982)) ；MRC 5 細胞；FS4 細胞；禾口人肝細胞癌細胞系OfeP G2)。宿主細胞用上述用于制備BvS和/或EG-VEGF的表達或克隆載體轉(zhuǎn)染(優(yōu)選轉(zhuǎn)
36化)，并在改進型傳統(tǒng)營養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基經(jīng)改進已適于誘導啟動子、篩選轉(zhuǎn)化體或擴增編碼所需序列的基因。轉(zhuǎn)染是指由宿主細胞攝取表達載體，而不論事實上是否表達了任何編碼序列。多種轉(zhuǎn)染方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的，例如，CaPOjX淀和電穿孔。成功的轉(zhuǎn)染一般在宿主細胞中出現(xiàn)關(guān)于該載體操作的任何征兆時可以予以識別。轉(zhuǎn)化是指，將DNA引入生物體，使DNA能夠作為染色體外元件或以染色體整合體的形式復制。根據(jù)所用的宿主細胞，用適合于所述細胞的標準技術(shù)進行轉(zhuǎn)化。利用氯化鈣進行鈣處理的方法(見Sambrook等，出處同上的1.82章節(jié))或電穿孔常用于包含堅固的細胞壁屏障的原核細胞或其它細胞。用根癌土壤桿菌進行的感染可以用于轉(zhuǎn)化一些植物細胞，參見Shaw等，Gene，23 :315(1983)以及1989年6月四日公開的WO 89/05859。此外，植物可以用1991年1月10日公開的WO 91/00358中所述的超聲處理方法進行轉(zhuǎn)染。對于沒有所述細胞壁的哺乳動物細胞，優(yōu)選Graham等，Virology, 52 456-457(1978)所述的磷酸鈣沉淀法。哺乳動物細胞宿主系統(tǒng)轉(zhuǎn)化的綜述見1983年8月 16日公布的美國專利4，399，216。酵母轉(zhuǎn)化通常根據(jù)Van Solingen等，J. Bact.，130 946(1977)和 Hsiao 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76 :3829 (1979)所述方法進行。但也可使用將DNA引入細胞中的其它方法，如核顯微注射、電穿孔、使細菌原生質(zhì)體與完整無損的(intact)細胞融合，或聚陽離子如polybrene，聚烏氨酸等。哺乳動物細胞轉(zhuǎn)化的各種技術(shù)可參見 Keown 等，Methods in Enzymology，185 :527-537 (1990)和 Mansour 等，1988， Nature,336 :348_352。用于產(chǎn)生Bv8多肽，EG-VEGF多肽或其組合的原核細胞在Sambrook等，出處同上所一般性描述的合適培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。用于產(chǎn)生本發(fā)明Bv8，EG-VEGF多肽或其組合的真核宿主細胞可以在各種培養(yǎng)基中培養(yǎng)。市售培養(yǎng)基如Ham’ s FlO (Sigma)，基本必需培養(yǎng)基((MEM) Sigma)， RPMI-1640 (Signma)，和 Dulbecco 改良 Eagle 培養(yǎng)基((DMEM)，Sigma)都適于培養(yǎng)所述宿主細胞。此夕卜，Ham 禾口 Wallace，Meth. Enz. ,58 :44 (1979)，Barnes 等，Anal. Biochem.， 102 255 (1980)，U. S. 4，767，704 ；4，657，866 ；4，927，762 ；4，560，655 ；或 5，122，469 ；WO 90/03430 ；WO 87/00195 ；U. S. Pat. Re. 30, 985所述的任一種培養(yǎng)基也可以用作宿主細胞培養(yǎng)基。任何上述培養(yǎng)基可以根據(jù)需要添加激素和/或其它生長因子(如胰島素，運鐵蛋白，或表皮生長因子)，鹽(如氯化鈉，鈣，鎂，和磷酸鹽)，緩沖液(如HEPEQ，核苷(如腺苷和胸苷)，抗生素(如Gentamycin )，痕量元素(定義為通常以微摩爾水平的終濃度出現(xiàn)的無機化合物)，和葡萄糖或等效能源。還可以包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的適當濃度的任何其它必需添加物。培養(yǎng)條件，如溫度，PH等，都是前面在選定的表達宿主上用到的那些，并且對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言也是顯而易見的。通常，使哺乳動物細胞培養(yǎng)物的生產(chǎn)力最大化的原則、方案、以及具體技術(shù)可以參見哺乳云力物 ian Cell Biotechnology :a Practical Apprcach, Μ. Butler,編(IRL Press, 1991)。該文獻中提到的宿主細胞包括培養(yǎng)的細胞以及宿主動物體內(nèi)的細胞。基因擴增和/或表達，可以基于本文提供的序列選擇適當標記的探針，利用諸如常規(guī) Southern 印跡、測定 mRNA 轉(zhuǎn)錄量的 Northern 印跡(Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 77 :5201-5205 (1980))、斑點(DNA分析)或原位雜交，直接在樣品中測定。可以采用各種標記，最常見放射性同位素，尤其是32P。也可以采用其它技術(shù)，如用生物素修飾的核苷酸來引入多核苷酸。該生物素然后可以作為親和素或抗體的結(jié)合位點，后者可以帶有各種標記，如放射性核素，熒光，酶等等?；蛘?，可以使用能夠識別特異雙鏈體的抗體，所述雙鏈體包括DNA雙鏈體、RNA雙鏈體和DNA-RNA雜合雙鏈體或者DNA-蛋白雙鏈體?？贵w也可以帶有標記，試驗在雙鏈體與表面結(jié)合之處進行，因此通過在表面形成雙鏈體可以檢測與雙鏈體結(jié)合的抗體的存在。或者，基因表達可以通過免疫學方法，如組織切片的免疫組化染色和細胞培養(yǎng)物或體液的分析來測定，以便直接確定基因產(chǎn)物的表達量。有了免疫組化染色技術(shù)，就可以制備細胞樣品(通常通過脫水和固定來制備)，然后將其與特異于所結(jié)合的基因產(chǎn)物的標記抗體反應，所述標記一般是可以目測觀察到的，如酶標記，熒光標記，發(fā)光標記等。適用于本發(fā)明的一種具體的敏感染色技術(shù)可參見Hsu等，1980，Am. J. Clin. Path. ,75 :734_738。適用于免疫組化染色和/或樣品液分析的抗體，可以是單克隆抗體或多克隆抗體，并且可以如本文所述進行制備。BvS和/或EG-VEGF優(yōu)選從培養(yǎng)基中回收，為分泌多肽的形式，也可以從宿主細胞裂解物回收。如果BvS或EG-VEGF為膜結(jié)合型，可以用合適的去污劑溶液(例如Triton-X 100)從膜上釋放。當Bv8，EG-VEGF多肽或其組合是在重組細胞中產(chǎn)生而不是從人源產(chǎn)生時，該Bv8 和/或EG-VEGF完全不含人源蛋白或多肽。但必需從重組細胞蛋白或多肽純化BvS和/或 EG-VEGF,以獲得本質(zhì)上均一的BvS和/或EG-VEGF制劑。第一步，可以使培養(yǎng)基或裂解物離心以除去微粒狀細胞殘渣。然后用以下舉例說明的適宜純化方法，從污染的可溶性蛋白和多肽中純化出BvS和/或EG-VEGF 在離子-交換柱上分級分離；乙醇沉淀；反相HPLC ；娃層析；層析聚焦；免疫親和；表位-標簽結(jié)合樹脂；SDS-PAGE ；硫酸銨沉淀；使用例如kphadex G-75進行凝膠過濾；和蛋白A Sepharose柱以除去污染物如IgG。Ε.修飾 Βν8 和 EG-VEGF本發(fā)明包括Bv8，EG-VEGF或其變體的共價修飾。一種共價修飾形式包括使Bv8 和/或EG-VEGF多肽的靶氨基酸殘基與能與該BvS或EG-VEGF的選定側(cè)鏈或N-或C-末端殘基發(fā)生反應的有機衍化劑進行反應。用雙功能劑進行的衍化可以用于，例如，使BvS或 EG-VEGF與水溶性支持物基質(zhì)或表面發(fā)生交聯(lián)，以便在純化抗-BvS或抗-EG-VEGF抗體的方法中使用，反之亦然。常用的交聯(lián)劑包括，例如，1，1_雙(二偶氮乙?；?-2-苯乙烷，戊二醛，N-羥琥珀酰亞胺酯，如與4-疊氮基水楊酸的酯，同型雙功能酰亞胺酯，包括二琥珀酰亞胺酯如3，3' -二硫代雙(琥珀酰亞胺基丙酸酯)、雙功能馬來酰亞胺如雙-N-馬來酰亞胺-1，8-辛烷和試劑如甲基-3-[(對-疊氮苯基)二硫]丙炔亞胺酯。其它修飾包括，谷氨酰胺基和天冬酰胺基分別脫酰胺成為相應的谷氨?；吞於滨；彼岷唾嚢彼崃u基化，絲氨?；蛱K氨酰殘基的羥基磷酸化，賴氨酸、精氨酸和組氛酸側(cè)鏈的 α -氛基甲基化(Τ. Ε. Creighton, 1983，Proteins Structure 禾口 Molecular Properties, W. H. Freeman & Co. ，San Francisco, pp. 79-86)，N- $立溝月安的乙酉jHt，\iLRii 何C-末端羧基的酰胺化。本發(fā)明還包括BvS和/或EG-VEGF多肽的另一類共價修飾，所述共價修飾包括改變多肽的天然糖基化模式?！案淖兲烊惶腔Ｊ健睘楸疚哪康氖侵福瑒h除天然序列BvS中一個或多個糖組分(方法是除去潛在的糖基化位點或利用化學和/或酶手段消除糖基化)，和/或添加一或多個在天然序列BvS或EG-VEGF中本不存在的糖基化位點。此外，該短語包括天然蛋白糖基化中的性質(zhì)變化，它涉及不同糖組分在性質(zhì)和比例上的變化。在BvS或EG-VEGF多肽中添加糖基化位點還可以通過改變氨基酸序列來現(xiàn)。所述改變可以是，例如，向天然序列BvS或EG-VEGF中添加、或取代一或多個絲氨酸或蘇氨酸殘基(對0-連接糖基化位點而言)。任選地，可以通過DNA水平的變化，特別是通過使編碼 BvS多肽的DNA中的預定堿基發(fā)生突變從而產(chǎn)生出翻譯所需氨基酸的密碼子，來改變BvS的氨基酸序列。另一種增加BvS或EG-VEGF多肽上糖組分數(shù)目的方法是，將配糖體(glycolside) 通過化學處理或酶處理而與所述多肽偶聯(lián)。這類方法可參見，例如1987年9月11日公布的 WO 87/05330，以及 Aplin 和 Wriston，CRC Crit. Rev. Biochem.第 259-306 頁(1981)。BvS或EG-VEGF多肽中糖組分的去除可以通過化學處理或酶處理來實現(xiàn)，或者通過使編碼糖基化靶點的氨基酸殘基的密碼子發(fā)生突變性取代來實現(xiàn)?；瘜W脫糖基化技術(shù)為本領(lǐng)域所公知，例如參見 Hakimuddin 等，Arch. Biochem. Biophys.，259 :52 (1987)和 Edge 等，Anal. Biochem.，118 :131 (1981)。多肽上糖組分的酶切除可以利用Thotakura等，Meth. Enzymol. , 138 =350(1987)所述的各種內(nèi)-和外-糖苷酶來實現(xiàn)。Bv8或EG-VEGF的另一類共價修飾包括，按照美國專利4，640, 835、4，496，689 ； 4，301，144,4, 670，417 ；4, 791，192 或 4，179，337 所述方式，將 Bv8 或 EG-VEGF 多肽連接與諸如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇或聚氧化烯等各種非蛋白聚合物之一連接。本發(fā)明BvS和EG-VEGF也可被修飾成嵌合分子，其中包含與另一異源多肽或氨基酸序列融合的Bv8或EG-VEGF。在一個實施方案中，所述嵌合分子包含BvS或EG-VEGF與標簽多肽所形成的融合體，該標簽多肽提供抗-標簽抗體可以選擇性結(jié)合的表位。表位標簽一般位于BvS或 EG-VEGF的氨基-或羧基-末端。Bv8和/或EG-VEGF的這類表位-標記形式的存在可以使用抗標簽多肽的抗體來檢測。另外，提供表位標簽，使BvS和/或EG-VEGF能利用抗-標簽抗體或另一類與該表位標簽結(jié)合的親和基質(zhì)容易地進行親和純化。各種標簽多肽及其各自的抗體是本領(lǐng)域眾所周知的。實例包括聚-組氨酸(poly-his)或聚-組氨酸-甘氨酸(poly-his-gly)標簽；flue HA 標簽多肽及其抗體 12CA5 (Field 等，Mol. Cell. Biol.， 8 :2159-2165(1988)) ；c-myc 標簽以及針對它的 8F9、3C7、6E10、G4、B7 和 9E10 抗體(Evan 等，Molecular 和 Cellular Biology, 5 :3610-3616(1985))；單純皰疹病毒糖蛋白 D(gD) 標簽及其抗體(Paborsky 等，Protein Engineering, 3 (6) :547-553 (1990))。其它標簽多肽包括 Flag-肽(Hopp 等，BioTechnology, 6 :12041210(1988)) ；KT3 表位肽(Martin 等， Science, 255 :192-194(1992)) ；α -微管蛋白表位肽(Skinner 等，J. Biol. Chem.，266 15163-15166(1991))；和 T7 基因 10 蛋白肽標簽(Lutz-Freyermuth 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87 :6393-6397(1990))。在另一實施方案中，嵌合分子可包括Bv8和/或EG-VEGF與免疫球蛋白或免疫球蛋白特定區(qū)域的融合。對于二價形式的嵌合分子(也稱“免疫粘附素”)而言，所述融合可以是與IgG分子的Fc區(qū)融合。
最簡單和最直接的免疫粘附素設(shè)計是將“粘附素”蛋白的結(jié)合區(qū)與免疫球蛋白重鏈的鉸鏈區(qū)和Fc區(qū)結(jié)合。通常，制備本發(fā)明所用的BvS-免疫球蛋白嵌合體或EG-VEGF-免疫球蛋白嵌合體時，將編碼BvS和/或EG-VEGF的核酸在C末端與編碼免疫球蛋白恒定區(qū)序列的N末端融合，也可以進行N末端融合。通常在此融合中，編碼的嵌合多肽至少保留免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)的功能活性鉸鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)。還可以與恒定區(qū)的Fc區(qū)的C末端或者緊鄰重鏈CHl的N-末端處或輕鏈的相應區(qū)域進行融合。進行所述融合的確切位點并不重要；具體位點是眾所周知的，并且為了使BvS-免疫球蛋白嵌合體的生物活性最佳，可以對這些位點進行選擇。在一些實施方案中，BvS-免疫球蛋白嵌合體和/或EG-VEGF-免疫球蛋白嵌合體被組裝成單體，或者異型或同型多聚體，尤其二聚體或四聚體，基本上如WO 91/08298所述。在優(yōu)選實施方案中，Bv8和/或EG-VEGF序列與抗體C末端區(qū)(尤其Fc區(qū))的N 末端融合，所述C末端區(qū)具有免疫球蛋白，例如免疫球蛋白Gl(IgGl)的效應功能。可以將整個重鏈恒定區(qū)與BvS和/或EG-VEGF序列融合。然而，更優(yōu)選在融合中應用起始于鉸鏈區(qū)中正好在木瓜蛋白酶切割位點(它從化學上限定IgG Fe;以重鏈恒定區(qū)的第一個殘基為 114時的殘基216，或其它免疫球蛋白的類似位點)上游的序列。在具體優(yōu)選實施方案中， Bv8氨基酸序列與IgGl，IgG2，或IgG3重鏈的鉸鏈區(qū)和CH2和CH3，或與CH1、鉸鏈、CH2和 CH3區(qū)融合。融合的確切位點并非關(guān)鍵，最佳位點可以通過常規(guī)實驗來確定。在一些實施方案中，所述BvS和/或EG-VEGF免疫球蛋白嵌合體被組裝為多聚體，尤其是同型-二聚體或-四聚體。通常，這些組裝好的免疫球蛋白具有已知的單元結(jié)構(gòu)。可以形成一種基本的四鏈結(jié)構(gòu)單元，其中有IgG、IgD和IgE。四-單元在較高分子量免疫球蛋白中重復；IgM—般以通過二硫鍵維持的基本四-單元的五聚體形式存在。IgA球蛋白，偶爾也包括IgG球蛋白，在血清中也以多聚體的形式存在。在多聚體的情況中，每個四-單元可以相同或不同?；蛘撸蓪vS或EG-VEGF序列插入免疫球蛋白重鏈和輕鏈序列之間，以得到含有嵌合重鏈的免疫球蛋白。在這個實施方案中，將BvS或EG-VEGF序列與免疫球蛋白每個臂中的重鏈3’末端融合，可以是在鉸鏈和CH2區(qū)之間或在CH2和CH3區(qū)之間。類似的構(gòu)建體可參見 Hoogenboom 等，Mol. Immunol. ,28 :1027-1037(1991)的報道。盡管本發(fā)明的免疫粘附素不需要免疫球蛋白輕鏈的存在，但也可使免疫球蛋白輕鏈與BvS或EG-VEGF免疫球蛋白重鏈融合多肽共價結(jié)合，或直接與BvS或EG-VEGF融合。在前一種情況中，編碼免疫球蛋白輕鏈的DNA通常與編碼BvS或EG-VEGF免疫球蛋白重鏈融合蛋白的DNA共表達。通過分泌，雜合重鏈和輕鏈共價結(jié)合，從而提供一種免疫球蛋白-樣結(jié)構(gòu)，它含有兩個二硫鍵連接的免疫球蛋白重鏈-輕鏈對。適合制備此類結(jié)構(gòu)的方法可以參見，例如美國專利4，816,567 (1989年3月28日授權(quán))。在一優(yōu)選實施方案中，用于構(gòu)建本發(fā)明免疫粘附素的免疫球蛋白序列來自IgG免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)。對人免疫粘附素而言，優(yōu)選使用人IgGl和IgG3免疫球蛋白序列。使用IgGl的主要好處是，IgGl免疫粘附素可以在固相蛋白A上有效純化。IgG3的純化需要蛋白G，這是一種遠不及蛋白A常用的介質(zhì)。然而，當選擇具體免疫粘附素構(gòu)建體的Ig融合配對物時，應該考慮免疫球蛋白的其它結(jié)構(gòu)和功能特性。例如，IgG3鉸鏈較長且較易彎曲(flexible)，因此它與可以適應較大的粘附素結(jié)構(gòu)域，這樣的結(jié)構(gòu)域在與IgGl融合時可能不能正確折疊或發(fā)揮功能。另一考慮是化合價；IgG免疫粘附素都是二價同型二聚體，而Ig 亞型象IgA和IgM分別可產(chǎn)生基本Ig同型二具體單元的二聚體或五聚體結(jié)構(gòu)。對那些為體內(nèi)應用而設(shè)計的BvS免疫粘附素而言，由Fc區(qū)決定的藥代動力學特性和效應功能也是重要的。盡管IgGl，IgG2和IgG4都具有21天的體內(nèi)半衰期，但它們激活補體系統(tǒng)的潛力是不同的。IgG4不激活補體，IgG2的補體激活能力顯著弱于IgGl0而且，與IgGl不同，IgG2 不結(jié)合單核細胞或中性粒細胞表面的Fc受體。IgG3對于補體激活而言是最佳的，但其體內(nèi)半壽期僅為其它IgG同種型的約三分之一。對設(shè)計用于人治療的免疫粘附素而言，另一個重點考慮是具體同種型的同種異型(allotypic)變體的數(shù)量。一般優(yōu)選具有較少的血清學限定性同種異型的IgG同種型。例如，IgGl僅具有四個血清學限定性同種異型位點，其中兩個(Glm和2、位于Fc區(qū)中；其中的Glml不具有免疫原性。而IgG3中有12個血清學限定性同種異型，它們都位于Fc區(qū)中；其中僅3個位點(G;3m5，ll和21)具有一種非免疫原性同種異型。因此，Y 3免疫粘附素的潛在免疫原性大于Yl免疫粘附素的。對親本免疫球蛋白而言，一個有效連接點是緊靠鉸鏈區(qū)胱氨酸上游之處，它形成兩條重鏈之間的二硫鍵。在常用的設(shè)計中，將該分子BvS部分的C-末端殘基的密碼子置于緊靠IgGl鉸鏈區(qū)序列DKTHTCPPCP的密碼子上游之處。適于構(gòu)建和表達免疫粘附素的一般方法與上文中涉及Bv8和EG-VEGF的方法相同。BvS和EG-VEGF免疫粘附素最方便的構(gòu)建方法是，將編碼BvS或EG-VEGF部分的 cDNA序列與Ig cDNA序列融合在同一閱讀框內(nèi)。也可以與基因組Ig片段融合(參見，例如 Gascoigne 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84 :2936-2940 (1987) ；Aruffo 等，Cell, 61 1303-1313(1990) ftamenkovic 等，Cell，66 :1133-1144(1991))。后一種融合形式需要表達調(diào)節(jié)序列的存在。編碼IgG重鏈恒定區(qū)的cDNA，可以根據(jù)已公開的序列，從衍生自脾或外周血淋巴細胞的cDNA文庫中，通過雜交或通過聚合酶鏈反應(PCR)技術(shù)分離。將編碼BvS 或EG-VEGF的cDNA以及免疫粘附素的Ig部分串聯(lián)插入能在所選宿主細胞中指導有效表達的質(zhì)粒載體中。為了在哺乳動物細胞中表達，可以采用基于PRK5的載體(khall等，Cell， 61 :361-370(1990))和基于 CDM8 的載體(Seed, Nature, 329 :840 (1989))?？梢岳霉押塑账岫ㄏ蛉笔дT變，除去所設(shè)計的連接密碼子之間的額外序列，來創(chuàng)建真正的連接(hller 等，核酸 Res.，10 :6487(1982) ；Capon 等，Nature，337 :525-531 (1989))?？梢允褂煤铣晒押塑账?，其中每一半與所需連接的任一側(cè)的序列互補；理想條件下，它們是36體-48體?；蛘?，可以通過PCR用合適的載體將該分子的兩部分連接在同一閱讀框中。對表達BvS或EG-VEGF免疫粘附素的宿主細胞系的選擇主要取決于表達載體。另一個考慮是需要的蛋白量。毫克量常?？梢酝ㄟ^瞬時轉(zhuǎn)染來產(chǎn)生。例如，經(jīng)腺病毒EIA-轉(zhuǎn)化的293人胚腎細胞系可以用基于pRK5的載體通過改良的磷酸鈣方法進行瞬時轉(zhuǎn)染，從而有效表達免疫粘附素?；贑DM8的載體可以用于通過DEAE-葡聚糖法轉(zhuǎn)染 COS 細胞(Aruffo 等，Cell,61 :1303-1313(1990) ；Zettmeissl 等，DNA Cell Biol. US,9 347-353 (1990))。當希望獲得大量蛋白時，可以在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染宿主細胞系之后表達免疫粘附素。例如，可以將基于PRIC5的載體在存在編碼二氫葉酸還原酶(DHFR)并賦于G418抗性的附加質(zhì)粒的情況下引入中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。在培養(yǎng)中選出G418抗性克??；在有水平不斷增加的DHFR抑制劑氨甲蝶呤存在的情況下培養(yǎng)這些克?。贿x出編碼DHFR的基因拷
41貝和免疫粘附素序列的數(shù)量一起被擴增的那些克隆。當免疫粘附素在其N-端包含疏水前導序列時，它傾向于被轉(zhuǎn)染細胞加工并分泌。具有更復雜結(jié)構(gòu)的免疫粘附素的表達可能需要唯一匹配的宿主細胞；例如，象輕鏈或J鏈等組分可以由特定的骨髓瘤或雜交瘤細胞宿主來提供(Gascoigne 等，1987，出處同上，Martin 等，1993，J. Virol. ,67 :3561-3568)。免疫粘附素可以通過親和層析方便地進行純化。蛋白A作為親和配體的合適性取決于嵌合體中所用的免疫球蛋白Fc區(qū)的類別和同種型。蛋白A可以用于純化那些基于人 Y 1, Y 2，或 Y 4 重鏈的免疫粘附素(Lindmark 等，J. Immunol. Meth.，62 :1-13 (1983))。蛋白G被推薦用于小鼠的所有同種型和人的Y3(Guss等，EMBO J.，5 :1567-1575 (1986))。親和配體所附著的基質(zhì)最常見瓊脂糖，也可以用其它基質(zhì)。機械穩(wěn)定型基質(zhì)如控制孔徑的玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯與瓊脂糖相比能允許較快的流速和較短的處理時間。使免疫粘附素與蛋白A或蛋白G親和柱結(jié)合所需的條件完全取決于Fc區(qū)的特性；即，其類別和同種型。一般而言，當選擇了正確的配體時，在未經(jīng)培養(yǎng)的培養(yǎng)液中可以直接產(chǎn)生有效結(jié)合。免疫粘附素的區(qū)別特征之一是，對于人Yl分子而言，與蛋白A結(jié)合的能力相對于具有相同F(xiàn)c 型別的抗體而言在一定程度上減弱。結(jié)合的免疫粘附素可以在酸性PH(3. O或更高)或在含有離液序列適中的鹽的PH緩沖液中有效洗脫。這種親和層析步驟可以獲得> 95%純的免疫粘附素制劑?？梢杂帽绢I(lǐng)域已知的其它方法替代，或補充在蛋白A或G上進行的親和層析，來純化免疫粘附素。免疫粘附素的行為在嗜硫凝膠層析(Hutchens等，Anal. Biochem.， 159 :217-226(1986))和固相金屬螯合層析(Al-Mashikhi 等，J. Dairy Sci. ,71 1756-1763(1988))中與抗體類似。但與抗體相反，它們在離子交換柱上的行為不僅取決于它們的等電點，還取決于它們的嵌合特性所導致的分子中的偶極電荷(charge dipole)。需要時，可以制備雙特異性免疫粘附素。因此，本發(fā)明的免疫粘附素可以將BvS 或EG-VEGF區(qū)與另一區(qū)，如來自另一種生長因子的區(qū)包括但不限于VEGF，Bv8以及EG-VEGF 組合。對于雙特異性分子而言，由一條臂上的嵌合抗體重鏈和另一條臂上的嵌合抗體重鏈-輕鏈對組成的具有它們的抗體-樣結(jié)構(gòu)的三聚體分子是有利的，因為它們易于純化。常規(guī)用于生產(chǎn)雙特異性免疫粘附素的抗體-生成quadroma可以產(chǎn)生十種四聚體的混合物，與它相反，用編碼三聚體免疫粘附素的三條鏈的核酸轉(zhuǎn)染的細胞僅僅產(chǎn)生三種分子的混合物，從該混合物中純化所需產(chǎn)物要相對較容易。F.制備并鑒定Bv8和EG-VEGF活性的調(diào)節(jié)物本發(fā)明還涉及篩選化合物以便鑒定那些能模擬或增強BvS和/或EG-VEGF的一或多種生物活性(激動劑)或阻止BvS和/或EG-VEGF的效應(拮抗劑)的方法。BvS和 EG-VEGF激動劑和拮抗劑也稱BvS和EG-VEGF調(diào)節(jié)物。針對拮抗劑藥物候選物的篩選試驗經(jīng)過設(shè)計，可以鑒定出與BvS和/或EG-VEGF多肽結(jié)合或與之形成復合物，或者干擾BvS和 /或EG-VEGF與其它細胞蛋白相互作用的化合物。1.小分子篩選小分子可以具有作為BvS激動劑或拮抗劑和/或EG-VEGF激動劑或拮抗劑的能力并因此具有治療價值。這樣的小分子可以包括天然小分子，合成的有機或無機化合物和肽。但本發(fā)明的小分子不限于這些形式。市場上已有廣泛多種小分子文庫，本領(lǐng)域也已知廣泛多種篩選具有所需活性的小分子的試驗。
候選的BvS激動劑或拮抗劑和/或EG-VEGF激動劑或拮抗劑小分子優(yōu)選首先在允許快速鑒定BvS和/或EG-VEGF活性的潛在調(diào)節(jié)物的試驗中予以鑒定。這類試驗的一個實例是蛋白-蛋白結(jié)合試驗，其中檢測候選分子與BvS或EG-VEGF受體結(jié)合的能力。在另一實例中，檢測候選分子干擾BvS與BvS受體結(jié)合或者EG-VEGF與EG-VEGF受體結(jié)合的能力。一個實施方案中，Bv8受體或EG-VEGF受體分別為Bv8或EG-VEGF受體-1和Bv8或EG-VEGF 受體-2。在優(yōu)選實施方案中，小分子Bv8或EG-VEGF激動劑通過它們模擬Bv8或EG-VEGF 的一或多種生物活性的能力來鑒定。例如，篩選小分子的以下能力誘導內(nèi)皮細胞增殖，促進內(nèi)皮細胞存活，如下文所述，或誘導血管生成，如下文所述。誘導BvS或EG-VEGF的一或多種所述生物活性的候選化合物被鑒定為激動劑。在另一實施方案中，小分子Bv8或EG-VEGF拮抗劑通過它們抑制Bv8或EG-VEGF 的一或多種生物活性的能力來鑒定。例如，篩選小分子的以下能力抑制內(nèi)皮細胞增殖，內(nèi)皮細胞存活，或血管生成，如下文所述。抑制BvS或EG-VEGF的一或多種所述生物活性的候選化合物被鑒定為拮抗劑。候選化合物誘導或抑制血管生成的能力在例如WO 02/00711和W003/020892中的小鼠實驗中測定。內(nèi)皮細胞增殖內(nèi)皮細胞存活鑒定為BvS和/或EG-VEGF激動劑或拮抗劑的化合物可以應用在本發(fā)明的方法中。例如，Bv8和/或EG-VEGF拮抗劑可以用于治療癌癥。2.制備和鑒定抗體能模擬BvS和/或EG-VEGF生物學特性的激動劑型的人和非-人多克隆和單克隆抗體(包括非-人單克隆抗體的人源化形式)，以及能抑制BvS和/或EG-VEGF生物學特性的拮抗劑型的人和非-人多克隆和單克隆抗體(包括非-人單克隆抗體的人源化形式)，也包括在本發(fā)明中。這些包括抗體的氨基酸序列變體，糖基化變體和片段。制備這類抗體并篩選激動劑抗體的一般技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，簡述如下。( )多克隆抗體制備多克隆抗體的方法為本領(lǐng)域已知。多克隆抗體可在哺乳動物中產(chǎn)生，例如，通過一次或多次注射致免疫劑，如果需要，可加入佐劑。通常，對哺乳動物皮下或腹膜內(nèi)多次注射致免疫劑和/或佐劑。將致免疫劑與在所免疫的哺乳動物中具有免疫原性的蛋白(如血清白蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑)進行偶聯(lián)是有效的。可以使用的佐劑的實例包括弗氏完全佐劑和MPL-TDM。(ii)單克隆抗體單克隆抗體可以使用由Kohler和Milstein，Nature，256 :495(1975)首次描述的雜交瘤方法來制備，或者可以通過重組DNA方法來制備(美國專利4，816，567)。在雜交瘤方法中，對小鼠或其它適宜宿主動物如倉鼠或獼猴(macaque monkey)按照上文所述進行免疫，以刺激那些產(chǎn)生或能夠產(chǎn)生與免疫所用蛋白特異性結(jié)合的抗體的淋巴細胞?；蛘?，淋巴細胞可以在體外致敏。然后，將淋巴細胞與骨髓瘤細胞用合適的融合劑，如聚乙二醇融合，以便形成雜交瘤細胞(Goding，Monoclonal Antibodies principles禾口 Practice, pp. 59-103, (Academic Press,1986))。如此制備的雜交瘤細胞可以接種在適宜培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基優(yōu)選含有一或多種抑制未融合的親本骨髓瘤細胞生長或存活的物質(zhì)。例如，親本骨髓瘤細胞缺乏次黃嘌呤烏嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT)時，雜交瘤的培養(yǎng)基通常包括次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培養(yǎng)基)，這些物質(zhì)阻止HGPRT-缺陷型細胞的生長。優(yōu)選骨髓瘤細胞是那些能有效融合、支持所選抗體生成細胞以穩(wěn)定的高水平產(chǎn)生抗體，并對諸如HAT培養(yǎng)基等類似培養(yǎng)基敏感的細胞。其中，優(yōu)選的骨髓瘤細胞系是鼠骨髓瘤系，如由 Salk Institute Cell Distreibution Center, San Diego, California USA提供的M0PC-21和Μ. C. -11小鼠腫瘤，和由美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Rockvilie，Maryland USA 提供的SP-2或)(63-Ag8-653細胞。也有報道稱人骨髓瘤以及小鼠-人異質(zhì)性骨髓瘤細胞系可用于產(chǎn)生人單克隆抗體(Kozbor，J. Immunol.，133 :3001(1984) ；Brodeur 等，Monoclonal Antibody Production Techniques 禾口 Applications, pp. 51-63 Marcel Dekker,Inc., New York,1987))?？稍诤猩L的雜交瘤細胞的培養(yǎng)基中分析抗所述抗原的單克隆抗體的產(chǎn)生。優(yōu)選地，雜交瘤細胞所產(chǎn)生的單克隆抗體的結(jié)合特異性通過免疫沉淀或通過體外結(jié)合試驗，如放射免疫分析(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)來分析。單克隆抗體的結(jié)合親和力可通過，例如Muson等，Anal. Biochem.，107 :220 (1980) 所述katchard分析來測定。鑒定出能產(chǎn)生具有所需特異性、親和力、和/或活性的抗體的雜交瘤細胞后，將這些細胞通過有限稀釋法進一步克隆并用標準方法進行培養(yǎng)(Goding，Monoclonal Antibodies :Principles 禾口 Practice，pp. 59—103 (Academic Press，1986)) 。目白勺白勺培養(yǎng)基包括，例如，D-MEM或RPMI-1640培養(yǎng)基。另外，雜交瘤細胞可以進行體內(nèi)生長，為動物中的腹水腫瘤形式。由這些亞克隆分泌的單克隆抗體可以適當?shù)赜贸Ｒ?guī)免疫球蛋白純化方法從培養(yǎng)基、腹水或血清中分離，所述方法例如蛋白-A-Sepharose、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析。編碼單克隆抗體的DNA可用常規(guī)方法很容易的分離和測序(如利用能與編碼該單克隆抗體重鏈和輕鏈的基因特異結(jié)合的寡核苷酸探針)。雜交瘤細胞是這類DNA的優(yōu)選來源。DNA分離后，可將其插入表達載體中，然后用此表達載體轉(zhuǎn)染宿主細胞，如大腸桿菌細胞、猴COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或不產(chǎn)生免疫球蛋白的骨髓瘤細胞，以便在重組宿主細胞中合成單克隆抗體。DNA也可以通過，例如，用編碼人類重鏈和輕鏈恒定區(qū)的序列取代小鼠同源序列來修飾，Morrison 等，Proc. Nat. Acad. Sci. U. S. Α. 81 :6851 (1984))，或通過將非免疫球蛋白多肽的全部或部分編碼序列與免疫球蛋白編碼序列共價結(jié)合來修飾。在這種方式中，可以制備出具有本文所述BvS或EG-VEGF激動劑單克隆抗體或者BvS 或EG-VEGF拮抗劑單克隆抗體的結(jié)合特異性的“嵌合”或“雜合”抗體。嵌合或雜合抗體也可以用合成蛋白質(zhì)化學中的已知方法在體外制備，包括那些涉及交聯(lián)劑的方法。例如，可以用二硫鍵交換反應或通過形成硫醚鍵來構(gòu)建免疫毒素。適于此目的的合適試劑包括亞氨基硫醇酯(iminothiolate)和甲基_4_巰基丁基亞胺酸酯 (mercaptobutyrimidate)。
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抗體的重組制備將在下文中詳述。(iii)人源化抗體一般情況下，人源化抗體中已導入一或多個源自非人來源的氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基常稱為“引進的”殘基，它們通常來自“引進的”可變區(qū)。人源化過程基本是按照 Winter 及其同事(Jones 等，Nature，321 :522-525(1986) ；Riechmann 等，Nature，332 323-327(1988) ；Verhoeyen 等，Science，239 :1534-1536(1988))所述，用嚙齒類 CDR 或 CDR 序列取代人類抗體的相應序列來進行。因此，這樣的“人源化”抗體是嵌合抗體(Cabilly，出處同上)，其中完整人類可變區(qū)的很少一部分被非人物種的相應序列取代。實踐中，人源化抗體通常是人的抗體，其中 CDR殘基且可能有部分FR殘基被嚙齒類抗體中類似位點的殘基取代。重要的是，將抗體人源化后保留了對抗原的高親和力和其它有利的生物特性。為達到此目的，在一種優(yōu)選方法中，通過用親本序列和人源化序列的三維模型分析親本序列和各種概念性人源化產(chǎn)物來制備人源化抗體。免疫球蛋白三維模型已有商品，是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的。還有用于描述和展示所選免疫球蛋白序列可能的三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)的計算機程序。通過觀察這些展示結(jié)果可分析殘基在候選免疫球蛋白序列的功能中可能發(fā)揮的作用，即分析能影響候選免疫球蛋白與其抗原結(jié)合的能力的殘基。通過這種方法，可從共有序列和引進序列中選出FR殘基并組合，從而得到所需抗體性質(zhì)，如對靶抗原的親和力增加。總之，⑶R殘基直接并且最主要涉及對抗原結(jié)合的影響。詳見美國專利5，821，337和 6，054，297。(iv)人的抗體人單克隆抗體可以通過雜交瘤方法制備。人骨髓瘤和小鼠-人異質(zhì)性骨髓瘤細胞系用于產(chǎn)生人單克隆抗體的相關(guān)報道可參見，例如，Kozbor，J. Immunol. , 133 :3001(1984)； Brodeur Monoclonal Antibody Production Techniques 禾口 Applications, pp. 51-63 Marcel Dekker, Inc., New York,1987))?，F(xiàn)在可以制備轉(zhuǎn)基因動物(如小鼠)，它經(jīng)過免疫能在缺乏內(nèi)源性免疫球蛋白生成的情況下產(chǎn)生全套人抗體。例如，已指出在嵌合和胚系(germ-line)突變小鼠中，抗體重鏈連接區(qū)(JH)基因的純合缺失導致內(nèi)源性抗體生成的完全抑制。將人胚系免疫球蛋白基因陣列轉(zhuǎn)移到此胚系突變小鼠中，將導致在抗原攻擊的情況下產(chǎn)生人抗體。例如，見 Jakobovits 等，1993, Proc. Natl. Acad. Aci. USA, 90 :2551 (1993) Jakobovits 等，Nature, 362 :255-258oMondez 等(Nature Genetics 15 :146-156 (1997))進一步改進了該技術(shù)并產(chǎn)生出命名為“Xeno小鼠II”的轉(zhuǎn)基因小鼠品系，當其受到抗原攻擊時，可產(chǎn)生高親和性完全人抗體。這是通過將兆堿基人重鏈和輕鏈基因座經(jīng)胚系整合到上述具有內(nèi)源Jh節(jié)段缺失的小鼠中實現(xiàn)的。feno小鼠II具有含約66VH基因，完全和丄區(qū)以及三種不同恒定區(qū)(μ，δ 和χ )的1020Kb人重鏈基因座，并具有包含32VK基因，Jk節(jié)段和Ck基因的800Kb人κ基因座。這些小鼠中產(chǎn)生的抗體與人類中所見的抗體在各方面均十分相似，包括基因重排、組裝和所有組成成分。由于內(nèi)源Jh節(jié)段中的缺失阻止鼠基因座中的基因重排，人抗體優(yōu)先于內(nèi)源抗體表達?；蛘撸捎檬删w展示技術(shù)(McCafferty等，自然348 :552-553(1990))從未免疫供體的免疫球蛋白可變(V)區(qū)基因的所有組成而體外產(chǎn)生人類抗體和抗體片段。依據(jù)此技術(shù)，將抗體V區(qū)基因與絲狀噬菌體(如M13或fd)主要或次要衣殼蛋白基因克隆在相同的閱讀框內(nèi)，并在噬菌體顆粒的表面展示為功能性抗體片段。因為絲狀顆粒包含噬菌體基因組的單鏈DNA拷貝，根據(jù)抗體的功能特點進行的選擇也導致對顯示這些性質(zhì)的抗體的編碼基因進行選擇。因此，噬菌體模仿了B細胞的部分特點。噬菌體展示可以以多種形式進行；這些綜述見 Johnson, Kevin S.禾口 Chiswell, David J. , Current Opinion in Structural Biology 3 :564-571(1993)?？墒褂肰基因節(jié)段的多個來源進行噬菌體展示。Clackson等， Nature, 352 =624-628(1991)從免疫小鼠脾臟來源的V基因隨機組合小文庫中分離出一批多樣的抗-噁唑酮抗體?？苫救鏜arks等，J. Mol. Biol. 222 :581-597 (1991)，或Griffith 等，EMBO J. 12 :725-734(1993)所述，構(gòu)建未免疫的人類供體的V基因庫，并分離針對多種多樣抗原(包括自身抗原)的抗體。在天然免疫應答中，抗體基因以較高速率積累突變(體細胞超變)。其中一些變化賦于較高親和力，而展示高親和力表面免疫球蛋白的B細胞在隨后的抗原攻擊階段優(yōu)先復制并分化。這種天然過程可以用已知為“鏈改組”的技術(shù)(Marks 等，Bio/Technol. 10，779-783 [1992])來模仿。在該方法中，通過噬菌體展示而獲得的“原代”人抗體的親和力可以得到改進，方法是用未免疫供體的V區(qū)基因的天然變體所有組成相繼取代重鏈和輕鏈V區(qū)基因。該技術(shù)允許產(chǎn)生具有nM水平的親和力的抗體和抗體片段。制備非常大的噬菌體抗體庫(也稱“所有庫的母庫”(the mother-of-alIlibrary))的策略在Waterhouse等，Nucl. Acids Res. 21，2265-2266 (1993)中描述，直接從這樣的噬菌體大文庫中分離出高親和力人抗體的技術(shù)可參見Griffith等，EMBO J. (1994)，待出版。基因改組也可以用于從嚙齒動物的抗體衍生出人抗體，其中的人抗體具有與起始的嚙齒動物抗體相似的親和性和特異性。根據(jù)該方法(也稱“表位印痕(印itope imprinting)”)，通過噬菌體展示技術(shù)獲得的嚙齒動物抗體重鏈或輕鏈V區(qū)基因被人V區(qū)基因所有組成取代，產(chǎn)生嚙齒動物-人嵌合體。對抗原的選擇導致分離出能重建原功能性抗原結(jié)合位點的人類可變區(qū)，即表位控制(govern)(決定(imprint))對配對物的選擇。當重復該方法以取代余下的嚙齒動物V區(qū)時，獲得人抗體(見PCT專利申請WO 93/06213，公開于1993年4月1日)。與嚙齒動物的抗體通過CDR移植進行的傳統(tǒng)人源化不同，該技術(shù)提供徹底的人抗體，其不具有嚙齒動物來源的框架或CDR殘基。(V)雙特異性抗體雙特異性抗體是具有針對至少兩種不同表位的結(jié)合特異性的單克隆抗體(優(yōu)選人抗體或人源化抗體)。制備雙特異性抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。傳統(tǒng)上，雙特異性抗體的重組制備是基于兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對的共表達，其中這兩條鏈具有不同特異性 (Millstein和Cuello，Nature，305 :537-539 (1983))。由于免疫球蛋白重鏈輕鏈隨機分配，這些quadroma產(chǎn)生10種不同抗體分子的混合物，其中只有一種具有正確的雙特異性結(jié)構(gòu)。對所述正確分子的純化(通常通過親和層析步驟來進行)非常復雜，且產(chǎn)量很低。類似的方法見冊93/08擬9(1993 年 5 月 13 日公開)和 Traunecker 等，EMBO J, 10 :3655-3659(1991)。依據(jù)另一種并且是更優(yōu)選的方法，可將具有所需結(jié)合特異性(抗體-抗原結(jié)合位點)的抗體可變區(qū)與免疫球蛋白恒定區(qū)序列融合。該融合優(yōu)選與包含鉸鏈區(qū)、CH2及CH3區(qū)的至少一部分的免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)融合。優(yōu)選使含有輕鏈結(jié)合所需位點的第一重鏈恒定區(qū)(CHl)出現(xiàn)在至少在一種融合中。可將編碼免疫球蛋白重鏈融合體，以及必要時，編碼免疫球蛋白輕鏈的DNA插入不同表達載體，共轉(zhuǎn)染至適當宿主生物。這使得在使用非等比的三種多肽鏈進行構(gòu)建的實施方案中，能夠較靈活地調(diào)整三種多肽片段的相互比例，以獲得最佳產(chǎn)量。但也可在至少兩種多肽鏈以等比例表達而獲得高產(chǎn)時或所述比例無特別意義時，將兩種或所有三種多肽鏈的編碼序列插入同一表達載體。在該方法的一個優(yōu)選實施方案中，所述雙特異性抗體由一條臂上的具有第一結(jié)合特異性的雜合免疫球蛋白重鏈和另一條臂上的雜合免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(提供第二結(jié)合特異性)構(gòu)成。已發(fā)現(xiàn)這種不對稱結(jié)構(gòu)有利于從非必要免疫球蛋白鏈的混合中分離出所需雙特異性化合物，因為只有該雙特異性分子的一半存在免疫球蛋白輕鏈，這使得分離更加容易。此方法公開于1994年3月3 日公開的W094/04690中。制備雙特異性抗體的進一步細節(jié)可以參見，例如Suresh等，Methods in Enzymology，121 :210 (1986)。(vi)異源偶聯(lián)抗體異源偶聯(lián)抗體由兩個共價連接的抗體組成。此種抗體據(jù)稱例如可以使免疫系統(tǒng)細胞靶向不需要的細胞(美國專利4，676，80)和用于治療HIV感染(W091/00360和WO 92/200373 ；EP 03089)。異源偶聯(lián)抗體可以用任何方便的交聯(lián)方法來制備。適宜的交聯(lián)劑為本領(lǐng)域已知，并在美國專利4，676，980中與一些交聯(lián)技術(shù)一起公開。(Vii)抗體片段在一些實施方案中，所述激動劑和/或拮抗劑抗體(包括鼠，人和人源化抗體，以及抗體變體)是抗體片段。已開發(fā)了多種技術(shù)用于生產(chǎn)抗體片段。傳統(tǒng)上，這些片段通過對完整抗體進行蛋白水解消化來衍生(見例如，Morimoto等，J. Biochem. Biojphys. Methods 24 :107-117(1992)和 Brennan 等，Science 229 :81(1985)) 然而，這些片段現(xiàn)在可通過重組宿主細胞直接產(chǎn)生。例如，F(xiàn)ab' -SH片段可從大腸桿菌直接回收并利用化學方法偶聯(lián)形成 F(ab' )2 片段(Carter 等，Bio/Technology 10:163-167(1992))。在另一實施方案中，利用亮氨酸拉鏈GCN4形成F(ab' )2以便促進F(ab' )2分子的組裝。根據(jù)另一方法，F(xiàn)v， Fab或F(ab' )2片段可以直接從重組宿主細胞培養(yǎng)物中分離。制備抗體片段的其它技術(shù)對于熟練技術(shù)人員而言是顯而易見的。(Viii)鑒定激動劑抗體 Bv8或EG-VEGF激動劑抗體根據(jù)它們誘導Bv8或EG-VEGF的生物活性，包括但不限于內(nèi)皮細胞增殖，內(nèi)皮細胞存活以及血管生成的能力來鑒定。測定內(nèi)皮細胞增殖，內(nèi)皮細胞存活以及血管生成的實驗是本領(lǐng)域已知的。內(nèi)皮細胞增殖的誘導可如上述“小分子”標題下所述內(nèi)容進行。BvS和EG-VEGF激動劑抗體可通過其誘導血管生成的能力鑒定，例如在 W002/00711和WO 03/020892中所述的小鼠實驗中進行。(Viii)鑒定拮抗劑抗體Bv8或EG-VEGF拮抗劑抗體根據(jù)它們抑制8或EG-VEGF的生物活性，包括但不限于內(nèi)皮細胞增殖，內(nèi)皮細胞存活以及血管生成的能力來鑒定，例如利用上述實驗之一G.篩選與Bv8和/或EG-VEGF相互作用的蛋白的試驗適于檢測蛋白-蛋白相互作用的任何方法都可以用于鑒定與BvS和/或EG-VEGF 相互作用的蛋白或其它分子，包括但不限于跨膜蛋白或細胞內(nèi)蛋白。在眾多可以應用的傳統(tǒng)方法中，有免疫沉淀，利用梯度或?qū)游鲋M行交聯(lián)和共-純化，來鑒定與BvS和/或EG-VEGF相互作用的蛋白。在這樣的試驗中，BvS或EG-VEGF組分可以是全長蛋白，其可溶性衍生物，對應于目的結(jié)構(gòu)域的肽，或含有BvS或EG-VEGF某一區(qū)域的融合蛋白。可以采用能同時鑒定編碼與BvS或EG-VEGF相互作用的蛋白的基因的方法。這些方法包括，例如，用標記的BvS或EG-VEGF或其變體，按照類似于已知對λ gtll文庫的抗體探測技術(shù)的方式來探測表達庫。一種體內(nèi)檢測蛋白質(zhì)相互作用的方法，雙雜合體系(two-hybrid system)在這里詳細描述作為舉例，而非限制。該體系的一種版本已有文獻描述(Chien等，1991，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88 :9578-9582)，并且可以從 Clontech (Palo Alto, CA)購買。簡言之，可以利用這樣的體系構(gòu)建編碼兩種雜合蛋白的質(zhì)粒其中一種質(zhì)粒由編碼轉(zhuǎn)錄激活蛋白的DNA-結(jié)合區(qū)的核苷酸與編碼BvS或EG-VEGF、或其多肽、肽、或融合蛋白的核苷酸序列融合而組成，另一種質(zhì)粒作為cDNA文庫的一部分、由編碼轉(zhuǎn)錄激活蛋白的激活區(qū)的核苷酸與編碼已重組在該質(zhì)粒中的未知蛋白的cDNA融合而組成。將DNA-結(jié)合區(qū)融合質(zhì)粒和cDNA文庫轉(zhuǎn)化到含有報告基因的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，所述報告基因(如HBS或IacZ)的調(diào)節(jié)區(qū)包含所述轉(zhuǎn)錄激活劑的結(jié)合位點。任何一種雜合蛋白單獨都不能激活該報告基因的轉(zhuǎn)錄所述DNA-結(jié)合區(qū)雜合體不能激活是因為它不能提供激活功能，所述激活區(qū)雜合體不能激活是因為它不能定位到激活劑結(jié)合位點。這兩種雜合蛋白的相互作用可以重新組建功能性激活蛋白，并導致報告基因的表達，該表達可以通過測定該報告基因產(chǎn)物的試驗來檢測。所述雙雜合體系或相關(guān)方法學可以用于篩選與“誘餌(bait) ”基因產(chǎn)物相互作用的蛋白的激活區(qū)文庫。例如，但并非限制地，可以用BvS和/或EG-VEGF作為誘餌基因產(chǎn)物。將總基因組或cDNA序列與編碼激活區(qū)的DNA融合。用該文庫和編碼誘餌BvS基因產(chǎn)物或誘餌EG-VEGF基因產(chǎn)物與DNA結(jié)合區(qū)融合所得的雜合體的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化到酵母報告菌株中，并篩選出表達該報告基因的轉(zhuǎn)化體。例如，但并非限制地，可以將誘餌BvS基因序列或誘餌EG-VEGF基因序列，例如所述基因的開放讀框，克隆到載體中，使其與編碼GAL4蛋白的 DNA-結(jié)合區(qū)的DNA融合在一起被翻譯。純化這些菌落，并分離出負責報告基因表達的文庫質(zhì)粒。然后用DNA測序來鑒定所述文庫質(zhì)粒編碼的蛋白。當從一種細胞系中檢測出與誘餌BvS基因產(chǎn)物或誘餌EG-VEGF基因產(chǎn)物相互作用的蛋白時，可以用本領(lǐng)域常規(guī)實踐的方法制備該細胞系的cDNA文庫。根據(jù)本文所述的具體體系，例如，可以將cDNA片段插入載體中，使它們與GAL4的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)融合在一起被翻譯。該文庫可以與誘餌Bv8基因-GAL4融合質(zhì)?；蛘T餌EG-VEGF基因-GAL4融合質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化到含有IacZ基因的酵母菌株中，所述IacZ基因受到含有GAL4激活序列的啟動子驅(qū)動。由 cDNA編碼、與GAL4轉(zhuǎn)錄激活區(qū)融合、并與誘餌Bv8基因產(chǎn)物或誘餌EG-VEGF基因產(chǎn)物相互作用的蛋白可以重新組建活性GAL4蛋白并因此驅(qū)動表達?？梢杂帽绢I(lǐng)域常規(guī)方法檢測出驅(qū)動表達的菌落。然后從這些菌株純化出cDNA，將其用于通過本領(lǐng)域常規(guī)實踐的技術(shù)來制備并分離誘餌BvS基因-相互作用蛋白或誘餌EG-VEGF基因-相互作用蛋白。 1.調(diào)節(jié)Bv8和/或EG-VEGF表達或活性的化合物設(shè)計以下試驗來鑒定與BvS或EG-VEGF相互作用(即發(fā)生結(jié)合)的化合物，干擾 Bv8或EG-VEGF與其結(jié)合配對物、關(guān)連物(cognate)或受體的相互作用的化合物，以及調(diào)節(jié) Bv8和/或EG-VEGF基因表達活性(即調(diào)節(jié)Bv8和/或EG-VEGF基因表達水平)或調(diào)節(jié)機
48體中Bv8和/或EG-VEGF水平的化合物。還可以利用該試驗鑒定出與Bv8和/或EG-VEGF 基因調(diào)節(jié)序列(如啟動子序列)結(jié)合、并因此可調(diào)節(jié)BvS和/或EG-VEGF基因表達的化合物。參見，例如 Platt，K.A. , 1994, J. Biol. Chem. 269 :28558_28562?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明進行篩選的化合物包括，但不限于，肽，抗體及其片段，以及其它有機化合物(例如肽模擬物)，它們可以與BvS或EG-VEGF，或Bv8/EG_VEGF受體結(jié)合，并模擬由天然配體激發(fā)的活性(即激動劑)或抑制由天然配激發(fā)的活性(即拮抗劑)。這類化合物包括但不限于肽，如可溶性肽，包括但不限于隨機肽文庫的成員；(參見，例如，Lam, K. S.等，1991，Nature 354 :82-84 ；Houghten, R.等，1991，Nature 354 84-86)，以及由D-和/或L-構(gòu)型的氨基酸組成的組合型化學衍生分子庫的成員，磷肽 (phosphopeptides)(包括但不限于隨機或部分變性的直接磷肽庫的成員(members of random 或 partially degenerate, directed phosphopeptide libraries)；參見，例如， Songyang, Ζ.等，1993，Cell 72 :767-778)，抗體(包括但不限于多克隆抗體，人源化抗體，抗-獨特型抗體，嵌合抗體或單鏈抗體，以及FAb，F(xiàn) (abN) 2和FAb表達庫片段，及其表位-結(jié)合片段)，還有有機或無機分小子?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明進行篩選的其它化合物包括，但不限于，能進入相應細胞(如內(nèi)皮細胞)并影響B(tài)v8或EG-VEGF基因表達或影響與Bv8和/或EG-VEGF介導的途徑(例如，通過與涉及基因表達的調(diào)節(jié)區(qū)或轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生相互作用)有關(guān)的一些基因表達的有機小分子；或者，影響或替代BvS或EG-VEGF活性或影響或替代與BvS和/或EG-VEGF信號傳遞、分解代謝，或代謝途徑有關(guān)的一些其它細胞內(nèi)因子的活性的化合物。計算機建模和搜索技術(shù)允許鑒定能調(diào)節(jié)BvS或EG-VEGF表達或活性的化合物或已知化合物的改進。在鑒定出這樣的化合物或組合物后，可以鑒定出活性位點或區(qū)域。這樣的活性位點通常是配體結(jié)合位點。活性位點可以用本領(lǐng)域已知方法來鑒定，例如從肽的氨基酸序列，從核酸的核苷酸序列，或從相關(guān)化合物或組合物與其天然配體形成的復合物的研究來鑒定。在后一種情況中，可以用化學方法或X-線晶體成像方法，通過找出該因子 (factor)上發(fā)現(xiàn)復合配體之處來找出活性位點。接著，測定活性位點的二維幾何結(jié)構(gòu)。這可以通過已知方法(包括測定完整分子結(jié)構(gòu)的X-線晶體成像)來完成。另一方面，可以用固相或液相NMR來確定一些分子內(nèi)間距。任何其它測定結(jié)構(gòu)的實驗方法都可以用于獲得部分或完整的幾何結(jié)構(gòu)。幾何結(jié)構(gòu)可以用天然或人工的復合配體來測量，它可以提高所測定的活性位點結(jié)構(gòu)的精確度。如果測定出不完整或不夠精確的結(jié)構(gòu)，可以用基于計算機的數(shù)字化建模方法來完成該結(jié)構(gòu)或提高其精確度。任何可以識別的建模方法都可以使用，包括特異于具體生物大分子(如蛋白或核酸)的參數(shù)化模型，基于計算機化分子運動的分子動力學模型，基于熱系綜(thermal ensemble)的統(tǒng)計學機械模型，或組合模型。對大多數(shù)類型的模型而言，標準分子力場(代表原子和基團之間的力)是必需的，且可以選自物理化學中已知的力場。上述不完整或不夠精確的實驗結(jié)構(gòu)可以作為用這些建模方法通過計算機獲得更精確的完整結(jié)構(gòu)時的一種限制。最后，通過實驗，通過建模，或者通過組合而測定了活性位點(或結(jié)合位點)的結(jié)構(gòu)以后，可以通過搜索含有化合物以及它們分子結(jié)構(gòu)的信息的數(shù)據(jù)庫來鑒定候選的調(diào)節(jié)性化合物。這樣的搜索可找出具有與測定的活性位點結(jié)構(gòu)相匹配的結(jié)構(gòu)并與限定該活性位點的基團相互作用的化合物。這樣的搜索可以是手動的，但優(yōu)選有計算機輔助。根據(jù)該搜索找出的這些化合物都是BvS和/或EG-VEGF活性的潛在調(diào)節(jié)物。另一方面，可以用這些方法從已知的調(diào)節(jié)化合物或配體鑒定改進的調(diào)節(jié)化合物。可以對已知化合物的組合物進行修飾，修飾的結(jié)構(gòu)效應可以用上述應用于新組合物的實驗方法和計算機建模方法來確定。然后將改變的結(jié)構(gòu)與該化合物的活性位點結(jié)構(gòu)相比較，從而確定是否匹配得更好或相互作用更好。通過這種方式，可以對組合物中的系統(tǒng)變化，諸如改變側(cè)鏈基團所導致的變化進行快速評估，以便獲得改進了特異性或活性的修飾型調(diào)節(jié)化合物或配體。其它可以根據(jù)對BvS或EG-VEGF活性位點(或結(jié)合位點)，以及相關(guān)轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄因子的鑒定，來鑒定調(diào)節(jié)化合物的實驗方法和計算機建模方法，都是本領(lǐng)域已知的。分子建模系統(tǒng)實例如CHARMm 和 QUANTA 程序(Polygen Corporation, ffaltham, MA)。CHARMm執(zhí)行能量最小化和分子動力學功能。QUANTA執(zhí)行分子結(jié)構(gòu)的構(gòu)建，建立模型圖和分析。QUANTA允許交互構(gòu)建、修飾、觀察、以及分析分子相互之間的行為。關(guān)于與具體蛋白相互作用的藥物的計算機建模綜述可以參見多篇文獻，如 Rotivinen，等，1988，Acta Pharmaceutical Fennica 97 :159-166 ；Ripka，New Scientist 54-57 (June 16，1988) ；McKinalyand Rossmann，1989，Annu.Rev. Pharmacol. Toxiciol. 29 111-122 ；Perry 禾口 Davies，OSAR-Quantitative Structure-Activity Relationships in Drug Design pp. 189-193 (Alan R.Liss， Inc. 1989) ；Lewis 禾口 Dean，1989 Proc. R. Soc. Lond. 236 :125-140和141-162 ；關(guān)于核酸組分的模型受體，參見Askew等，1989，J.Am. Chem. Soc. Ill :1082_1090。其它用圖像和畫面描述化學物品的計算機程序可以從諸如 BioDesign, Inc. (Pasadena, CA.), Allelix, Inc. (Mississauga, Ontario, Canada), I^l Jk. Hypercube,Inc. (Cambridge,Ontario)公司獲得。盡管這些程序主要是為具體蛋白的特異性藥物應用所設(shè)計的，它們也適于設(shè)計DNA或RNA區(qū)域特異性藥物，只要該區(qū)域是確定的。上文針對能夠改變結(jié)合的化合物的設(shè)計和制備進行了描述，但也可以在已知化合物(包括天然產(chǎn)物或合成的化學物質(zhì))，以及生物活性物質(zhì)(包括蛋白)的文庫中篩選可以作為抑制劑或激活劑的化合物。通過本文上述試驗鑒定出的化合物可以用于，例如，闡述BvS基因產(chǎn)物和/或 EG-VEGF基因產(chǎn)物的生物功能?？梢詫⑦@樣的化合物以治療有效劑量給予患者，以便治療任一種生理學疾病。治療有效劑量是指化合物足以導致任何生物學癥狀的改善，阻礙 (impediment)，預防或改變的量。b.分析與Bv8和/或EG-VEGF結(jié)合的化合物可以設(shè)計一些系統(tǒng)，用于鑒定能與BvS和/或EG-VEGF相互作用(如結(jié)合)或能模擬Bv8和/或EG-VEGF，或能干擾Bv8和/或EG-VEGF與關(guān)連受體、結(jié)合配對物或底物的相互作用的化合物。所鑒定的化合物可以用于，例如，調(diào)節(jié)野生型和/或突變的BvS基因產(chǎn)物或EG-VEGF基因產(chǎn)物的活性；闡述BvS和/或EG-VEGF的生物功能；在篩選中鑒定那些能破壞BvS和/或EG-VEGF的正常相互作用的化合物；或它們自身可以破壞或激活這類相互作用。用于鑒定與Bv8和/或EG-VEGF結(jié)合，或與Bv8和/或EG-VEGF關(guān)連受體或底物結(jié)合的化合物的試驗，在原則上涉及制備BvS和/或EG-VEGF與待測化合物的反應混合物，該過程所用的時間和條件足以允許這兩種組分相互作用并結(jié)合而形成復合物，該復合物可以從反應混合物中取出和/或檢測出。所用的BvS和/或EG-VEGF的類型可以根據(jù)篩選試驗的目的不同而不同。例如，希望篩選出天然受體的激動劑時，可以利用全長BvS或EG-VEGF，或可溶性截短型Bv8或EG-VEGF，肽，或包含一或多個Bv8或EG-VEGF結(jié)構(gòu)域與在試驗系統(tǒng)中提供便利(如，標記，分離所得復合物，等等)的蛋白或多肽的融合蛋白。當希望篩選出與BvS直接相互作用的化合物時，可以使用對應于BvS和/或EG-VEGF的多肽以及含有BvS 或EG-VEGF的融合蛋白。篩選試驗可以通過多種方式來進行。例如，一種方法涉及將BvS或EG-VEGF，其多肽，肽，或融合蛋白錨著在固相上，并在反應結(jié)束時檢測錨著在固相上的BvS/待測化合物復合物或EG-VEGF/待測化合物復合物。在這類方法的一個實施方案中，BvS或EG-VEGF反應試劑可以錨著在固體表面，未錨著的待測化合物可以被直接或間接標記。在實踐中，可以方便地用微滴板作為固相。將錨著組分通過非共價或共價結(jié)合作用而固定。非共價結(jié)合可以通過將固體表面簡單地包被蛋白溶液并干燥而實現(xiàn)?；蛘?，可以用特異于待固定蛋白的固相抗體(優(yōu)選單克隆抗體)將該蛋白錨著到固體表面。所述表面可以事先制備并貯藏。為了進行試驗，將未固定的組分添加到含有錨著組分的包被表面。反應完成后，在能使所形成的任何復合物仍然固定在固體表面的條件下除去(例如，通過洗滌)未反應的組分。對錨著在固體表面的復合物的檢測可以通過多種方式實現(xiàn)。當上述未固定組分事先已有標記時，檢測出固定在所述表面的標記就表明形成了復合物。當上述未固定組分事先未被標記時，可以用間接標記物檢測錨著在所述表面的復合物；例如，用帶有標記的特異于上述未固定組分的抗體(該抗體本身可以直接標記或用標記的抗-Ig抗體間接標記)?；蛘?，可以在液相中進行反應，使反應產(chǎn)物與未反應的組分分離，并檢測復合物；例如用特異于BvS或EG-VEGF蛋白，多肽，肽，或融合蛋白或待測化合物的固相抗體來錨著溶液中形成的任何復合物，以及用對抗可能的復合物中另一組分的特異性標記抗體來檢測錨著的復合物。c.干擾Bv8和/或EG-VEGF的相互作用的化合物與BvS和/或EG-VEGF相互作用的大分子在本節(jié)中稱為“結(jié)合配對物”。這些結(jié)合配對物都很可能參與BvS和/或EG-VEGF介導的生物途徑。因此，希望鑒定干擾或破壞所述結(jié)合配對物的相互作用的化合物，它們可用于調(diào)節(jié)或增強機體中的BvS和/或EG-VEGF 活性和/或控制與該活性相關(guān)的疾病(或該活性的缺陷)。用于鑒定能干擾BvS或EG-VEGF與結(jié)合配對物或配對物相互作用的化合物的試驗系統(tǒng)，其基本原則涉及制備含有BvS和/或EG-VEGF或其一些變體以及結(jié)合配對物的反應混合物，該過程所用的時間和條件足以允許這兩種組分相互作用并結(jié)合而形成復合物。為了檢驗化合物的抑制活性，所述反應混合物在有和沒有該待測化合物的條件下制備。待測化合物可以是最初就包括在反應混合物中，或者可以是在添加了 BvS或EG-VEGF和它的結(jié)合配對物之后間隔一段時間而加入混合物中。對照反應混合物在不含待測化合物或含有安慰劑的條件下保溫。然后檢測BvS或EG-VEGF與結(jié)合配對物是否形成任何復合物。在對照反應中形成復合物，但在含有待測化合物的反應混合物中不形成復合物，則表明所述化合物干擾BvS或EG-VEGF與結(jié)合配對物的相互作用。另外，也可以將在含有待測化合物和正
51常BvS或EG-VEGF蛋白的反應混合物中復合物的形成與在含有待測化合物和突變BvS或 EG-VEGF蛋白的反應混合物中復合物的形成進行比較。當在這些情況中希望鑒定出那些特異性破壞突變體或突變的BvS或EG-VEGF而不是正常蛋白的相互作用的化合物時，這種比較是很重要的。干擾BvS和/或EG-VEGF與結(jié)合配對物相互作用的化合物的分析可以采用異質(zhì) (heterogeneous)形式或同質(zhì)(homogeneous)形式。異質(zhì)試驗涉及將Bv8，或EG-VEGF，或者其結(jié)合配對物錨著在固相上，并在反應結(jié)束時檢測錨著在固相上的復合物。在同質(zhì)試驗中，整個反應在液相中進行。在每一種方法中，可以改變反應試劑的添加順序，以便獲得關(guān)于待測化合物的不同信息。例如，通過競爭來干擾相互作用的待測化合物，可以通過在有該待測物質(zhì)存在的情況下進行反應來鑒定；即，將待測物質(zhì)先加入反應混合物中，然后再加入BvS或EG-VEGF和相互作用結(jié)合配對物；或者將它們同時加入。另外，對已形成的復合物造成破壞的待測化合物，例如具有較高結(jié)合常數(shù)因而能替換掉復合物上的一種組分的化合物，可以通過在形成復合物之后將該待測化合物加入反應混合物中而進行檢驗。各種形式簡述如下。在異質(zhì)試驗系統(tǒng)中，將多肽(Bv8或EG-VEGF)或者相互作用結(jié)合配對物錨著在固體表面，未錨著的物質(zhì)被直接或間接標記。在實踐中，常常利用微滴板。錨著物質(zhì)可以通過非共價或共價結(jié)合作用而固定。非共價結(jié)合可以簡單地通過將固體表面包被BvS或結(jié)合配對物溶液并干燥而實現(xiàn)。或者，可以用特異于待錨著物質(zhì)的固相抗體將所述物質(zhì)錨著到固體表面。所述表面可以事先制備并貯藏。為了進行該試驗，在有或無待測化合物的條件下將所固定物質(zhì)的配對物暴露于包被表面。反應完成后，除去(例如，通過洗滌)未反應的組分，所形成的任何復合物仍然固定在固體表面。對錨著在固體表面的復合物的檢測可以通過多種方式實現(xiàn)。當未被固定的物質(zhì)事先已有標記時，檢測出固定在所述表面的標記就表明形成了復合物。當未被固定的物質(zhì)事先未被標記時，可以用間接標記物檢測錨著在所述表面的復合物；例如，用帶有標記的特異于最初未被固定的物質(zhì)的抗體(該抗體本身可以直接標記或用標記的抗-Ig抗體間接標記)。根據(jù)反應組分的添加順序，可以檢測出抑制復合物形成或者破壞已形成的復合物的待測化合物?；蛘撸梢栽诖郎y化合物存在或缺乏的條件下在液相中進行反應，使反應產(chǎn)物與未反應的組分分離，并檢測復合物；例如用特異于其中一種結(jié)合組分的固相抗體來錨著溶液中形成的任何復合物，以及用特異于另一種配對物的標記抗體來檢測錨著的復合物。同樣，根據(jù)液相中反應組分的添加順序，可以鑒定出抑制復合物形成或者破壞已形成的復合物的待測化合物。在本發(fā)明的另一實施方案中，可以采用同質(zhì)試驗。在該方法中，制備預形成的多肽 (Bv8或EG-VEGF)與結(jié)合配對物的復合物，使其中的BvS或其結(jié)合配對物被標記，但該標記所產(chǎn)生的信號由于形成復合物而消失(參見，例如Rubenstein的美國專利4，109，496，它利用此方法進行免疫分析)。加入能競爭并替換掉預形成復合物上的一種物質(zhì)的待測物質(zhì)，將產(chǎn)生高于背景的信號。這樣就可以鑒定出破壞所述相互作用的待測物質(zhì)。在一個具體實施方案中，可以制備Bv8(或EG-VEGF)融合體用于進行固定。例如，可以用融合載體(如PGEX-5X-1)將多肽(Bv8或EG-VEGF)或其肽片段與谷胱甘肽_S_轉(zhuǎn)移酶(GST)基因融合，所用的融合方式使得在最終的融合蛋白中保留了所述多肽的結(jié)合活性?？梢詫⒔Y(jié)合配對物純化，并用于產(chǎn)生單克隆抗體，其利用實踐中常規(guī)的以及本發(fā)明上文中描述的方法。該抗體可以通過本領(lǐng)域常規(guī)實踐的方法用放射性同位素125I進行標記。在異質(zhì)試驗中，可以將融合蛋白錨著在谷胱甘肽-瓊脂糖珠上。然后在有或沒有待測化合物的情況下，按照允許發(fā)生相互作用并結(jié)合的方式，添加相互作用結(jié)合配對物。在反應結(jié)束時，將未結(jié)合的物質(zhì)洗去，向該系統(tǒng)中添加標記的單克隆抗體，使之與復合的組分結(jié)合。多肽(Bv8或EG-VEGF)與相互作用結(jié)合配對物之間的相互作用，可以通過測量仍然保持與谷胱甘肽-瓊脂糖珠結(jié)合的放射活性的量來檢測。待測化合物對相互作用的成功抑制可以導致所測量的放射活性降低。或者，在缺乏固體的谷胱甘肽-瓊脂糖珠的情況下，可以將GST融合蛋白與相互作用結(jié)合配對物混合在液體中。待測化合物可以在上述物質(zhì)發(fā)生相互作用期間或之后加入。然后將該混合物添加到谷胱甘肽-瓊脂糖珠上，洗去未結(jié)合的物質(zhì)。BvS或EG-VEGF與結(jié)合配對物之間相互作用受到抑制的程度，可以通過添加標記抗體并測量與珠結(jié)合的放射活性來進行檢測。在本發(fā)明另一實施方案中，可以用對應于多肽(Bv8或EG-VEGF)和/或相互作用配對物或結(jié)合配對物(在結(jié)合配對物是蛋白的情況中)的結(jié)合區(qū)的肽片段，代替兩種全長蛋白之一或兩者，實施上述相同的技術(shù)。可以用本領(lǐng)域常規(guī)實踐的任意多種方法來鑒定并分離結(jié)合位點。這些方法包括，但不限于，對編碼其中一種蛋白的基因進行誘變并在共-免疫沉淀試驗中篩選對結(jié)合的破壞。然后可以選出編碼復合物中第二種物質(zhì)的基因中的補償突變。對編碼每種蛋白的基因進行序列分析，可以揭示對應于蛋白上參與相互結(jié)合的區(qū)域的突變?；蛘?，可以用上述方法將一種蛋白錨著在固體表面，使之與其帶有標記的結(jié)合配對物發(fā)生相互作用并結(jié)合，所述配對物已經(jīng)經(jīng)過蛋白水解酶(如胰蛋白酶)處理。洗滌后，相對較短的、含有結(jié)合區(qū)的標記肽可以保持與固體物質(zhì)結(jié)合，可以將其分離并通過氨基酸測序而鑒定。一旦獲得了編碼細胞內(nèi)結(jié)合配對物的基因，可以對短基因節(jié)段進行工程化，以便表達所述蛋白的肽片段，然后檢驗其結(jié)合活性，并進行純化或合成?？梢匀缟纤鰧v8和/或EG-VEGF錨著在固體物質(zhì)上，方法是例如，但并非限制地，制備GST融合蛋白并使之與谷胱甘肽-瓊脂糖珠結(jié)合。相互作用結(jié)合配對物可以被放射性同位素如mS標記，并用諸如胰蛋白酶等蛋白水解酶切割。再將切割產(chǎn)物添加到錨著的融合蛋白上，使之結(jié)合。洗去未結(jié)合的肽之后，可以用已知方法將標記的結(jié)合物質(zhì)(代表細胞內(nèi)結(jié)合配對物結(jié)合區(qū))洗脫，純化，并分析其氨基酸序列。如此鑒定出的肽可以通過合成來制備，或者利用重組DNA技術(shù)與適當?shù)挠欣鞍兹诤?。H.藥物組合物本文所述Bv8多肽，EG-VEGF多肽及其調(diào)節(jié)物，包括Bv8和/或EG-VEGF的激動劑或拮抗劑可以以治療劑的形式應用。本發(fā)明所述多肽及其調(diào)節(jié)物可以按照已知方法配制，以便制備藥物學有效的組合物，其中將這里的BvS和/或EG-VEGF產(chǎn)物與可藥用載體賦形劑混合。Bv8，EG-VEGF或其組合的治療性配制劑可以如下制備將具有所需純度(優(yōu)選基本純)的BvS和/或EG-VEGF，與任選的藥用載體、賦形劑或穩(wěn)定劑(Remington’ s Pharmaceutical Sciences，見上文)混合成凍干劑或水溶液的形式?？山邮艿妮d體、賦形劑或穩(wěn)定劑對暴露在所用劑量和濃度下的細胞或哺乳動物無毒性。實例包括緩沖劑例如磷酸鹽，檸檬酸鹽和其它有機酸；抗氧化劑包括抗壞血酸；小分子多肽(少于約10個殘基)；蛋白，如血清白蛋白，明膠或免疫球蛋白；親水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮，氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或賴氨酸；單糖，二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合劑如EDTA ；糖醇如甘露糖醇或山梨糖醇；成鹽反離子如鈉；和/或非離子表面活性劑，如 Tween，Pluronics 或 PEG。用于體內(nèi)給藥的BvS和/或EG-VEGF必需是無菌的。這可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法，如在冷凍干燥和重新配制之前或之后通過除菌濾膜過濾而輕易實現(xiàn)。BvS可以以凍干形式保存。治療性組合物Bv8，EG-VEGF或其組合通常置于具有無菌存取口的容器中，例如靜脈注射袋或帶有能通過皮下注射針刺穿的塞子的小瓶。Bv8可以選擇與其它生長因子組合或聯(lián)合給藥。例如，它可以與EG-ECGF或VEGF 組合。EG-ECGF可以選擇與其它生長因子組合或聯(lián)合給藥。例如，它可以與BvS或VEGF組
口 OBv8, EG-ECGF或其調(diào)節(jié)物可以與治療以下疾病的其它常規(guī)療法一起使用癌癥，其它血液疾病，嗜中性粒細胞減少癥，免疫缺陷疾病，自身免疫疾病等。給藥途徑與已知方法一致，例如經(jīng)靜脈，經(jīng)腹腔內(nèi)，經(jīng)大腦內(nèi)，經(jīng)肌肉內(nèi)，經(jīng)眼內(nèi)，經(jīng)動脈內(nèi)或經(jīng)損傷內(nèi)等途徑進行注射或輸注，局部給藥，或通過持續(xù)釋放系統(tǒng)給藥。本發(fā)明藥物組合物的劑量和所需藥物濃度將依預想的特定用途而異。決定適宜劑量或給藥途徑是普通內(nèi)科醫(yī)師完全能夠很好勝任的事情。動物實驗可以為確定人類治療的有效劑量提供可靠的指導?？梢园凑誐ordenti，J.和Chappel 1，W. "The use of interspecies scaling in toxicokinetics，，In Toxicokinetics 禾口 New Drug Development, Yacobi 等編，Pergamon Press, New York 1989，pp. 42-96 中所述原則，來換算種屬間有效劑量的比例(Interspecies scaling)。當希望將BvS和/或EG-VEGF多肽以配制劑形式持續(xù)釋放地給藥且該配制劑具有適于治療任何需要給藥BvS和/或EG-VEGF多肽的疾病的釋放特性時，考慮將BvS和/ 或EG-VEGF多肽或其調(diào)節(jié)物包封在微膠囊中。例如，將純化的Bv8，EG-VEGF或其組合包封在按照例如凝聚技術(shù)或界面聚合技術(shù)制備的微膠囊(分別例如羥甲基纖維素或明膠微膠囊和聚_(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)中，在膠體藥物釋放系統(tǒng)(例如脂質(zhì)體，白蛋白微球體，微乳劑，納米顆粒和納米膠囊)中或在大乳劑(macroemulsion)中。這類技術(shù)公開在 Remington' s Pharmaceutical Sciences，16th edition, Osol, A. Ed. (1980)中。可以將Bv8，EG-VEGF或其組合摻入持續(xù)釋放制劑中用于治療用途。持續(xù)釋放制劑的適當實例包括具有一定形狀的半通透聚合物基質(zhì)，如薄膜或微膠囊。緩釋基質(zhì)實例包括聚酯、水凝膠(如聚(2-羥基乙基-異丁烯酸酯)(Langer等，J. Biomed. Mater. Res.， 15 :167-277(1981) ；Langer, Chem. Tech. , 12 :98-105 (1982))或聚(乙烯醇)，聚交酯(美國專利3773919，EP 58，481)，L-谷氨酸與、乙基-L-谷氨酸的共聚物(Sidman，等， Biopolymers 22 :547 (1983))，不可降解的乙烯乙酸乙酯(Langer，等，出處同上)，或可降解的乳酸-羥基乙酸共聚物如Lupron Depot (由乳酸-羥基乙酸共聚物和亮氨酰脯氨酸 (Ieuprolide)乙酸酯組成的可注射的微球體)，以及聚D-(-)-3-羥丁酸(EP 133，988)。聚合物如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-羥基乙酸能持續(xù)釋放分子100天以上，而一些水凝膠釋放蛋白的時間卻較短。當膠囊化蛋白長時間停留在體內(nèi)時，它們可能由于暴露
54在37°C潮濕環(huán)境中而變性或凝聚，導致?lián)p失生物活性，且免疫原性可能會改變?？梢愿鶕?jù)相關(guān)機理來設(shè)計使蛋白穩(wěn)定的合理策略。例如，如果發(fā)現(xiàn)凝聚的機理是通過硫代二硫鍵互換而形成分子間S-S鍵，則可通過修飾巰基殘基、從酸性溶液中凍干、控制濕度、采用合適的添加劑、和開發(fā)特異性聚合物基質(zhì)組合物來實現(xiàn)穩(wěn)定。持續(xù)釋放型BvS和/或EG-VEGF組合物也可以包括用脂質(zhì)體包裹的BvS和/或 EG-VEGF。含有Bv8和/或EG-VEGF的脂質(zhì)體通過本領(lǐng)域已知方法來制備(Epstein等， 1985，Proc. Natl. Acid. Sci. 82 :3688 ；Hwang 等，1980，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 :4030 ； DE 3. 218，121 A ；EP 52322A ；EP 36676A ；EP 88046A ；EP 143949A ；EP 142641A ；日本專利申請83-118008 ；美國專利4，485，045和4，544，545 ；EP 102，324A)。脂質(zhì)體通常為小單層 (unilamelar)(約200-800A )，其中的脂質(zhì)含量超過約30mol. %膽固醇，調(diào)整所選比例以便使BvS治療效果最佳。當局部用藥時，Bv8, EG-VEGF或其組合適合于與諸如載體和/或佐劑等其它成分組合。對所述其它成分的特性沒有限制，但它們必須是生理上可接受的，對于其目的用藥是有效的，并且不會降低組合物中活性成分的活性。合適的賦形劑的例子包括軟膏劑，乳膏，凝膠劑，或懸液，含有或不含純化的膠原蛋白。組合物也可浸滲到經(jīng)皮貼劑(pach)，硬膏劑 (plaster)和繃帶中，優(yōu)選以液體或半液體的形式浸滲。為了獲得凝膠配制劑，可以將配制在液體組合物中的Bv8，EG-VEGF或其組合與有效量的水溶性多肽或合成聚合物如PEG混合，以便形成具有適合于局部應用的粘度的凝膠。可以使用的多糖包括，例如，纖維素衍生物，如醚化的纖維素衍生物，包括烷基纖維素，羥基烷基纖維素，和烷基羥基烷基纖維素，例如，甲基纖維素，羥乙基纖維素，羧甲基纖維素，羥丙基甲基纖維素，和羥丙基纖維素；淀粉和分級淀粉；瓊脂；藻酸和藻酸鹽；阿拉伯膠；支鏈淀粉；瓊脂糖；角叉藻聚糖；葡聚糖(dextran)；糊精；果聚糖；菊粉；甘露聚糖；木聚糖；阿拉伯聚糖；脫乙酰殼多糖；糖原；葡聚糖(glucan)；和合成性生物聚合物；以及膠，例如黃原膠；瓜爾豆膠；槐豆莢膠；阿拉伯膠；西黃蓍膠；和刺梧桐樹膠；及其衍生物和混合物。本文優(yōu)選的膠化劑是對生物學系統(tǒng)為惰性的，無毒的，制備簡單的，且不太流動或粘滯的膠化劑，它不會使承載在其內(nèi)部的BvS和/或EG-VEGF失去穩(wěn)定性。優(yōu)選的多糖是醚化的纖維素衍生物，更優(yōu)選充分鑒定、純化并在USP中列出的多糖，例如，甲基纖維素和羥烷基纖維素衍生物，如羥丙基纖維素，羥乙基纖維素和羥丙基甲基纖維素。本文最優(yōu)選甲基纖維素。用于凝膠配制的聚乙二醇一般是低分子量和高分子量PEG的混合物，這樣能獲得適當?shù)恼扯?。例如，分子?00-600的PEG與分子量1500的PEG的混合物當以適當比率混合而獲得糊劑(paste)時對該目的是有效的。用于多糖和PEG的術(shù)語“水溶性”意在包括膠體溶液和分散液。一般來說，纖維素衍生物的溶解度可以通過醚基團的取代程度來確定，本文有用的穩(wěn)定衍生物在纖維素鏈中每個脫水葡萄糖單元應具有足夠量的這類醚基團以使所述衍生物具有水溶性。醚取代程度為每個脫水葡萄糖單元上至少0. 35個醚基團一般是足夠的。另外，纖維素衍生物可以是堿金屬鹽，例如，Li，Na, K，或Cs鹽的形式。當凝膠中使用甲基纖維素時，優(yōu)選它占該凝膠的約2-5%，更優(yōu)選約3%，而BvS和 /或EG-VEGF的量為每毫升凝膠約300-1000mg。
半通透的可植入膜裝置可以作為在一些情況下運送藥物的有效工具。例如，可以將分泌Bv8和/或EG-VEGF，Bv8和/或EG-VEGF變體，Bv8和/或EG-VEGF嵌合體或Bv8 和/或EG-VEGF激動劑或拮抗劑的細胞被囊化，并將這類裝置植入到患者體內(nèi)。相應地，本發(fā)明還包括預防或治療癌癥、其它血液疾病、嗜中性粒細胞減少癥、免疫疾病、自身免疫病等的方法，包括將分泌BvS和/或EG-VEGF、或根據(jù)具體情況需要分泌其激動劑或拮抗劑的細胞植入到有需要的患者體內(nèi)。最后，本發(fā)明包括通過在患者體內(nèi)植入植入體來預防或治療癌癥、其它血液疾病、嗜中性粒細胞減少癥、免疫疾病、自身免疫病等的裝置，所述植入體包含半透膜，和分泌BvS和/或EG-VEGF (或根據(jù)具體情況的需要分泌其激動劑或拮抗劑) 的細胞，所述細胞包裹在所述膜中，且所述膜可以透過BvS和/或EG-VEGF (或其激動劑或拮抗劑)但不能透過來自患者的對細胞有害的因子?？梢詫⒒颊咦陨淼慕?jīng)過轉(zhuǎn)化能離體 (exvivo)產(chǎn)生BvS和/或EG-VEGF的細胞直接植入該患者，任選不經(jīng)過上述被囊化。將活細胞用膜進行被囊化的方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員很熟悉的，且被囊化細胞的制備以及將它們植入患者都無需過多的實驗就可以實現(xiàn)。含有Bv8，EG-VEGF或其組合，或其激動劑或拮抗劑的藥物組合物優(yōu)選裝在合適的容器內(nèi)。所述容器優(yōu)選帶有詳細說明該藥物組合物的相應用途和劑量的說明。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到，依據(jù)治療方法的不同，這些說明會有不同。I.治療方法本文提供的Bv8，EG-VEGF及其激動劑或拮抗劑可以在多種診斷實驗和治療中使用。BvS和/或EG-VEGF誘導骨髓細胞及其子代的增殖，包括但不限于，造血干細胞，⑶34+ 髓樣祖細胞，CD34+淋巴樣祖細胞，髓樣前體細胞，淋巴樣前體細胞，單核細胞，以及淋巴細胞。所述增殖導致白細胞包括B細胞，T細胞，巨噬細胞，特別是嗜中性粒細胞的數(shù)量增加。Bv8，EG_VEGF及其激動劑可用于治療例如需要增加骨髓細胞及其子代增殖的疾病或病癥，所述骨髓細胞包括但不限于，髓樣祖細胞，髓樣前體細胞，嗜中性粒細胞，淋巴樣祖細胞，淋巴樣前體細胞以及淋巴細胞，或用于治療需要促進特定類型血細胞的存活，所述血細胞諸如嗜中性粒細胞，B細胞，或T細胞。一個實施方案中，將有效治療所述疾病的量的 Bv8, EG-VEGF，或其激動劑給藥哺乳動物。優(yōu)選，所述哺乳動物是人。Bv8，EG-VEGF，或其組合可以以多肽或核酸的形式給藥。例如，Bv8，EG-VEGF及其激動劑可用于治療與嗜中性粒細胞減少癥，淋巴細胞減少癥，或免疫缺陷疾病(可為原發(fā)或繼發(fā)免疫缺陷疾病)相關(guān)的疾病或病癥。所述疾病或病癥可與例如以下疾病相關(guān)遺傳疾病，B細胞缺陷，T細胞缺陷，感染疾病包括細菌和病毒感染，浸潤性和血液疾病，手術(shù)和外傷，以及給藥具有繼發(fā)免疫抑制效果的治療劑。一些情況下，激發(fā)免疫抑制效應導致免疫缺陷疾病。BvS，EG-VEGF或其組合可用于促進骨髓抑制的恢復，例如在正在接受治病性治療的癌癥患者中，其中所述治療劑嚴重降低循環(huán)白細胞的水平并損害所述患者的免疫系統(tǒng)。Bv8，EG-VEGF或其組合可在放射，高劑量化療，或其它抗癌藥物之前，聯(lián)合，或之后給藥，以促進造血恢復和/或增加循環(huán)嗜中性粒細胞，B細胞，T細胞的數(shù)目。Bv8, EG-VEGF或其組合可與另一種化合物或組合物聯(lián)合給藥。Bv8和/或EG-VEGF 可在所述化合物或組合物的治療之前，過程中，或之后給藥，使得Bv8，EG-VEGF和/或所述化合物或組合物的治療效力增加。如上所述，所述化合物或組合物可為化療劑。優(yōu)選的化療劑包括但不限于，長春新堿(長春新堿)，順鉬(順鉬)，氨甲蝶呤，3’ -疊氮(疊氮基)_3，-脫氧胸苷，紫杉醇(taxane) (TAXOL , Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ)和紫杉萜(TAXOTERE ,Rh0ne—Poulenc Rorer, Antony, France)和 /或蒽環(huán)類(蒽環(huán)類抗生素)抗生素。這類化療劑的制備和劑量方案可以按照廠家的說明書所述來確定，或者可以由有經(jīng)驗的醫(yī)師根據(jù)其經(jīng)驗來確定。這類化療劑的制備和劑量方案還可以參見 Chemotherapy Service Ed. , Μ. C. Perry, Williams &ffilkins, Baltimore, MD(1992)。另一實施方案中，Bv8，EG-VEGF或其組合與VEGF或其激動劑一起給藥。VEGF可以是VEGF的受體選擇性突變體。一個是實施方案中，所述化合物是VEGF的FLTl受體選擇性突變體或其激動劑。另一實施方案中，所述化合物是VEGF的DDR受體選擇性突變體或其激動劑。BvS和EG-VEGF的拮抗劑及其組合可用于治療與血細胞異常增殖或分化相關(guān)的血液疾病。所述異常增殖或分化可導致血細胞發(fā)育不良性變化以及血液惡性疾病。具體實施方案包括治療患者中的白血病，骨髓增生性疾病，骨髓發(fā)育不良性疾病，淋巴組織增生性疾病，或淋巴組織發(fā)育不良性疾病。各種白血病性疾病中的細胞諸如ALL，AML, MPD, CML和 MDS細胞，已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)表達Bv8和EG-VEGF受體。Bv8和EG-VEGF受體的拮抗劑可用于抑制這些白血病細胞的增生。BvS和EG-VEGF誘導B和T細胞活化。這些分子的激動劑和拮抗劑可治病性地用于調(diào)節(jié)免疫反應?？山o藥Bv8，EG-VEGF或其組合或其激動劑以誘導B淋巴細胞，⑶4+T淋巴細胞，和/或CD8+T淋巴細胞的增殖和/或活化。BvS和EG-VEGF的拮抗劑可被給藥以抑制B淋巴，⑶4+T淋巴細胞，和/或⑶8+T淋巴細胞的增殖和/或活化。Bv8和/或EG-VEGF可促進或抑制CD4+T淋巴細胞的增殖和活化。Bv8和EG-VEGF 誘導CD4+T淋巴細胞中的細胞因子生成。一個實施方案中，所述細胞因子是IL-2和/或 IFN- γ。選擇性誘導⑶4+T淋巴細胞中的IL-2合成的Bv8或EG-VEGF激動劑可用于誘導 ⑶4+T淋巴細胞的增殖。選擇性誘導⑶4+T淋巴細胞中的IFN- γ合成的Bv8或EG-VEGF激動劑可用于抑制CD4+T淋巴細胞的增殖。BvS拮抗劑，EG-VEGF拮抗劑以及其組合可用于治療自身免疫病，對于所述自身免疫病而言，活化的B細胞，CD4+T細胞，和/或CD8+T細胞的數(shù)目減少是所需的。具體實施方案包括利用本文提供的藥劑和組合物來治療與自身免疫病相關(guān)的II，III和IV型超敏反應。在優(yōu)選實施方案中，所述自身免疫病是炎性腸病，克隆氏病，結(jié)腸炎，或移植物抗宿主疾病。諸如通過以上部分4和5中所述的篩選實驗鑒定的那些物質(zhì)的化合物，可用于調(diào)節(jié)Bv8和/或EG-VEGF活性或表達的水平。具體地，鑒定為Bv8和/或EG-VEGF激動劑或可刺激BvS和/或EG-VEGF與其受體的結(jié)合的化合物可用于這樣的治療，其中升高的BvS 和/或EG-VEGF活性水平是所需的。類似地，被鑒定為可促進BvS和/或EG-VEGF表達的化合物可用于這種類型的治療。Bv8和/或EG-VEGF激動劑以及增加Bv8和/或EG-VEGF 基因表達的化合物可用于治療嗜中性粒細胞減少癥，淋巴細胞減少癥，以及免疫缺陷疾病，其中嗜中性粒細胞，B淋巴細胞和/或T淋巴細胞數(shù)目的增加是所需的?；衔镏T如通過以上部分4和5中的篩選實驗鑒定的BvS和/或EG-VEGF拮抗劑，
57可分別用于調(diào)節(jié)BvS和/或EG-VEGF活性或表達的水平，如本文所述?；衔镏T如通過以上部分4和5中的篩選實驗鑒定的BvS和/或EG-VEGF激動劑，可分別用于調(diào)節(jié)本文所述的免疫反應。應理解增加骨髓細胞增殖和抑制骨髓細胞增殖的方法可在體內(nèi)或體外進行。一些情況下，需要將Bv8，EG-VEGF或其組合添加到體外細胞樣品中，以刺激具體細胞類型的增殖。用Bv8，EG-VEGF或其組合處理的樣品可用于篩選試驗，或者移植到需要治療的個體或動物模型中。有效量的Bv8或Bv8激動劑或拮抗劑，EG-VEGF或EG-VEGF激動劑或拮抗劑可以根據(jù)，例如治療目的，給藥途徑，和病人的情況而用于治療。因此，臨床醫(yī)師必需根據(jù)獲得最佳治療效果的需要來滴定劑量并調(diào)整給藥途徑。通常，臨床醫(yī)師會持續(xù)給藥BvS和/或 EG-VEGF直到獲得所需效果。全身治療的通常日劑量為約lOng/kg-最多100mg/kg哺乳動物體重/天或更高劑量不等。優(yōu)選約lPg/kg/天-10mg/kg/天，這取決于給藥途徑。應能預計到，不同配制劑可以針對不同的治療化合物和不同的疾病有效，針對一種器官或組織進行給藥時所必需的方式可以不同于其它器官或組織。另一種建議是，將BvS和/或EG-VEGF以能在靶組織中建立有效但無不當毒性的 BvS和/或EG-VEGF水平的劑量來配制并運送到靶位點或組織。該組織內(nèi)濃度應通過連續(xù)輸注、緩釋、局部應用、植入表達BvS和/或EG-VEGF的細胞、或按照經(jīng)驗確定的頻率進行注射等方式盡可能地維持。該治療的進展可以通過常規(guī)試驗很容易地監(jiān)控。用藥方案必需根據(jù)個體的情況來確定。但在優(yōu)選實施方案中，BvS和/或EG-VEGF，及其激動劑或拮抗劑是每天給藥，更優(yōu)選每隔天給藥，還更優(yōu)選一周至少兩次給藥。治療優(yōu)選持續(xù)6個月，更優(yōu)選持續(xù)1個月，還更優(yōu)選持續(xù)至少兩周。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認同，真實的用藥方案必需由臨床醫(yī)師根據(jù)個體的情況來確定。編碼BvS和/或EG-VEGF多肽的多核苷酸可以用于基因治療。在基因治療的應用中，將基因引入細胞以便實現(xiàn)在體內(nèi)合成對治療有效的基因產(chǎn)物，例如用于替換缺陷基因基因產(chǎn)物?！盎蛑委煛奔劝ń?jīng)單次治療就可獲得永久效果的常規(guī)基因治療，也包括基因治療劑的給藥，后者涉及一次或重復多次施用治療有效量的DNA或mRNA。反義RNA和DNA 可用作體內(nèi)阻斷特定基因表達的治療劑。業(yè)已證明，可以將短鏈反義寡核苷酸運輸?shù)郊毎?，它們在那里起抑制劑的作用，該作用不受細胞膜限制其攝取所導致的其較低細胞內(nèi)濃度。(Zamecnik 等，1986，Proc. Natl. Acad. ki. USA 83:4143-4146)?？梢孕揎椆押塑账嵋栽鰪娖鋽z取，例如用不帶電荷的基團取代帶負電荷的磷酸二酯基團。有多種技術(shù)可以用于將核酸引入到活細胞中。所述技術(shù)根據(jù)是將核酸轉(zhuǎn)移到體外培養(yǎng)的細胞中，還是轉(zhuǎn)移到目標宿主體內(nèi)的細胞中而異。適于將核酸轉(zhuǎn)移到哺乳動物體外細胞中的技術(shù)，包括脂質(zhì)體的使用、電穿孔、顯微注射、細胞融合、DEAE-葡聚糖、磷酸鈣沉淀法等。目前優(yōu)選的體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移技術(shù)包括，用病毒(通常為逆轉(zhuǎn)錄病毒)載體進行轉(zhuǎn)染和用病毒衣殼蛋白-脂質(zhì)體介導的轉(zhuǎn)染(Dzau等，Trends in Biotechnology 11， 205-210 (1993))。有些情況下，希望提供帶有靶向靶細胞的試劑的核酸源，所述物質(zhì)如對細胞表面膜蛋白或靶細胞具有特異性的抗體，靶細胞表面受體的配體等。使用脂質(zhì)體時，將與參與胞吞的細胞表面膜蛋白結(jié)合的蛋白用于靶向和/或促進攝取，例如對特定類型細胞具有向性的衣殼蛋白或其片段、在循環(huán)中發(fā)生內(nèi)化的蛋白的抗體、靶向細胞內(nèi)位置并延長細胞內(nèi)半壽期的蛋白。有關(guān)受體-介導的胞吞的技術(shù)在例如mi等，J.Biol. Chem. 262, 4429-4432(1987)；和 Wagner 等，Proc. Natl. Acad. ki. USA 87,3410-3414(1990)中有描述。關(guān)于基因示蹤(marking)和基因治療方案的綜述，請參見Anderson等，Science 256， 808-813(1992)。編碼Bv8和/或EG-VEGF的肽或核酸序列也可以用于診斷方法中。Bv8和/或 EG-VEGF的異常表達可以指示造血異常，血液疾病的開始，嗜中性粒細胞減少的開始，免疫缺陷疾病的開始，或自身免疫病的開始。而且，可以分析患者樣品中突變的或失去功能的 Bv8和/或EG-VEGF。這類方法一般包括比較患者樣品和對照樣品中Bv8和/或EG-VEGF 的表達。J.制品本發(fā)明另一實施方案涉及一種制品，其包含可用于治療或預防疾病的材料。所述制品優(yōu)選包括一個容器和位于該容器表面的或與該容器相連的標簽或包裝插頁。適當?shù)娜萜饔衅孔樱∑?，注射器等。容器可由各種材料如玻璃或塑料制成。該容器內(nèi)裝載含有 BvS和/或EG-VEGF、或其激動劑或拮抗劑的組合物，標簽或包裝插頁優(yōu)選提供BvS和/或 EG-VEGF、或其激動劑或拮抗劑的使用說明。在一個實施方案中，所述制品包含BvS和/或 EG-VEGF的拮抗劑和用所述拮抗劑治療血液疾病諸如白血病、骨髓增生性疾病，骨髓發(fā)育不良性疾病等的使用說明。在另一實施方案中，所述制品包含BvS和/或EG-VEGF，以及用所述多肽治療或預防與異常造血相關(guān)的疾病的使用說明。在另一實施方案中，所述制品包含 BvS和/或EG-VEGF，以及使用所述多肽治療免疫缺陷疾病的使用說明。包裝插頁還說明了適當?shù)膭┝糠桨?。在一個實施方案中，該插頁指示，可以按照約0. 01 μ g/kg-50mg/kg的量給藥所述組合物。
實施例以下實施例中用到的可購得試劑，除非特別說明，都按照廠家建議使用。以下實施例以及說明書全文中用ATCC保藏號定義的細胞都來自美國典型培養(yǎng)物保藏中心 (American Type Culture Collection)，Manassas，VTV0本文引用的所有參考文獻均包含在此作為參考。實施例1Βν8及其受體的表達分析為說明BvS的表達模式，對代表多種組織和細胞系RNA陣列進行斑點分析(Dot blot analysis)，所述組織和細胞系來自多種人，小鼠和大鼠組織。組織/細胞RNA陣列和印跡(blot)均購自CL0NTECH。cDNA探針利用50ng人或小鼠Bv8編碼序列利用前述方法 (LeCouter et al. , 2001,Nature)制備。如圖13所示，Bv8表達似乎限制在外周血白細胞，骨髓組織和以前表征的睪丸(LeCouter et al.，2003，PNAS)。為鑒定表達hBv8的細胞類型，利用一系列炎性組織樣品進行原位雜交(ISH)試驗，其中存在升高的白細胞水平。加工組織以便進行ISH，并利用標準方法和物質(zhì)生成[33P] UTP-標記的RNA探針。hBv8的有義和反義探針從對應核苷酸533-1132的cDNA片段合成； mBv8,從對應核苷酸886-161ID的cDNA片段合成；和mR-1，從對應核苷酸220-946的cDNA 片段合成。該探針與1^-2有81.2%相同。在炎性扁桃體和炎性闌尾炎中，BvS的強雜交信號主要在嗜中性粒細胞和相關(guān)浸潤細胞中檢測到(圖14)。
為證實BvS及其受體的細胞表達模式，在造血細胞和白血病細胞系中進行實時定量PCR分析(Heid etal.，1996，GnomeRes.，6 :986-994)。從人和小鼠造血干細胞，系定向型祖細胞或白血病細胞系、利用toeasy試劑盒、根據(jù)生產(chǎn)商的說明制備總RNA。人細胞制備物購自AllCells Inc. (Berkeley, CA)，系定向型小鼠細胞和干細胞(Sca+c-Kit+)自28 大腿的總收集物制備并如上述進行分類(Gerber，2002，Nature)。人細胞系(HL-60，K562， Hel-92，TF-1和KG-1)獲自ATCC。對于實時RT-PCR分析，利用IOOng總RNA0對于小鼠和人樣品，利用睪丸RNA產(chǎn)生標準曲線。所述分析中所用引物和探針如下
權(quán)利要求
1.BvS多肽，編碼BvS多肽的多核苷酸，EG-VEGF多肽，編碼EG-VEGF多肽的多核苷酸，或其組合在制備用于誘導骨髓細胞，淋巴系祖細胞(lymphoid lineage progenitor cell) 及其子代的增殖的藥物中的用途。
2.權(quán)利要求1的用途，其中所述骨髓細胞是造血干細胞，髓樣祖細胞，或髓樣前體細胞。
3.權(quán)利要求1的用途，其中所述子代是髓樣細胞，淋巴樣前體細胞或淋巴細胞。
4.權(quán)利要求3的用途，其中所述子代是嗜中性粒細胞，B細胞或T細胞。
5.權(quán)利要求4的用途，其中所述T細胞是CD4+T細胞。
6.BvS多肽，編碼BvS多肽的多核苷酸，EG-VEGF多肽，編碼EG-VEGF多肽的多核苷酸，或其組合在制備用于治療免疫缺陷疾病的藥物中的用途。
7.權(quán)利要求6的用途，其中所述免疫缺陷疾病包括原發(fā)性免疫缺陷疾病或繼發(fā)性免疫缺陷疾病。
8.權(quán)利要求6的用途，其中所述免疫缺陷疾病包括淋巴細胞減少癥，嗜中性粒細胞減少癥，單核細胞減少癥或粒細胞減少癥。
9.權(quán)利要求6的用途，其中所述免疫缺陷疾病包括B淋巴細胞疾病或T淋巴細胞疾病。
10.權(quán)利要求6的用途，其中所述免疫缺陷疾病是與以下情況相關(guān)的疾病化療，感染性疾病，細菌感染，人免疫缺陷病毒(HIV)感染，給藥免疫抑制劑，白血病，骨髓增生性疾病，或骨髓發(fā)育不良性疾病，或給予放射療法。
11.權(quán)利要求10的用途，其中所述免疫缺陷疾病是嗜中性粒細胞減少癥。
12.權(quán)利要求10的用途，其中所述的化療包括利用5-氟尿嘧啶，長春新堿，順鉬， oxoplatin，甲氨喋呤，3'-疊氮基_3'-脫氧胸苷，紫杉醇，紫杉萜，蒽環(huán)類抗生素，或其混合物進行的治療。
13.權(quán)利要求10的用途，其中所述免疫抑制劑是具有原發(fā)或繼發(fā)性免疫抑制效應的治療劑。
14.BvS多肽拮抗劑，EG-VEGF多肽拮抗劑，或其組合在制備用于治療與異常造血相關(guān)的自身免疫疾病或病癥的藥物中的用途。
15.權(quán)利要求14的用途，其中所述與異常造血相關(guān)的疾病包括血液疾病。
16.權(quán)利要求15的用途，其中所述血液疾病包括白血病，骨髓增生性疾病，骨髓發(fā)育不良性疾病，淋巴組織增生性疾病，或淋巴組織發(fā)育不良性疾病。
17.權(quán)利要求16的用途，其中所述白血病包括急性髓性白血病，慢性髓性白血病，或急性淋巴母細胞白血病。
18.權(quán)利要求14的用途，其中所述自身免疫病是炎性腸病，克隆氏病，結(jié)腸炎，移植物抗宿主疾病，狼瘡，多發(fā)性硬化，重癥肌無力，視神經(jīng)炎，銀屑病，類風濕性關(guān)節(jié)炎，Graves 病，自身免疫性肝炎，I型糖尿病，或再生障礙性貧血。
19.Bv8多肽，編碼Bv8多肽的多核苷酸，EG-VEGF多肽，編碼EG-VEGF多肽的多核苷酸，或其組合在制備用于調(diào)節(jié)B細胞或T細胞增殖或活化的藥物中的用途。
20.BvS多肽拮抗劑，EG-VEGF多肽拮抗劑，或其組合在制備用于調(diào)節(jié)B細胞或T細胞增殖或活化的藥物中的用途。
21.Bv8多肽，編碼Bv8多肽的多核苷酸，EG-VEGF多肽，編碼EG-VEGF多肽的多核苷酸，或其組合在制備用于調(diào)節(jié)免疫反應的藥物中的用途。
22.BvS多肽拮抗劑，EG-VEGF多肽拮抗劑，或其組合在制備用于調(diào)節(jié)免疫反應的藥物中的用途。
23.權(quán)利要求19到22之一的用途，其中所述調(diào)節(jié)包括誘導。
24.權(quán)利要求19到22之一的用途，其中所述調(diào)節(jié)包括抑制。
25.權(quán)利要求19到22之一的用途，其中所述藥物誘導CD4+T細胞中的細胞因子產(chǎn)生。
26.權(quán)利要求25的用途，其中所述細胞因子包括白介素-2或干擾素-、。
27.權(quán)利要求1-22之一的用途，其中所述BvS多肽包含這樣的氨基酸序列，其與SEQID NO :2或SEQ ID NO :4的氨基酸序列具有至少80%同一性，并可誘導內(nèi)皮細胞的增殖。
28.權(quán)利要求1-22之一的用途，其中所述Bv8多肽包含SEQID NO :2,SEQ ID NO :4或 SEQ ID NO 6的氨基酸序列。
29.權(quán)利要求沈的用途，其中所述BvS多肽是天然人BvS多肽。
30.權(quán)利要求沈的用途，其中所述BvS多肽結(jié)合肝素。
31.權(quán)利要求沈的用途，其中所述BvS多肽包含融合多肽，嵌合多肽或免疫粘附素。
32.權(quán)利要求1-13，19，或21之一的用途，其中編碼BvS多肽的多核苷酸包含以下核酸序列SEQ ID NO 1的核酸位置11到核酸位置400，SEQ ID NO 3的核酸位置11到核酸位置396，SEQ ID NO 5的核酸位置46到核酸位置384。
33.權(quán)利要求1-22之一的用途，其中所述EG-VEGF多肽包含這樣的氨基酸序列，其與 SEQ ID NO 8的氨基酸20-105具有至少80%的同一性，并可誘導內(nèi)皮細胞的增殖。
34.權(quán)利要求33的用途，其中所述EG-VEGF多肽是天然人EG-VEGF多肽。
35.權(quán)利要求1-22之一的用途，其中所述EG-VEGF多肽包含SEQID NO 10或SEQ ID NO 8的氨基酸殘基20-105。
36.權(quán)利要求33的用途，其中所述EG-VEGF多肽包含融合多肽，嵌合多肽或免疫粘附ο
37.權(quán)利要求1-13，19或21之一的用途，其中編碼EG-VEGF多肽的多核苷酸包含SEQ ID NO 7或SEQ ID NO 9的核酸序列。
38.一種制品，其包括容器；BvS多肽拮抗劑，EG-VEGF多肽拮抗劑，或其組合；使用BvS多肽拮抗劑，EG-VEGF多肽拮抗劑，或其組合治療血液疾病的說明。
39.一種制品，其包括容器；BvS多肽，編碼BvS多肽的多核苷酸，EG-VEGF多肽，編碼EG-VEGF多肽的多核苷酸，或其組合；以及使用BvS多肽，編碼BvS多肽的多核苷酸，EG-VEGF多肽，編碼EG-VEGF多肽的多核苷酸，或其組合治療與異常造血相關(guān)的免疫疾病或病癥的說明。
40.鑒定BvS拮抗劑的方法，包括(a)使BvS與化合物接觸；并(b)將接觸過的BvS施用于骨髓細胞，淋巴系祖細胞，或其子代；其中抑制BvS所誘導的所述細胞的增殖或活化的化合物被鑒定為BvS拮抗劑。
41.鑒定BvS拮抗劑的方法，包括(a)使骨髓細胞，淋巴系祖細胞，或其子代與BvS或編碼BvS的多核苷酸接觸；(b)將化合物施用于接觸過的細胞；其中抑制BvS所誘導的所述細胞的增殖或活化的化合物被鑒定為BvS拮抗劑。
42.鑒定EG-VEGF拮抗劑的方法，包括(a)使EG-VEGF與化合物接觸；并(b)將接觸過的EG-VEGF施用于骨髓細胞，淋巴系祖細胞，或其子代；其中抑制EG-VEGF所誘導的所述細胞的增殖或活化的化合物被鑒定為EG-VEGF拮抗劑。
43.鑒定EG-VEGF拮抗劑的方法，包括(a)使骨髓細胞，淋巴系祖細胞，或其子代與EG-VEGF或編碼EG-VEGF的多核苷酸接觸；(b)將化合物施用于該接觸過的細胞；其中抑制EG-VEGF所誘導的所述細胞的增殖或活化的化合物被鑒定為EG-VEGF拮抗劑。
44.權(quán)利要求40-43之一的方法，其中所述骨髓細胞是造血干細胞，髓樣祖細胞，或髓樣前體細胞。
45.權(quán)利要求40-43之一的方法，其中所述子代是髓樣細胞，淋巴樣前體細胞，或淋巴細胞。
46.權(quán)利要求40-43之一的方法，其中所述子代是嗜中性粒細胞，B細胞，或T細胞。
47.權(quán)利要求46的方法，其中所述T細胞是⑶4+T細胞。
全文摘要
本發(fā)明提供了利用Bv8和EG-VEGF多肽及核酸促進造血的方法。還提供了篩選Bv8和EG-VEGF活性的調(diào)解物的方法。此外，提供了利用Bv8和EG-VEGF多肽或Bv8和EG-VEGF拮抗劑的治療方法。
文檔編號A61P37/06GK102225194SQ20111016209
公開日2011年10月26日申請日期2004年3月12日優(yōu)先權(quán)日2003年3月12日
發(fā)明者珍妮弗·萊庫特, 納波利昂·費拉拉申請人:健泰科生物技術(shù)公司

完整全部詳細技術(shù)資料下載

該技術(shù)已申請專利。僅供學習研究，如用于商業(yè)用途，請聯(lián)系技術(shù)所有人。
技術(shù)研發(fā)人員：納波利昂·費拉拉;珍妮弗·萊庫特
技術(shù)所有人：健泰科生物技術(shù)公司
我是此專利的發(fā)明人

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