專利名稱：治療肺纖維化疾病的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及肺纖維化疾病領(lǐng)域，例如，特發(fā)性肺纖維化(IPF)。 簡(jiǎn)介肺纖維化疾病的特征為肺中的炎癥和結(jié)締組織病理性積聚，且包括病癥例如間質(zhì)性肺炎、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)和特發(fā)性肺纖維化(IPF)。目前尚無針對(duì)這些慢性、進(jìn)行性疾病的有效療法。IPF的特征為肺部組織的炎癥和最終纖維化，盡管這兩種癥狀也可以相互分離。IPF的病因仍未知，可能是由于自身免疫性疾病引起或是感染的結(jié)果。IPF的癥狀包括呼吸困難(即，呼吸急促)和干咳，呼吸困難隨疾病進(jìn)展成為主要癥狀。血氧不足、右心衰竭、心臟病發(fā)作、肺栓塞、中風(fēng)或肺感染可導(dǎo)致死亡，所有這些病癥都可由所述疾病引起。病理學(xué)上，早期IPF的特征為肺泡炎癥，隨后為肺泡纖維化。這包括成纖維細(xì)胞活化，成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞的擴(kuò)增以及肺實(shí)質(zhì)中胞外基質(zhì)的異常沉積。IPF相關(guān)肌成纖維細(xì)胞可衍生自活化的成纖維細(xì)胞，可源自循環(huán)的骨髓衍生祖細(xì)胞，或可由肺泡上皮細(xì)胞的“上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)”產(chǎn)生。肺泡的纖維性瘢痕化降低了氧傳遞能力，導(dǎo)致血氧不足。血氧不足可進(jìn)而導(dǎo)致肺動(dòng)脈高血壓，后者最終弱化右心室。IPF的主要治療為藥物治療，且大多數(shù)IPF患者需要終生接受治療。IPF治療最常用的藥物是皮質(zhì)激素(例如，氯潑尼松)，青霉胺和多種抗腫瘤藥(例如，環(huán)磷酰胺、硫唑嘌呤、苯丁酸氮芥、長(zhǎng)春新堿和秋水仙素)。其它治療包括氧氣給予和極端情況下的肺移植。顯然，除肺移植外，所有IPF治療都不能逆轉(zhuǎn)纖維化損傷，而僅僅防止進(jìn)一步纖維化。因此，需要不但能預(yù)防疾病進(jìn)展還能逆轉(zhuǎn)已有纖維性損傷的非侵入性IPF治療。

發(fā)明內(nèi)容
本文公開了用于預(yù)防和治療肺纖維化疾病的方法和組合物。還公開了用于逆轉(zhuǎn)和/或減輕肺纖維化疾病癥狀的方法和組合物。本發(fā)明公開的組合物包括賴氨酰氧化酶相關(guān)蛋白-2的抑制劑，例如，小分子、核酸和蛋白質(zhì)(例如，抗體；例如，抗L0XL2抗體)。還提供包含L0XL2的抑制劑(例如，抗L0XL2抗體)的藥物組合物，可選組合有藥學(xué)上可接受的賦形劑。示例性肺纖維化疾病包括特發(fā)性肺纖維化(IPF)、間質(zhì)性肺炎和急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)。肺纖維化疾病的癥狀可包括但不限于體重減輕，肺重量增加，肺纖維化，病理性肺結(jié)構(gòu)(例如，“蜂窩”肺)，艾氏評(píng)分(Ashcroft score)升高,肺部膠原蛋白水平升高，CD45+/膠原蛋白+細(xì)胞數(shù)量升高，肺細(xì)胞增生和擴(kuò)增，以及支氣管肺泡灌洗(BAL)液中白細(xì)胞數(shù)量升高。例如，癥狀還可包括一種或多種以下分子的肺部水平升高L0XL2，α-平滑肌肌動(dòng)蛋白U-SMA)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β-I (TGFP-I)，基質(zhì)衍生因子-I (SDF-I)(例如，SDF-I α )，內(nèi)皮素-I (ET-I)和磷酸化 SMAD2。本發(fā)明的治療方法包括給予患有肺纖維化疾病的對(duì)象賴氨酰氧化酶相關(guān)蛋白-2(L0XL2)抑制劑。示例性抑制劑包括但不限于L0XL2的抗體。示例性抗體有本文所述的 AB0023 和 AB0024 抗體。 還提供了通過測(cè)定來自對(duì)象的肺部組織樣品中的L0XL2水平診斷對(duì)象中肺纖維化疾病的方法，其中L0XL2水平提高表明肺纖維化疾病的發(fā)發(fā)生或進(jìn)展。L0XL2水平可以用本領(lǐng)域已知的任何方法測(cè)定，例如，使樣品接觸抗-L0XL2抗體，檢測(cè)所述抗體與所述樣品中L0XL2之間復(fù)合物的形成，并測(cè)定所形成復(fù)合物的量。其它測(cè)定方法包括檢測(cè)L0XL2mRNA的水平。本領(lǐng)域熟知mRNA的檢測(cè)方法。肺部組織中例如α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β-I (TGFii-I)、基質(zhì)衍生因子-I (如SDF-I α或SDF-I β )、內(nèi)皮素-I (ET-I)和磷酸化SMAD2的水平升高也表明肺纖維化疾病發(fā)生或進(jìn)展。在另一些實(shí)施方式中，提供預(yù)后方法。因此，本發(fā)明包括通過測(cè)定來自對(duì)象肺部組織樣品中的L0XL2水平監(jiān)測(cè)對(duì)象對(duì)治療肺纖維化疾病療法響應(yīng)的方法，其中L0XL2水平降低表明肺纖維化疾病的緩解。L0XL2水平可以用本領(lǐng)域已知的任何方法測(cè)定，例如，使樣品接觸抗-L0XL2抗體，檢測(cè)所述抗體與所述樣品中L0XL2之間復(fù)合物的形成，并測(cè)定所形成復(fù)合物的量。其它測(cè)定方法包括檢測(cè)L0XL2mRNA的水平。本領(lǐng)域熟知mRNA的檢測(cè)方法。肺部組織中例如α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β-I (TGFii-I)、基質(zhì)衍生因子-I (如SDF-I α或SDF-I β )、內(nèi)皮素-I (ET-I)和磷酸化SMAD2的水平降低也表明肺纖維化疾病緩解。因此，本發(fā)明包括但不限于以下實(shí)施方式I.預(yù)防對(duì)象中肺纖維化疾病的方法，所述方法包括給予所述對(duì)象賴氨酰氧化酶相關(guān)-2蛋白(L0XL2)活性的抑制劑。2.如實(shí)施方式I所述的方法，其中所述肺纖維化疾病選自下組間質(zhì)性肺炎，急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)和特發(fā)性肺纖維化(IPF)。3.如實(shí)施方式I所述的方法，其中所述抑制劑是L0XL2的抗體。4.如實(shí)施方式3所述的方法，其中所述抗體包括如SEQ ID NO :1所示重鏈序列和如SEQ ID NO 2所示輕鏈序列。5.如實(shí)施方式3所述的方法，其中所述抗體是人源化抗體。6.如實(shí)施方式5所述的方法，其中所述抗體包括如SEQ ID NO :3所示重鏈序列和如SEQ ID NO 4所示輕鏈序列。7.治療對(duì)象中肺纖維化疾病的方法，所述方法包括給予所述對(duì)象賴氨酰氧化酶相關(guān)-2蛋白(L0XL2)活性的抑制劑。8.如實(shí)施方式7所述的方法，其中所述肺纖維化疾病選自下組間質(zhì)性肺炎，急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)和特發(fā)性肺纖維化(IPF)。
9.如實(shí)施方式7所述的方法，其中所述抑制劑是L0XL2的抗體。10.如實(shí)施方式9所述的方法，其中所述抗體包括如SEQ ID NO :1所示重鏈序列和如SEQ ID NO :2所示輕鏈序列。11.如實(shí)施方式9所述的方法，其中所述抗體是人源化抗體。12.如實(shí)施方式11所述的方法,其中所述抗體包括如SEQ ID NO 3所示重鏈序列和如SEQ ID NO 4所示輕鏈序列。13.逆轉(zhuǎn)對(duì)象中肺纖維化疾病癥狀的方法，所述方法包括給予所述對(duì)象賴氨酰氧化酶相關(guān)-2蛋白(L0XL2)活性的抑制劑。14.如實(shí)施方式13所述的方法，其中所述肺纖維化疾病選自下組間質(zhì)性肺炎，急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)和特發(fā)性肺纖維化(IPF)。
15.如實(shí)施方式13所述的方法，其中所述抑制劑是L0XL2的抗體。16.如實(shí)施方式15所述的方法,其中所述抗體包括如SEQ ID NO 1所示重鏈序列和如SEQ ID NO 2所示輕鏈序列。17.如實(shí)施方式15所述的方法，其中所述抗體是人源化抗體。18.如實(shí)施方式17所述的方法，其中所述抗體包括如SEQ ID NO 3所示重鏈序列和如SEQ ID NO 4所示輕鏈序列。19.如實(shí)施方式13所述的方法，其中所述癥狀選自下組體重減輕，肺重量提高，纖維化，肺結(jié)構(gòu)，艾氏評(píng)分升高，肺部膠原蛋白水平升高和CD45+/膠原蛋白+細(xì)胞數(shù)量升高。20.如實(shí)施方式13所述的方法，其中所述癥狀是一種或多種選自下組的分子的水平升高L0XL2，α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β _1 (TGF β-I)，基質(zhì)衍生因子-I a (SDF-1 a )，內(nèi)皮素-I (ET-I)和磷酸化 SMAD2。21.如實(shí)施方式13所述的方法，其中所述癥狀是支氣管肺泡灌洗(BAL)液中白細(xì)
胞數(shù)量升高。22.在對(duì)象中用于預(yù)防或治療肺纖維化疾病或用于逆轉(zhuǎn)肺纖維化疾病癥狀的藥物組合物，所述組合物包含賴氨酰氧化酶相關(guān)-2蛋白(L0XL2)活性的抑制劑和藥學(xué)上可接受的賦形劑。23.如實(shí)施方式22所述的組合物，其中所述肺纖維化疾病選自下組間質(zhì)性肺炎，急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)和特發(fā)性肺纖維化(IPF)。24.如實(shí)施方式22所述的組合物，其中所述抑制劑是L0XL2的抗體。25.如實(shí)施方式24所述的組合物,其中所述抗體包括SEQ ID NO :1所示重鏈序列和SEQ ID NO 2所示輕鏈序列。26.如實(shí)施方式24所述的組合物，其中所述抗體是人源化抗體。27.如實(shí)施方式26所述的組合物,其中所述抗體包括SEQ ID NO :3所示重鏈序列和SEQ ID NO 4所示輕鏈序列。28.如實(shí)施方式22所述的組合物，其中所述癥狀選自下組體重減輕，肺重量提高，纖維化，肺結(jié)構(gòu)，艾氏評(píng)分升高，肺部膠原蛋白水平升高和CD45+/膠原蛋白+細(xì)胞數(shù)量升聞。29.如實(shí)施方式22所述的組合物，其中所述癥狀是一種或多種選自下組的分子的水平升高L0XL2，α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(a-SMA)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β _1 (TGF β-I)，基質(zhì)衍生因子-I a (SDF-1 α )，內(nèi)皮素-I (ET-I)和磷酸化SMAD2。30.如實(shí)施方式22所述的組合物，其中所述癥狀是支氣管肺泡灌洗(BAL)液中白
細(xì)胞數(shù)量升高。31.用于診斷對(duì)象中肺纖維化疾病的方法，所述方法包括(a)獲取來自所述對(duì)象的肺部組織樣品；以及(b)確定所述樣品中的L0XL2水平；其中所述樣品中L0XL2水平相比對(duì)照樣品升高表明存在肺纖維化疾病。32.如實(shí)施方式31所述的方法，其中所述肺纖維化疾病選自下組間質(zhì)性肺炎，急 性呼吸窘迫綜合征(ARDS)和特發(fā)性肺纖維化(IPF)。33.如實(shí)施方式31所述的方法，其中所述樣品中的L0XL2水平檢測(cè)是通過使所述樣品接觸L0XL2抗體以使得所述抗體和所述樣品中的L0XL2之間形成復(fù)合物并測(cè)定所形成復(fù)合物的量。34.如實(shí)施方式33所述的方法，其中所述抗體包括如SEQ ID NO :1所示重鏈序列和如SEQ ID NO 2所示輕鏈序列。35.如實(shí)施方式33所述的方法，其中所述抗體是人源化抗體。36.如實(shí)施方式35所述的方法，其中所述抗體包括如SEQ ID NO :3所示重鏈序列和如SEQ ID NO 4所示輕鏈序列。37.監(jiān)測(cè)對(duì)于治療肺纖維化疾病療法的對(duì)象響應(yīng)的方法，所述方法包括(a)獲取來自所述對(duì)象的肺部組織樣品；以及(b)確定所述樣品中的L0XL2水平；其中所述樣品中L0XL2水平相比對(duì)照樣品降低表明肺纖維化疾病緩解。38.如實(shí)施方式37所述的方法，其中所述肺纖維化疾病選自下組間質(zhì)性肺炎，急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)和特發(fā)性肺纖維化(IPF)。39.如實(shí)施方式37所述的方法，其中所述樣品中的L0XL2水平檢測(cè)是通過使所述樣品接觸L0XL2抗體以使得所述抗體和所述樣品中的L0XL2之間形成復(fù)合物并測(cè)定所形成
復(fù)合物的量。40.如實(shí)施方式39所述的方法，其中所述抗體包括如SEQ ID NO :1所示重鏈序列和如SEQ ID NO 2所示輕鏈序列。41.如實(shí)施方式39所述的方法，其中所述抗體是人源化抗體。42.如實(shí)施方式41所述的方法，其中所述抗體包括如SEQ ID NO 3所示重鏈序列和如SEQ ID NO 4所示輕鏈序列。43.如實(shí)施方式37所述的方法，其中所述治療包括給予所述對(duì)象L0XL2的抑制劑。44.如實(shí)施方式43所述的方法，其中所述抑制劑是抗體。45.如實(shí)施方式44所述的方法，其中所述抑制劑包含如SEQ ID NO : I所示重鏈序列和如SEQ ID NO 2所示輕鏈序列。46.如實(shí)施方式44所述的方法，其中所述抑制劑是人源化抗體。47.如實(shí)施方式46所述的方法，其中所述抑制劑包含如SEQ ID NO 3所示重鏈序列和如SEQ ID NO :4所示輕鏈序列。48.用于預(yù)防肺纖維化疾病的賴氨酰氧化酶相關(guān)-2蛋白(L0XL2)活性的抑制劑。
49.如實(shí)施方式48所述的抑制劑，其中所述肺纖維化疾病選自下組間質(zhì)性肺炎，急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)和特發(fā)性肺纖維化(IPF)。50.如實(shí)施方式48所述的抑制劑，其中所述抑制劑是L0XL2的抗體。51.如實(shí)施方式50所述的抑制劑,其中所述抗體包括SEQ ID NO :1所示重鏈序列和SEQ ID NO 2所示輕鏈序列。52.如實(shí)施方式50所述的抑制劑，其中所述抗體是人源化抗體。53.如實(shí)施方式52所述的抑制劑，其中所述抗體包括SEQ ID NO :3所示重鏈序列和SEQ ID NO 4所示輕鏈序列。54.用于治療肺纖維化疾病的賴氨酰氧化酶相關(guān)-2蛋白(L0XL2)活性的抑制劑。55.如實(shí)施方式54所述的抑制劑，其中所述肺纖維化疾病選自下組間質(zhì)性肺炎， 急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)和特發(fā)性肺纖維化(IPF)。56.如實(shí)施方式54所述的抑制劑，其中所述抑制劑是L0XL2的抗體。57.如實(shí)施方式56所述的抑制劑，其中所述抗體包括SEQ ID NO :1所列的重鏈序列和SEQ ID NO 2所列的輕鏈序列。58.如實(shí)施方式56所述的抑制劑，其中所述抗體是人源化抗體。59.如實(shí)施方式58所述的抑制劑，其中所述抗體包括SEQ ID NO 3所列的重鏈序列和SEQ ID NO :4所列的輕鏈序列。60.用于逆轉(zhuǎn)對(duì)象中肺纖維化疾病癥狀的賴氨酰氧化酶相關(guān)-2蛋白(L0XL2)活性的抑制劑。61.如實(shí)施方式60所述的抑制劑，其中所述肺纖維化疾病選自下組間質(zhì)性肺炎，急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)和特發(fā)性肺纖維化(IPF)。62.如實(shí)施方式60所述的抑制劑，其中所述抑制劑是L0XL2的抗體。63.如實(shí)施方式62所述的抑制劑，其中所述抗體包括SEQ ID NO : I所列的重鏈序列和SEQ ID NO 2所列的輕鏈序列。64.如實(shí)施方式62所述的抑制劑，其中所述抗體是人源化抗體。65.如實(shí)施方式64所述的抑制劑，其中所述抗體包括SEQ ID NO 3所列的重鏈序列和SEQ ID NO :4所列的輕鏈序列。66.如實(shí)施方式60所述的抑制劑，其中所述癥狀選自下組體重減輕，肺部重量提高，纖維化，肺結(jié)構(gòu)，艾氏評(píng)分升高，肺部膠原蛋白水平升高和CD45+/膠原蛋白+細(xì)胞數(shù)量升聞。67.如實(shí)施方式60所述的抑制劑，其中所述癥狀是一種或多種選自下組的分子的水平升高L0XL2，α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β _1 (TGF β-I)，基質(zhì)衍生因子-I a (SDF-1 a )，內(nèi)皮素-I (ET-I)和磷酸化SMAD2。68.如實(shí)施方式60所述的抑制劑，其中所述癥狀是支氣管肺泡灌洗(BAL)液中白細(xì)胞數(shù)量升高。附圖簡(jiǎn)要說明圖I顯示在預(yù)防研究過程中的平均體重。菱形表示用鹽水處理的對(duì)照動(dòng)物(第I組)；星形表示第O天用博來霉素處理的動(dòng)物(第2組)；圓形表示用抗-L0XL2抗體預(yù)治療，第O天用博來霉素處理，然后每周兩次用抗-L0XL2抗體治療的動(dòng)物(第3組)。
圖2顯示(從左向右)來自鹽水處理動(dòng)物(第I組)、博來霉素處理動(dòng)物(第2組)、和經(jīng)抗-L0XL2預(yù)處理和后續(xù)處理的博來霉素處理動(dòng)物(第3組)的BAL液中的平均白細(xì)胞數(shù)。圖3顯示通過α -平滑肌肌動(dòng)蛋白(a -SMA，左圖)和L0XL2 (右圖)免疫組化分析的肺切片。上圖顯示來自用博來霉素和抗體稀釋劑處理動(dòng)物(第2組)的切片；下圖顯示來自用博來霉素處理并用抗-L0XL2抗體(ΑΒ0023)預(yù)處理和后續(xù)處理的動(dòng)物的切片。圖4顯示來自第I組(“鹽水”)，第2組(1160:載劑”)和第3組(“Bleo:AB0023”)中動(dòng)物的肺切片的平均L0XL2信號(hào)面積。圖5顯示來自第I組(“鹽水”)，第2組(11的載劑”)和第3組("Bleo AB0023”)中動(dòng)物的肺切片的平均a-SMA信號(hào)面積。
圖6顯示來自博來霉素處理(第2組，左上圖)和博來霉素+抗-L0XL2抗體處理(第3組，右上圖)動(dòng)物的肺Η&Ε染色切片。放大倍數(shù)為20χ。下圖中顯示來自對(duì)照動(dòng)物(“鹽水對(duì)照”)、博來霉素處理動(dòng)物(“博來霉素載劑”)和用博來霉素與抗-L0XL2抗體處理動(dòng)物(“博來霉素ΑΒ0023”)的肺的艾氏評(píng)分。圖7顯示透射光下觀測(cè)來自博來霉素處理(第2組，左上圖)和博來霉素+抗-L0XL2抗體處理(第3組,右上圖)動(dòng)物的肺的天狼星紅(Sirius Red)染色切片。放大倍數(shù)為20x。下圖中顯示來自博來霉素處理動(dòng)物(“博來霉素載劑”)和用博來霉素與抗-L0XL2抗體處理動(dòng)物(“博來霉素AB0023”)肺的已交聯(lián)膠原蛋白水平的定量分析(通過偏振光下檢測(cè)天狼星紅染色確定)。圖8顯不通過免疫組化分析基質(zhì)衍生因子-I a (SDF-Ia)存在的切片，米用來自博來霉素處理動(dòng)物(第2組，左上圖)和用博來霉素與抗-L0XL2抗體處理動(dòng)物(第3組，右上圖)的肺切片。放大倍數(shù)為20χ。下圖中顯示來自對(duì)照動(dòng)物(“鹽水”)，博來霉素處理動(dòng)物(“博來霉素載劑”)和用博來霉素與抗-L0XL2抗體處理動(dòng)物(“博來霉素ΑΒ0023”)肺切片的SDF-I a信號(hào)定量。圖9顯示通過免疫組化分析TGF β -I存在的切片，采用來自博來霉素處理動(dòng)物(第2組，左上圖)和用博來霉素與抗-L0XL2抗體處理動(dòng)物(第3組，右上圖)的肺切片。放大倍數(shù)為20χ。下圖中顯示來自對(duì)照動(dòng)物(“鹽水”)，博來霉素處理動(dòng)物(“博來霉素-載劑”)和用博來霉素與抗-L0XL2抗體處理動(dòng)物(“博來霉素-ΑΒ0023”)肺切片的TGF^-I
信號(hào)定量。

圖10顯示博來霉素處理小鼠中由ELISA測(cè)定的P-SMAD2相對(duì)水平，所述小鼠還用抗-L0XL2抗體(ΑΒ0023，右側(cè))或?qū)φ湛贵w(AC-1，左側(cè))處理。圖11顯不通過免疫組化分析內(nèi)皮素-I (ET-I)存在的切片，米用來自博來霉素處理動(dòng)物(第2組，左上圖)和用博來霉素與抗-L0XL2抗體處理動(dòng)物(第3組，右上圖)的肺切片。放大倍數(shù)為20χ。下圖中顯示來自對(duì)照動(dòng)物(“鹽水”)，博來霉素處理動(dòng)物(“博來霉素載劑”)和用博來霉素與抗-L0XL2抗體處理動(dòng)物(“博來霉素ΑΒ0023”)肺切片的ET-I信號(hào)定量。圖12顯示用I型膠原蛋白(綠色)和⑶45 (紅色)染色的肺切片的代表性圖像。放大倍數(shù)在上圖中為20χ，下圖中為63Χ。左側(cè)兩個(gè)小圖顯示來自經(jīng)博來霉素處理(“1U博來霉素載劑”)的動(dòng)物的肺切片，而右側(cè)兩個(gè)小圖顯示來自經(jīng)博來霉素和抗-L0XL2抗體處理(“1U博來霉素AB0023”)的動(dòng)物的肺切片。CD45陽性細(xì)胞和膠原蛋白的共定位(由箭頭標(biāo)示)表明存在可能的纖維細(xì)胞，即能導(dǎo)致肺纖維化的成纖維細(xì)胞的前體。用抗體治療減少了肺部組織中纖維細(xì)胞前體的發(fā)生率。圖13顯示接受了抗L0XL2抗體AB0023 (上方曲線)或不識(shí)別L0XL2的對(duì)照抗體(AC-1，下方曲線)處理后注射的博來霉素處理動(dòng)物中的體重平均升高測(cè)量。圖14顯示博來霉素處理和對(duì)照動(dòng)物中肺重量的測(cè)量。圖中所示肺腫瘤來自未用博來霉素處理的對(duì)照動(dòng)物(“鹽水”)，來自博來霉素處理不久的動(dòng)物(“收獲Rx”)，來自博來霉素處理后22天且每周兩次注射對(duì)照抗體的動(dòng)物(“Bleo :AC-1”)，和來自博來霉素處理后22天且每周兩次注射抗-L0XL2抗體的動(dòng)物(“Bleo :AB0023”)。圖15顯示蘇木精和曙紅(H&E)染色的小鼠肺部切片。頂部小圖顯示來自收獲Rx樣品的代表性切片，該樣品于博來霉素給藥后第7天啟動(dòng)抗體治療后24-48小時(shí)取得，表明肺部組織增厚和廣泛的肺部損傷。中間的小圖顯示來自接受對(duì)照AC-I抗體注射的博來霉素處理動(dòng)物的代表性肺部切片，其中肺部損傷已有進(jìn)展。底部小圖顯示來自接受對(duì)照抗-L0XL2AB0023抗體注射的博來霉素處理動(dòng)物的代表性肺部切片，表明博來霉素處理導(dǎo)致的肺部損傷有逆轉(zhuǎn)以及肺結(jié)構(gòu)正?；D16顯示來自未用博來霉素處理的對(duì)照動(dòng)物(“鹽水”)，來自博來霉素處理不久的動(dòng)物(“收獲Rx”)，來自博來霉素處理后22天且每周兩次注射對(duì)照抗體的動(dòng)物(“Bleo-ACl”)，和來自博來霉素處理后22天且每周兩次注射抗-L0XL2抗體的動(dòng)物(“Bleo-AB0023”)的艾氏評(píng)分。圖17顯示在未用博來霉素處理的對(duì)照動(dòng)物(“鹽水”)，博來霉素處理不久的動(dòng)物(“收獲Rx”)，博來霉素處理后22天且每周兩次注射對(duì)照抗體的動(dòng)物(“Bleo :AC1”)，和博來霉素處理后22天且每周兩次注射抗-L0XL2抗體的動(dòng)物(“Bleo :AB0023”)中的a -SMA水平。a -SMA水平通過免疫組化測(cè)定，并用MetaMorph圖像分析軟件(分子設(shè)備公司(Molecular Devices),賓夕法尼亞州唐寧鎮(zhèn))定量。圖18顯示在未用博來霉素處理的對(duì)照動(dòng)物(“鹽水”)，博來霉素處理不久的動(dòng)物(“收獲Rx”)，博來霉素處理后22天且每周兩次注射對(duì)照抗體的動(dòng)物(“Bleo :AC1”)，和博來霉素處理后22天且每周兩次注射抗-L0XL2抗體的動(dòng)物(“Bleo :AB0023”)中的L0XL2水平。L0XL2水平通過免疫組化測(cè)定，并用MetaMorph圖像分析軟件(分子設(shè)備公司，賓夕法尼亞州唐寧鎮(zhèn))定量。圖19顯示在未用博來霉素處理的對(duì)照動(dòng)物(“鹽水”)，博來霉素處理不久的動(dòng)物(“收獲Rx”)，博來霉素處理后22天且每周兩次注射對(duì)照抗體的動(dòng)物(“Bleo :AC1”)，和博來霉素處理后22天且每周兩次注射抗-L0XL2抗體的動(dòng)物(“Bleo :AB0023”)中的已交聯(lián)膠原蛋白水平，該水平通過在偏振光下檢測(cè)天狼星紅染色確定。發(fā)明詳述除非另有說明，本文的實(shí)施采用細(xì)胞生物學(xué)、毒理學(xué)、分子生物學(xué)、生物化學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、重組DNA領(lǐng)域和相關(guān)領(lǐng)域中的標(biāo)準(zhǔn)方法和常規(guī)技術(shù)，所述方法和技術(shù)在本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)。這些技術(shù)描述于文獻(xiàn)中并因而本領(lǐng)域技術(shù)人員可用。參見例如 Alberts, B.等"Molecular Biology of the Cell (《細(xì)胞分子生物學(xué)》)"，第5版,紐約州紐約市的加蘭德科學(xué)出版社(Garland Science), 2008 ；Voet, D.等"Fundamentals ofBiochemistry Life at the Molecular Level (《基礎(chǔ)生物化學(xué)分子水平的生命》)"，第3版，新澤西州霍博肯的約翰威利出版社(John Wiley & Sons), 2008 ;Sambrook,J.等，"Molecular Cloning A Laboratory Manual (《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》)"，第3版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press), 2001 ；Ausubel,F.等，"Current Protocols in Molecular Biology (《新編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》)"，紐約的約翰威利出版社，1987,定期更新；Freshney, R. I. , " Culture of Animal Cells A Manual of Basic Technique (《動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)手冊(cè)》)"，第4版,新澤西州薩默塞特的約翰威利出版社，2000 ;Methods in Enzymology (《酶學(xué)方法》)，加利福尼亞州圣地亞哥的學(xué)術(shù)出版社(Academic Press)。肺纖維化疾病肺纖維化疾病以肺實(shí)質(zhì)的炎癥和纖維化為特征。這些疾病的病因?qū)W尚未確立，且預(yù)后通常較差。目前，肺纖維化疾病按發(fā)病頻率排序分成以下各組特發(fā)性肺纖維化(IPF)，非特異性間質(zhì)性肺炎(NSIP)，呼吸細(xì)支氣管相關(guān)間質(zhì)性肺病，脫屑性間質(zhì)性肺炎，隱 源性機(jī)化性肺炎，急性間質(zhì)性肺炎和淋巴細(xì)胞性間質(zhì)性肺炎(LIP)。急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)也已鑒定為肺纖維化疾病。其它肺纖維化疾病包括硬皮病相關(guān)肺纖維化和作為結(jié)節(jié)病后遺癥的纖維化損傷。肺纖維化疾病的癥狀包括體重減輕，肺重量提高，存在活化的成纖維細(xì)胞或纖維細(xì)胞，存在纖維細(xì)胞前體細(xì)胞(例如，同時(shí)表達(dá)CD45和膠原蛋白的細(xì)胞)，異常的肺結(jié)構(gòu)(包括肺泡增厚、肺細(xì)胞增生和擴(kuò)增，和蜂窩肺)，艾氏評(píng)分(Ashcroft score)(反映常規(guī)肺結(jié)構(gòu)和構(gòu)造)升高，膠原蛋白水平增加，以及支氣管肺泡灌洗液中白細(xì)胞數(shù)量上升。肺纖維化的分子癥狀包括以下蛋白中一種或多種的水平升高L0XL2，α -平滑肌肌動(dòng)蛋白U-SMA)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β-I (TGFP-I)，基質(zhì)衍生因子-Ia (SDF-la)，基質(zhì)衍生因子-I β (SDF-1 β )，內(nèi)皮素-I (ET-I)和磷酸化SMAD2。L0XL2參與肺纖維化疾病從肺纖維化患者的肺活檢檢查發(fā)現(xiàn)L0XL2在IPF的所有組織學(xué)明確分期中都有廣泛表達(dá)。L0XL2在疾病相關(guān)血管和基質(zhì)重塑與活性纖維發(fā)生區(qū)域中的表達(dá)尤為強(qiáng)烈。還在纖維化肺組織的反應(yīng)性II型肺細(xì)胞中測(cè)得L0XL2表達(dá)。此外，L0XL2過量表達(dá)的位點(diǎn)與表達(dá)a -平滑肌肌動(dòng)蛋白(a -SM)的位點(diǎn)相關(guān)聯(lián)。SMA是活化成纖維細(xì)胞的標(biāo)記物，該細(xì)胞是纖維化組織的標(biāo)志。因此，纖維化肺組織中L0XL2的主要來源看來是活化的成纖維細(xì)胞(“纖維細(xì)胞”)和疾病相關(guān)(“反應(yīng)性”)肺細(xì)胞。鑒于L0XL2在纖維化肺中的過量表達(dá)及L0XL2過量表達(dá)與纖維發(fā)生和成纖維細(xì)胞活化位點(diǎn)的共定位，本發(fā)明人確定了抑制L0XL2是預(yù)防和/或治療肺纖維化疾病的有效方法。此外，本發(fā)明人確定了抑制L0XL2能逆轉(zhuǎn)肺纖維化的癥狀，包括上文所述癥狀。因此，不同于阻斷、緩解或預(yù)防肺纖維化發(fā)展的其它方法，本文公開的方法和組合物實(shí)際上促進(jìn)了纖維化肺組織的愈合，并因此能用于逆轉(zhuǎn)肺纖維化疾病的病程。賴氨酰氧化酶型酶本文所用術(shù)語“賴氨酰氧化酶型酶”指催化賴氨酸和羥賴氨酸殘基的ε-氨基氧化脫氨的蛋白家族成員，該氧化脫氨導(dǎo)致肽基賴氨酸轉(zhuǎn)變成肽基-a -氨基己二酸-S -半醛(醛賴氨酸)并釋放化學(xué)計(jì)量量的氨和過氧化氫
權(quán)利要求
1.防止對(duì)象中肺纖維化疾病的方法，所述方法包括給予所述對(duì)象賴氨酰氧化酶相關(guān)-2蛋白(L0XL2)活性的抑制劑。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述肺纖維化疾病選自下組間質(zhì)性肺炎，急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)和特發(fā)性肺纖維化(IPF)。
3.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述抑制劑是L0XL2的抗體。
4.如權(quán)利要求3所述的方法,其特征在于,所述抗體包括如SEQID NO :1所示重鏈序列和如SEQ ID NO 2所示輕鏈序列。
5.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述抗體是人源化抗體。
6.如權(quán)利要求5所述的方法,其特征在于,所述抗體包括如SEQID NO :3所示重鏈序列和如SEQ ID NO 4所示輕鏈序列。
7.治療對(duì)象中肺纖維化疾病的方法，所述方法包括給予所述對(duì)象賴氨酰氧化酶相關(guān)-2蛋白(L0XL2)活性的抑制劑。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述肺纖維化疾病選自下組間質(zhì)性肺炎，急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)和特發(fā)性肺纖維變性(IPF)。
9.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述抑制劑是L0XL2的抗體。
10.如權(quán)利要求9所述的方法,其特征在于,所述抗體包括如SEQID NO :1所示重鏈序列和如SEQ ID NO 2所示輕鏈序列。
11.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述抗體是人源化抗體。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述抗體包括如SEQID NO 3所示重鏈序列和如SEQ ID NO :4所示輕鏈序列。
13.逆轉(zhuǎn)對(duì)象中肺纖維化疾病癥狀的方法，所述方法包括給予所述對(duì)象賴氨酰氧化酶相關(guān)-2蛋白(LOXL2)活性的抑制劑。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述肺纖維化疾病選自下組； 間質(zhì)性肺炎，急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)和特發(fā)性肺纖維化(IPF)。
15.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述抑制劑是LOXL2的抗體。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述抗體包括如SEQID NO 1所示重鏈序列和如SEQ ID NO :2所示輕鏈序列。
17.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述抗體是人源化抗體。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述抗體包括如SEQID NO :3所示重鏈序列和如SEQ ID NO 4所示輕鏈序列。
19.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述癥狀選自下組體重減輕，肺重量提高，纖維化，肺結(jié)構(gòu)，艾氏評(píng)分升高，肺部膠原蛋白水平升高和CD45+/膠原蛋白+細(xì)胞數(shù)量升聞。
20.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述癥狀是一種或多種選自下組的分子的水平升高LOXL2，α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β _1 (TGF β-I)，基質(zhì)衍生因子-I a (SDF-1 a )，內(nèi)皮素-I (ET-I)和磷酸化SMAD2。
21.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述癥狀是支氣管肺泡灌洗(BAL)液中白細(xì)胞數(shù)量升高。
22.在對(duì)象中用于防止或治療肺纖維化疾病或用于逆轉(zhuǎn)肺纖維化疾病癥狀的藥物組合物，所述組合物包含賴氨酰氧化酶相關(guān)-2蛋白(L0XL2)活性的抑制劑和藥學(xué)上可接受的賦形劑。
23.如權(quán)利要求22所述的組合物，其特征在于，所述肺纖維化疾病選自下組間質(zhì)性肺炎，急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)和特發(fā)性肺纖維化(IPF)。
24.如權(quán)利要求22所述的組合物，其特征在于，所述抑制劑是L0XL2的抗體。
25.如權(quán)利要求24所述的組合物，其特征在于，所述抗體包括SEQID NO :1所列的重鏈序列和SEQ ID NO 2所列的輕鏈序列。
26.如權(quán)利要求24所述的組合物，其特征在于，所述抗體是人源化抗體。
27.如權(quán)利要求26所述的組合物，其特征在于，所述抗體包括SEQID NO :3所列的重鏈序列和SEQ ID NO 4所列的輕鏈序列。
28.如權(quán)利要求22所述的組合物，其特征在于，所述癥狀選自下組體重減輕，肺重量提高，纖維化，肺結(jié)構(gòu)，艾氏評(píng)分升高，肺部膠原蛋白水平升高和CD45+/膠原蛋白+細(xì)胞數(shù)量升高。
29.如權(quán)利要求22所述的組合物，其特征在于，所述癥狀是一種或多種選自下組的分子的水平升高L0XL2，α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β-I (TGFP-I)，基質(zhì)衍生因子-I a (SDF-1 a )，內(nèi)皮素-I (ET-I)和磷酸化SMAD2。
30.如權(quán)利要求22所述的組合物，其特征在于，所述癥狀是支氣管肺泡灌洗(BAL)液中白細(xì)胞數(shù)量升高。
31.用于診斷對(duì)象中肺纖維化疾病的方法，所述方法包括 (a)獲取來自所述對(duì)象的肺部組織樣品；以及 (b)確定所述樣品中的LOXL2水平； 其中所述樣品中LOXL2水平相比對(duì)照樣品升高表明存在肺纖維化疾病。
32.如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于，所述肺纖維化疾病選自下組間質(zhì)性肺炎，急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)和特發(fā)性肺纖維化(IPF)。
33.如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于，所述樣品中的LOXL2水平檢測(cè)是通過使所述樣品接觸LOXL2抗體以使得所述抗體和所述樣品中的LOXL2之間形成復(fù)合物并測(cè)定所形成復(fù)合物的量。
34.如權(quán)利要求33所述的方法，其特征在于，所述抗體包括如SEQID NO 1所示重鏈序列和如SEQ ID NO :2所示輕鏈序列。
35.如權(quán)利要求33所述的方法，其特征在于，所述抗體是人源化抗體。
36.如權(quán)利要求35所述的方法，其特征在于，所述抗體包括如SEQID NO :3所示重鏈序列和如SEQ ID NO 4所示輕鏈序列。
37.監(jiān)測(cè)對(duì)象響應(yīng)治療肺纖維化疾病療法的方法，所述方法包括 (a)獲取來自所述對(duì)象的肺部組織樣品；以及 (b)確定所述樣品中的LOXL2水平； 其中所述樣品中LOXL2水平相比對(duì)照樣品降低表明肺纖維化疾病緩解。
38.如權(quán)利要求37所述的方法，其特征在于，所述肺纖維化疾病選自下組間質(zhì)性肺炎，急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)和特發(fā)性肺纖維化(IPF)。
39.如權(quán)利要求37所述的方法，其特征在于，所述樣品中的LOXL2水平檢測(cè)是通過使所述樣品接觸L0XL2抗體以使得所述抗體和所述樣品中的L0XL2之間形成復(fù)合物并測(cè)定所形成復(fù)合物的量。
40.如權(quán)利要求39所述的方法，其特征在于，所述抗體包括如SEQID NO 1所示重鏈序列和如SEQ ID NO :2所示輕鏈序列。
41.如權(quán)利要求39所述的方法，其特征在于，所述抗體是人源化抗體。
42.如權(quán)利要求41所述的方法，其特征在于，所述抗體包括如SEQID NO 3所示重鏈序列和如SEQ ID NO 4所示輕鏈序列。
43.如權(quán)利要求37所述的方法，其特征在于，所述治療包括給予所述對(duì)象LOXL2的抑制劑。
44.如權(quán)利要求43所述的方法，其特征在于，所述抑制劑是抗體。
45.如權(quán)利要求44所述的方法，其特征在于，所述抑制劑包含如SEQID NO 1所示重鏈序列和如SEQ ID NO 2所示輕鏈序列。
46.如權(quán)利要求44所述的方法，其特征在于，所述抑制劑是人源化抗體。
47.如權(quán)利要求46所述的方法，其特征在于，所述抑制劑包含如SEQID NO 3所示重鏈序列和如SEQ ID NO 4所示輕鏈序列。
48.用于防止肺纖維化疾病的賴氨酰氧化酶相關(guān)-2蛋白(LOXL2)活性的抑制劑。
49.如權(quán)利要求48所述的抑制劑，其特征在于，所述肺纖維化疾病選自下組間質(zhì)性肺炎，急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)和特發(fā)性肺纖維化(IPF)。
50.如權(quán)利要求48所述的抑制劑，其特征在于，所述抑制劑是LOXL2的抗體。
51.如權(quán)利要求50所述的抑制劑，其特征在于，所述抗體包括SEQID NO :1所列的重鏈序列和SEQ ID NO 2所列的輕鏈序列。
52.如權(quán)利要求50所述的抑制劑，其特征在于，所述抗體是人源化抗體。
53.如權(quán)利要求52所述的抑制劑，其特征在于，所述抗體包括SEQID NO :3所列的重鏈序列和SEQ ID NO :4所列的輕鏈序列。
54.用于治療肺纖維化疾病的賴氨酰氧化酶相關(guān)-2蛋白(LOXL2)活性的抑制劑。
55.如權(quán)利要求54所述的抑制劑，其特征在于，所述肺纖維化疾病選自下組間質(zhì)性肺炎，急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)和特發(fā)性肺纖維化(IPF)。
56.如權(quán)利要求54所述的抑制劑，其特征在于，所述抑制劑是LOXL2的抗體。
57.如權(quán)利要求56所述的抑制劑，其特征在于，所述抗體包括SEQID NO :1所列的重鏈序列和SEQ ID NO 2所列的輕鏈序列。
58.如權(quán)利要求56所述的抑制劑，其特征在于，所述抗體是人源化抗體。
59.如權(quán)利要求58所述的抑制劑，其特征在于，所述抗體包括SEQID NO :3所列的重鏈序列和SEQ ID NO 4所列的輕鏈序列。
60.用于逆轉(zhuǎn)對(duì)象中肺纖維化疾病癥狀的賴氨酰氧化酶相關(guān)-2蛋白(LOXL2)活性的抑制劑。
61.如權(quán)利要求60所述的抑制劑，其特征在于，所述肺纖維化疾病選自下組間質(zhì)性肺炎，急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)和特發(fā)性肺纖維化(IPF)。
62.如權(quán)利要求60所述的抑制劑，其特征在于，所述抑制劑是LOXL2的抗體。
63.如權(quán)利要求62所述的抑制劑，其特征在于，所述抗體包括SEQID NO 1所列的重鏈序列和SEQ ID NO 2所列的輕鏈序列。
64.如權(quán)利要求62所述的抑制劑，其特征在于，所述抗體是人源化抗體。
65.如權(quán)利要求64所述的抑制劑，其特征在于，所述抗體包括SEQID NO :3所列的重鏈序列和SEQ ID NO 4所列的輕鏈序列。
66.如權(quán)利要求60所述的抑制劑，其特征在于，所述癥狀選自下組體重減輕，肺重量提高，纖維化，肺結(jié)構(gòu)，艾氏評(píng)分升高，肺部膠原蛋白水平升高和CD45+/膠原蛋白+細(xì)胞數(shù)量升高。
67.如權(quán)利要求60所述的抑制劑，其特征在于，所述癥狀是一種或多種選自下組的分子的水平升高LOXL2，α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β-I (TGFP-I)，基質(zhì)衍生因子-I a (SDF-1 a )，內(nèi)皮素-I (ET-I)和磷酸化SMAD2。
68.如權(quán)利要求60所述的抑制劑，其特征在于，所述癥狀是支氣管肺泡灌洗(BAL)液中白細(xì)胞數(shù)量升高。
全文摘要
本發(fā)明公開了用于預(yù)防和治療肺纖維化疾病及用于減輕或逆轉(zhuǎn)肺纖維化疾病如特發(fā)性肺纖維化癥狀的方法和組合物。所述組合物包括LOXL2蛋白的抑制劑，且所述方法包括所述抑制劑的制備和使用方法。
文檔編號(hào)A61K39/395GK102711820SQ201080047970
公開日2012年10月3日 申請(qǐng)日期2010年8月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月21日
發(fā)明者R·斯潘格勒, V·史密斯 申請(qǐng)人:吉聯(lián)亞生物科技有限公司