專利名稱：利用反義iap寡聚物和化療劑治療增生性疾病的制作方法
利用反義IAP寡聚物和化療劑治療增生性疾病本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2004年10月29日、申請(qǐng)?zhí)枮?00480039601. 8 (國(guó)際申請(qǐng)?zhí)枮?PCT/CA2004/001900)、發(fā)明名稱為“利用反義IAP寡聚物和化療劑治療增生性疾病”的發(fā)明 申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及癌癥及其它增生性疾病的治療。一種細(xì)胞死亡的方式被稱為凋亡，或程序性細(xì)胞死亡。凋亡通常是發(fā)育和維持健康組織的正常部分。這一過(guò)程可能發(fā)生的很快，以至于難以檢測(cè)到?，F(xiàn)在已經(jīng)知道凋亡路徑在胚胎發(fā)育，病毒致病，癌癥，自身免疫紊亂，神經(jīng)變性疾 病和其它疾病中起關(guān)鍵性的作用。凋亡反應(yīng)衰竭牽涉到癌癥，自身免疫紊亂，例如紅斑狼瘡 和多發(fā)性硬化的發(fā)展和病毒感染，其中病毒感染包括那些與皰疹病毒，痘病毒和腺病毒相 關(guān)的病毒感染。近年來(lái)，凋亡在癌癥中的重要性已經(jīng)變得明朗。在二十世紀(jì)七十年代后期促生長(zhǎng) 致癌基因的鑒定引起了對(duì)細(xì)胞增殖幾乎普遍的聚焦關(guān)注，使細(xì)胞增殖支配癌癥生物學(xué)研究 多年。長(zhǎng)期存在的信條一直認(rèn)為，抗癌癥治療應(yīng)優(yōu)先靶向相對(duì)于”正常細(xì)胞"的快速分裂 的癌細(xì)胞。這種解釋并不全然令人滿意，因?yàn)橐恍┥L(zhǎng)遲緩的腫瘤容易治療，而許多快速分 裂的腫瘤類型卻對(duì)抗癌治療具有極強(qiáng)的抵抗力?，F(xiàn)在癌癥領(lǐng)域的發(fā)展已經(jīng)通向了癌癥生物 學(xué)的新模式，在新模式中認(rèn)為不能執(zhí)行正常路徑的程序性細(xì)胞死亡導(dǎo)致了腫瘤形成。正常 細(xì)胞可以通過(guò)各種生長(zhǎng)因子從鄰近細(xì)胞接受連續(xù)的反饋，當(dāng)從該環(huán)境中移出時(shí)，正常細(xì)胞 會(huì)"自殺"。由于某種原因，癌細(xì)胞會(huì)忽視這些命令，繼續(xù)不適當(dāng)?shù)脑鲋场，F(xiàn)在相信許多癌 癥治療，包括放療和許多以前認(rèn)為通過(guò)使細(xì)胞受損起作用的化療，實(shí)際上是通過(guò)觸發(fā)凋亡 起作用。雖然這種抗性的決定因素現(xiàn)在仍在調(diào)查中，但正常細(xì)胞類型和癌細(xì)胞類型都顯示 出對(duì)凋亡觸發(fā)信號(hào)廣泛的敏感性。許多正常細(xì)胞對(duì)半數(shù)致死劑(sub-lethal)量的放射線 或細(xì)胞毒性化學(xué)制劑的反應(yīng)是出現(xiàn)暫時(shí)的生長(zhǎng)延滯，而附近的癌細(xì)胞此時(shí)則會(huì)發(fā)生凋亡。 在給定劑量出現(xiàn)的差異效果為成功的抗癌治療提供了決定性的治療窗。因此，腫瘤細(xì)胞對(duì) 凋亡的抗性以癌癥治療失敗的主要原因出現(xiàn)并不令人驚訝。已經(jīng)鑒定了幾種有效的能抑制凋亡的內(nèi)源性蛋白質(zhì)，包括哺乳動(dòng)物中的Bcl-2和 IAP蛋白家族。IAP家族的某些成員可直接抑制終末效應(yīng)器——胱冬酶(caspases)，即參與 執(zhí)行細(xì)胞死亡的casp-3和casp-7，以及關(guān)鍵的線粒體起始胱冬酶——casp-9, casp-9對(duì)介 導(dǎo)癌癥化療誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡很重要。IAPs是唯一已知的內(nèi)源胱冬酶抑制劑，因此在調(diào)節(jié)凋 亡中起重要作用。已經(jīng)假設(shè)IAPs促進(jìn)了一些癌癥的發(fā)展，而且在MALT淋巴瘤中已經(jīng)鑒定出涉及一 個(gè)特別IAP(cIAP2/HIAPl)的假設(shè)的表示原因的染色體易位。近來(lái)在患有急性髓性白血病 的患者中已經(jīng)顯示升高的XIAP，預(yù)后差和存活時(shí)間短之間存在相關(guān)性。而且，XIAP在NCI 小組的許多腫瘤細(xì)胞系中都呈高度過(guò)量表達(dá)。因此，需要改進(jìn)的癌癥治療方法，特別是那些能夠誘導(dǎo)癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，并不考慮這種細(xì)胞中提供的抗凋亡信號(hào)的治療方法。發(fā)明概述通常，本發(fā)明描述了有用的誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)凋亡的方法。本發(fā)明的方法在治療癌癥及其它增生性疾病方面有用。本發(fā)明描述了一種通過(guò)施用反義IAP核堿基(nucleobase)寡聚物和化療劑治療 患有增生性疾病，例如癌癥的患者的方法。可同時(shí)或在彼此相距28天內(nèi)施用(例如，在21 天內(nèi)，14天內(nèi)，7天內(nèi)，1天內(nèi)或1小時(shí)內(nèi))化療劑和反義IAP核堿基寡聚物，施用的總量足 以治療患者。反義IAP核堿基寡聚物會(huì)減少產(chǎn)生的IAP蛋白的量，使通常表達(dá)IAP的細(xì)胞 發(fā)生凋亡。通過(guò)提供特定地與一種或多種編碼IAP的多核苷酸雜交的核堿基寡聚物就可以 實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)。核堿基寡聚物與IAP多核苷酸(例如RNA，DNA)的特異性雜交會(huì)干擾IAP多 核苷酸的正常功能，因此會(huì)降低產(chǎn)生的IAP蛋白的量。通過(guò)特定地與靶目標(biāo)雜交調(diào)整靶核 酸功能的核酸分子一般被稱為"反義治療分子"?？梢允褂萌魏文芙档虸AP表達(dá)水平的反義IAP核堿基寡聚物，一方面，核堿基寡聚 物長(zhǎng)度為八到三十個(gè)堿基，并包括選自SEQ ID NOs :1-99，143，147，151，163-260，287，289 和300-460的序列的至少八個(gè)連續(xù)堿基。在某些實(shí)施例中，核堿基寡聚物包括選自SEQ ID NOs :1-99，143，147，151， 163-260，287，289和300-460的序列核堿基寡聚物。希望是由上述的一個(gè)或多個(gè)SEQ ID NOs.組成(或基本由其組成)。例如，核堿基寡聚物可以包括選自SEQ ID NOs 97,98,99, 143，147，151，287 和 289，SEQ IDNOs 300-389，或 SEQ ID NOs 390-460 的序列。在一個(gè)特 別合乎需要的實(shí)施例中，本發(fā)明描述了具有十一個(gè)DNA殘基的核堿基寡聚物，其中在DNA 殘基兩側(cè)都側(cè)接了四個(gè)2' -0-甲基RNA殘基，核堿基寡聚物由下列序列中的一個(gè)組成 5' -AUUGGTTCCAATGTGUUCU-3‘ (SEQ ID NO 155) ；5' -ACACGACCGCTAAGAAACA-3‘ (SEQ ID NO 16) ； 5 ‘ -ACAGGACTACCACTTGGAA-3 ‘ (SEQ ID NO 157)； 5 ‘ -UGCCAGTGTTGATGCUGAA-3 ‘ (SEQ ID NO 27) ；5 ‘ -GCUGAGTCTCCATATUGCC-3 ‘ (SEQ ID NO 141) ；5 ‘ -UCGGGTATATGGTGTCUGA-3 ‘ (SEQ ID NO 41) ；5 ‘ -AAGC ACTGCACTTG⑶CAC-3‘ (SEQ ID NO 47) ；5' -CCGGCCCAAAACAAAGAAG-3‘ (SEQ ID NO 51)； 5' -ACCCTGGATACCATTUAGC-3‘ (SEQ ID NO 63) ；5' -U⑶CAGTACATGTTGGCUC-3‘ (SEQ ID NO: 161)禾口 5' -UGCACCCTGGATACCAUUU-3‘ (SEQ ID NO 151)。在另一個(gè)實(shí)施例中，反義IAP核堿基寡聚物的長(zhǎng)度可達(dá)30堿基，并包括選自SEQ ID NOs 461-490的序列的至少八個(gè)連續(xù)堿基。能夠與化療劑結(jié)合施用的其它反義IAP核堿基寡聚物是那些在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下能 與編碼IAP多肽的多核苷酸雜交的寡聚物，其中IAP多肽選自NAIP(Bircl)，HIAPl (cIAP2， API2, MIHC, hITA), HIAP2(cIAPl, MIHB)， XIAP(hILP, hILPl, MIHA, API3)，存活蛋白 (survivin) (TIAP, MIHD, API4)，livin (KIAP, ML-IAP, cIAP3, HIAP3)禾口 hILP2 (Ts—IAP， TIAP)。在本發(fā)明的方法中使用的核堿基寡聚物可以包括至少一個(gè)修飾鍵(例如硫代磷 酸酯，磷酸甲酯，磷酸三酯，二硫代磷酸酯或phosphoselenate連接)，修飾的堿基(例如 5-甲基胞嘧啶)，和/或修飾的糖部分(例如2'-氧-甲氧乙基或2'-氧-甲基)。在 一個(gè)實(shí)施方案中，寡聚物是嵌和寡聚物(例如，包含通過(guò)硫磷酰或磷酸二酯鍵連接在一起的DNA殘基的寡核苷酸，其中DNA殘基的兩側(cè)都側(cè)接了至少一個(gè)，兩個(gè)，三個(gè)或四個(gè)通過(guò)硫磷酰連接在一起的2'-氧-甲基RNA殘基)。另一個(gè)方面，本發(fā)明描述了增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)凋亡的方法。這些方法包括同時(shí)或在彼此 相距28天內(nèi)給細(xì)胞施用反義IAP核堿基寡聚物和化療劑的步驟，施用的總量足以增強(qiáng)凋 亡。細(xì)胞可以在體外(ex vivo)或在活體內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞是癌細(xì)胞(例如人 癌細(xì)胞)，淋巴或骨髓來(lái)源的細(xì)胞。癌癥可以是，例如急性白血病、急性淋巴細(xì)胞性白血病、急性髓細(xì)胞性白血病、急 性成髓細(xì)胞性白血病、急性早幼粒細(xì)胞性白血病、急性髓單核細(xì)胞性白血病、急性單核細(xì)胞 性白血病、急性紅白血病、慢性白血病、慢性髓細(xì)胞性白血病、骨髓發(fā)育不良綜合征、慢性淋 巴細(xì)胞性白血病、真性紅細(xì)胞增多癥、淋巴瘤、何杰金(Hodgkin's)病、Waldenstrom氏巨球 蛋白血癥、纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、軟骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、 淋巴管肉瘤、淋巴管內(nèi)皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、Ewing氏瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結(jié)腸 癌、胰癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳 頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細(xì)胞癌、肝癌、膽管癌、絨毛膜癌、精原細(xì) 胞瘤、胚胎癌、Wilm氏瘤、宮頸癌、子宮癌、睪丸癌、肺癌、小細(xì)胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神經(jīng) 膠質(zhì)瘤、星形細(xì)胞瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、成血管細(xì)胞瘤、聽神 經(jīng)瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤、神經(jīng)鞘瘤、腦(脊)膜瘤、黑色素瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤或成視網(wǎng)膜 細(xì)胞瘤。治療癌癥時(shí)，同時(shí)也施用一種或多種另外的化療劑，生物效應(yīng)調(diào)節(jié)劑和/或化學(xué)致 敏劑是可取的。希望的情形是施用核堿基寡聚物的28天內(nèi)施用一種或多種這些制劑。
可以通過(guò)相同或不同的途徑來(lái)施用化療劑和核堿基寡聚物?？梢允褂萌魏文苁鼓?的位點(diǎn)藥物達(dá)到有效量的給藥途徑，特別可取的途徑是靜脈內(nèi)施用和瘤內(nèi)施用。另一方面，本發(fā)明描述了包括化療劑和反義IAP核堿基寡聚物的藥物組合物，其 中化療劑和反義IAP核堿基寡聚物的總量加在一起足以治療患有增生性疾病(例如癌癥) 的患者。如果需要，藥物組合物可以更進(jìn)一步地包括另外的組分(例如膠態(tài)分散系統(tǒng))。本發(fā)明也描述了通過(guò)給患者施用化療劑和催化RNA分子，或編碼這種催化RNA分 子的表達(dá)載體來(lái)治療患有增生性疾病，例如患有癌癥，淋巴組織增生紊亂的患者的方法，其 中化療劑和催化RNA分子可同時(shí)施用，或在彼此相距28天內(nèi)施用，它們的總量加在一起足 以治療患者。在可取的實(shí)施例中，催化RNA分子包括，在其結(jié)合臂中，至少八個(gè)連續(xù)的相當(dāng) 于反義IAP核堿基寡聚物的堿基(例如表2，3，7，8和9中的任何一個(gè)的堿基序列)。希望 的RNA分子可以位于錘頭狀基序中，也可以位于發(fā)夾結(jié)構(gòu)，δ肝炎病毒，組I內(nèi)含子，VS RNA 或RNaseP RNA基序中。本發(fā)明也描述了通過(guò)給患者施用化療劑和具有21-29個(gè)核堿基的雙鏈RNA分子 來(lái)治療患有癌癥或淋巴組織增生紊亂的患者的方法，其中至少八個(gè)連續(xù)的核堿基相當(dāng)于反 義IAP核堿基寡聚物(例如表2，3，7，8和9中的任何一個(gè)的堿基序列)?？赏瑫r(shí)或在彼此 相距28天內(nèi)施用化療劑和雙鏈RNA分子，使用的總量加在一起足以治療患者。另一方面，本發(fā)明也描述了通過(guò)給患者施用化療劑和具有50-70個(gè)堿基的雙鏈 RNA分子來(lái)治療患有癌癥或淋巴組織增生紊亂的患者的方法，其中RNA分子具有一個(gè)長(zhǎng)度 為21-29個(gè)堿基的第一域，堿基包含相當(dāng)于反義IAP核堿基寡聚物(例如表2，3，7，8和9 中的任何一個(gè)的堿基序列)的至少八個(gè)連續(xù)的核堿基；與第一域互補(bǔ)的第二域以及位于第一域和第二域之間，使第一域和第二域能形成雙鏈RNA分子的環(huán)狀域?？赏瑫r(shí)或在彼此相距28天內(nèi)施用化療劑和雙鏈RNA分子，施用的總量加在一起足以治療患者。本發(fā)明也描述了幾種試劑盒。這種試劑盒包括(i)長(zhǎng)度為八到三十個(gè)核堿基之間 的反義IAP核堿基寡聚物；(ii)化療劑；和(iii)給患有增生性疾病的患者施用化療劑和 反義IAP核堿基寡聚物的說(shuō)明書，其中化療劑和反義IAP核堿基寡聚物的總量加在一起足 以治療增生性疾病。本發(fā)明的另一個(gè)試劑盒包括(i)長(zhǎng)度為八到三十個(gè)堿基之間的反義IAP核堿基寡 聚物；(ii)給患有增生性疾病的患者施用化療劑和反義IAP核堿基寡聚物的說(shuō)明書，其中 化療劑和反義IAP核堿基寡聚物的的總量加在一起足以治療增生性疾病。然而本發(fā)明的另一個(gè)試劑盒包括(i)本發(fā)明的組合物(如上所述)；(ii)給患有 增生性疾病的患者施用組合物的說(shuō)明書，其中組合物的量足以治療增生性疾病?！昂藟A基寡聚物"指包括至少八個(gè)通過(guò)連接基團(tuán)連接在一起的核堿基形成的鏈 的化合物。天然和非天然的寡核苷酸，修飾或未修飾的，以及寡核苷酸模擬物，例如肽核酸 (PNA)，鎖核酸(locked nucleic acids) (LNA)和阿拉伯核酸(arabinonucleic acid) (ANA) 都包括在該定義的范圍內(nèi)。在本發(fā)明的核堿基寡聚物中可以使用多種核堿基和連接基團(tuán)， 包括下文標(biāo)題為"寡核苷酸及其它核堿基寡聚物"的部分中詳細(xì)描述那些核堿基和連接 基團(tuán)。“蛋白質(zhì)"或"多肽"或"多肽片段"指不論是否發(fā)生了翻譯后修飾(例如糖 基化作用或磷酸化作用)的任何超過(guò)兩個(gè)氨基酸的鏈，它構(gòu)成天然多肽或肽的全部或一部 分，或者構(gòu)成非天然多肽或肽。凋亡指細(xì)胞死亡的過(guò)程，在該過(guò)程中，瀕死細(xì)胞顯示出一組容易表征的生物化學(xué) 標(biāo)志，包括細(xì)胞膜起泡，細(xì)胞體皺縮，染色質(zhì)凝縮和DNA梯狀條帶(laddering)。‘‘ IAP基因〃指具有至少一個(gè)BIR域，通過(guò)其它胞內(nèi)或胞外遞送方法供給 時(shí)能調(diào)整(抑制或增強(qiáng))細(xì)胞或組織凋亡的多肽的編碼基因(例如，參見美國(guó)專利 No. 5，919，912)。在優(yōu)選實(shí)施例中，IAP基因是與人或鼠XIAP，HIAPl或HIAP2 (美國(guó)專利 No. 6，156，535中對(duì)每一個(gè)都進(jìn)行了描述)中的至少一個(gè)具有大約50%或更高核苷酸序列 同一性(例如至少85%，90%或95%)的基因。優(yōu)選的測(cè)定同一性的序列區(qū)域是編碼至少 一個(gè)BIR域和鋅指域的區(qū)域。哺乳動(dòng)物IAP基因包括分離自任何來(lái)源的哺乳動(dòng)物的核苷酸 序列。優(yōu)選的哺乳動(dòng)物是人。“ IAP蛋白〃或〃 IAP多肽〃指IAP基因編碼的多肽或其片段。IAP多肽包括 NAIP(Bircl)，HIAPl (cIAP2, API2, MIHC, hITA)，HIAP2(cIAPl, MIHB)，XIAP(hILP, hILPl, MIHA, API3)，存活蛋白(survivin) (TIAP, MIHD, AP14)，livin(KIAP, ML-IAP, cIAP3HIAP3) 和 hILP2(Ts-IAP，TIAP)?！?IAP生物活性〃指IAP多肽在體內(nèi)或體外產(chǎn)生的任何活性?！霸鰪?qiáng)凋亡"指增加給定的細(xì)胞群體(例如癌細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、成纖維細(xì)胞，或任 何其它細(xì)胞)中發(fā)生凋亡的細(xì)胞的數(shù)量。應(yīng)理解在一個(gè)給定的測(cè)定方法中，增強(qiáng)凋亡的化 合物產(chǎn)生的凋亡增強(qiáng)程度會(huì)發(fā)生變化，但本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的凋亡水 平變化，而該變化能鑒定出IAP限制的能增強(qiáng)凋亡的其它核堿基寡聚物。優(yōu)選地，"增強(qiáng) 凋亡"指相對(duì)于未施用本發(fā)明的核堿基寡聚物，但其它處理的方式實(shí)質(zhì)上相似的情形，發(fā)生凋亡的細(xì)胞數(shù)目增加10%，更優(yōu)選增加25%或更多，最優(yōu)選增加至少一倍。監(jiān)測(cè)的樣品優(yōu)選是那些通常凋亡不充分的細(xì)胞樣品(即癌細(xì)胞)。這里描述了檢測(cè)凋亡水平變化(即 增強(qiáng)或減弱)的方法。抑制靶基因(例如，IAP)表達(dá)的核堿基寡聚物指相對(duì)于未處理的對(duì)照組，能減少 至少大約5%的靶mRNA的量或靶mRNA編碼的蛋白質(zhì)的量的寡聚物，更優(yōu)選減少至少大約 10%，25%，甚至50%。測(cè)量mRNA和蛋白水平的方法為本領(lǐng)域所熟知；在這里描述了示例 性方法?！s交〃指互補(bǔ)堿基之間的氫鍵連結(jié)，可以是Watson-Crick，Hoogsteen或反向 Hoogsteen氫鍵連結(jié)。例如腺嘌呤和胸腺嘧啶是通過(guò)氫鍵形成配對(duì)的互補(bǔ)堿基?！霸錾约膊?指由于不適當(dāng)?shù)母咚郊?xì)胞分裂，不適當(dāng)?shù)牡退降蛲龌騼烧咭?起或?qū)е碌募膊　０┌Y是增生性疾病的一個(gè)實(shí)例，癌癥的實(shí)例包括但不限于白血病(例 如急性白血病、急性淋巴細(xì)胞性白血病、急性髓細(xì)胞性白血病、急性成髓細(xì)胞性白血病、急 性早幼粒細(xì)胞性白血病(acute promyelocytic leukemia)、急性髓單核細(xì)胞性白血病、急 性單核細(xì)胞性白血病、急性紅白血病、慢性白血病、慢性髓細(xì)胞性白血病、慢性淋巴細(xì)胞性 白血病)、真性紅細(xì)胞增多癥、淋巴瘤(何杰金氏病，非何杰金氏病)、Waldenstrom氏巨球 蛋白血癥、重鏈疾病以及實(shí)體瘤，例如肉瘤和癌(如纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、軟骨肉 瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內(nèi)皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、 Ewing氏瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結(jié)腸癌、胰癌(pancreatic cancer)、乳腺癌(breast cancer)、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、 乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細(xì)胞癌、肝癌、膽管癌、絨毛膜癌、精原細(xì)胞瘤、胚 胎癌、Wilm氏瘤、宮頸癌、子宮癌、睪丸癌、肺癌、小細(xì)胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、 星形細(xì)胞瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、成血管細(xì)胞瘤、聽神經(jīng)瘤、少 突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤、神經(jīng)鞘瘤、腦(脊)膜瘤、黑色素瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤或成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤)。 淋巴組織增生紊亂也被認(rèn)為是增生性疾病。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法中使用的核堿基寡聚物存在于一般不經(jīng)受足夠凋亡的細(xì)胞 中時(shí)能夠增強(qiáng)凋亡和/或降低IAP mRNA或蛋白水平。相對(duì)于對(duì)照，增加量?jī)?yōu)選為至少10%， 更優(yōu)選為25%，最優(yōu)選為1倍或1倍以上。本發(fā)明的方法中使用的合乎需要的核堿基寡聚 物包括大約8-30個(gè)堿基。在某些實(shí)施方案中，至少八個(gè)連續(xù)的堿基來(lái)源于選自SEQ ID NOs 1-99，143，147，151，163-260，287，289，300-490的序列。本發(fā)明的核堿基寡聚物也可 以包含，例如，與編碼IAP多肽的多核苷酸互補(bǔ)的另外的20，40，60，85，120或更多個(gè)連續(xù)的 堿基。核堿基寡聚物(或其一部分)可以包含修飾的骨架。硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，及 其它修飾的骨架本領(lǐng)域已經(jīng)公知。核堿基寡聚物也可以包含一個(gè)或多個(gè)非天然連接。“患者"指任何動(dòng)物(例如人)。可以利用本發(fā)明的方法，組合物和試劑盒進(jìn) 行治療的非人患者包括馬、狗、貓、豬、山羊、兔子、倉(cāng)鼠、猴子、豚鼠(guinea pigs)、大鼠、小 鼠、蜥蜴(lizard)、蛇、羊、牛、魚和鳥。“化療劑"指用來(lái)殺死癌細(xì)胞或減慢癌細(xì)胞生長(zhǎng)的試劑。因此，細(xì)胞毒性劑和細(xì) 胞生長(zhǎng)抑制劑都被認(rèn)為是化療劑。示例性化療劑有紫杉烷類(taxanes)(例如，紫杉醇、 多西它賽(doxetaxel)、RPR109881A, SB-T-1213, SB-T-1250, SB-T-101187, BMS-275183, BRT 216、DJ-927、MAC-321、IDN5109 和 IDN5390)、長(zhǎng)春花生物堿(vinca alkaloids)(例如，長(zhǎng)春花新堿(vincristine)、長(zhǎng)春花堿(vinblastine)、脫乙酰長(zhǎng)春花堿(vindesine)、長(zhǎng)春氟寧(vinflunine)、長(zhǎng)春瑞濱(vinorelbine)和脫水長(zhǎng)春堿(anhydrovinblastine)) 、 多拉司它汀(dolastatins)(多拉司它汀-10、多拉司它汀-15、ILX651、T2T-1027、 symplostatin 1、symplostatin3 和 LU103793)、隱藻素(cryptophycins)(例如，隱藻素 1 和隱藻素52)、埃博霉素(印othilones)(例如，埃博霉素A、埃博霉素B、脫氧埃博霉素B和 ±矣博霉素 B 內(nèi)酉先胺)、艾槽素(eleutherobin)、discodermolide、2_印i-discodermolide、 2-des-methyldiscodermolide>5-hydroxymethyldiscodermolide、19-des-aminocarbonyl discodermolide、9 (13) -cyclodiscodermolide 和 Iaulimalide0 其它的化療劑列見下表 1?！吧镄?yīng)調(diào)節(jié)劑"指能促進(jìn)或恢復(fù)免疫系統(tǒng)抵抗病原體能力的試劑。一些，但 不是全部的生物效應(yīng)調(diào)節(jié)劑可以減慢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，因此也被認(rèn)為是化療劑。生物效應(yīng)調(diào) 節(jié)劑的實(shí)例有干擾素(α，β，Y)、白細(xì)胞介素_2、利妥昔單抗(rituximab)和曲妥單抗 (trastuzumab)。
“化學(xué)致敏劑"指使腫瘤細(xì)胞對(duì)化療效應(yīng)更敏感的試劑?！傲馨徒M織增生紊亂〃指淋巴系統(tǒng)的細(xì)胞(例如，T細(xì)胞和B細(xì)胞)出現(xiàn)異常增 殖的紊亂?！昂嗣?指具有酶活性，對(duì)靶RNA分子具有位點(diǎn)特異性和切割能力的RNA。核酶 可用于降低多肽的表達(dá)。例如 Turner et al (Adv. Exp. Med. Biol. 465 :303_318，2000)和 Norris et al (Adv. Exp. Med. Biol. 465 :293_301，2000)描述了利用核酶降低多肽表達(dá)的方法?！皥?bào)告基因"指編碼表達(dá)可以被測(cè)定的多肽的基因；這種多肽包括但不限于葡糖 醛酸酶(GUS)、熒光素酶、氯霉素轉(zhuǎn)乙酰酶(CAT)和β-半乳糖苷酶?！皢?dòng)子"指足以指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的多核苷酸?！安僮餍赃B接"指當(dāng)適當(dāng)?shù)姆肿?例如，轉(zhuǎn)錄活化蛋白質(zhì))連接到第二多核苷酸 上時(shí)，第一多核苷酸靠近指導(dǎo)第一多核苷酸轉(zhuǎn)錄的第二多核苷酸。從下文中描述的優(yōu)選實(shí)施例和權(quán)利要求書可以明顯看出本發(fā)明的其它特征和優(yōu)
點(diǎn)ο本發(fā)明還涉及1. 一種治療患有增生性疾病的患者的方法，所述方法包括給所述患者施用(i)長(zhǎng)度為八到三十個(gè)核堿基之間的反義IAP核堿基寡聚物；和(ii)化療劑，兩者總量加在一起足以治療患者。2.項(xiàng)1所述的方法，其中在彼此相距28天內(nèi)施用所述的反義IAP核堿基寡聚物和 所述的化療劑。3.項(xiàng)2所述的方法，其中在彼此相距24小時(shí)內(nèi)施用所述的反義IAP核堿基寡聚物 和所述的化療劑。4.項(xiàng)3所述的方法，其中在彼此相距1小時(shí)內(nèi)施用所述的反義IAP核堿基寡聚物 和所述的化療劑。5.項(xiàng)4所述的方法，其中同時(shí)施用所述的反義IAP核堿基寡聚物和所述的化療劑。6.項(xiàng)1-5任一項(xiàng)所述的方法，其中所述的核堿基寡聚物包含從SEQ IDNOs :1_99，143，147，151，163-260，287，289和300-460組成的群組中選擇出來(lái)的序列的至少八個(gè)連續(xù)
核堿基。7.項(xiàng)6所述的方法，其中所述的核堿基寡聚物包含從SEQ ID NOs =97,98,99,143，147，151，287，289和300-460組成的群組中選擇出來(lái)的序列的至少八個(gè)連續(xù)核堿基。8.項(xiàng)7所述的方法，其中所述的核堿基寡聚物基本上由從SEQ ID NOs =97,98,99, 143，147，151，287，289和300-460組成的群組中選擇出來(lái)的序列組成。9.項(xiàng)8所述的方法，其中所述的核堿基寡聚物由從SEQ ID NOs :97，98，99，143， 147，151，287，289和300-460組成的群組中選擇出來(lái)的序列組成。10.項(xiàng)1-9任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述核堿基寡聚物是寡核苷酸。11.項(xiàng)10所述的方法，其中所述的寡核苷酸包含至少一個(gè)修飾鍵。12.項(xiàng)11所述的方法，其中所述的修飾鍵選自由硫代磷酸酯，磷酸甲酯，磷酸三 酯，二硫代磷酸酯和phosphoselenate鍵組成的組。13.項(xiàng)1-9任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述核堿基寡聚物包含至少一個(gè)修飾的糖 部分。14.項(xiàng)13所述的方法，其中修飾的糖部分是2'-氧-甲基或2'-氧-甲氧乙基。15.項(xiàng)1-9任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述核堿基寡聚物包含至少一個(gè)修飾的堿基。16.項(xiàng)15所述的方法，其中所述的修飾的核堿基是5-甲基胞嘧啶。17.項(xiàng)1-9任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述核堿基寡聚物是嵌合的核堿基寡聚物。18.項(xiàng)17所述的方法，其中所述的核堿基寡聚物包含通過(guò)硫代磷酸酯鍵連接在一 起的DNA殘基，其中所述的DNA殘基的每側(cè)側(cè)接了至少一個(gè)2'-氧-甲基或2'-氧-甲
氧乙基RNA殘基。19.項(xiàng)18所述的方法，其中所述的DNA殘基的兩側(cè)都側(cè)接了至少三個(gè)2'-氧-甲 基或2'-氧-甲氧乙基RNA殘基。20.項(xiàng)19所述的方法，其中所述的DNA殘基的兩側(cè)都側(cè)接了四個(gè)2'-氧-甲基 或2'-氧-甲氧乙基RNA殘基。21.項(xiàng)18所述的方法，其中所述的RNA殘基通過(guò)硫代磷酸酯鍵連接在一起，而且所 述的RNA殘基通過(guò)硫代磷酸酯鍵連接到所述DNA殘基上。22.項(xiàng)18所述的方法，其中所述的核堿基寡聚物包含通過(guò)磷酸二酯鍵連接在一起 的DNA殘基，其中所述的DNA殘基的兩側(cè)分別側(cè)接了至少兩個(gè)通過(guò)硫代磷酸酯鍵連接在一 起的2'-氧-甲基或2'-氧-甲氧乙基RNA殘基。23.項(xiàng)22所述的方法，其中所述的DNA殘基的兩側(cè)都側(cè)接了至少三個(gè)2'-氧-甲 基或2'-氧-甲氧乙基RNA殘基。24.項(xiàng)1-5任一項(xiàng)所述的方法，其中所述的核堿基寡聚物包含i^一個(gè)DNA殘基，DNA 殘基兩側(cè)都側(cè)接了四個(gè)2'-氧-甲基RNA殘基，所述核堿基寡聚物由下列序列中的一個(gè)組 成5' -AUUGGTTCCAATGTGUUCU-3‘ (SEQ ID NO 155)；5' -ACACGACCGCTAAGAAACA-3‘ (SEQ ID NO 16)；
5' -ACAGGACTACCACTTGGAA-3' (SEQ ID NO : 157)；5' -UGCCAGTGTTGATGCUGAA-3' (SEQ ID NO 27)；5' -GCUGAGTCTCCATATUGCC-3' (SEQ ID NO : 141)；5' -UCGGGTATATGGTGTCUGA-3' (SEQ ID NO 41)；5' -AAGCACTGCACTTG⑶CAC-3' (SEQ ID NO 47)；5' -CCGGCCCAAAACAAAGAAG-3' (SEQ ID NO 51)；5' -ACCCTGGATACCATTUAGC-3' (SEQ ID NO 63)；5' -U⑶CAGTACATGTTGGCUC-3' (SEQ ID NO : 161)；和5' -UGCACCCTGGATACCAUUU-3' (SEQ ID NO : 151)，所述殘基通過(guò)硫代磷酸酯鍵連
接在一起。25.項(xiàng)1-24任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述化療劑破壞微管。26.項(xiàng)1-24任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述化療劑穩(wěn)定微管。27.項(xiàng)1-24任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述化療劑是紫杉烷。28.項(xiàng)27所述的方法，其中所述的紫杉烷是紫杉醇、多西它賽(doxetaxel)、 RPR109881A、SB-T-1213、SB-T-1250、SB-T-101187、BMS-275183、BRT216、DJ-927、MAC-321、 IDN5109 或 IDN5390。29.項(xiàng)1-24任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述化療劑是長(zhǎng)春花生物堿。30.項(xiàng)29所述的方法，其中所述的長(zhǎng)春花生物堿是長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春花堿、脫乙酰長(zhǎng) 春花堿、長(zhǎng)春氟寧、長(zhǎng)春瑞濱和脫水長(zhǎng)春花堿。31.項(xiàng)1-24任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述化療劑是多拉司它汀(dolastatin)。32.項(xiàng)31所述的方法，其中所述的多拉司它汀是多拉司它汀-10、多拉司它汀-15、 ILX651、TZT-1027、symplostatin 1、symplostatin 3 或西馬多丁(cemadotin)。33.項(xiàng)1-24任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述化療劑是隱藻素(cryptophycin)。34.項(xiàng)33所述的方法，其中所述隱藻素是隱藻素1或隱藻素52。35.項(xiàng)1-25任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述化療劑是埃博霉素(印othilone)。36.項(xiàng)35所述的方法，其中所述埃博霉素是埃博霉素A、埃博霉素B、脫氧埃博霉素 B或埃博霉素B內(nèi)酰胺。37.項(xiàng)1-24任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述化療劑是艾榴素(eleutherobin)、 discodermolide、2-epi-discodermolide、2-des-methyldiscodermolide、 5-hydroxymethyldiscodermolide>19-des-aminocarbonyldiscodermolide> 9 (13)-cyclodiscodermolide 或 Iaulimalide038.項(xiàng)1-24任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述化療劑是一種選自表1的藥物。39.項(xiàng)1-38任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述增生性疾病是癌癥。40.項(xiàng)39所述的方法，其中所述癌癥是急性白血病、急性淋巴細(xì)胞性白血病、 急性髓細(xì)胞性白血病、急性成髓細(xì)胞性白血病、急性早幼粒細(xì)胞性白血病、急性髓單核細(xì) 胞性白血病、急性單核細(xì)胞性白血病、急性紅白血病、慢性白血病、慢性髓細(xì)胞性白血病、 骨髓發(fā)育不良綜合征、慢性淋巴細(xì)胞性白血病、真性紅細(xì)胞增多癥、淋巴瘤、何杰金氏病、 Waldenstrom氏巨球蛋白血癥、纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、軟骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、 血管肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內(nèi)皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、Ewing氏瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結(jié)腸癌、胰癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細(xì)胞癌、肝癌、膽管 癌、絨毛膜癌、精原細(xì)胞瘤、胚胎癌、Wilm氏瘤、宮頸癌、子宮癌、睪丸癌、肺癌、小細(xì)胞肺癌、 膀胱癌、上皮癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、星形細(xì)胞瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體 瘤、成血管細(xì)胞瘤、聽神經(jīng)瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤、神經(jīng)鞘瘤、腦(脊)膜瘤、黑色素瘤、成 神經(jīng)細(xì)胞瘤或成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤。41.項(xiàng)1-40任何一項(xiàng)所述的方法，更進(jìn)一步地包含給所述患者施用化學(xué)致敏劑。42.項(xiàng)1-41任何一項(xiàng)所述的方法，更進(jìn)一步地包含給所述患者施用生物效應(yīng)調(diào)節(jié) 劑。43.權(quán)利1-42任何一項(xiàng)所述的方法，更進(jìn)一步地包含給所述患者施用第二化療 劑。44. 一種組合物，包含(i)長(zhǎng)度為八到三十個(gè)堿基之間的反義IAP核堿基寡聚物；和(ii)化療劑，兩者總量加在一起足以治療患有增生性疾病的患者。45.項(xiàng)44所述的組合物，其中所述的核堿基寡聚物包含從SEQ ID NOs =1-99,143, 147，151，163-260，287，289，和300-460組成的群組中選擇出來(lái)的序列的至少八個(gè)連續(xù)堿基。46.項(xiàng)45所述的組合物，其中所述的核堿基寡聚物包含從SEQ ID NOs =97,98,99, 143，147，151，287，289和300-460組成的群組中選擇出來(lái)的序列的至少八個(gè)連續(xù)堿基。47.項(xiàng)46所述的組合物，其中所述的核堿基寡聚物基本上由從SEQ IDNOs =97,98, 99，143，147，151，287，289和300-460組成的群組中選擇出來(lái)的序列組成。48.項(xiàng)47所述的組合物，其中所述的核堿基寡聚物由從SEQ ID NOs =97,98,99, 143，147，151，287，289和300-460組成的群組中選擇出來(lái)的序列組成。49.項(xiàng)44-48任何一項(xiàng)所述的組合物，其中所述核堿基寡聚物是寡核苷酸。50.項(xiàng)49所述的組合物，其中所述的寡核苷酸包含至少一個(gè)修飾鍵。51.項(xiàng)50所述的組合物，其中所述的修飾鍵選自硫代磷酸酯，膦酸甲酯，磷酸三 酯，二硫代磷酸酯和phosphoselenate鍵組成的組。52.項(xiàng)44-48任何一項(xiàng)所述的組合物，其中所述核堿基寡聚物包含至少一個(gè)修飾 的糖部分。53.項(xiàng)52所述的組合物，其中修飾的糖部分是2'-氧-甲基或2'-氧-甲氧乙基。54.項(xiàng)44-48任何一項(xiàng)所述的組合物，其中所述核堿基寡聚物包含至少一個(gè)修飾 的堿基。55.項(xiàng)54所述的組合物，其中所述的修飾的堿基是5_甲基胞嘧啶。56.項(xiàng)44-48任何一項(xiàng)所述的組合物，其中所述核堿基寡聚物是嵌合的核堿基寡 聚物。57.項(xiàng)56所述的組合物，其中所述的核堿基寡聚物包含通過(guò)1硫代磷酸酯鍵 連接在一起的DNA殘基，所述的DNA殘基的兩側(cè)分別側(cè)接了至少一個(gè)2 ‘-氧-甲基或2'-氧-甲氧乙基RNA殘基。58.項(xiàng)57所述的組合物，其中所述的DNA殘基的兩側(cè)都側(cè)接了至少三個(gè) 2'-氧-甲基或2'-氧-甲氧乙基RNA殘基。59.項(xiàng)58所述的組合物，其中所述的DNA殘基的兩側(cè)都側(cè)接了四個(gè)2 ‘-氧-甲基或2'-氧-甲氧乙基RNA殘基。60.項(xiàng)57所述的組合物，其中所述的RNA殘基通過(guò)硫代磷酸酯鍵連接在一起，而且 所述的RNA殘基通過(guò)硫磷酰鍵連接到所述DNA殘基上。61.項(xiàng)57所述的組合物，其中所述的核堿基寡聚物包含通過(guò)磷酸二酯鍵連接在一 起的DNA殘基，其中所述的DNA殘基的兩側(cè)分別側(cè)接了至少兩個(gè)通過(guò)硫代磷酸酯鍵連接在 一起的2'-氧-甲基或2'-氧-甲氧乙基RNA殘基。62.項(xiàng)61所述的組合物，其中所述的DNA殘基的兩側(cè)都側(cè)接了至少三個(gè) 2'-氧-甲基或2'-氧-甲氧乙基RNA殘基。63.項(xiàng)44所述的組合物，其中所述的核堿基寡聚物包含i^一個(gè)DNA殘基，DNA殘基 兩側(cè)都側(cè)接了四個(gè)2'-氧-甲基RNA殘基，所述核堿基寡聚物由下列序列中的一個(gè)組成5' -AUUGGTTCCAATGTGUUCU-3‘ (SEQ ID NO 155)；5' -ACACGACCGCTAAGAAACA-3‘ (SEQ ID NO 16)；5' -ACAGGACTACCACTTGGAA-3‘ (SEQ ID NO 157)；5' -UGCCAGTGTTGATGCUGAA-3‘ (SEQ ID NO 27)；5' -GCUGAGTCTCCATATUGCC-3‘ (SEQ ID NO 141)；5' -UCGGGTATATGGTGTCUGA-3‘ (SEQ ID NO 41)；5' -AAGCACTGCACTTG⑶CAC-3‘ (SEQ ID NO 47)；5' -CCGGCCCAAAACAAAGAAG-3‘ (SEQ ID NO 51)；5' -ACCCTGGATACCATTUAGC-3‘ (SEQ ID NO 63)；5' -U⑶CAGTACATGTTGGCUC-3‘ (SEQ ID NO 161)；禾口5' -UGCACCCTGGATACCAUUU-3‘ (SEQ ID NO 151)，所述殘基通過(guò)硫代磷酸酯鍵連
接在一起。64.項(xiàng)44-63任何一項(xiàng)所述的組合物，其中所述化療劑破壞微管。65.項(xiàng)44-63任何一項(xiàng)所述的組合物，其中所述化療劑穩(wěn)定微管。66.項(xiàng)44-63任何一項(xiàng)所述的組合物，其中所述化療劑是紫杉烷。67.項(xiàng)66所述的組合物，其中所述的紫杉烷是紫杉醇、多西它賽(doxetaxel)、 RPR109881A、SB-T-1213、SB-T-1250、SB-T-101187、BMS-275183、BRT216、DJ-927、MAC-321、 IDN5109 或 IDN5390。68.項(xiàng)44-63任何一項(xiàng)所述的組合物，其中所述化療劑是長(zhǎng)春花生物堿。69.項(xiàng)68所述的組合物，其中所述的長(zhǎng)春花生物堿是長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春花堿、脫乙酰 長(zhǎng)春花堿、長(zhǎng)春氟寧、長(zhǎng)春瑞濱和脫水長(zhǎng)春花堿。70.項(xiàng)44-63任何一項(xiàng)所述的組合物，其中所述化療劑是多拉司它汀 (dolastatin)071.項(xiàng)70所述的組合物，其中所述的多拉司它汀是多拉司它汀-10、多拉司它 汀-15、ILX651、TZT-1027、symplostatin 1、symplostatin 3 或西馬多丁(cemadotin)。
72.項(xiàng)44-63任何一項(xiàng)所述的組合物，其中所述化療劑是隱藻素(cryptophycin)。73.項(xiàng)72所述的組合物，其中所述隱藻素是隱藻素1或隱藻素52。 74.項(xiàng)44-63任何一項(xiàng)所述的組合物，其中所述化療劑是埃博霉素(印othilone)。75.項(xiàng)74所述的組合物，其中所述埃博霉素是埃博霉素A、埃博霉素B、脫氧埃博霉 素B或埃博霉素B內(nèi)酰胺。76.項(xiàng)44-63任何一項(xiàng)所述的組合物，其中所述化療劑是艾榴素(eleutherobin)、 discodermolide、2-epi-discodermolide、2-des-methyldiscodermolide、 5-hydroxymethyldiscodermolide>19-des-aminocarbonyldiscodermolide> 9 (13)-cyclodiscodermolide 或 Iaulimalide077.項(xiàng)44-63任何一項(xiàng)所述的組合物，其中所述化療劑是一種選自表1的藥物。78. 一種增強(qiáng)細(xì)胞凋亡的方法，所述方法包括使所述細(xì)胞與項(xiàng)44-77任何一項(xiàng)所 述的組合物接觸。79.項(xiàng)78所述的方法，其中所述細(xì)胞在活體內(nèi)。80.項(xiàng)78所述的方法，其中所述細(xì)胞是在活體外。81.項(xiàng)78-80所述的方法，其中所述細(xì)胞是癌細(xì)胞。82.項(xiàng)81所述的方法，其中所述癌細(xì)胞是人癌細(xì)胞。83. —種試劑盒，包括(i)長(zhǎng)度為八到三十個(gè)堿基之間的反義IAP核堿基寡聚物；(ii)化療劑，和(iii)給患有增生性疾病的患者施用所述反義IAP核堿基寡聚物和所述化療劑的 說(shuō)明，施用劑量足以治療所述的增生性疾病。84. —種試劑盒，包括(i)長(zhǎng)度為八到三十個(gè)堿基之間的反義IAP核堿基寡聚物；和(ii)給患有增生性疾病的患者施用所述反義IAP核堿基寡聚物和所述化療劑的 說(shuō)明，施用劑量足以治療所述的增生性疾病。85. —種試劑盒，包括(i)項(xiàng)44-77任何一項(xiàng)所述的組合物；和(ii)給患有增生性疾病的患者施用所述組合物的說(shuō)明，施用劑量足以治療所述的 增生性疾病。附圖簡(jiǎn)述

圖1A-1L是顯示相對(duì)于總蛋白，反義XIAP寡核苷酸對(duì)XIAP蛋白表達(dá)的影響的圖 (圖1A、1C、1E、1G、1I和1K)。圖IB、ID、IF、1H、IJ和IL是顯示與模擬轉(zhuǎn)染結(jié)果相比較的， 用于將上述XIAP蛋白質(zhì)結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化的每一個(gè)寡核苷酸轉(zhuǎn)染的總蛋白濃度值的圖。圖2A-2C是顯示單獨(dú)或聯(lián)合使用的各種反義XIAP寡核苷酸對(duì)XIAPRNA (圖2A)和 蛋白質(zhì)(圖2B)的影響的圖。圖2C是顯示與模擬轉(zhuǎn)染結(jié)果相比較的，用于將圖2B中顯示 的XIAP蛋白質(zhì)結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化的每一個(gè)寡核苷酸轉(zhuǎn)染的總蛋白濃度值的圖。圖3和4圖是顯示31nM(圖3)或63nM(圖4)的4X4混合骨架(MBO)FG8或E12 寡核苷酸的影響的圖。在一天，或連續(xù)兩天或三天里用125nMMB0s和Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染H460肺癌細(xì)胞18小時(shí)。在標(biāo)明的時(shí)間處收集用于蛋白質(zhì)印跡分析的樣品。實(shí)施光密度掃描，參照GAPDH將XIAP蛋白水平標(biāo)準(zhǔn)化，并與設(shè)置為100%的模擬對(duì)照進(jìn)行比較。標(biāo)明的百分比表示相對(duì)于特異性混雜(scrambled)對(duì)照的XIAP蛋白質(zhì)下降的百分比。圖5A-5D是顯示反義XIAP寡核苷酸對(duì)細(xì)胞成活力的影響(圖5A，5C和5D)，以及 阿霉素(adriamycin)存在時(shí)的化學(xué)致敏作用的圖(圖5B)。圖6是顯示寡核苷酸在體外介導(dǎo)H460細(xì)胞中特異性XIAP mRNA下調(diào)的圖。圖中描 繪的是單獨(dú)用 Lipofectamine 2000 (LFA)處理，或用 Lipofectamine 2000 與 1. 20 Μ(μΜ) 的F3、G4、C5、AB6、DE4或D7 —起，或用各自的反極性(RP)或混雜的(SC)寡核苷酸對(duì)照處 理的H460細(xì)胞的XIAP mRNA水平。在轉(zhuǎn)染6小時(shí)后實(shí)施實(shí)時(shí)RT-PCR，定量檢測(cè)XIAPmRNA 的相對(duì)量。顯示的所有數(shù)據(jù)都是從典型實(shí)驗(yàn)中獲得的三重?cái)?shù)據(jù)的均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(SD)。在 相同實(shí)驗(yàn)條件保持的未處理細(xì)胞(對(duì)照)中的XIAPmRNA水平被定為數(shù)值1。圖7是顯示用各種的PS-XIAP寡核苷酸轉(zhuǎn)染后的H460細(xì)胞中的XIAPRNA水平的 圖。用IuM的PS寡核苷酸和Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染H460人肺癌細(xì)胞6小時(shí)。然后收 集細(xì)胞進(jìn)行Taqman分析。圖8是顯示用4X4MB0s轉(zhuǎn)染9小時(shí)后的H460細(xì)胞中的XIAP RNA水平的圖。利用 62. 5nM至IuM的4X4MB0s和Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染H460細(xì)胞9小時(shí)。然后收集細(xì)胞進(jìn) 行Taqman分析。圖9是顯示用4X4MB0s轉(zhuǎn)染24小時(shí)后的H460細(xì)胞中的XIAP蛋白質(zhì)knockdown 的圖。用IuM的IuM 4X4MB0s和Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染H460細(xì)胞24小時(shí)。然后收集 細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。實(shí)施光測(cè)密掃描，參照肌動(dòng)蛋白將XIAP蛋白水平標(biāo)準(zhǔn)化，并與 設(shè)置為100%的特異混雜(sm、rm)對(duì)照進(jìn)行比較。圖10A和10B是顯示反義寡核苷酸在體外介導(dǎo)H460細(xì)胞中的XIAP蛋白質(zhì)特異性 下調(diào)的簡(jiǎn)圖。其中描述了用Lipofectamine 2000單獨(dú)(LFA)處理的H460細(xì)胞，或者用LFA 和1. 2uM XIAP寡核苷酸F3，G4或C5，或它們各自的寡核苷酸對(duì)照(RP，SC)處理的H460細(xì) 胞中的XIAP蛋白水平。采用免疫印跡來(lái)分析XIAP蛋白水平(圖10A)，采用光密度法對(duì)蛋 白質(zhì)含量進(jìn)行定量(圖10B)。參照細(xì)胞的肌動(dòng)蛋白水平將XIAP水平標(biāo)準(zhǔn)化，并與未處理的 對(duì)照(CNT)水平進(jìn)行比較。圖1IA和1IB是顯示XIAP寡核苷酸介導(dǎo)的胱冬酶活化效應(yīng)的簡(jiǎn)圖。其中顯示了與 對(duì)照與相比，1. 2uM的XIAP寡核苷酸F3，G4或C5，或它們各自的RP和SC ODN對(duì)照對(duì)轉(zhuǎn)染 的H460細(xì)胞中的前胱冬酶-3，PARP(全長(zhǎng)(116kDa)和加工后的(85kDa))(圖10A)的表達(dá)， 以及Bcl-2和Bax蛋白水平(圖10B)的影響。通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分析(western blotting) 蛋白質(zhì)的表達(dá)。參照細(xì)胞的肌動(dòng)蛋白水平將Bcl-2和Bax蛋白水平標(biāo)準(zhǔn)化，并通過(guò)光密度 法進(jìn)行定量。用兩個(gè)或三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均數(shù)來(lái)顯示Bcl-2/Bax的比值，對(duì)照細(xì)胞(CNT) 中的比值設(shè)置為1。圖12A和12B是顯示XIAP寡核苷酸特異性誘導(dǎo)凋亡的簡(jiǎn)圖。測(cè)量用1. 2uM的XIAP G4AS寡核苷酸，G4SC寡核苷酸的處理的H460細(xì)胞或未處理的對(duì)照(CNT)中誘導(dǎo)的凋亡。 圖12A顯示了用碘化丙啶(propidiumiodide) (PI)染色和流細(xì)胞計(jì)數(shù)法測(cè)定的具有亞-GO/ Gl (凋亡的)DNA含量的細(xì)胞的百分比。圖12B顯示了 DAPI染色的寡核苷酸處理的H460細(xì) 胞的核形態(tài)學(xué)。箭頭表示具有核DNA凝縮或斷裂的特征性凋亡形態(tài)學(xué)的細(xì)胞。圖13A是顯示XIAP G4AS寡核苷酸處理對(duì)H460細(xì)胞成活力的影響的圖。用濃度逐漸增加的單獨(dú)的LFA，或LFA與G4AS寡核苷酸或G4SC寡核苷酸形成的寡核苷酸復(fù)合物處理細(xì)胞，在處理24小時(shí)后通過(guò)MTT法確定細(xì)胞成活力。數(shù)據(jù)代表三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均數(shù) 士 SD。圖13B是顯示存在或不存在阿霉素(DOX)，紫杉酚，vinorelbine (VNB)或依托撲沙 (Etoposide) (Etop)時(shí)，用0. 4uM的LFA，以及LFA與G4AS寡核苷酸或G4SC寡核苷酸的復(fù) 合物處理后通過(guò)MTT法測(cè)定的死亡的H460細(xì)胞的百分比的圖。數(shù)據(jù)代表三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的 平均數(shù)士 SD。圖14是顯示用XIAP AS 2X2MB0s和長(zhǎng)春瑞濱處理的小鼠體內(nèi)H460腫瘤相對(duì)生 長(zhǎng)的圖。對(duì)攜帶皮下H460細(xì)胞異種移植的SCID-RAG2小鼠實(shí)施瘤內(nèi)注射寡核苷酸，劑量為 50ug/g腫瘤質(zhì)量。將這些治療與施用長(zhǎng)春瑞濱聯(lián)合。圖15是顯示用XIAP AS PS寡核苷酸進(jìn)行全身治療的小鼠體內(nèi)平均H460細(xì)胞腫 瘤大小的圖。相對(duì)于對(duì)照，通過(guò)系統(tǒng)給藥方式(I. P.)(腹膜內(nèi))給皮下植入了 H460細(xì)胞異 種移植物的SCID-RAG2小鼠施用XIAP AS PS寡核苷酸能降低腫瘤大小。圖16是顯示用XIAP AS PS寡核苷酸進(jìn)行全身治療的小鼠體內(nèi)的MDA_MB_435/ LCC6人乳腺癌細(xì)胞(LCC細(xì)胞)腫瘤大小的圖。相對(duì)于對(duì)照，通過(guò)系統(tǒng)給藥方式(腹膜內(nèi)) 給乳房脂墊內(nèi)植入了 LCC6細(xì)胞異種移植物的雌性SCID-RAG2小鼠施用XIAP AS PS寡核苷 酸能降低腫瘤大小。圖17是顯示G4寡核苷酸對(duì)腫瘤生長(zhǎng)和腫瘤XIAP蛋白水平的體內(nèi)影響的簡(jiǎn)圖。顯 示了系統(tǒng)施用的裸XIAP G4AS寡核苷酸或G4SC寡核苷酸對(duì)雄性SCID-RAG2小鼠體內(nèi)皮下 H460細(xì)胞異種移植物生長(zhǎng)的抗腫瘤效力。所有數(shù)據(jù)用均數(shù)士SEM(η = 6只小鼠/組)表
7J\ ο圖18A和18B是描述用G4AS寡核苷酸，G4SC寡核苷酸或單獨(dú)的載體處理21天后， 通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分析和光密度法定量獲得的SCID-RAG2小鼠體內(nèi)的H460腫瘤異種移植物 中的XIAP蛋白質(zhì)表達(dá)水平的簡(jiǎn)圖。參照細(xì)胞肌動(dòng)蛋白水平將XIAP水平標(biāo)準(zhǔn)化。所有數(shù)據(jù) 用均數(shù)士SD(n = 3)表示。圖19A和19B顯示系統(tǒng)施用15mg/kg的XIAP G4AS寡核苷酸或G4SC寡核苷酸21 天后，G4寡核苷酸對(duì)植入到SCID-RAG2小鼠體內(nèi)的H460腫瘤的病理組織學(xué)的體內(nèi)影響的顯 微照片。圖19A描繪了用蘇木精和伊紅染色的腫瘤切片。圖19B是顯示腫瘤切片中的泛素 表達(dá)的免疫組織化學(xué)圖片。顯示了有代表性的腫瘤顯微照片。內(nèi)在的比例尺標(biāo)記為lOOum。圖20A和20B是顯示長(zhǎng)春瑞濱(VNB)與XIAP寡核苷酸聯(lián)合施用時(shí)，體內(nèi)效力增強(qiáng) 的圖。在SCID-RAG2小鼠體內(nèi)確定了有或沒有XIAP G4AS寡核苷酸或G4SC寡核苷酸時(shí)，長(zhǎng) 春瑞濱對(duì)H460腫瘤異種移植物的抗腫瘤效力。圖20A描述了單一試劑的抗腫瘤活性，圖 20B描述了 VNB和G4寡核苷酸聯(lián)合的抗腫瘤活性。用均數(shù)士SEM(η = 6只小鼠/組)表示 所有數(shù)據(jù)。圖21是顯示HIAPl寡核苷酸對(duì)HIAP1RNA水平的影響的圖。圖22Α和22Β是顯示蛋白質(zhì)印跡的密度計(jì)掃描的簡(jiǎn)圖，該圖顯示了 HIAPl寡核苷 酸對(duì)細(xì)胞阻斷放線菌酮誘導(dǎo)的HIAPl蛋白質(zhì)上調(diào)的能力的影響。圖23是顯示HIAPl寡核苷酸對(duì)細(xì)胞毒性影響的圖，其中利用總蛋白來(lái)進(jìn)行測(cè)定。圖24是顯示驗(yàn)證HIAPl寡核苷酸APO 2序列特異性的圖。
圖25是顯示HIAPl寡核苷酸化學(xué)致敏耐藥SF295惡性膠質(zhì)瘤的效應(yīng)的圖。發(fā)明詳述 本發(fā)明描述了通過(guò)聯(lián)合施用本發(fā)明的堿基(nucleobase)寡聚物和化療劑，例如 細(xì)胞毒性劑，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑或生物效應(yīng)調(diào)節(jié)劑來(lái)增強(qiáng)細(xì)胞凋亡的方法。希望的情形是同 時(shí)或彼此相距28天內(nèi)施用兩種試劑。在某些實(shí)施方案中，化療劑是破裂或穩(wěn)定微管的試 齊U。例如化療劑可以是紫杉烷或長(zhǎng)春花生物堿。如果需要，也可以施用化學(xué)致敏劑(即，使 增殖細(xì)胞對(duì)化療更敏感的試劑)?？梢杂蒙鲜鲈噭┑娜魏谓M合來(lái)形成藥物組合物。這些藥 物組合物可用來(lái)治療增生性疾病，例如癌癥或淋巴組織增生紊亂，或增生性疾病的癥狀。本 發(fā)明的核堿基寡聚物/化療劑組合也可以與放療聯(lián)合，用于治療癌癥或其它增生性疾病?；罨┘?xì)胞的凋亡為改進(jìn)患者對(duì)常規(guī)化療或放療的反應(yīng)提供了可能有用的新途 徑。就直接抑制胱冬酶和凋亡的能力來(lái)說(shuō)，XIAP是IAP基因家族中最有效的成員。我們通過(guò) 反義(AS)寡核苷酸研究了 XIAP下調(diào)對(duì)非小細(xì)胞肺癌(NCI-H460)體外和體內(nèi)生長(zhǎng)的影響。 在培養(yǎng)的H460人肺癌細(xì)胞中，寡核苷酸G4AS被確定為最有效的化合物，通過(guò)實(shí)時(shí)RT-PCR 和蛋白質(zhì)(western)印跡確定它能有效下調(diào)XIAP mRNA55%，下調(diào)蛋白水平達(dá)60%，濃度為 1. 2uM時(shí)能誘導(dǎo)60%的細(xì)胞死亡。相反，混雜的對(duì)照G4寡核苷酸幾乎不能導(dǎo)致XIAP損失， 引起的細(xì)胞死亡也不到10%。前胱冬酶_3和PARP蛋白質(zhì)的降解，以及顯著的核DNA凝縮 和片斷化已經(jīng)顯示用1. 2uM的G4AS處理可導(dǎo)致凋亡。而且，XIAPAS寡核苷酸可以使H460 細(xì)胞對(duì)阿霉素，紫杉酚，長(zhǎng)春瑞濱和依托撲沙的細(xì)胞毒性影響敏感。在動(dòng)物模型中，我們證 明通過(guò)腹腔內(nèi)給藥進(jìn)行全身治療時(shí)，15mg/kg的G4AS對(duì)SCID/RAG2免疫缺陷小鼠的異種移 植模型中的人H460腫瘤具有顯著的序列特異性生長(zhǎng)抑制效果。系統(tǒng)性施用AS ODN伴隨著 腫瘤異種移植物中XIAP蛋白質(zhì)下調(diào)85%。將15mg/kg的G4AS與5mg/kg的長(zhǎng)春瑞濱結(jié)合 能顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)，效果超過(guò)單獨(dú)施用一種試劑的效果。這些研究表明XIAP的下調(diào)是肺 癌細(xì)胞的有效死亡信號(hào)，而且在體外能誘導(dǎo)凋亡，在體內(nèi)能抑制腫瘤生長(zhǎng)。這些研究支持 IAPs是治療人非小細(xì)胞肺癌和其它實(shí)體瘤的適宜靶標(biāo)的觀點(diǎn)。治療可以在通常實(shí)施癌癥治療的任何地方家里，醫(yī)生的辦公室，診所，醫(yī)院的門診部 或者醫(yī)院來(lái)提供這種治療。治療通常從醫(yī)院開始，這樣以便醫(yī)生能夠密切觀察治療的效果， 并作出任何必須的調(diào)整。治療的持續(xù)時(shí)間取決于待治療的癌癥的種類，患者的年齡和狀況， 患者疾病的分期和類型，以及患者的身體對(duì)治療的反應(yīng)?？梢砸圆煌拈g隔(例如每日，每 周或每月)來(lái)給藥。為了使患者的身體有構(gòu)建健康新細(xì)胞和恢復(fù)體力的機(jī)會(huì)，可以采用包 括間斷期的斷續(xù)周期來(lái)實(shí)施治療。依據(jù)癌癥的種類和它的發(fā)展階段，治療可用于減慢癌癥的擴(kuò)散，減慢癌癥的生長(zhǎng)， 殺死或延滯(arrest)已經(jīng)從原發(fā)腫瘤處擴(kuò)散到身體其它部分的癌細(xì)胞，減輕癌癥引起的 癥狀或防止癌癥在第一位點(diǎn)出現(xiàn)。這里使用的術(shù)語(yǔ)〃癌癥〃或〃贅生物〃(neoplasm)或〃贅生性細(xì)胞〃指以異常 方式增殖的細(xì)胞集合。癌癥生長(zhǎng)不受控制，而且呈進(jìn)行性，在通常不引起或?qū)е抡＜?xì)胞增 殖停止的情況下會(huì)發(fā)生。為了給遭受細(xì)胞過(guò)度增殖引起的疾病折磨的患者施用化合物，可以利用常規(guī)的制 藥實(shí)踐來(lái)提供適當(dāng)?shù)呐浞交蚪M合物。可以在患者出現(xiàn)癥狀之前就開始給藥?？梢圆捎萌魏芜m當(dāng)?shù)耐緩絹?lái)給藥，例如可以是腸胃外、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、皮下、瘤內(nèi)、肌內(nèi)、顱內(nèi)、眶內(nèi)、目艮用、心室內(nèi)、肝內(nèi)、囊內(nèi)、鞘內(nèi)、腦池內(nèi)(intracisternal)、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)、氣溶膠、栓劑或口服 給藥。例如治療的劑型可以是液體溶液或懸浮液形式；口服劑型可以是用片劑或膠囊形 式；鼻內(nèi)劑型可以是粉劑、滴鼻劑或氣溶膠形式。例 如 在“Remington :The Science and Practice of Pharmacy " Ed. A. R. Gennaro, Lippincourt Williams & Wilkins，Philadelphia, PA，2000 中已經(jīng)找到本 領(lǐng)域制造這些劑型的公知方法。例如腸胃外給藥的劑型可以包含賦形劑，無(wú)菌水或鹽水，聚 二醇，例如聚乙二醇，植物油或氫化萘。也可以用生物相容性的可生物降解的丙交酯聚合 物，丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯_聚氧丙烯共聚物來(lái)控制化合物的釋放。適合于IAP 調(diào)節(jié)化合物的其它可能有用的腸胃外藥物遞送系統(tǒng)包括乙烯_醋酸乙烯共聚物顆粒，滲透 泵，可植入的浸漬系統(tǒng)和脂質(zhì)體。吸入劑的劑型可以包含賦形劑，例如，乳糖，或者是包含如 聚氧乙烯-9-月桂基醚，甘油膽酸鹽和脫氧膽酸鹽的水溶液，或者是適合以滴鼻劑或凝膠 形式給藥的油性溶液?？梢越o病人施用治療有效量(例如，防止，消除或者減少病理狀況的量)的這些制 劑來(lái)提供對(duì)疾病或狀況的治療。本發(fā)明的核堿基寡聚物的優(yōu)選劑量可能取決于象紊亂的類 型和程度，特殊患者的總體健康狀態(tài)，化合物賦形劑的組成和給藥途徑這樣的變量。如上所述，如果愿意，可以將本發(fā)明的核堿基寡聚物治療與治療增生性疾病的治 療方法(例如放療、外科手術(shù)或化療)聯(lián)合使用。上述的任何使用方法中都希望通過(guò)靜脈內(nèi)給藥來(lái)施用本發(fā)明的核堿基寡聚物，或 者將本發(fā)明的核堿基寡聚物應(yīng)用到需要凋亡發(fā)生的位點(diǎn)(例如通過(guò)注射)。寡核苷酸及其它核堿基寡聚物至少兩種寡核苷酸即具有磷酸二酯(PO)或硫代磷酸酯(PS)鍵的多聚脫氧核苷 酸會(huì)導(dǎo)致RNase H切割RNA。雖然2' -OMe-RNA序列對(duì)RNA靶呈現(xiàn)出高親合力，但這些序 列不是RNase H的底物?？扇〉墓押塑账崾且园丫勖撗鹾塑账崛笨诘?‘修飾寡核 苷酸為基礎(chǔ)的寡核苷酸，其中一些或全部核苷酸之間的鍵被改變?yōu)閷?duì)核酸酶具有抗性的硫 代磷酸酯。膦酸甲酯修飾的存在增加了寡核苷酸對(duì)靶RNA的親合力，因此降低了 IC5(I。這 些修飾也增加了修飾的寡核苷酸對(duì)核酸酶的抗性。應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的方法和試劑可以和 任何可能發(fā)展的技術(shù)，包括共價(jià)閉合多反義(covalently-closed multiple antisense) (CMAS)寡核苷酸(Moon et al.，Biochem J. 346 :295_303，2000 ；PCT
發(fā)明者丹尼爾·麥克馬納斯, 喬恩·P·德金, 埃里克·拉卡西 申請(qǐng)人:艾吉拉醫(yī)療股份有限公司