寡聚流感免疫原性組合物的制作方法
【專利說明】
[0001] 與相關申請的奪叉引用
[0002] 本申請根據(jù)35U. S. C. § 119(e)要求于2013年2月15日提交的美國臨時專利申 請61/765, 519的權益，其全部內(nèi)容以引用并入本文。
[0003] 關于聯(lián)邦咨助研究的聲明
[0004] 本發(fā)明是在美國國立衛(wèi)生研究院授予的批準號為R03AI088449的政府支持下進 行的。政府對本發(fā)明享有一定的權力。
技術領域
[0005] 本公開內(nèi)容涉及用于預防流感感染的免疫原性組合物。
【背景技術】
[0006] 屬于正粘病毒（Orthomyxoviridae)科的甲型流感病毒可在人類、禽類或馴養(yǎng)食 用動物中導致流感。該病毒可基于其表面糖蛋白、血凝素（HA)和神經(jīng)氨酸酶（NA)而被進 一步分為不同亞型。在已知的18種HA和11種NA中，三種HA亞型（Hl、H2和H3)和兩種 NA亞型（NI和N2)在人類中是最常見的。HlNl和H3N2是導致人類季節(jié)性流感和全球流行 性流感的主要亞型。2009年的流感流行是由豬源性甲型流感病毒HlNl所引起的。這已導 致人們對高致病性禽流感（HPAI)H5N1病毒的流行可能性的關注增加。因此，迫切需要開發(fā) 針對不同甲型流感病毒株的有效且安全的疫苗以預防流感在未來爆發(fā)。
[0007] 發(fā)明概沐
[0008] 本文公開了用于預防和治療流感病毒感染的蛋白質(zhì)和免疫原性組合物。
[0009] 在一個實施方式中，提供了包含免疫原序列的蛋白質(zhì)，所述免疫原序列包含甲型 流感病毒基質(zhì)蛋白M2e結構域或其片段，以及甲型流感病毒血凝素融合肽（FP)結構域或其 片段；以及免疫增強物（immunopotentiator)序列。
[0010] 在一個實施方式中，F(xiàn)P結構域來自于甲型流感病毒血凝素亞型1、2、3、4、5、6、7、 8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18。在另一個實施方式中，F(xiàn)P結構域和M2e結構域獨立 地來自于選自HlNl病毒、H1N2病毒、H2N2病毒、H3N2病毒、H5N1型病毒、H7N2病毒、H7N3 病毒、H7N7病毒、H7N9病毒、H9N2病毒或H10N8病毒的甲型流感病毒。在另一個實施方式 中，F(xiàn)P結構域的氨基酸序列與SEQ ID NO. 3、7、17、18、19或20中的一個至少90%相同。在 另一個實施方式中，M2e結構域的氨基酸序列與SEQ ID NO. 4、8、21、22、23或24中的一個 至少90%相同。在某些實施方式中，免疫原包括12〇4?或？?-126。
[0011] 在另一個實施方式中，蛋白質(zhì)還包含穩(wěn)定化序列。在另一個實施方式中，所述穩(wěn)定 化序列為折疊子（Fd)或GCM序列。
[0012] 在另一個實施方式中，免疫增強物序列為人IgG Fc的Fc片段序列、C3d序列、旋 盤尾絲蟲（Onchocerca volvulus)ASP-I序列、霍亂毒素序列或胞壁酰肽序列。在另一個實 施方式中，免疫增強物序列與SEQ ID NO. 10的人IgG Fc序列至少90%相同。
[0013] 在另一個實施方式中，所述蛋白質(zhì)為融合蛋白。在一個實施方式中，所述免疫增強 物序列被連接至免疫原序列的C端。在另一個實施方式中，所述穩(wěn)定化序列被連接至免疫 原序列的C端；且免疫增強物序列被連接至穩(wěn)定化序列的C端。在某些實施方式中，融合蛋 白包括 M2e-FP-Fc、FP-M2e-Fc、M2e-FP-FdFc 或 FP-M2e-FdFc。
[0014] 在另一個實施方式中，所述融合蛋白還包含位于至少一個以下位置的連接子序 列：免疫原序列的M2e和FP結構域之間、免疫原序列和穩(wěn)定化序列之間，以及穩(wěn)定化序列和 免疫增強物序列之間。在另一個實施方式中，所述連接子為（GGGGS) n，其中η為0和8之間 的整數(shù)。在一個實施方式中，η為1。
[0015] 還提供了一種免疫原性組合物，其包含本文所公開的蛋白質(zhì)以及至少一種藥學上 可接受的賦形劑。在另一個實施方式中，所述免疫原性組合物還包含佐劑。
[0016] 本文還提供了一種在受試者中誘導針對流感病毒的免疫應答的方法，其包括向所 述受試者施用本文所公開的免疫原性組合物或蛋白質(zhì)。在另一個實施方式中，所述免疫應 答為保護性免疫應答。在另一個實施方式中，所述流感病毒是甲型流感病毒、乙型流感病毒 或丙型流感病毒。
[0017] 本文還提供了一種預防受試者的流感病毒感染的方法，其包括向所述受試者施用 本文所公開的免疫原性組合物或蛋白質(zhì)。在另一個實施方式中，免疫應答為保護性免疫應 答。在另一個實施方式中，所述流感病毒是甲型流感病毒、乙型流感病毒或丙型流感病毒。
[0018] 附圖簡沐
[0019] 圖IA-B示出了含甲型流感病毒H5NlM2e和FP結構域的與折疊子（Fd)和人 IgG可結晶（Fe)部分片段融合（M2e-FP-FdFc，其也被稱為M2e-FP-FdFc)或與Fc融合 (M2e-FP-Fc)或M2e僅與Fc融合（M2e-Fc)以及H7N9M2e和FP與Fd以及人IgG的Fc融合 (H7N9M2e-FP-FdFc)的所構建的重組融合蛋白的示意性結構。H5N1和H7N9甲型流感病毒 的M2e和FP的高度保守序列以及Fd序列被列在頂部。H5N1和H7N9的M2e和FP中氨基酸 殘基的差異用下劃線標出。
[0020] 圖2A-C示出了通過SDS-PAGE和Western印跡進行的重組M2e-FP融合蛋白的表 征。用SDS-PAGE分析純化的H5NlM2e-FP融合蛋白，然后考馬斯藍染色（圖2A)并通過分別 使用H5NlM2e-(圖2B)和HA2-特異性MAb進行Western印跡（圖2C)。在左邊示出了蛋白 質(zhì)分子量標記（kDa)。MAb以I :3000進行稀釋以用于H5N1病毒的M2e(#16)和HA2(1B12)。 [0021 ] 圖3A-B示出了由重組H5NlM2e_FP融合蛋白所誘導的抗流感IgG抗體應答。PBS被 用作陰性對照。圖3A :在每次接種后10天收集的小鼠血清（I :6400)中檢測H5N1 M2e-FP 特異性IgG抗體應答。數(shù)據(jù)被表示為每組5只小鼠的平均A450土標準差（SD)。圖3B:IgG 抗體的結合至重組H5N1 M2e-FP融合蛋白的能力，其中在最后一次接種后10天收集的小鼠 血清中檢測IgG抗體。數(shù)據(jù)被表示為各稀釋點的每組5只小鼠的平均A450土SD。
[0022] 圖4A-B示出了 IgGl (圖4A)和IgG2a (圖4B)抗體的結合至重組H5N1 M2e-FP融 合蛋白的能力，其中在最后一次接種后10天收集的小鼠血清中檢測抗體。PBS被用作陰性 對照。數(shù)據(jù)被表示為各稀釋點的每組5只小鼠的平均A450土SD。
[0023] 圖5六-8示出了由重組!15附126-??融合蛋白誘導的針對1050%致死劑量（〇)5。） 的H5N1病毒攻擊的跨分支（cross-clade)保護。接種的小鼠經(jīng)鼻內(nèi)（i.n.)分別受到 10〇) 5。的 H5N1 病毒分支 I :A/ 越南 /1194/2004(VN/1194)(圖 5A)或分支 2. 3. 4 :A/ 深圳 /406H/06 (SZ/406H)(圖5B)的攻擊，并監(jiān)控被攻擊小鼠的存活率（％ ) 2周。用時序檢驗 (log-rank test)的Kaplan-Meier生存分析來分析每組8只小鼠的生存曲線之間的顯著 性。*和**分別指示與對照組相比P〈0. 05和P〈0. 01。
[0024] 圖6A-B示出了由重組H5NlM2e-FP融合蛋白誘導的針對3LD5。的H5N1病毒攻擊的 跨分支保護。接種的小鼠經(jīng)鼻內(nèi)（i. η.)受到3LD5。的H5N1病毒分支I :VN/1194(圖6A)或 分支2. 3. 4 :SZ/406H(圖6B)的攻擊，并監(jiān)控被攻擊小鼠的存活率)2周。用時序檢驗 的Kaplan-Meier生存分析來分析每組8只小鼠的生存曲線之間的顯著性。林和分別 指示與對照組相比P〈〇. 01和P〈〇. 0001。
[0025] 圖7A-B示出了來自在致命性H5N1病毒攻擊后接種重組H5NlM2e-FP融合蛋白的 小鼠肺組織的病毒滴度。接種的小鼠經(jīng)鼻內(nèi)（i. η.)分別受到IOLD5。（圖7A)或3LD5。（圖 7B)的H5N1病毒分支I :VN/1194或分支2. 3. 4 :SZ/406H的攻擊，并在攻擊后5天在所收集 的肺組織中檢測病毒滴度。數(shù)據(jù)被表示為Log1QTCID 5Q/g肺組織，并被表現(xiàn)為每組5只小鼠 的幾何平均滴度（GMT) 土SD。檢測的下限為1.5L〇g1QTCID5Q/g組織。在不同組之間的P值 被示出。
[0026] 圖8示出了重組H5N1 M2e-FP融合蛋白與重組H7N9M2e-FP-FdFc蛋白質(zhì)所誘導的 IgG抗體應答的交叉反應性的檢測。PBS被用作陰性對照。在最后一次接種后10天收集的 小鼠血清中檢測IgG抗體。數(shù)據(jù)被表示為各稀釋點的每組5只小鼠的平均A450土SD。
[0027] 術語宙義
[0028] 為了便于對下面的詳細描述、實施例和所附權利要求的理解，參考下列定義是有 用的。這些定義的性質(zhì)是非限制性的且僅僅是為方便讀者而提供的。
[0029] 基因：本文所使用的"基因"是指具有基因構建體所需的或修改基因構建體的表達 所需的啟動子和/或其他調(diào)控序列的基因構建體的至少一部分。
[0030] 宿主：如在本文所使用的，"宿主"是指本發(fā)明免疫原性組合物的接受者。示例性 宿主是哺乳動物，包括但不限于靈長類動物、嚙齒類動物、牛、馬、狗、貓、綿羊、山羊、豬和大 象。在本發(fā)明的一個實施方式中，宿主為人。對于本公開內(nèi)容的目的而言，宿主等同于"被 接種者"。
[0031] 免疫原：如在本文所使用的，術語"免疫原"是指在宿主中引發(fā)免疫應答的任何物 質(zhì)。
[0032] 免疫原性組合物：如在本文中所使用的，"免疫原性組合物"指具有或不具有佐劑 的所表達的蛋白質(zhì)或重組載體，其在體內(nèi)表達和/或分泌免疫原，且其中所述免疫原在宿 主中引發(fā)免疫應答。本文所公開的免疫原性組合物可以是或可以不是免疫保護性或治療性 的。當免疫原性組合物