專利名稱：用于治療腫瘤的4000-10000道爾頓的寡脫氧核糖核苷酸的制作方法
用于治療腫瘤的4000-10000道爾頓的 寡脫氧核糖核苷酸本發(fā)明主題為通過對患肺瘤的哺乳動物施用有效量的oligotide來治療 所述哺乳動物的方法；具體地，涉及oligotide用于治療血管發(fā)生依賴性肺 瘤(如多發(fā)性骨髄瘤或乳腺癌)的用途。
背景技術(shù)：
血管發(fā)生是引起由預(yù)先存在的脈管系統(tǒng)形成新血管的多步驟過程，它 是原發(fā)性腫瘤生長、侵襲和發(fā)生轉(zhuǎn)移所必需的(20)。正常情況下，它在成 人中受到抑制，其中血管發(fā)生僅在生殖、發(fā)育和傷口愈合中暫時性出現(xiàn)。 超過臨界體積之后，腫瘤不能在沒有新血管形成的情況下進(jìn)一步增殖(12)。 為了促進(jìn)增殖，腫瘤必須獲得血管發(fā)生表型，所i^型是正(仏血管發(fā)生) 和負(fù)(fefiL管發(fā)生)調(diào)節(jié)劑凈平衡的結(jié)果(16)。然而，肺瘤在血管結(jié)構(gòu)、分化 和功能性血供應(yīng)上是高度異源的(24)。這些無血管血管發(fā)生前腫瘤大小上 的差異可能部分是因為腫瘤細(xì)胞在不同缺氧程度下存活的能力(18)。某些胂瘤血管發(fā)生依賴性的證據(jù)來自這一觀察血管發(fā)生程度的度 量一一微血管密度是所述臨床實體中獨立的存活預(yù)后因子(17)，所述腫瘤 為例如多發(fā)性骨髄瘤，甚至非實體白血病和淋巴瘤(8)和(21)以及乳腺癌 (25)、結(jié)腸直腸癌(7)、胃癌(26)、前列腺癌(9)、宮頸癌(19)、肝細(xì)胞癌(23) 和非小細(xì)胞肺癌(13)。在最近的臨^l研究中(再次在乳腺癌中)，已經(jīng)開始明 確血管發(fā)生相關(guān)基因?qū)εR床結(jié)果是很重要的，例如血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子 VEGF、 VEGF受體FLT1和金屬蛋白酶MMP9(6)。定義
本文使用的術(shù)語oligotide用于標(biāo)識分子量為4000-10000道爾頓的任何 寡脫氧核糖核香酸。其優(yōu)選標(biāo)識具有以下分析參數(shù)的任何寡脫氧核糖核苷 酸分子量(mw): 4000-10000道爾頓，增色性(h): <10，A+T/C+G: 1.100-1.455，A+G/C+T: 0.800-1.160，比旋光十30。誦+46.80，優(yōu)選+300- +46.20。oligotide可以通iWw動物和/或植物組織(特別是哺乳動物器官諱l取而 產(chǎn)生，或者可以合成產(chǎn)生。優(yōu)選地，通過^^取產(chǎn)生時，其優(yōu)選按照引入本 文為參考的(l)、 (2)和(3)中所述方法獲得。已知oligotide具有顯著的抗局 部缺血活性?；蛑参锝M織提取獲得，但也可以合成產(chǎn)生；所述多脫氧核糖核苷酸通常以 堿金屬鹽的形式使用， 一般為鈉鹽， 一般具有約45-50 kDa的分子量(CAS 登記號83712-60-1)。優(yōu)選地，去纖維蛋白多核苷酸顯示引入本文為參考的 (4)和(5)中描述的物理/化學(xué)特征。發(fā)明描迷我們最近開發(fā)了用于腫瘤血管發(fā)生備選途徑的模型.除了從預(yù)先存在 的血管形成內(nèi)皮細(xì)胞以外，我們提出血'^JL生的內(nèi)皮細(xì)胞也可以產(chǎn)生腫瘤 脈管系統(tǒng)。這些內(nèi)皮樣細(xì)胞(ELC)在特定培養(yǎng)條件下由腫瘤相關(guān)的樹突細(xì) 胞轉(zhuǎn)分化(ll)。簡言之，從健"供血者的白細(xì)胞分離產(chǎn)物中淘選單核細(xì) 胞，并在粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞-集落刺激因子(GM-CSF)和白介素4(IL-4)存在下 培養(yǎng)，以刺激樹突細(xì)胞(DC)的分化。此外，用腫瘤細(xì)胞特異性釋放的混合 物(M-CSF、 IL.6和乳酸，Gottfried等，手稿已提交)處理細(xì)胞，以促itJt 瘤相關(guān)樹突細(xì)胞(TuDC)向外生長。這些TuDC-ELC獲得了內(nèi)皮細(xì)J^^型(因子VIII相關(guān)的Ag， vWF)，
然而它們失去了單核細(xì)胞(CD14)和樹突細(xì)胞標(biāo)志物(CDla)。很重要的是， 它們不表達(dá)CD34，也不表達(dá)CD133或CD146,這證明它們是真實的轉(zhuǎn)分 化產(chǎn)物，沒有循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞(CD34、 CD133)或成熟循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞(CD146) 的污染。此外，它們能在MatrigelTM(血管發(fā)生的體外測定)中形成管樣結(jié) 構(gòu)'MatrigelTM測U最普遍并廣泛使用的體外血管發(fā)生測定之一(22)。 MatrigelTM ^J&外M蛋白的半固體合成混合物，其刺激生理存在于血管 內(nèi)皮細(xì)胞壁以下的基質(zhì)。當(dāng)目的細(xì)胞接種在顯微小室栽玻片中的該M上 時，它們被激活，在3-7天內(nèi)形成管狀結(jié)構(gòu)，^it^它們具有內(nèi)皮細(xì)胞 表型的情況下發(fā)生。因此，該測定適于顯示細(xì)胞引起腫瘤脈管系統(tǒng)發(fā)生的 潛在能力。我們的數(shù)據(jù)證明臨床或亞臨床濃度的oligotide和/或去纖維蛋白多核 苷酸能抑制轉(zhuǎn)分化ELC(TuDC-ELC)在MatrigelTM中的管形成.將 TuDC-ELC和成熟的已分化內(nèi)皮細(xì)胞AJ^frJ^(HUVEC)或,管內(nèi)皮細(xì) 胞(HMEC)作為"穩(wěn)定"對照在存在或不存在oligotide或去纖維蛋白多核 苷酸(各為10^g/mL)的條件下溫育.重要的是，在單次加入去纖維蛋白多 核苷酸后，HUVEC和HMEC的管形成潛力未受影響，提示去纖維蛋白多 核苷酸和/或oligotide僅把向轉(zhuǎn)分化內(nèi)皮細(xì)胞(

圖1A)。然而，重復(fù)加入去纖 維蛋白多核苷酸時，也能阻斷成熟的完全分化內(nèi)皮細(xì)胞的血管發(fā)生(見下 文)。借助來自NIH(ImageJ，http:〃rsb.info.nih.gov/ij/)的輔助軟件，我們能 夠定量這些效果，評估管的總長和照片面積，接著以總長>1/面積<象素-11 給出微血管密度(MVD)。 DF顯著(p-0.02， t檢驗)下調(diào)TuDC-ELC的 MVD(圖1B)。為了用備選血管發(fā)生測定支持這些數(shù)據(jù)，在每日基礎(chǔ)上應(yīng)用DF時， 大鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)^ MatrigelTM中的萌發(fā)被接近100%阻止(圖2)，提 示DF不但/ft用于轉(zhuǎn)分化細(xì)胞，而且還作用于成熟的完全分化的內(nèi)皮細(xì)胞。主動脈環(huán)測定研究大血管內(nèi)皮細(xì)胞。但腫瘤脈管系統(tǒng)經(jīng)常由^J^管內(nèi)
皮細(xì)胞組成。因此，基于培養(yǎng)9-ll天后通過一層皮膚成纖維細(xì)胞層的微血 管內(nèi)皮細(xì)胞血管化，進(jìn)行了第三種體外血管發(fā)生測定。接著可以通過CD31 和vWF染色顯示這些血管樣結(jié)構(gòu)。如圖3(A和B)所示，DF還能阻斷人微血管內(nèi)皮細(xì)胞的血管發(fā)生，優(yōu) 選每日應(yīng)用。有趣的是，10/ig/mL左右的濃;l^來是最有效的。單次應(yīng)用 DF不能顯著阻斷血管發(fā)生。總而言之，我們的數(shù)據(jù)強烈提出，去纖維蛋白多核苷酸和/或oligotide 能阻斷腫瘤相關(guān)轉(zhuǎn)分化內(nèi)皮細(xì)胞和來自現(xiàn)有血管細(xì)胞的那些細(xì)胞的血管發(fā) 生。繼續(xù)研究oligotide和去纖維蛋白多核苷酸是否在體內(nèi)也抑制血管發(fā) 生。我們目前進(jìn)行了背皮室測定(14),其在高度血管化的人胃癌小鼠模型(異 種移植系統(tǒng))中研究去纖維蛋白多核苷酸的效果。初步數(shù)據(jù)明確顯示DF處 理的腫瘤的^fc管密度(MVD)低于對照腫瘤。在截止時間前將重復(fù)i^M實 驗。DF能阻斷血管發(fā)生的作用機制仍有待闡明，但是來自Western印跡 的初步證據(jù)提示DF對活化的p70S6激酶(p-p70S6)(促分裂原活化的蛋白激 酶)的下調(diào)作用.對p70S6激酶影響的其他證據(jù)得自另一管形成測定，其中在存在或不 存在p70S6激酶抑制劑DRB的情況下培養(yǎng)HMEC.也有來自接受同種異體干細(xì)胞移植(SCT)的患者(pts.)的第 一批臨床數(shù) 據(jù)在17名用去纖維蛋白多核苷酸治療的一組患者中觀察到了血清VEGF 水平的顯著下降，也提示去纖維蛋白多核苷酸可能通過生長因子撤除發(fā)揮 作用，所述生長因子用于使腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞萌發(fā)，去纖維蛋白多核苷酸和oligotide是血管發(fā)生依賴性腫瘤治療的有力候 選者，并且可單獨使用或與其他^jk管發(fā)生劑(如雷帕霉素(14))組^^吏用。 有趣的是，雷帕霉素具有促血栓形成活性的消極副作用(15)，這可通過同 時應(yīng)用^jfiL栓形成和溶纖維蛋白的去纖維蛋白多核苷酸來減弱。 參考文獻(xiàn)1 US56461272 US56462683 US60461724 US49855525 US52236096 't Veer，L丄,et al.(2002) Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer. Nature, 415， 530-536.7 Abdalla，S.A.， et al.(1999) Prognostic relevance of microvessel density in colorectal tumours. Oncol.Rep.， 6， 839-842.8 Andersen，N.F.， et al. (2005) Syndecan-1 and angiogenic cytokines in multiple myeloma: correlation with bone marrow angiogenesis and survival. Br丄Haematol.， 128， 210-217.9 BostwickjD.G. & Iczkowski，K.A. (1998) Microvessel density in prostate cancer: prognostic and therapeutic utility. Semin.Urol.Oncol" 16， 118-123.10 Eissner，G.， et al. (2002) Fludarabine induces apoptosis， activation, and allogenicity in human endothelial and epithelial cells: protective effect of defibrotide. Blood, 100， 334-340.11 Fernandez，P.B.， et al. (2001) Dendritic cells derived from peripheral monocytes express endothelial markers and in the presence of angiogenic growth factors differentiate into endothelial誦like cells. Eur丄CeH Biol" 80， 99-110.12 Folkman，J.， et al. (1971) Isolation of a tumor factor responsible for angiogenesis. J.Exp.Med.， 133， 275-288.13 Fontanini，G.， et al. (1995) Microvessel count predicts metastatic disease and survival in non-small cell lung cancer. J.Pathol" 177， 57-63.14 Guba，M.， et al.(2002) Rapamycin inhibits primary and metastatic tumor growth by antiangiogenesis: involvement of vascular endothelial growth factor. Nat.Med.， 8， 128-135.15 Guba，M.， et al. (2005) Rapamycin induces tumor-specific thrombosis via tissue factor in the presence of VEGF. Blood.16 Hanahan，D. & Folkman，J. (1996) Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis. Cell， 86， 353-364.17 Hasan,J.， et al. (2002) Intra國tumoural microvessel density in human solid tumours. Br丄Cancer， 86， 1566-1577.18 HelmIinger，G, et al. (1997) Interstitial pH and p02 gradients in solid tumors in vivo: high-resolution measurements reveal a lack of correlation. Nat.Med., 3， 177-182.19 Kainz，C.， et al. (1995) Prognostic value of tumour microvessel density in cancer of the uterine cervix stage IB to IIB. Anticancer Res" 15， 1549-1551.20 Morabito，A., et al. (2004) Antiangiogenic strategies, compounds, and early clinical results in breast cancer. Crit Rev.Oncol.Hematol,， 49， 91-107.21 Podar，K. & Anderson,ICC. (2005) The pathophysiologic role of VEGF in hematologic malignancies: therapeutic implications. Blood， 105， 1383-1395.22 Staton，C.A.， et al. (2004) Current methods for assaying angiogenesis in vitro and in vivo. Int丄Exp.Pathol.， 85， 233-248.23 S叫H.C.， et al. (1999) Microvessel density of hepatocellular carcinoma: its relationship with prognosis. J.Cancer Res.Clin.Oncol" 125， 419-426.24 Verheul，H.M.， et al. (2004) Are tumours angiogenesis-dependent J.Pathol.， 202， 5-13. 25 Weidner，N.， et al. (1992) Tumor angiogenesis: a new significant and independent prognostic indicator in early-stage breast carcinoma. J.Natl.Cancer Inst" 84， 1875-1887.26 Xiangming，C.， et al. (1998) Angiogenesis as an unfavorable factor related to lymph node metastasis in early gastric cancer. Ann.Surg.Oncol.， 5， 585-589.
權(quán)利要求
1、 分子量為4000-10000道爾頓的寡脫氧核糖核苷酸用于生產(chǎn)具有抗 肺瘤作用的制劑的用途。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l的用途，其特征在于所述寡脫氧核糖核苷酸具有以 下分析^lt: h<10， A+T/C+G: 1.100-1.455， A+G/C+T: 0.800-1.160，比旋 光+30。國+46.80。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2的用途，其特征在于所述比旋光在+30°到+46.2°之間。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其特征在于通it^動物和/或植物組織提 取、優(yōu)選從哺乳動物器官提取獲得所述寡脫氧核糖核苷酸。
5、 根據(jù)權(quán)利要求l的用途，其特征在于所述寡脫氧核糖核苷酸通過合 成獲得.
6、 根據(jù)權(quán)利要求l的用途，其特征在于將所述制劑施用于哺乳動物。
7、 根據(jù)權(quán)利要求l的用途，其特征在于所述哺乳動物為人.
8、 根據(jù)權(quán)利要求l的用途，其特征在于靜脈內(nèi)施用所述制劑。
9、 根據(jù)權(quán)利要求l的用途，其特征在于所述制劑為水溶液。
10、 根據(jù)權(quán)利要求l的用途，其特征在于所述制劑含有至少另一具有 抗腫瘤作用的活性成分。
11、 根據(jù)權(quán)利要求10的用途，其特征在于具有抗腫瘤作用的另一種活 性成分選自去纖維蛋白多核苷酸、雷帕霉素、紫杉醇、單野百合堿、BCNU 和/或環(huán)磷酰胺。
12、 根據(jù)權(quán)利要求l的用途，其特征在于所述制劑含有慣用的賦形劑 和/或佐劑.
全文摘要
描述了具有4000-10000道爾頓分子量的寡脫氧核糖核苷酸作為抗腫瘤劑單獨或與具有抗腫瘤作用的其他活性成分組合的用途。所述oligotide可以通過從動物和/或植物組織(特別是從哺乳動物器官)提取產(chǎn)生，也可以合成產(chǎn)生?？梢灾委煹哪[瘤優(yōu)選為血管發(fā)生依賴性腫瘤如多發(fā)性骨髓瘤或乳腺癌。
文檔編號A61P35/00GK101123973SQ200680005555
公開日2008年2月13日 申請日期2006年2月27日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月3日
發(fā)明者G·艾森納, L·I·費羅, M·亞科貝利 申請人:真蒂奧姆有限公司